thu nhận enzyme bromelin từ phế liệu dứa

Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
PHẦN NỘI DUNG
I. TỔNG QUAN
I.1 Nguồn nguyên liệu – Phế liệu dứa
I.1.1 Công dụng
 Cây dứa (Ananas comusus) thuộc họ đơn tử diệp, thuộc họ Bromeliaceae có nguồn gốc từ Nam Mỹ.
 Hiện nay, ở nước ta loại dứa đang đựơc trồng nhiều nhất là Ananas comusa được dùng làm nguồn
thực phẩm tươi, đóng hộp, là nguồn thu nhận enzyme và được sử dụng trong một số lĩnh vực như mỹ
phẩm, dược phẩm…
 Phần thân và lá sau khi thu hoạch có thể làm giấy, lấy sợi, làm phân bón…
I.1.2 Thành phần của dứa
Trong quả dứa chín, nước chiếm đa số, hàm lượng 80- 86%, cacbohyrat chiếm 10- 18% (trong đó
saccharose 60- 67%, glucose và fructose chiếm 30- 40%), protein 2- 3%, axit hữu cơ 0.1- 1.6%( axit
citric chiếm 87% và axit maleic chiếm 13%), tro 0.3%, sắc tố 0.03- 0.6% và các hợp chất phenolic( tạo
màu), các hợp chất tạo mùi, các vitamin: A, B1, C… và enzyme bromelin.
I.2 Enzyme bromelin
I.2.1 Đặc điểm
 Bromelin là tên gọi chung của nhóm enzmye thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải
protein được thu nhận từ cây dứa.
 Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa, có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở
pH6-8.
 Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin
trong cây thuộc họ Sung.
 Enzyme bromelin có trọng lựơng phân tử lớn khoảng 33000 Da, lớn 1.5 lần so với papain.
I.2.2 Tính chất của Bromelin
 Thành phần chủ yếu của Bromelin có chứa nhóm sulfhydryl, trong dịch chiết Bromelin có chứa một ít
peroxidase, phospatase acid và chất cản protease.
 Hiện nay người ta ghi nhận trong thân có chứa 8 thành phần cơ bản có hoạt tính thủy phân protein.
 Dịch chiết Bromelin toàn phần hoạt động trong khoảng pH 4,5- 9,8. Bromelin chiết tách từ các bộ
phận khác nhau của cây dứa sẽ có hoạt động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính sinh lý giống nhau.

Bromelin không ổn định với nhiệt độ trong quá trình chiết tách hay điều kiện bảo quản không thích hợp.
 Bromelin có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động vật. Nồng độ cao nhất trong máu được
tìm thấy sau khi ăn 1 giờ nhưng khả năng thủy phân protein bị bất hoạt nhanh chóng có thể do hoạt
động của các prtease nội sinh và yếu tố
linemacroglobu−− 2
α
của huyết thanh.
I.2.3 Cấu tạo hóa học của Bromelin
 Bromelin là một protease nhưng khác papain và ficin vì nó là một glicoprotein, mỗi phân tử có một
glican gồm 3 manose, 2 glucosamin, 1 xylose và 1 fructose. Sợi hydratcacbon liên kết hoán vị với sợi
polipeptid.
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
1
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
 Khi phân tích thành phần amino axit của Bromelin thân và Bromelin quả thì tùy theo phương pháp
thu nhận mà thành phần axit amin khác nhau. Bromelin có thành phần amino axit thay đổi trong khoảng
321- 144 và Bromelin quả là 283- 161 amino axit.
 Bromelin thân có một sợi polipeptid có amino axit ở đầu amin là valine và ở đầu cacbohydrat là
glicine, Bromelin quả có amino axit ở đầu là alanine.
I.2.4 Cấu trúc không gian của Bromelin
 Theo Murachi và Busan, cấu trúc bậc một của Bromelin như sau:
Ser- Val- Lis- Asn- Gln- Asn- Pro- Cys- Gli- Ala- Cys- Tryp-
- Gli- Cys- Lis-

OH
OH
OH
OH
OH

OH
OH
OH
OH
OH
OH
CH OH
2
CH OH
2
CH OH
2
OH
OH
NHCONH
3
NHCONH
3
NHCOCH
2
C
N
CH
CH
2
Fructose
Maltose
Maltose
Maltose
Xylose

Glucofamine
 Bromelin có trung tâm hoạt động chứa Cysteine và 2 sợi polippetid liên kết với nhau bằng cầu nối –S-
S-, phân tứ có hình cầu do cách sắp xếp phức tạp.
 Trong Bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong xúc tác và trong phân tử có 5
cầu nối dislfit, ngoài ra trong phân tử có các ion Zn
2+
có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme.
I.2.5 Tính chất vật lý Bromelin
Hằng số sa lắng S 2,73s
Hằng số khuyếch tán D 7,77x10
-7
cm
2
/s
Thể tích riêng phần V 0,743ml/g
Độ nhớt bên trong [I] 0,039dl/g
Tỷ số ma sát f/f
o
1,26
Điểm đẳng điện Pl 9,55
Sự hấp phụ
%1
cm
A
ở 280nm
20,1
Trọng lượng phân tử 33.200(tính bằng phương pháp sa lắng- khuyếch
tán)
32.100(tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang

