TUYỂN CHỌN VÀ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TUYỂN CHỌN VÀ TỐI ƯU HÓA KHẢ NĂNG ĐÔNG TỤ
TRONG NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI HEO (SAU BIOGAS)
CỦA BACILLUS CÁC DÒNG KG.05, ST.02, VL.01, VL.05
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Gs. Ts CAO NGỌC ĐIỆP TRẦN NGỌC HÂN
MSSV: 3112462
LỚP: CNSH K37
Cần Thơ, tháng 5/2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TUYỂN CHỌN VÀ TỐI ƯU HÓA KHẢ NĂNG ĐÔNG TỤ
TRONG NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI HEO (SAU BIOGAS)
CỦA BACILLUS CÁC DÒNG KG.05, ST.02, VL.01, VL.05
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Gs. Ts CAO NGỌC ĐIỆP TRẦN NGỌC HÂN
MSSV: 3112462
LỚP: CNSH K37
Cần Thơ, tháng 5/2014
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)
Cao Ngọc Điệp Trần Ngọc Hân
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã tận tình
giảng dạy tôi trong thời gian học tập vừa qua.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy Gs.Ts. Cao Ngọc Điệp_người đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành tốt luận văn.
Xin cảm ơn Cô Nguyễn Thị Liên_cố vấn học tập, người đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và
động viên tôi khi vừa bước chân vào giảng đường đại học.
Chân thành cám ơn anh Hồ Thanh Tâm, anh Trần Hoài Phong và chị Giang_cán
bộ phòng thí nghiệm Vi sinh Môi trường, các anh chị cán bộ phòng thí nghiệm của Viện
nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ, tận tình chỉ dạy, dìu dắt và giúp
đỡ trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học khóa 37, các anh chị, các em trong
Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ về kiến thức cũng như tinh
thần để tôi hoàn thành luận văn.
Cuối cùng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã
khích lệ và luôn ủng hộ tôi để tôi vững tin hoàn thành tốt khóa học của mình.
Kính chúc quý Thầy Cô luôn dồi dào sức khỏe để tiếp tục cống hiến cho sự nghiệp
trồng người.
Xin chân thành cám ơn!
Cần Thơ, ngày 05 tháng 5 năm 2014
Trần Ngọc Hân
MỤC LỤC

DANH SÁCH HÌNH i
DANH SÁCH BẢNG i
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT iii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu của đề tài 1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Tính chất nước thải chăn nuôi heo 3
2.1.1. Nước thải chăn nuôi heo trước khi qua xử lý biogas 3
2.1.2. Nước thải chăn nuôi heo sau biogas 3
2.2. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus 4
2.3. Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải 6
2.3.1. Bùn hoạt tính 6
2.3.2. Màng sinh học 6
Hình 2. Hệ vi sinh vật trong màng sinh học 7
2.4. Sự đông tụ 8
2.4.1. Khái niệm 8
2.4.3. Cơ chế của sự đông tụ 10
Quá trình đông tụ chủ yếu phụ thuộc vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào và các thành phần
cấu tạo tham gia vào các liên kết giữa các tế bào vi khuẩn với nhau 10
Lipopolysaccharides (LPSs) là thành phần cấu trúc bề mặt quan trọng của vi khuẩn Gram
âm, nằm giữa các protein và phospholipid chiếm gần 75% diện tích bề mặt ngoài tế bào vi
khuẩn. Một LPS gồm có ba thành phần: lipid A, oligosaccharides và O-kháng nguyên.
Thường cấu trúc O-Kháng nguyên không đồng nhất trong các LPSs giúp tế bào vi khuẩn có
thể thích nghi trong các trường hợp môi trường có biến động. Cấu trúc của LPS bị biến đổi
sẽ ảnh hưởng đến khả năng đông tụ của các dòng vi khuẩn thông qua làm thay đổi tính kỵ
nước của bề mặt tế bào (Sutherland, 2001). Để làm rõ hơn vấn đề này, một nghiên cứu của
Kimchhayarasy et al. (2009) được tiến hành. Ông gây đột biến dòng A. johnsonii S35 có bề
mặt gồ ghề hiệu suất đông tụ 88% bằng cách cấy chuyển nhiều lần; kết quả kiểm tra hiệu
suất đông tụ chỉ còn 20% gần như mất khả năng đông tụ, và đặc điểm bề mặt tế bào vi

