Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng trong kiểm tra động vật

TRƯỜNG
TRƯỜNG
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
KHOA CÔNG NGHỆ
KHOA CÔNG NGHỆ
SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

“Chuyên đề: Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng
trong kiểm tra động vật chuyển gen
Thái Nguyên, 2014
Thái Nguyên, 2014
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
•
Đặt vấn đề
•
Nội dung
•
Kết luận
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
Đặt vấn đề
Đặt vấn đề
•
Động vật chuyển gen: là những động vật có hệ gen bị biến đổi
bằng cách đưa thêm DNA ngoại lai gắn vào hệ gen của nó.
Đoạn DNA ngoại lai dùng để đưa vào cơ thế khác gọi là gen
chuyển.
•

Để khẳng định ĐV có được chuyển gen lạ vào hay không
người ta phải kiểm tra xem có gen lạ xâm nhập được vào bộ
máy di truyền của động vật hay không. Phương pháp thường
hay sử dụng đó là các kỹ thuật lai phân tử trên pha rắn
(Southern blot, Nouthern blot….)
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
Hình ảnh một số động vật chuyển gene
Mèo phát sáng Cá gấu trúc phát sáng
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
Hình ảnh một số động vật chuyển gene
Dê tạo tơ nhện Lợn thân thiện với môi trường
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
Nội dung
Nội dung
1. Khái niệm về lai phân tử
2. Các phương pháp lai phân tử
3. Các phương pháp khác
4. Kết luận
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
1.Khái
1.Khái
niệm về lai phân tử
niệm về lai phân tử
•
Lịch sử:
- 1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý

ngành học tại Đại học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại
(reannealing).Quá trình này bao gồm sự kết hợp của những
mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững. Từ sự khám
phá ra quá trình reannealing phương pháp lai các nucleic
được phát triển.
- Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau
của acid nucleic có thể trọn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch
đôi được đặt tên là thể lai (hybrid).
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
1.Khái
1.Khái
niệm về lai phân tử
niệm về lai phân tử
=> Việc lai phân tử mở rộng ra nhiều kỹ thuật khác nhau và
được dùng vào những mục đích đa dạng với mục đích sử dụng
lai DNA như 1 kỹ thuật so sánh dùng cặp base bổ sung để đối
chiếu bộ gene chứa toàn bộ nội dung di truyền của 2 loài khác
nhau và đánh giá những điểm tương đồng giữa chúng
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
1.Khái
1.Khái
niệm về lai phân tử
niệm về lai phân tử
*Cơ sở của lai phân tử : là sự biến tính và hồi tính của DNA.
Khi 1 phân tử DNA mạch đôi được đun lên 1 nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ
nóng chảy Tm thì 2 mạch đơn sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên
kết Hydro nối liền mạch. Sau khi 2 mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản
ứng được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp,

chúng sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này gọi là lai phân tử.
* Đặc điểm của lai phân tử:
-Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự có trình
tự hoàn toàn bổ sung.
-Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA dẫn đến sự hình thành
các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lại DNA-RNA.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
1.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến lai phân tử
- Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA.
- Ảnh hưởng của độ dài DNA
-
Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch).
-
Ảnh hưởng của môi trường phản ứng.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
1.1.1 Ảnh hưởng của thành phần base
Do số lượng các liên kết hidro giữa A và T, G và C không bằng nhau
(A=T; G =C) nên thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có
ảnh hưởng rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt là
tỷ lệ các base G,C. Trong điều kiện chuẩn , Tm được đánh giá bằng
công thức sau: Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C).
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH

1.1.2
Ảnh hưởng của độ dài DNA
Ảnh hưởng của độ dài DNA
Đọan DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hidro nối 2

mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng
càng cao. Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính
theo công thức sau: ∆Tm = -500/số lượng cặp base
Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đ
ối với những đoạn DNA ngắn.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH

1.1.3Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch
)
+ Bắt cặp sai lệch ngoài quy tắc ( A=T, G=C) => Giảm tính ổn
định của phân tử lai.
+ Tm giảm 10ºC => 1% bắt cặp sai lệch.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
1.1.4 Ảnh hưởng của môi trường phản ứng
* Ảnh hưởng của nồng độ muối:
+ Sự giảm lực ion sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy.
+ Dung dịch càng loãng càng làm mất tính ổn định của chuỗi
xoắn kép DNA.
* Ngoài ra còn các yếu tố như : nhiệt độ tốc độ phản ứng lai phụ
thuộc vào nhiệt độ. Thông thường phản ứng lai đạt cực đại ở
nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó 25%.

Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2. Phân loại
- Lai trong pha lỏng ( dùng quang phổ kế, nuclease S
1
, sắc kí

trên hydroxylapatite).
- Lai trên pha rắn ( thường sử dụng hơn) :
+ Southern blot
+Nouthern blot
+Western blot
+Dot ( slot ) blot.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.1 Lai trong pha lỏng
Nguyên tắc:
+Các mạch đơn nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch
đệm.
+Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển
động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất
vài độ.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.1.1 Phương pháp dùng quang phổ kế
- DNA hấp thụ ánh sáng yếu hơn DNA mạch đôi.
- Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác
định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị mật độ
quang (OD) ở bước sóng 260 nm.
- Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển
thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là phản ứng siêu
sắc (hyperchromic effect).
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.1.1 Phương pháp dùng quang phổ kế
Nhuộm tím phân tử DNA, nếu đem chúng đun nóng và làm
lạnh từ từ thì kết quả là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm.

Nếu hạ nhiệt độ một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất
đậm. Đó là hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thụ tia UV
mạnh hơn DNA mạch đôi.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.1.2 Phương pháp sử dụng nuclease S1
-
Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic acid mạch đơn
bất kể là DNA hy RNA trong một số điều kiện thực nghiệm.
-
Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần đem xử lý với
nuclease S1.
-
Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các NA còn lại tương ứng với
các phân tử lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem
định lượng.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.1.3 Phương pháp sắc ký trên hydroxylapatite
•
Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci.
•
Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc
kháng thể ) để lai với DNA, RNA hoặc với các protein ở trong
các tế bào mà không cần tách chiết.
•
Sau khi bị đốt nóng chúng được làm lạnh để những mạch đơn
va chạm ngẫu nhiên. Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 60
0

trong một dung dịch đệm Natri phosphat.
•
Ở nồng độ muối cao chỉ những nucleic mạch đôi mới gắn
được vào giá thể này, phần nucleic không gắn sẽ được thu
nhận.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.2 Lai trên pha rắn
* Nguyên tắc:
-
Giống với nguyên tắc lai trên pha lỏng.
-
Khác ở chỗ một trong 2 trình tự bổ sung được cố định trên một
giá thể rắn.
*Ưu điểm:
-Dễ dàng trong thao tác tách các trình tự không lai ra khỏi các
phân tử.
-ngăn sự tái bắt cặp giữa hai mạch của cùng 1 phân tử.
*Nhược điểm:
-Phân tích và định lượng các phân tử lai kém chính xác và hiệu
quả lai thấp.
-Vận tốc lai kém so với lai trên pha lỏng.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.2.1 Phương pháp Southern blot
Nguyên tắc:
Màng lai nitrocelluse có khả nagw tiếp nhậ DNA đã được biết từ
lâu và đã được sử dụng trong các nghiên cứ lai nucleic acid khác
nhau vào những thập niên 1950 và 1960.
Các bước tiến hành:

•
Cắt DNA bằng enzyme giới hạn
•
Điện di sản phẩm cắt trên gel
•
Làm biến tính DNA
•
Chuyển DNA lên màng lai
•
Lai DNA đã được cố định với mẫu dò DNA có đánh dấu
•
Định vị các phân tử lai DNA-mẫu dò.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.2.1 Phương pháp Southern blot
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.2.2 Phương pháp Nouthern blot
Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi
nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò
được gắn với enzyme thì đem ủ với cơ chất không màu.
Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩm không
màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát
hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp.
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH
2.2.2 Phương pháp Nouthern blot
Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp
43CNSH