sản xuất protease từ bacillus subtilis s5

MỞ ĐẦU:
-Protease là nhóm enzyme được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực như: Nông
nghiệp, Công nghiệp, Thực phẩm
-Nghiên cứu về protease vẫn còn là một lĩnh vực mới mẻ nhưng có rất nhiều triển
vọng ở nước ta.
-Có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật, từ nội tạng
động vật, từ vi sinh vật. Trong đó thu nhận protease từ vi sinh vật nhất là từ vi khuẩn
Bacilus Subtilis có nhiều triển vọng vì B.subtilis có khả năng sản xuất protease có hoạt
tính cao và có nhiều ưu thế hơn hẳn.
I/ TỔNG QUAN:
1/Sơ lược về vi khuẩn B.Subtilis:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi:Bacillus
B. subtilis là trực khuẩn Gram dương có
kích thước 2-3 x 0,7-0,8 µm, nội bào tử ở
trung tâm có kích thước 1,5-1,8 x 0,8µm.
Trực khuẩn có ở mọi nơi trong tự nhiên
và khi điều kiện sống gay go, chúng có khả
năng tạo ra bào tử gần như hình cầu, để tồn tại trong trạng thái "ngủ đông" trong thời
gian dài. Ở điều kiện 100
o
C, bào tử của B.subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định
cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ. Loại sinh vật
này có cực kỳ nhiều loài khác nhau, trong đó đa số là vô hại.
Bacillus là vi khuẩn catalase dương tính, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron
khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình
dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval

có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của
giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng.
Hai loài được xem là quan trọng về mặt y học là Bacillus anthracis (gây ra
anthrax) và Bacillus cereus (có thể gây ra một dạng bệnh từ thực phẩm tương tự
Staphylococcus). Hai loài nổi tiếng làm hỏng thức ăn là Bacillus subtilis và Bacillus
coagulans. B. subtilis là một sinh vật hiếu khí sống ký sinh có bào tử có thể sống sót
trong độ nóng cùng cực thường thấy khi nấu ăn. Nó chính là tác nhân làm cho bánh mì
hư. B. coagulans có thể phát triến đến tận mức và gây ra vị chua nặng ở thức ăn đóng
hộp bị ôi (bao gồm cả các thức ăn có tính acid mà bình thường có thể khống chế sự
phát triển của đa số vi khuẩn ở mức thấp nhất). Ấu trùng Paenibacillus gây ra các
chứng bệnh của ong mật ở ong mật.
2/Giới thiệu chung về protease:
Cấu trúc của protease
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh
vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ).
So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt.
Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme
rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới
dạng tinh thể đồng nhất.
Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-
NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin.
Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein
Sơ đồ phân loại protease
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi

polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác
của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm
chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase.
Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)
Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)
Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Aminopeptidase
Carboxypeptidase
Serine proteinase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase
Metallo proteinase
Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin
BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính
đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin,
một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường
hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin.
Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường
hoạt động mạnh ở pH trung tính.

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường
hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease
của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao, cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng,
chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein.
Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so
với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng, có khả năng ái lực cao đối với các
amino acid ưa béo và thơm.
3/Đặc tính của enzyme protease chiết tách từ B.subtilis S5:
Khối lượng phân tử 20.000-30.000.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11.
Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12 .
Có pHopt :6.0÷6.5, topt: 55
o
C và không bền ở nhiệt độ từ 60
o
C trở lên.
Muối ăn có thể làm giảm hoạt tính của protease B.Subtilis S5 và nồng độ muối
ăn càng cao thì mứa độ giảm hoạt tính càng mạnh.
Các chất làm giảm hoạt độ của protease DC (dịch chiết ) và CPE (chế phẩm
enzyme ) là: Zn
2+
, Cd
2+