khuẩn được quan sát có sự thay đổi từ lồi lõm thành bề mặt tế bào tương đối nhẵn hơn 10
Sự kết dính của hai tế bào thông qua sự liên kết của một dạng protein loại lectin trên tế bào
này với một oligosaccharide trên tế bào kia. Sự đông tụ ngừng lại nếu protein lectin bị biến
tính do nhiệt độ hoặc các enzyme protease; hoặc sự xuất hiện của đường (lactose, galactose,
hoặc các đường đơn khác), chúng liên kết với protein lectin khóa hoạt động của protein này
(Kolenbrander and Anderson, 1989; Kinder and Holt, 1993; Shaniztki et al, 1997). Để làm
rõ vai trò liên kết protein lectin-oligosaccharide, các tế bào vi khuẩn có khả năng đông tụ
được xử lý với actinase E để phân hủy protein lectin, và xử lý với periodate để cắt cầu nối
carbon trên oligosaccharide, kết quả đã làm ngăn cản quá trình đông tụ. (Malik et al., 2003).
11
2.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự đông tụ 11
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 13
3.2. Phương tiện nghiên cứu 13
3.2.1. Vật liệu 13
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị 13
3.2.3. Hóa chất 13
3.3. Phương pháp nghiên cứu 14
3.3.1. Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn 14
3.3.2. Phương pháp tính hiệu suất đông tụ 14
3.4. Tiến hành thí nghiệm 14
3.4.1. Thí nghiệm 1: xác định cặp dòng vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất đông tụ cao nhất
14
Mục đích: chọn được cặp dòng vi khuẩn có khả năng đông tụ cao nhất, xác định thời gian tối
ưu nhất để sự đông tụ đạt được hiệu suất đông tụ cao 15
3.4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu suất đông tụ 16
Mục đích: xác định giá trị pH tối ưu nhất để hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn ở thời
điểm tối ưu đạt được cao nhất 16
3.4.3. Thí nghiêm 3: khảo sát ảnh hưởng của các cation Ca2+, Mg2+, K+, Na+ đến hiệu suất
đông tụ 17
3.4.4. Khảo sát tính tương quan của yếu tố pH và cation hiệu suất đông tụ 19

Mục đích: tìm điều kiện tối ưu nhất cho sự đông tụ của cặp dòng vi khuẩn được chọn, khi
khảo sát mối tương quan của hai yếu tố pH và cation. 19
3.5. Phương pháp phân tích số liệu 19
4.1. Cặp dòng vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất đông tụ cao nhất 20
Bốn dòng vi khuẩn KG.05, VL.05, VL.01, ST.02 được tổ hợp thành 6 cặp dòng vi khuẩn
KG.05-VL.05, KG.05-VL.01, KG.05-ST.02, VL.01-VL.05, VL.05-ST.02, VL.01-ST.02 để
kiểm tra thời gian đông tụ tốt nhất của các cặp dòng vi khuẩn. đồng thời dựa vào thí nghiệm
này có thể chọn được cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao để tiến hành các thí
nghiệm tiếp theo. Hiệu suất đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn được ghi nhận tại năm móc
thời gian 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ (bảng 4 ) 20
Bảng 4. Hiệu suất đông tụ ở những thời điểm khác nhau của các cặp dòng vi khuẩn. 21
Từ kết quả thống kê, có thể kết luận rằng các cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ khác
biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy 99%. Cụ thể là, trung bình hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi
khuẩn KG.05-VL.01 tại các thời điểm là 58.82% khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê và
cao nhất so với các cặp dòng vi khuẩn còn lại 21
Hiệu suất đông tụ ở các móc thời gian khác biệt có ý nghĩa ở mức 1%. Trong đó, tại móc
thời gian 6 giờ, trung bình hiệu suất đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn cao nhất là 75.27%
và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các móc thời gian còn lại 21
4.3. Ảnh hưởng của các cation 24
Cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01, thời gian cho tổ hợp hai dòng vi khuẩn là 6 giờ, và pH=7
được chọn qua 2 thí nghiệm trên để tiến hành thực hiện kiểm tra ảnh hưởng của 4 loại :
cation Ca2+, Mg2+, K+, Na+, mỗi loại khảo sát ở 6 nồng độ: 10mM, 20nM, 30mM, 40mM,
50mM, 60mM của các loại muối tương ứng: CaCl2, MgCl2, KCl, NaCl 24
Bảng 6. Ảnh hưởng của các cation ở các nồng độ khác nhau đến hiệu suất đông tụ của cặp
dòng vi khuẩn KG.05-VL.01 24
Từ kết quả phân tích có thể nhận định, các loại cation (loại muối) ảnh hưởng khác nhau đến
hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01 có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức tin
cậy 99%. Trong đó, sự hiện diện của Mg2+ cho hiệu suất đông tụ cao nhất (53.47%) so với
các loại cation còn lại và hiệu suất đông tụ thấp nhất là 44.69% dưới sự tác động của cation
K+. 24