2
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
trong)
35.500(tính bằng phương pháp Archibald)
I.2.6 Hoạt tính của Bromelin
I.2.6.1 Hoạt tính phân giải
 Bromelin có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase.
 Bromelin thân có nhiều cơ chất tự nhiên và có thể phân giải cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp.
• Khả năng phân giải cơ chất tự nhiên của Bromelin
Đối với cơ chất là Casein, hoạt tính phân giải của Bromelin thân cao hơn Bromelin quả xanh và Bromelin quả
chín.
Cơ chất Hoạt tính phân giải Casein (UI/mg)
Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín
Casein 7.4 4.0 3.0
• Khả năng phân giải cơ chất nhân tạo của Bromelin
Cơ chất Hoạt tính phân giải (UI/mg)
Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín
Benzoyl-L-Arginine amid 3.7 9.1 7.2
Ở nhiệt độ 5
O
C, pH= 6
Benzoyl-L-
Arginine amid
Benzoyl-L-Arginine
ethyl ester
Benzoyl-L-Arginine
methyl ester
Bromelin thân 1.2x10
-3

1.7x10-
1
3.2x10
-2
(hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau)
I.2.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của Bromelin
• Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những cơ chất khác nhau thì hoạt tính của Bromelin khác nhau.
 Ví dụ: Nếu cơ chất là hemoglobin thì Bromelin phân giải mạnh hơn papan 4 lần.
Nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của Bromelin tương tự papain
Nếu là cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải của Bromelin yếu hơn papain.
• Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian
tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ thay đổi là ảnh hưởng đến hoạt tính, nồng độ, dạng tồn tại của
enzyme, nồng độ cơ chất.
 Ví dụ: Ở dịch chiết quả (pH=3.5) khi tăng nhiệt độ lên 60
O
C, Bromelin vẫn còn hoạt tính nhưng
Bromelin tính khiết lại rất nhạy cảm với nhiệt độ.
Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính.
• Ảnh hưởng bởi pH: pH tối thích của Bromelin không ổn định mà tùy thuộc nhiệt độ, thời gian phản
ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự có mặt của
chất tăng hoạt tính. Bromelin có biên độ pH rộng 3- 10 nhưng pH tối thích của enzyme là 5- 8 tùy cơ
chất.
 Ví dụ: Bromelin thân đã tinh sạch 1 phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6 và pH 8, ổn định ở pH 3.5 – 5.6
với nhiệt độ 63
O
C
• Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến Bromelin vì chúng thừơng gắn vào
trung tâm hoạt động của enzyme.
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
3

Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
 Ví dụ: Muối thủy ngân ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của Bromelin và mức độ kìm hãm tùy vào
nồng độ muối.
Các ion kim loại: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử của Bromelin.
• Ngoài ra, Bromelin còn bị ức chế bởi các ion hay các hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm –SH, các tác
nhân oxi hóa, halogen, ankyl hóa, …:iodoacetate, bromoacetate, methyl bromur…
• Ảnh hưởng bởi trạng thái và điều kiện bảo quản:
Hoạt tính (UI/mg protein)
Dịch chiết Đông khô
Nguyên liệu tươi 1.600 1.150
Bảo quản ở 4
O
C trong 5 ngày 830 630
Sấy khô ở 4
O
C 1.880 1.360
I.2.7 Cơ chế tác động của Bromelin
 Casein và hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất.
 Đầu tiên, Bromelin kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polipeptid và axit amin. Proetein kết
hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazone khử ester giải phóng enzyme,
axit amin và peptid.
 Ở giai đoạn đầu, Zn
2+
kết hợp với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động hình thành mercaptid phân li yếu
( nhưng vẫn có khả năng tạo liên kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của protein: amin,
cacboxyl,…)
Enzyme-SH + Zn
2+
 Enzyme-S-Zn + H