, Ba
2+
, Cu
2+
, Pb
2+
, Hg
2+
, CN
-
, H
2
O
2
, EDTA, trong đó Hg
2+
và
EDTA làm giảm tới trên 90%, còn Mg
2+
và Mn
2+
làm tăng nhẹ hoạt độ CPE, 2-
Mecraptoethanol và L-cystein làm tăng rõ rệt hoạt độ của protease CPE nhưng ảnh
hưởng rất ít đến hoạt độ protease DC.
Protease CPE tủa bởi ethanol nồng độ 75%.
Protease B.Subtilis S5 kém bền với nhiệt so với các protease tứ thực vật và bển
hơn protease nấm mốc.
4/Phương pháp và điều kiện nuôi cấy:
a/Phương pháp:
Nuôi cấy bán rắn trong điều kiện có thông gió và giữ ẩm theo ba phương pháp:

• Phương pháp 1: bề mặt khay nuôi không phủ vải ẩm
• Phương pháp 2: bề mặt các khay nuôi được phủ vải ẩm
• Phương pháp 3: bề mặt khay nuôi phủ vải ẩm và sau bốn giờ nuôi phun
hơi nước qua máy thổi khí vào phòng nuôi để tạo độ ẩm
Ảnh hưởng của phương pháp giữ ẩm tới hoạt độ protease B.Subtilis S5
thu được trong canh trường .
Từ kết quả trên ta thấy phương pháp phủ vải ẩm trên bề mặt canh trường nuôi
và phủ vải ẩm là phương pháp thích hợp nhằm giữ ẩm cho canh trường nuôi B.Subtilis
S5 để sản xuất protease.
b/Điều kiện nuôi cấy:
Môi trường nuôi cấy: Bột bắp, cám gạo, khô dầu lạc và khoáng chất như:NaCl,
CaCO
3
, DAP.
Nhiệt độ nuôi ban đầu là 30-32
o
C.
Ảnh hưởng của thông gió tới hoạt độ protease thu được.
Thời gian (giờ) 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53
Hoạt độ protease
( UI/g )
5.0 8.0 12.5 17.5 23.5 31.5 33.2 33.1 32.0 29.5
Ảnh hưởng của thời gian tới hoạt độ protease thu được.
Thời gian nuôi cấy 41 giờ trong điều kiện thông gió và giữ ẩm.
pH: 7
II/QUY TRÌNH:
Phương
pháp
Hoạt độ protease
( UI/g canh trường)

Trạng thái của canh trường
1 20.2 Bề mặt canh trường bị khô, nứt, vi khuẩn mọc trắng
phía dưới còn ở phía trên thì không mọc.
2 21.1 Tương tự như trên
3 28.2 Bề mặt canh trường không bị khô, khối canh trường
nóng, ẩm, mềm, vi khuẩn mọc trắng cả trên và
dưới.
Phương
pháp
Hoạt độ protease
( UI/g canh trường)
Trạng thái của canh trường
Không
thông gió
19.3 Nhiệt độ canh trường nuôi có thể lên đến 55
o
C, vi
khuẩn phát triển kém, canh trường rời rạc.
Thông gió 28.6 Nhiệt độ canh trường nuôi tối đa lên tới 45
o
C, vi
khuẩn mọc trắng cả trên và dưới, canh trường dẻo
dính.
1/Quy trình:
Gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn nuôi cấy và giai đoạn tinh sạch.
Giai đoạn nuôi cấy và thu canh trường Protease
Nước 80% so
với nguyên
liệu
Bột bắp+khô

dầu lạc+cám
gạo
Khoáng hỗn
hợp
Hấp 100
o
C
trong 2 giờ
Làm nguội
đến 37
o
C
Đổ lên khay
Nuôi 41 giờ
ở nhiệt độ
Đánh tơi
Thu bột canh
trường chứa
protease
Xay mịn
Giống
B.Subtilis S5
dùng để sx
enzyme
Giống
B.Subtilis S5
S5
Hoạt hóa giống
Nhân giống
Sấy khô ở