Nồng độ của các loại muối cũng có những tác động khác nhau đến hiệu suất đông tụ của
cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý
nghĩa 1%. Trong tất cả các trung bình của từng nồng độ tính trên cả 4 loại muối, nồng độ
cho hiệu suất đông tụ cao nhất (65.32%) là 30mM, thấp nhất (36.48%) ở nồng độ 60mM. 25
Qua phân tích ANOVA có thể nhận định, các nồng loại muối khác nhau sẽ có một nồng độ
tối ưu cho hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01. Cụ thể là, 2 muối cation
hóa trị II: CaCl2 và MgCl2 có hiệu suất đông tụ cao nhất, khác biệt có ý nghĩa với mức tin
cậy 99%, (tương ứng là 57.07%; 62.95%) ở nồng độ 20mM so với các nồng độ muối còn
lại; 2 muối có cation hóa trị I: KCl và NaCl có hiệu suất đông tụ cao nhất (tường ứng là
69.64%; 71.63%) khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nồng độ muối còn lại. Ở
các nồng độ muối ban đầu thấp 10mM (và 20mM đối với cation hóa trị I) hiệu suất đông tụ
chưa tối ưu nhất, cho đến khi tăng nồng độ muối đến giá trị phù hợp đối với từng muối. Và
tiếp tục, nồng độ các muối được nâng lên 40mM, 50mM, 60mM hiệu suất đông tụ có những
biến động theo chiều hướng giảm (hình), và thấp nhất là ở nồng độ muối 60mM. Nguyên
nhân là do, sự thay đổi nồng độ hay điện tích ion trong môi trường sẽ làm thay đổi cấu trúc
bề mặt tế bào dẫn đến sự đông tụ bị ảnh hưởng. Hơn nữa liên kết giữa các dòng vi khuẩn là
nhờ liên kết lectin-olygosaccharide, protein lectin chiệu sự tác động của điện tích trong môi
trường nên nồng độ muối cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn.
25
26
Kết quả này là phù hợp với nghiên cứu của Min et al., (2010) khi khảo sát các yếu tố hóa, lý
ảnh hưởng đến sự đông tụ của 2 dòng vi khuẩn Sphingomonas natatoria 2.1gfp và
Micrococcus luteus 2.13 trong bùn hoạt tính của nước thải sinh hoạt. Tế bào vi khuẩn được
pha loãng trong các dung dịch có nồng độ khác nhau của các muối CaCl2, MgCl2, MgSO4
và NaCl, KCl, sự đông tụ bị hạn chế khi nồng độ muối NaCl, KCl (cation hóa trị 1) ở 90
mM, trong khi đó nồng độ các muối CaCl2, MgCl2, MgSO4 (cation hóa trị 2) chỉ cần 40
mM. 26
Muối cation hóa trị I: NaCl và KCl, cation cation hóa trị II: CaCl2, MgCl2 tương ứng có
hiệu suất đông tụ cao nhất ở nồng độ 30mM, 20mM khác biệt có ý nghĩa với mức tin cậy
99% so với các nồng độ còn lại. Nhưng khi so sánh giữa chúng với nhau thì sự khác biệt này