+
 Nhóm –SH trong trung tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gian được bảo vệ
ổn định.
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
4
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
II. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ THU NHẬN BROMELIN TỪ PHẾ LIỆU DỨA
II.1. Các phương pháp thu nhận
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
5
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
II.2. Giải thích quá trình thu nhận:
II.2.1. Xử lý nguyên liệu thu dịch enzyme thô:
 Enzyme bromelin có thể thu được trong thân, trong phần thịt quả và trong chồi quả.
 Phế liệu dứa ( chồi, vỏ, thân, cùi dứa ) được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc.
 Sau đó đem dịch lọc li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để lọai bỏ chất sơ sẽ thu được
dịch chiết có chứa Bromelin.
 Khi sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh sạch enzyme bromelin thì các hợp chất pectin trong dịch
chiết quả sẽ làm tăng độ nhớt của dịch chiết làm trở ngại quá trình lọc.
Vì vậy người ta có thể dùng phương pháp đồng hóa nguyên liệu dưới điều kiện áp suất cao thì có thể
phá vỡ tế bào mô dứa, giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzyme nội bào, mà không làm
biến tính chúng.
 Khi đồng hóa nguyên liệu ở 15Mpa:
Đô nhớt trong dịch chiết giảm xuống, giá trị độ brix và pH thay đổi không đáng kể, sản lượng và họat
tính của enzyme gia tăng, sản lượng enzyme tăng gấp 2 lần (1.27g/500mL dịch chiết từ quả dứa kể
cả phần lõi) với họat tính cao nhất là 2.06 UI/mg
2
.

 Khi đồng hóa nguyên liệu ở 20Mpa :
Sản lượng enzyme thu được từ vỏ quả là 0.9g/500mL dịch chiết.
II.2.2. Các phương pháp thu tủa Bromelin thô:
II.2.2.1. Phương pháp kết tủa:
 Nguyên tắc : Điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH=7 nên trong điều kiện sinh lý, các phân
tử protein tích điện âm thừa kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở
trong dung dịch, protein liên kết với một lượng nước khá lớn) hoặc với các ion dương. Sự kết hợp với
nước tạo ra một lớp nước xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng.
 Để có thể kết tủa được enzyme phải phá vỡ lớp nước liên kết bằng cách bổ sung vào dung dịch
protein enzyme các dung môi hoặc các hóa chất có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra
khỏi phân tử protein, giúp cho protein tủa xuống.
 Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa bromelin là: Acetone và ethanol,… có tác dụng làm
giảm hằng số điện môi của dung dịch nên làm giảm độ hòa tan của protein.
 Các hóa chất khác như muối trung tính ở nồng độ cao ( vì có độ hòa tan rất tốt ). Ở nồng độ muối
thấp, đa số các protein và enzyme có độ hòa tan lớn nên chỉ có một số tạp chất kết tủa. Khi tăng dần
nồng nồng độ muối thì có hiện tượng tranh giành lớp vỏ hirat của prtein làm các protein gắn kết lại
với nhau và tủa xuống. Ở nầng độ muối bão hòa thì toàn bộ các prtein và enzyme bị kết tủa.Muối của
các ion hóa trị II tủa protein tốt hơn các muối của các ion hóa trị I, các muối thường dùng là:
(NH
4
)
2
SO
4
, MgCl
2
vì rẻ tiến và dễ tìm.
II.2.2.1.1.Tủa bằng ethanol:
 Làm lạnh dung dịch nước dứa sau li tâm, cho ethanol 96
0

(đã được làm lạnh) vào theo tỷ lệ 4
nước dứa: 1 cồn, trộn đều ở 0
0
C trong 3- 4 giờ.
 Li tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút và tủa bằng acetone rồi thu nhận
Bromelin thô.
 Dẫn chứng bằng một số kết quả từ thực nghiệm:
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
6
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng:
Khảo sát tỷ lệ dịch enzyme và cồn 96
O
C
** Cách thực hiện
Dịch enzyme và cồn 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6
Thể tích dịch enzyme
(ml)
50 50 50 50 50 50
Thể tích cồn (ml) 50 100 150 200 250 300
** Kết quả:
Tỷ lệ Hàm lượng protein Hoạt tínhbromelin Hoạt tính riêng
µ
g/g
mg/g UI/g UI/mg
1:1 162821 162.821 1105.04 6.0
1:2 179060 179.06 1267.88 7.09
1:3 201282 201.282 1253.66 6.24
1:4 223932 223.932 1182.55 5.28

1:5 230342 230.342 1148.41 5.01
1:6 220940 220.94 1097.21 4.97
** Nhận xét và kết luận: Lượng tác nhân tủa càng nhiều thì hàm lượng protein thu được càng nhiều, tủa
bằng tỷ lệ 1:5 hàm lượng prtein cực đại; nhưng sau đó hàm lượng giảm do lượng tác nhân nhiều làm
hẳng số điện môi giảm, các prtein tự tháo gỡ liên kết. Hoạt tính Bromelin cực đại ở tỷ lệ 1:2.
Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở tỷ lệ 1:2:
t
O
C 27 37 47 57 67 77
UI/g 1370.99 1460.58 1530.98 1346.81 1183.26 989.84

GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
7
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính Bromelin
** Nhận xét và kết luận: Khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi nhiệt độ tăng tới
hạn thì hoạt tính Bromelin giảm dần do bị biến tính. Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng cồn 96
O
C tỷ
lệ 1:2 ở nhiệt độ 47
O
C.
Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở tỷ lệ 1:2:
pH 5 6 7 8 9 10
UI/g 105.24 1460.58 850.47 757.31 717.49 701.14
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính Bromelin
** Nhận xét và kết luận: : Khi pH tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi pH tăng tới hạn thì hoạt
tính Bromelin giảm dần do bị biến tính, tuy nhiên ảnh hưởng không đáng kể như ảnh hưởng của nhiệt
độ. Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng cồn 96

O
C tỷ lệ 1:2 ở nhiệt độ 47
O
C pH 7.
II.2.2.1.2. Tủa bằng acetone:
 Thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào một dung dịch nước dứa sau li tâm, để
yên trong một giờ ở nhiệt độ 0- 4
0
C.
 Li tâm với tốc độ 6000vòng/phút trong 5 phút, lọai bỏ tủa.
 Thêm hai thể tích acetone lạnh vào để 1 giờ ở 0- 4
0
C, li tâm thu tủa, rửa tủa bằng acetone lạnh.
 Chú ý:
 Bromelin trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó để sự
kết tủa đạt hiệu quả cao thường tiến hành quá trình kết tủa trong điều kiện lạnh (0
0
c – 4
0
c).
 Sau khi thu được tủa thì rửa sạch tủa bằng acetone và làm khô thật nhanh để
Bromelin không bị biến tính.
 Dẫn chứng bằng một số kết quả từ thực nghiệm:
 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng:
Khảo sát tỷ lệ dịch enzyme và aceton:
** Cách thực hiện
Dịch enzyme và aceton 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6
Thể tích dịch enzyme
(ml)
50 50 50 50 50 50

Thể tích cồn (ml) 50 100 150 200 250 300
** Kết quả:
Tỷ lệ Hàm lượng protein Hoạt tínhbromelin Hoạt tính riêng
µ
g/g
mg/g UI/g UI/mg
1:1 200857 200.857 1354.63 6.74
1:2 209402 209.402 1550.18 7.41
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
8
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
1:3 214106 214.106 1708.75 7.98
1:4 203846 203.846 1806.17 8.87
1:5 200427 200.427 1865.48 9.34
1:6 198291 198.291 1632.67 8.23
** Nhận xét và kết luận: Lượng tác nhân tủa càng nhiều thì hàm lượng protein thu được càng nhiều, tủa
bằng tỷ lệ 1:5 hàm lượng prtein cực đại; nhưng sau đó hàm lượng giảm do lượng tác nhân nhiều làm
hẳng số điện môi giảm, các prtein tự tháo gỡ liên kết. Hoạt tính Bromelin cực đại ở tỷ lệ 1:5.
Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở tỷ lệ 1:5:
t
O
C 27 37 47 57 67 77
UI/g 1316.23 1652.58 1847.42 1654.00 1383.79 936.51

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính Bromelin
** Nhận xét và kết luận: Khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi nhiệt độ tăng tới
hạn thì hoạt tính Bromelin giảm dần do bị biến tính. Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng aceton tỷ lệ
1:5 ở nhiệt độ 47
O

C.
Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở tỷ lệ 1:5:
pH 5 6 7 8 9 10
UI/g 143.64 1118.55 1273.99 966.37 795.71 673.4
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
9
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính Bromelin
** Nhận xét và kết luận: : Khi pH tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi pH tăng tới hạn thì hoạt
tính Bromelin giảm dần do bị biến tính, tuy nhiên ảnh hưởng không đáng kể như ảnh hưởng của nhiệt
độ. Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng aceton tỷ lệ 1:5 ở nhiệt độ 47
O
C pH 7.
II.2.2.1.3. Tủa bằng muối ammonium sulfate (NH
4
)
2
SO
2
:
 Cách thực hiện
 Chuẩn bị 1 lít dung dịch nước
dứa sau li tâm cho từ từ 532g ammonium sulfate vào
khuấy đều (dung dịch đạt độ bão hòa ammonium sulfate
là 70%).
 Để yên ở nhiệt độ phòng 10-
15 phút, sau đó đem li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút để
thu nhận tủa.
Sự kết tủa protein bằng ammonium sulfate (đặc biệt là ở nhiệt độ thấp) là một quá trình thuận nghịch,

tủa dễ hòa tan bằng nước và muối có thể được lọai ra khỏi protein bằng cách thẩm tích.
Phương pháp này có thể thực hiện ở nhiệt độ thường.
 Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng của chế phẩm enzyme là:
 Nồng độ của ammonium sulfate
 pH của dung dịch chiết
 Nhiệt độ kết tủa
 Thời gian tiếp xúc của các tác nhân đệm và dịch tiết
Thông thường nếu sử dụng phương pháp tủa với (NH
4
)
2
SO
2
thì cứ 60Kg nguyên liệu tươi thì thu được
khỏang 1 Kg Bromelin thô.
 Dẫn chứng bằng một số kết quả từ thực nghiệm:
 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng:
Khảo sát tỷ lệ dịch enzyme và aceton:
** Cách thực hiện
Dịch enzyme và (NH
4
)
2
SO
4
1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6
Thể tích dịch enzyme (ml) 50 50 50 50 50 50
Thể tích cồn (ml) 50 100 150 200 250 300
** Kết quả:
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang

10
Các phân tử enzyme trong dung môi hữu cơ.
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
Tỷ lệ Hàm lượng protein Hoạt tínhbromelin Hoạt tính riêng
µ
g/g
mg/g UI/g UI/mg
1:1 134615 134.615 993.66 6.94
1:2 167521 167.521 1294.90 7.73
1:3 180342 180.342 1395.16 7.74
1:4 190598 190.598 1465.56 7.69
1:5 199145 199.145 1395.87 7.01
1:6 220513 220.513 1311.97 5.95

** Nhận xét và kết luận: Lượng tác nhân tủa càng nhiều thì hàm lượng protein thu được càng nhiều,
trong trường hợp tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4
ngoài protein còn có lượng muối dư do nồng độ quá cao nên hàm
lượng tăng dần đến 100%. Hoạt tính Bromelin cực đại ở nồng độ(NH
4
)
2
SO
4
80%.

Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
80% :
t
O
C 27 37 47 57 67 77
UI/g 1323.34 1397.30 1479.07 1383.79 1090.82 1020.42

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính Bromelin
** Nhận xét và kết luận: Khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi nhiệt độ tăng tới
hạn thì hoạt tính Bromelin giảm dần do bị biến tính. Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4

80% ở nhiệt độ 47
O
C.
Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của Bromelin ở nồng độ (NH
4
)
2
SO
4

80%:
pH 5 6 7 8 9 10
UI/g 102.40 473.59 856.87 646.38 393.23 300.79
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
11
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính Bromelin
** Nhận xét và kết luận: : Khi pH tăng thì hoạt tính của enzyme tăng nhưng khi pH tăng tới hạn thì hoạt
tính Bromelin giảm dần do bị biến tính. Hoạt tính Bromelin cực đại khi tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4
80% ở nhiệt
độ 47
O
C, pH 7.
 So sánh hiệu quả giữa 3 phương pháp:
Tác nhân tủa Hàm lượng protein (mg/g) Hoạt tính Bromelin (UI/g) Hoạt tính riêng (UI/mg)
Cồn 96
O
C 230.24 1267.88 7.09
Aceton 214.10 1864.48 9.34
(NH
4
)
2
SO

4
220.51 1465.56 7.69

Trong 3 phương pháp thì tủa bằng Aceton cho hiệu quả cao nhất.
II.2.2.2. Phương pháp hấp phụ:
II.2.2.2.1. Hấp phụ bằng Kaolin:
Kaolin: là một chất có tính hấp phụ tốt
 Kích thước hạt nhỏ hơn 1 µm do diện tích tiếp xúc giữa
hạt kaolin và chất bị hấp phụ tăng lên rất nhiều.
 Trên bề mặt kaolin có rất nhiều ion OH
-
và O
2-
, những
ion này có khả năng liên kết tương đối bền vững với chất
bị hấp phụ.
 Cách thực hiện:
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
12
Cấu tạo của Kaolin
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
 Cho kaolin khô ( hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau li tâm với tỉ lệ 25 mg
kaolin/ml dung dịch nước dứa.
 Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó li tâm để thu tủa, tủa được gọi là bromelin-kaolin
II.2.2.2 Hấp phụ bằng Bentonit
Nguyên tắc và cách tiến hành tương tự cách hấp phụ bằng Kaolin
II.2.2.3. Phương pháp siêu lọc:
 Định nghĩa:
Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua màng lọc dưới mp65t áp suất để tách phân đoạn các thành