50
o
C
Chế phẩm
enzyme thô đem
sử dụng
Bã
Thức ăn
gia súc
Ethanol
75%
Enzyme
bán tinh
khiết
Nước 4-5
phần
Nghiền mịn
Trích ly
Lọc
Kết tủa
Thu nhận kết tủa
Sấy kết tủa
Sắc kí lọc gel
Enzyme
tinh
khiết
bột canh
trường chứa
protease
Quá trính tinh sạch enzyme

Chất trợ
nghiền
Giải thích quy trình:
a/nuôi cấy:
Nhân giống B.Subtilis S5: giống B.Subtilis S5 phân lập từ tự nhiên và được bảo
quản ở 5
o
C trên môi trường giữ giống có thành phần: agar 2%, cao thịt 0,5%, peptone
0,5%, NaCl 0,25%.
Chuyển giống B.Subtilis S5 vào môi trường hoạt hóa có thành phần: agar 2%,
cao thịt 0,5%, pepton 0,5%, NaCl 0,25%, tinh bột 1% và nước chiết giá đậu
xanh(200g/lít). Sau khi hoạt hóa 48 giờ, cấy giống sang môi trường nhân giống có
thành phần: dịch chiết cám 20%, dịch thủy phân khô dầu lạc 10%, NaCl 0,36%, MgSO
4

0,05%, CaCO
3
0,6%, pH = 7.Trước khi cấy giống, hấp và khử trùng môi trường nhân
giống bằng hơi bão hòa ở áp suất 1atm trong thời gian 30 phút. Quá trình nhân giống
tiến hành trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút, sau 24 giờ kiểm tra giống đang lắc cấy
trên môi trường hoạt hóa sau 24 giờ thấy giống mọc tốt, đều không có khuẩn lạc là
được. Sau khi nhân giống ly tâm thu B.Subtilis S5 dùng để sản xuất enzyme.
Sản xuất protease từ B.Subtilis S5:
Môi trường nuôi B.Subtilis S5 sản xuất protease (152,19kg/mẻ) có thành phần
như sau: bột bắp xay mịn 70kg, cám gạo 30kg, khô dầu lạc (45% protein) 50kg, NaCl
540g, CaCO
3
900g, DAP 750g, pH = 7. Khoáng DAP pha trong 80% nước so với
nguyên liệu, điều chỉnh pH= 7, trộn với nguyên liệu sau đó hấp ở 100
o

C trong 2 giờ, làm
nguội đến nhiệt độ 37
o
C và cấy giống theo tỉ lệ 5% so với nguyên liệu. Sau khi đã trộn
giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, mỗi khay khoảng 12
kg, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết
kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ
thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí.
Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán
rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn
bộ khối môi trường.
Trong quá trình sản xuất bề mặt các khay nuôi được phủ vải ẩm và sau 4 giờ
nuôi bắt đầu phun hơi nước để tạo độ ẩm cho phòng nuôi vào khoảng 90÷100%. Nuôi
trong điệu kiện thông gió với mục đích đuổi CO
2
, giải nhiệt và cung cấp oxy cho vi
khuẩn.
Sau 41 giờ nuôi ở nhiệt độ phòng thu canh trường chứa enzyme.
b/thu nhận sản phẩm:
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được bột canh trường chứa enzym
protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym
ra, chúng còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường).
Để đảm bảo cho chế phẩm enzym protease không bị mất hoạt tính nhanh người
ta thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng ở
đây là máy sấy chân không). Độ ẩm cần đạt được sau khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ
hơn10% độ ẩm. Để đảm bảo hoạt tính enzym không thay đổi người ta thường sấy ở
nhiệt độ 38-40
o
C . Enzyme protease của B.Subtilis sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên đến
60-70