không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên, mỗi dòng vi khuẩn sẽ phù hợp với một loại
ion ở nồng độ nhất định để hoạt động tối ưu nhất (Theo Lương Đức Phẩm, 2009), trong khi
đó, môi trường nước thải chăn nuôi heo tồn tại rất nhiều các loại ion hóa trị I, II. Vì thế, thí
nghiệm tiếp được thực hiện để tìm ra loại cation có nồng độ tối ưu được 26
26
27
TÀI LIỆU THAM KHẢO 28
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.Vi khuẩn bacillus sau khi nhuộm Gram 4
Hình 2. Hệ vi sinh vật trong màng sinh học 6
Hình 3. Sự đông tụ giưa các dòng vi khuẩn 7
Hình 4. Hoạt động liên kết của protein Lectin trên bề mặt tế bào vi khuẩn đông tụ 9
DANH SÁCH BẢNG
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
i
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
Bảng 1. Thành phần và tính chất nước thải chăn nuôi heo 2
Bảng 2. Giá trị giới hạn các thông số chất lượng nước thải công nghiệp 3
Bảng 3. Thành phần môi trường Polypepton lỏng nhân sinh khối vi khuẩn đông tụ 8
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
ii
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT
BOD Biochemical Oxygen Demand_Nhu cầu oxy hóa sinh học
COD Chemical Oxygen Demand_Nhu cầu oxy hóa học
LPS Lipopolysaccharides
OD
660
OD

0
OD
S
QCVN Quy chuẩn Việt Nam
TSS Total Suspended Solids_
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
iii
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Ở Việt Nam, chăn nuôi heo là một nghề đã có từ lâu, đến ngày nay nó được mở rộng
với quy mô lớn tại các cơ sở do nhu cầu tiêu thụ thịt ngày càng tăng. Bên cạnh đó là sự
phát sinh lượng nước thải lớn làm ô nhiễm môi trường. Vấn đề này được khắc phục bằng
nhiều biện pháp: sinh học, hóa lý, cơ học,…Trong đó biện pháp sinh học được sử dụng
rộng rãi do có nhiều ưu điểm: an toàn, dễ thực hiện, giá thành rẻ,… Đặc biệt là biện pháp
ủ yếm khí (biogas) được nhiều người áp dụng, ngoài việc cải thiện tình trạng ô nhiễm còn
có thể thu khí metan làm nhiên liệu. Những lợi ích do ủ biogas đem lại là không thể phủ
nhận, tuy nhiên các chỉ tiêu ô nhiễm vẫn còn ở mức khá cao, vì thế việc tiếp tục xử lý
nước thải chăn nuôi heo sau biogas là cần thiết.
Sự kết tụ nhờ vi sinh vật (microbial flocculants) trong hệ thống bùn hoạt tính, màng
sinh học tỏ ra có hiệu quả khi đưa vào các quy trình làm sạch nước thải, trong đó có chăn
nuôi heo sau biogas bằng cách tổng hợp các chất kết tụ sinh hoc (bioflocculants) làm lắng
tụ vật chất lơ lững có kích thước nhỏ. Nhưng theo nhiều nghiên cứu gần đây các dòng vi
khuẩn chiếm ưu thế lại không có khả năng kết tụ (Non-flocculation bacteria), chúng có
một cơ chế riêng ít được nói đến, trong đó quần thể vi khuẩn có khả năng đông tụ
(Aggregation) lại có tỉ lệ cao, chúng cũng tham gia vào quá trình lắng động, kết dính các
vật chất có kích thước nhỏ, khó xử lý vì thế giữ vai trò quan trọng trong quá trình hình
thành màng sinh học, bùn sinh học.
Đề tài “Tuyển chọn và tối ưu hóa khả năng đông tụ trong nước thải chăn nuôi heo
(sau biogas) của vi khuẩn Bacillus các dòng KG.05, ST.02, VL.01, VL.05” được thực