phần trong chất lỏng đó. Sự phân chia các công đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng. Tuỳ theo
kích thước của lỗ trên màng và trọng lượng phân tử của chất thấm qua và kích thước của lỗ trên màng mà
thu được nước và những chất có phân tử nhỏ, còn những chất có phân tử lớn sẽ bị giữ lại trên màng.
 Cấu tạo màng siêu lọc:
 Màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi rỗng. Trong
mỗi sợi rỗng lại có nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn
chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm
qua.
 Các sợi này được chế tạo từ cáac loại polime (FS),
cenlulose acetate (CA), polisulphone (GR)… Tuỳ theo mục
đích cụ thể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp.
Ví dụ cô đặc protein (dùng màng FS, GR), cô đặc enzyme (dùng màng GR).
 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc:
Trong quá trình siêu lọc cần chú ý đến các đặc điểm sau:
 Nhiệt độ: phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn nhiệt độ sử dụng cần lưu ý
đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì quá trình này có thể làm
bít màng.
 Áp suất: Thường tốc độ của dòng chảy (số lít chất lỏng qua 1m
2
màng trong 1 giờ) sẽ tăng cùng với
sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt đến giá trị (tốc độ) cực đại. Nếu áp suất tăng lên cao hơn nữa thí
dòng chảy sẽ giảm.
 Tốc độ dòng chảy nên được điều chỉnh từ 4- 5 lít/phút, tương ứng với hiệu suất PI
1
- PI
2
ở trong
khoảng 0,5 – 3bar.
 Áp suất dòng vào lớn nhất (PI
1max

) là 7bar (tương đương 102Psi). Áp suất dòng ra nhỏ nhất (PI
2min
) là
0,5bar (tương đương 7,25Psi).
 Các kiểu siêu lọc : có ba kiểu hệ thống siêu lọc
 Kiểu một bước (single pas operation)
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
13
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
 Kiểu lô (batch operation): Chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ của dung dịch cô đặc ở
trong chậu chứa đạt được như yêu cầu.
 Kiểu thể tích không đổi (constant volume operation) : Dòng chất lỏng được cung cấp liên tục để thể
tích ở trong chậu chứa không thay đổi và chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ dung dịch cô
đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cấu.
 Ưu điểm của phương pháp siêu lọc
 Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể:
 Đối với enzyme: Có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính.
 Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzyme. Trong quá trình thực hiện nếu thêm
nước vào thì độ tinh sạch của enzyme càng cao.
 Trong quá trình siêu lọc, nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme, do đó nhiệt độ thích hợp
nhất là 10 – 20
0
C. Quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp (5
0
C).
 Cách thực hiện: Sử dụng màng FS 50 PP có giá trị loại trừ (cut of) 30.000, diện tích màng 366 cm
2
.
 Đầu tiên dùng phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn.

 Dịch nước dứa sau li tâm được cho qua siêu lọc, trong quá trình này cho nước cất vào để tinh sạch và
thu được dung dịch cô đặc.
 Thu nhận tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc.
II.2.2.4. Phương pháp thu tủa bằng carboxyl methyl cellulose (CMC) :
Phương pháp tách bromelin bằng CMC cho phép thu được bromelin ở dạng bột trắng có hoạt tính cao, thời
gian nhanh và đơn giản hơn so với các phương pháp khác.
 Công nghệ chế tạo CMC:
CMC được chế tạo từ vải màn, bông, vải gạc loại tốt.
 Cân 300g bông hay vải màn hay gạc ngâm trong 2000 mL dung dịch NAOH 45% trong 10 phút, thỉnh
thoảng cho monochloacetic 15% cho vào (4 lần), vừa cho vừa đảo trộn đều.
 Đun cách thuỷ hỗn hợp ở 60
0
C trong 30 phút, sau đó làm sạch bằng nước đá đến khi dung dịch có
màu vàng.
 Thêm vào từ từ 100 ml dung dịch acid acetic 10%. Sau 2 giờ pha loãng với nước cất đến 20 lít.
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
14
NaOH ClCH2COOH
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
 Để yên, gạn bỏ rồi thêm nước như trên đến phản ứng trung tính. Nếu còn kiềm thì ngâm tiếp với
dung dịch acid acetic, rồi rửa loại acid.
 Ngâm trong H
2
SO
4
0,1N trong thời gian 48 giờ, sau đó rửa bằng nước cất đến pH trung tính, sấy khô
ở 50
0
C. Quá trình phản ứng xảy ra như sau:

Vải màn Alcalicellulose Carboxyl methyl cellulose(CMC)
 Ưu điểm:
 Hiệu suất đạt được 0.1% so với chồi dứa tươi và có hoạt tính 24 nK/mg chế phẩm enzyme.
 So với tủa (NH
4
)
2
SO
4
thì độ sạch của chế phẩm enzyme cao hơn 2 lần, thời gian nhanh và tiến hành
thuận lợi hơn.
 Cách thực hiện:
 CMC vải màn được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphate 0.005M, pH = 6.1, sau đó cho dịch chiết
dứa vào thỉnh thoảng khuấy trộn.
 Sau 2 giờ tháo ra vắt kiệt, vẩy sạch chất bẩn bám vào CMC, rửa protein bằng đệm phosphate 0.05M,
pH = 6.5.
 Sau đó tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ nhất, cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm
phosphate (0.05M, pH 7.1 và NaCl), khuấy trộn 3- 4 lần. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung dịch
đậm đặc chứa bromelin.
 Tiếp tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai như lần thứ nhất. Sau đó gộp cả dịch chiết lại và tủa bằng
acetone hay cồn lạnh để thu tủa enzyme.
 Sấy phun thu enzyme thô:
Sấy phun là kỹ thuật chuyển từ 1 dung dịch, huyền phù hay nhũ tương thành dạng bột.
Nguyên tắc hoạt động: quá trình sấy phuntrải qua 4 bước:
* Mẫu dạng lỏng  dạng phun sương, các hạt chất lỏng có đường kính 20
µ
m, diện tích bề mặt
3000cm
2
/ml.