o
C.
Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần
phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm
sạch enzym. Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau:
Toàn bộ khối lượng enzym thô protease được đem đi nghiền nhỏ.Mục đích của
qúa trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế
phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ ,các enzym nội bào chưa thoát ra khỏi tế
bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzym protease ngoại bào khi được tổng
hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi ta nghiền
nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn.
Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường
hợp này đượcdùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ
không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát
thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100
o
C để
loại bỏ nước và tiêu diệt VSV.
c/Trích ly:
Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym protease. Các loại
enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như
một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần
nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc
( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc
ăn).
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước,
các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách
enzym ra khỏi vật chất này.
d/Quá trình kết tủa enzym protease:
Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ những tác nhân gây

tủa.Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta thường dùng cồn và sunfat amon. Hai
tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác.
Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và
cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất làm kết tủa
enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính.
Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như
sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat
amon.
Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ,
sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7
o
C) theo thời gian, các
enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận
kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W).
Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản
người ta sấy kết tủa enzyme protease ở 40
o
C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W
( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương).
Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn
toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzym ngoài enzym ta quan
tâm.
Máy sấy phun sương
Máy sấy chân không
e/Tách enzyme:
Đã tách chế phẩm protease B.Ssubtilis S5 qua cột lọc gel sephadex G-75 thu
được bốn đỉnh protein kí hiệu: I, II, III, IV và xác định đặc tính của protease tách được
như sau:
Tóm tắt quá trình tinh sạch protease
Sau khi qua cột lọc gel thu được hai dỉnh chính có hoạt độ protease là P-I và P-II

, trong đó P-II chiếm tới 84,3% hoạt độ lên cột và có độ tinh sạch gấp 15 lần DC ban
đầu.
Kết quả nghiên cứu cho thấy ion Ca
2+
và Mg
2+
ở nồng dộ 10
-3
M làm giảm hoạt độ
P-I, nhưng Ca
2+
lại không ảnh hưởng đén hoạt độ P-II. Mn
2+
không ảnh hưởng tới hoạt
độ P-I nhưng lại tăng hoạt độ P-II
P-II có pH
opt
là 6,0 và t
opt
55
o
C.Các chất làm giảm hoạt độ P-II là: Zn
2+
, Cd
2+
,
Ba
2+
, Cu
2+

, Hg
2+
, CN
-
, Fe
2+
, H
2
O
2
và EDTA, trong đó Hg
2+
, H
2
O
2
và EDTA làm giảm
Mẫu Protein(mg) Hoạt độ protease Độ sạch
(lần)
UI % Hoạt độ riêng
(UI/mg protein)
Được 192.55 8.28 100.00 0.043 1.0
CPE 21.33 6.63 80.07 0.311 7.2
P-I 1.48 0.18 2.17 0.122 2.8
P-II 8.69 5.59 67.51 0.643 15.0
tương ứng tới 100%, 97,9% và 98,6%. P-II có tính điển hình của proteinase thiol là: các
chất khử 2-Mecraptoethanol và L-cystein làm tăng hoạt độ P-II tới 200% và 189,7%
đông của enzyme). Như vậy chứng tỏ P-II thuộc nhóm proteinase thiol (proteinase
cystein)theo cách phân loại của Hartley.
Để tiếp tục tìm hiểu về đặc tính của P-II, tiến hành xử lí P-II bằng EDTA với nồng

độ trong hỗn hợp là 6x10
-3
M ở 30
o
C trong thời gian 10 phút.Sau khi xử lí tái hoạt hóa
enzyme bằng 2-Mecraptoethanol, Mg
2+
và Mn
2+.
Kết quả cho thấy sau khi xử lí với
EDTA hoạt độ của P-II gần như giảm hoàn toàn. Nhưng nếu sau đó lại thêm 2-
Mecraptoethanol thì hoạt độ của P-II hồi phục tới 75%, còn nếu thêm Mn
2+
hoặc hỗn
hợp Mg
2+
và Mn
2+
thì hoạt độ enzyme chỉ phục hồi 25% hoạt độ ban đầu. kết quả này
cho thấy P-II cũng cần Mn
2+
để hỗ trợ cho hoạt động của mình.
2/Tách và làm sạch chế phẩm enzyme:
Một điều quan trọng là enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các
enzyme trong tế bào (intracellular), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi
trường sống. Đó là các enzyme ngoài tế bào (extracellular). Enzyme vi sinh vật thường
chiết là enzyme ngoại bào.
Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của
các cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là
phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch.

Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền
với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa
(homogenizator).
Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các
yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như
butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng
tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ.
Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất,
bằng các dung dịch đệm thích hợp ( dung dịch đệm Britton pH6, dung dịch đệm
phosphat pH6 ) hoặc các dung dịch muối trung tính.
Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết đó là
nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết
tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 5
o
C). Các thao tác phải nhanh. Một số chất điện
ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl
2
, CaCl
2
. Tác dụng của chúng còn
phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút.
Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường là các tạp chất có phân tử lượng
thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các
dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử
lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp
biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp
kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp
sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel.
Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên

ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh hưởng lớn
đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thích hợp
không có mặt các chất gây biến hình enzyme.
a/Phương pháp kết tủa:
Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH
4
)
2
SO
4
dựa trên cơ sở sự khác nhau
về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo phần %
nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của
các dịch enzyme. Các loại muối có thể được dùng là (NH
4
)
2
SO
4
, Na
2
SO
4
, MgSO
4

người ta đã nhận thấy muối (NH
4
)
2

SO
4
là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định
(làm bền) hầu hết các loại enzyme. Loại muối này lại rẻ và phổ biến. Độ hòa tan của nó
lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 25
o
C).
b/Phương pháp sắc ký:
Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration)
Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và
phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra.
Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không
phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các
yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc
phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước
(hydrophyl).
c/Phương pháp sắc ký trao đổi ion:
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các
protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản
ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác
nhân trao đổi ion. Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích
nhóm sinh ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có
bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect)
hoặc là chất nhựa polystirol. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa.
Các chất trao đổi ion có chất giá là cellulose, sephadex, molselect thông thường được
dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là polystirol (ví dụ
như Dowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.
d/Phương pháp tách hệ hai pha nước:
Cơ sở kỹ thuật này dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch
hai pha không hòa tan vào nhau. Các hệ hai pha đặc trưng bằng cách trộn các hệ dung

môi vào nhau để tạo thành hai pha riêng biệt. Hệ dung môi được sử dụng trong
phương pháp này có thể là polymer/polymer như: polyethylene glycol (PEG) và dextran
hoặc polymer/muối như PEG và potassium phosphate, sodium sulphate, sodium
phosphate,
Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì
vậy phương pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi
mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein. Hệ hai
pha nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách và tinh sạch các hỗn hợp,
vì phân tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách các chất rắn ra khỏi
các chất lỏng. So với các phương pháp tinh sạch khác thì hệ hai pha nước có một số
ưu điểm hơn như: có độ hòa tan trong nước của hai pha lớn (70-80%), đạt độ tinh sạch
cao, hiệu suất cao, dễ dàng sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử
dụng.
Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân
tử và điện tích của đối tượng nghiên cứu, nồng độ và khối lượng phân tử của các
polymer, nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các loại muối
đa hóa trị như phosphaste hoặc sulphate
Phương pháp tách hệ hai pha nước
Kết quả ngiên cứu cho thấy:
Nước cất là dung môi thích hợp nhất để chiết rút protease.
Dùng ethanol ở nồng độ 75% để tủa thu chế phẩm protease.
Có thể bảo quản chế phẩm protease từ B.Subtilis S5dưới dạng đông khô hoặc hòa tan
trong dung dịch sorbitol có nồng độ ≥ 10%, ở 4
o
C.
III/ĐÁNH GIÁ:
1/Hiệu suất:
Đối với tác nhân tủa khác nhau thì hiệu suất thu hồi cũng khác nhau:
• Đối với ethanol 75%: 5,37%
• Đối với aceton 70%: 3,70%