hiện để xác định các điều kiện tối ưu cho sự đông tụ của dòng vi khuẩn có hiệu suất đông
tụ cao nhất, tạo tiền đề cho những nghiên cứu kế tiếp để xử lý nước thải chăn nuôi heo
một cách có hiệu quả.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Chọn cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất từ Bacillus các dòng KG.05,
VL.01, VL.05, ST.02 được phân lập từ nước thải chăn nuôi heo sau biogas, và xác định
điều kiện tối kiện tối ưu nhất cho quá trình đông tụ trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
1
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
1.3. Nội dung nghiên cứu
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tính chất nước thải chăn nuôi heo
2.1.1. Nước thải chăn nuôi heo trước khi qua xử lý biogas
Nước thải chăn nuôi bao gồm: nước vệ sinh vật nuôi, chuồng trại chứa phân, nước
tiểu, thức ăn thừa… chúng là tác nhân gây ra ô nhiễm môi trường do chứa nhiều các chất
lơ lững, hợp chất hữu cơ, hàm lượng N, P khá cao ngoài ra còn có coliform, trứng giun
sán; là môi trường thuận lợi cho nhiều vi sinh vật gây bệnh phát triển đặc biệt là sự biến
thể của các virus làm bùn phát các dịch bệnh: lở mồm long móng, tai xanh trên heo,…
ảnh hưởng lớn đến nền kinh tế, sức khỏe con người và vật nuôi…
Theo Từ Thụy Hạnh (2013), trong thành phần chất rắn của nước thải, chất hữu cơ
chiếm 70-80% gồm các chất hydrocacbon, proxit, acid amin chất béo và các dẫn xuất của
chúng có trong phân và thức ăn thừa. Chất vô cơ chiếm 20-30% gồm các, đất, muối
clorua, SO
4
đặc biệt là hàm lượng đạm trong nước thải rất cao do hệ tiêu hóa của gia súc
có khả năng hấp thu kém thành phần nitơ. Chỉ có 30% lượng nitơ đưa vào cơ thể vật nuôi

chuyển hóa thành sản phẩm, 70% còn lại bị bài tiết ra ngoài dưới dạng NH
4+
, NO
2
-
, NO
3
-
(Jongbloes và Lenis, 1992). Lân là thành phần tương đối ít, chiếm 0.25-1.4% trong thức
ăn thừa, và một ít trong nước tiểu của heo…tồn tại chủ yếu ở dạng HPO
4
2-
, H
2
PO
4
, PO
4
3-
,
và photphate hữu cơ.
Bảng 1. Thành phần và tính chất nước thải chăn nuôi heo.
Thông số Đơn vị Giá trị
pH 7.23-8.07
COD mg/l 2561-5028
BOD mg/l 1664-3268
SS mg/l 1700-3218
N_NH
3
mg/l 304-471

N_Tổng mg/l 512-594
P_Tổng mg/l 13-62
(*Nguồn: ngày 7/1/2014).
2.1.2. Nước thải chăn nuôi heo sau biogas
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
Sau khi qua xử lý bằng cách ủ biogas, các chất hữu cơ có trong nước thải chăn nuôi
heo được chuyển hóa có hiệu quả: COD giảm 76.3%; SS giảm 86.1% và 51.2% vi sinh
vật gây bệnh bị tiêu diệt; nhưng các chất dinh dưỡng (N, P) được xử lý chỉ một phần: N
giảm 11.8%; P giảm 7.0% (Nguyễn Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu, 2012).
Nước thải sau khi qua xử lý biogas, nếu thải trực tiếp ra ngoài môi trường sẽ ảnh
hưởng đến hệ sinh thái tự nhiên, do hàm lượng các chất ô nhiễm vẫn chưa đạt các chỉ tiêu
an toàn cho phép, nhất là các thành phần dinh dưỡng còn ở mức cao, cần được tiếp tục xử
lý trước khi thải vào môi trường.
Bảng 2. Giá trị giới hạn các thông số chất lượng nước thải công nghiệp.
(*Nguồn: QCVN 24: 2009/btnmt cột B, ngày 7/1/2014).
2.2. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus
Phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Thông số Đơn vị Giá trị giới hạn (cột B)
pH 5.5-9
COD mg/l 100
BOD mg/l 50
SS mg/l 100
N_NH
3
mg/l 10