* Các hạt phun sương tiếp xúc với không khí nóng, hơn 90% hơi nước bị bay đi.
* Làm khô các hạt phun sương.
* Tách sản phẩm ở dạng bột khỏi luồng khí.
 Sấy phun thu enzyme thô dẫn chứng bằng kết quả từ thực nghiệm:
 Hàm lượng protein và hoạt tính Bromelin trước và sau khi sấy phun:
Kết quả:
Tên Hàm lượng protein Hoạt tínhbromelin Hoạt tính riêng
µ
g/g
mg/g UI/g UI/mg
Dịch chiết 7136.5 71.37 118.17 1.66
Tủa bằng aceton
trước khi sấy phun
197009 197.01 1819.57 9.24
Sau sấy phun 217521 217.52 2097.78 9.64
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
15
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
Nhận xét: Hoạt tính Bromelin sau sấy phun chỉ cao hơn trước sấy phun 1.15 lần nhưng lớn hơn
hoạt tính của dịch chiết khoảng 17.75 lần.
II.2.3. Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin
II.2.3.1. Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích
 Cân 1 gam enzyme thô, pha trong 10 ml dung dịch đệm sodium phoshat 0.03M có pH 7.2.
 Sau khi enzyme đã hoà tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane (đã trán đầy bằng dung dịch đệm) rồi
đặt vào cốc có chứa 1 lít dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M, pH 7.2.
 Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ 2 giờ thay dung dịch đệm bên ngoài 1 lần. Dung dịch đệm phía
ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ.
 Người ta thường tiến hành tinh sạch enzyme ở nhiệt độ thấp để làm giảm sự biến tính của enzyme,
vì: khi thay đổi nhiệt độ trong một giới hạn nhất định thì vận tốc khuếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng

nhiệt độ, nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ vượt quá mức cho phép thì protein enzyme sẽ bị biến tính ảnh
hưởng đến những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzyme.
II.2.3.2. Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex
II.2.3.2.1. Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G- 50
 Sephadex G- 50 được đun cách thuỷ ở 100
0
C trong 1 giờ và nhồi vào cột (kích thướt cột 23.5x0.9cm).
 Đặt một cái phễu thuỷ tinh phía trên cột, cho Sephadex từ từ vào phễu và khuấy liên tục. Các hạt sẽ
lắng xuống cột, phải khuấy từ từ đến khi nhồi xong cột, nhồi sao cho nồng độ hạt đồng nhất và không có
bọt khí. Trong quá trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong 1 giờ, với vận tốc khoảng 1ml/7 phút.
 Cách thực hiện:
 Cân 100 mg enzyme thô hoà vào 1 ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M, pH 7.2. Khi enzyme
đã hoà tan hoàn toàn thì cho từ từ vào cột.
 Sau đó cho dung môi phân li enzyme qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7phút.
 Loại bỏ 5 ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme. Dịch enzyme thu nhận được làm đông khô.
 Quá trình lọc enzyme qua sephadex G-50 được tiến hàng 1 giờ trong điều kiện thấp để giảm thiểu sự
biến tính của enzyme.
II.2.3.2.2. Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G- 100
 Sephadex G- 100 được đun cách thuỷ ở 100
0
c trong 5 giờ, sau đó nhồi vào cột kích thước 28x1cm.
 Thực hiện nhồi cột tương tự như thực hiện với sephadex G- 50.
 Sau khi hoàn tất việc nhồi cột, cho dung dịch đệm sodium phosphate 0.03mg pH 7.2 chảy qua cột
khoảng 3-4 giờ để cân bằng cột.
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
16
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
 Cách thực hiện:
 Cân 100 mg enzyme thô hoà vào 1 ml dung dịch đệm như trên rồi cho vào cột. Chỉnh cho tốc độ của