• Đối với amonisulfat 70%: 2,14%
Kết luận: với tác nhân tủa là ethanol 75% thì hiệu suất thu hồi enzyme cao nhất.
2/Chất lượng:
PEG
PPB







Trộn đều Sau khi
phân tách

tạp chất
PEG: polyethylene glycol
PPB: potassium phosphate buffer
Protease và tạp chất




Sau khi ngừng quá trình nuôi sấy khô ở nhiệt độ 50
o
C thu được canh trường
chứa protease B.Subtilis S5 có hoạt độ enzyme là 33UI/g.
Hoạt độ
protease(UI/g CT)
Hàm lượng protein

(mg Pr /g CT)
Hoạt độ riêng
(UI/mg Pr)
1,63 94,92 0,017
Hoạt độ protease của canh trường vi khuẩn là 1,63UI/gCT (giá trị trung bình).
Tác nhân tủa Hoạt độ
protease(UI/g CT)
Hàm lượng protein
(mg Pr /g CT)
Hoạt độ riêng
(UI/mg Pr)
Ethanol 22,61 318,60 0,072
Aceton 14,29 284,63 0,050
Amonisulfat 6,93 203,44 0,034
Trong các loại chế phẩm protease, chế phẩm có hoạt độ cao nhất là chế phẩm
enzyme được tủa bằng cồn ( 22,61UI/gCPE).
Hàm lượng protein cao nhất ở chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn
96
o
318,60mg/gCPE (giá trị trung bình).
Hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn là cao nhất
0,072UI/mgCPE (giá trị trung bình).
a/Khảo sát theo nhiệt độ:
0
10
20
30
40
50
60

70
0 20 40 60 80 100
NHIEÄT ÑOÄ (ÑOÄ C)
HOAÏT ÑOÄ
(UI/g CPE)
Sự phụ thuộc của hoạt độ chế phẩm protease (tủa bằng cồn) theo nhiệt độ.
Nhận xét: ở 55
o
C chế phẩm proteasse được tủa bằng cồn 96
o
có hoạt độ cao nhất là
63,40UI/g CPE (giá trị trung bình).
-10
0
10
20
30
40
50
0 20 40 60 80 100
NHIEÄT ÑOÄ (ÑOÄ C)
HOAÏT ÑOÄ
(UI/g CPE)
Sự phụ thuộc của hoạt độ chế phẩm protease (tủa bằng aceton) theo nhiệt độ.
Nhận xét: ở 55
o
C chế phẩm proteasse được tủa bằng aceton có hoạt độ cao nhất là
42,88UI/g CPE (giá trị trung bình).
0
5

10
15
20
25
30
35
40
0 20 40 60 80 100
NHIEÄT ÑOÄ (ÑOÄ C)
HOAÏT ÑOÄ
(UI/g CPE)
Sự phụ thuộc của hoạt độ chế phẩm protease (tủa bằng amonisulfat ) theo nhiệt độ.
Nhận xét: ở 55
o
C chế phẩm proteasse được tủa bằng amonisulfat có hoạt độ cao nhất
là 37,33UI/g CPE (giá trị trung bình).
b/Khảo sát theo pH:
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12
pH
HOAÏT ÑOÄ

(UI/g CPE)
Sự phụ thuộc hoạt độ của chế phẩm protease (tủa bằng cồn ) theo pH.
Ở pH 6.0, chế phẩm enzyme protease tủa bằng cồn 96o có hoạt độ cao nhất là
78,45 UI/g CP ( giá trị trung bình ).
IV/ỨNG DỤNG:
1/Công nghiệp thực phẩm:
Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy
phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị
tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt.
Ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định- phương pháp
này phổ biến và thuận lợi nhất.
• Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt).
• Tiêm dung dịch enzyme vào thịt.
• Tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ.
Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách
được chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm
từ da, lông vũ. Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin chứa lưu
huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm giảm
giá trị sinh học của axit amin).
Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền
đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy
người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực
vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân. Ưu điểm của việc thuỷ
phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các
sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân.
Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực
phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.
Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường
thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất
nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản

xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme
thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện
hương vị của nước mắm. Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về
công nghệ.
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt
tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P.
roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát.
Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian
trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.
Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm
tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để
thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
2/Trong công nghiệp da:
Quá trình chế biến da bao gồm một số công đoạn như ngâm ướt, tẩy lông, làm
mềm da và thuộc da. Thông thường các phương pháp thuộc da thường dùng các hóa
chất độc hại như natri sulfide, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến môi trường khi
nước thải của nhà máy này thải ra sông. Việc sử dụng enzyme để thay thế các hóa
chất đã rất thành công trong việc nâng cao chất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi
trường.
Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da,
chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da
các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện
hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân
lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn
(B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S.
griseus, S. rimosus ) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần
chiếm một vị trí quan trọng.
3/Trong công nghiêp dệt:
Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các
sợi nhân tạo được bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được được bóng, dể

nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ
tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy
trắng.
Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản
xuất mỹ phẩm,…
4/Trong chăn nuôi:
Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp
enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi
gia súc và gia cầm.
6/Chất tẩy rửa:
Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại
chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc
răng giả và kem đánh răng. Việc ứng dụng enzyme vào các chất tẩy rửa nhiều nhất là
trong bột giặt. Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửa thường có tính đặc
hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu và các chất do cơ
thể con người tiết ra. Một tiêu chuẩn quan trọng khác của các protease dùng trong chất
tẩy rửa là hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ và pH cao cũng như phải thích hợp với
các tác nhân oxy hóa và các chất kìm hãm có trong thành phần của chất tẩy rửa. Và
tham số đóng vai trò chìa khóa cho việc bổ sung protease nào vào chất tẩy rửa là pI
của chúng. Một protease phù hợp khi pI của nó trùng với pH của dung dịch chất tẩy
rửa. Subtilisin đáp ứng được đầy đủ những yêu cầu khắt khe trên.
Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956
với tên BIO-40. Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên
thương mại là BIOTEX được chiết xuất từ B. licheniformis. Và đến gần đây, tất cả các
protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease được sản
xuất từ các chủng Bacillus (Rao et al., 1998; Thangam and S., 2002), và chủ yếu là từ
B. subtilis. Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành
công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal
mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzyme protease (Gupta et al.,
2002).

7/Các ứng dụng khác:
Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng
sinh,
Do protease kiềm từ Bacillus được tạo thành với lượng lớn, có đặc tính bền
vững, hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều ngành
công nghiệp khác nhau như: xử lý phim X-quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc
(Fujiwara et al., 1991; Ishikawa et al., 1993), làm nước mắm cá (Rebeca et al., 1991),
xử lý chất thải từ động vật giáp xác (Yang et al., 2000), xử lý rác thải trong các lò mổ
gia cầm (Dalev, 1994).
Sản xuất thuốc

Sản xuất xà phòng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Trần Xuân Ngạch (2007), Công nghệ enzym, Trường Đại Học Bách Khoa Đà
Nẵng.
2. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998),
Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh.
3. Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà
Nội.
4. Lưu Thị Nguyệt Minh(2007), “Phân tách Protease của Bacillus Subtilis bằng hệ
hai pha Polyethylene glycol/ Potassium phosphate”, Đồ án tốt nghiệp.
5. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nội.
6. Luận án tốt nghiệp trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQG TP.HCM.
TÀI LIỆU MẠNG
1. />2.
3. />4. />imgurl= />5. />Hàm lượng protein của canh trường vi khuẩn B.Subtilis là 94,92mg/g CT (giá trị
trung bình).