dung môi phân li enzyme là 1ml/5phút.
 Thu từng phân đoạn enzyme (mỗi phân đoạn là 3 ml) và đo OD ở bước sống 280 nm. Tính trọng
lượng của phân tử enzyme theo công thức :
LgM = 5.941-0.874 Ve/Vo Vo= 40%Vt (Vt: thể tích tổng cộng của cột)
Ve: Thể tích dung môi phân li enzyme đựơc tính
từ lúc cho mẫu vào đến khi thu nhận mẫu.
II.2.3.3. Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc kí lọc gel:
Sắc kí là quá trình tách liên tục từng phần trong hỗn hợp các chất do sự phân bố không đều của chúng giữa
pha tĩnh và pha động khi pha động di chuyển qua pha tĩnh.
Nguyên tắc của sắc kí lọc gel:
III. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELIN
III.1. Vai trò hỗ trợ tiêu hoá
 Bromelin là enzyme phân huỷ protid có đặc tính giúp tiêu hoá nhanh các chất protein. Bromelin có
thể li trích từ thơm dưới dạng tinh khiết hoặc cung cấp cho cơ thể từ các loại thực phẩm có thêm thơm
trong thực đơn nấu nướng.
 Một số enzyme khác thường bị phân hủy trong môi trường tiêu hóa, còn Bromelin được hấp thu từng
phần và đi vào máu, tạo nên tác động tiêu hóa protein. Khi dùng thuốc viêm bromelin cải thiện việc tiêu
hóa thì nên dùng giữa bữa ăn.
III.2. Giảm đau và phù nề sau phẫu thuật hoặc sau chấn thương
 Bromelin ngăn chặn sự phóng thích prostaglandin gây sưng viêm. Vì thế bromelin dùng để chống
bệnh viêm khớp.
 Theo một nghiên cứu được công bố vào năm 1995 tại Đức trên 59 người thử nghiệm bị đau do dập
cơ, người ta thấy có giảm đáng kể hiện tượng sưng phồng và đau. Từ 1960, với thí nghiệm lâm sàng đối
chiếu với giả dược trên 146 võ sĩ quyền anh bị dập mũi và tụ máu đã đi đến kết luận rằng: 78% được
dược trị bằng bromelin qua đường tiêm tĩnh mạch hoàn toàn khỏi trong vòng 4 ngày đối lại 14% được
dùng giả dược.
 Nhiều nghiên cứu khác trên các sưng viêm sau phẫu thuật giảm nếu bệnh nhân được cho sử dụng
40mg bromelin, 4 lần/ngày, dùng 2 ngày trước khi phẫu thuật và 5 ngày sau đó. Tuy nhiên cũng có 2
nghiên cứu trên 154 không cho được kết quả mong đợi trên việc sưng phù sau phẫu thuật.
III.3. Làm mau lành vết thương

Việc đắp lại tại chỗ bromelin làm gia tăng tiêu hủy các mô hoại tử.
III.4. Giảm đau nhức cơ
Một ngiên cứu công bố vào năm 2002, với 30 đối tượng thử nghiệm đã thực hiện các động tác thể lực
gây đau cơ tay, so sánh giữa việc dùng bromein 900mg/ngày với dùng 1600mg ibuprofen (thuốc trị đau
nhức) cho kết quả tương đương.
III.5. Chống rối loạn tim mạch
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
17
Trường ĐH Tôn Đức Thắng BÁO CÁO MÔN HỌC
Lớp 06SH1D CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME
Các quan sát lâm sàng cho phép kết luận rằng việc dùng bromelin với liều 400mg – 1000mg giúp làm
giảm đau thắt ngực sau khi ngưng dùng thuốc trị đau thắt ngực. Việc kết hợp bromelin với potassium và
magnesium làm giảm tai biến nhồi máu cơ tim. Bromelin làm sạch máu giúp giải thích tác động chống
kết tập tiểu cầu. Một nghiên cứu khác trên 73 người tình nguyện bị viêm tĩnh mạch cấp tính thì thấy việc
sử dụng bromelin với thuốc kháng viêm giảm đau giúp làm giảm các triệu chứng của bệnh trên hệ tĩnh
mạch.
III.6. Các nghiên cứu khác
 Ngoài ra bromelin còn được dùng để điều trị sung huyết đường hô hấp, cải thiện việc tiêu hóa và hấp
thu một số thuốc. Bromelin dùng cho các bệnh nhân bị rối loạn tiêu hóa do cắt bỏ tụy tạng hoặc thiếu
enzyme tuyến tụy. Từ đó người ta nghĩ đến việc dùng bromelin để gia tăng hấp thu hoạt chất thuốc như
glucosamin, kháng sinh, thuốc an thần làm tăng thời gian tác dụng của thuốc.
 Ngoài ra bromelin còn tác động lên hệ miễn dịch, nên có thể giúp gia tăng khả năng phòng chống
một số bệnh do hệ tự miễn yếu kém của con người vì lão hóa cũng như chống lại sự thành lập các khối
u. Các chế phẩm Bromelin còn có tác dụng làm vết thương mau lành dưới dạng kem bôi.
 Việc ăn tráng miệng bằng thơm sau các bữa ăn nặng sẽ giúp mau “nhẹ bụng”.
Một số sản phẩm bromelin trên thị trường
GV giảng dạy: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
18