N_Tổng mg/l 30
P_Tổng mg/l 6
4
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillaceae
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus (*Nguồn: ngày 31/12/2013)
Hình 1. Vi khuẩn bacillus sau khi nhuộm Gram.
(Nguồn: ngày 20/2/2014).
Bacillus là một chi vi khuẩn Gram dương có hình que, tạo bào tử, hiếu khí hoặc yếm
khí. Bacillus được tìm thấy ở nhiều môi trường với nhiều chủng loài khác nhau và được
ứng dụng nhiều trong cuộc sống, có tác động đáng kể đến hoạt động của con người trên
nhiều lĩnh vực: từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men hiện
đại, sinh học phân tử, y-dược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, xử lý môi trường
ô nhiễm, thu hồi kim loại nặng, sản xuất chế phẩm sinh học, nhiên liệu sinh học…. cụ thể
là, B. thuringiensis được sử dụng rộng rãi để tiêu diệt côn trùng có hại, B. subtilis
là chủng sản xuất một loạt các peptide có hoạt tính sinh học cao (Shalini et al., 2009).
Theo nghiên cứu của Singh et al. (2013), B.subtilis NG220 được ứng dụng để xử lý nước
thải của các nhà máy sản xuất đường một cách hiệu quả, đồng thời tạo ra poly β-
hydroxybutyrate là thành phần tổng hợp nhựa phân hủy sinh học. B. aterrimus, B.
megaterium, B. natto, B. panis, B. pumilis… giúp cải thiện môi trường, kiểm soát sự phát
triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh, tăng cường miễn dịch cho các loài thủy sinh trong
nuôi trồng thủy sản.
Bacillus có thể sống riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi. Do có bào tử nên
chúng có thể kháng lại các điều kiện bất lợi của môi trường rất có hiệu quả: chúng có thể
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
5
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
sống trong môi trường có pH biến động cao, có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ,

kháng áp suất cao…Đặc biệt vi khuẩn Bacillus còn có bao nhầy được cấu tạo từ các
polypeptide đóng vai trò dự trữ thức ăn, bảo vệ vi khuẩn khỏi các điều kiện bất lợi…(Trần
Thị Thu Hiền, 2012).
Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus dễ nuôi cấy, thường mọc tốt trên môi trường có
nguồn cacbon là đường, acid hữu cơ, rượu… với nguồn nitơ duy nhất là ammonium,
ngoài ra còn có một số dạng phân lập cần vitamin để tăng trưởng. Môi trường sống chủ
yếu của Bacillus là đất, nước và bùn (Green et al., 1999).
2.3. Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải
Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải là phương pháp sử dụng khả năng sống
và hoạt động của vi sinh vật để khoáng hóa các chất hữu cơ có trong nước thải thành các
chất vô cơ, các chất khí đơn giản và nước. Các vi sinh vật tồn tại trong môi trường thực
hiện quá trình trao đổi chất để tăng sinh khối, tạo sản phẩm cần thiết cho nhu cầu sinh hoá
của tế bào. Vi sinh vật phân hủy các chất có trong nước thải, thường có hai kiểu sinh
trưởng: sinh trưởng lơ lửng (bùn hoạt tính) và sinh trưởng dính bám (màng sinh học).
2.3.1. Bùn hoạt tính
Bùn hoạt tính bao gồm những vi sinh vật sống kết lại thành dạng hạt hoặc dạng bông
với trung tâm là các chất rắn lơ lửng chiếm 40%. Các hạt bông này khi được khuấy đảo và
thổi khí sẽ dần dần lớn lên do tiếp tục hấp thụ nhiều hạt rắn nhỏ, tế bào vi sinh vật,
nguyên sinh động vật… (Nguyễn Văn Phước, 2009). Trong quá trình hình thành bùn hoạt
tính các vi sinh vật có trong bùn sử dụng các chất dinh dưỡng, chất hữu cơ có trong nước
thải làm nguồn thức ăn để tổng hợp năng lượng và các thành phần cấu tạo nên tế bào mới.
Những hạt bông bùn sẽ lắng xuống đáy khi chúng đủ lớn hoặc ngừng các hoạt động thổi
khí, khuấy trộn. Sau đó, vi sinh vật yếm khí dưới đáy bùn tiếp tục quá trình phân hủy các
hợp chất hữu cơ này.
2.3.2. Màng sinh học
Màng sinh học là tập hợp nhiều dòng vi khuẩn khác nhau, có hoạt tính oxy hóa các
chất hữu cơ khi chúng tiếp xúc với màng. Màng sinh học thường có các kênh thông nhau
như một hệ thống tuần hoàn giúp cộng đồng vi khuẩn có thể loại thải các chất độc hại
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
6

Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
cũng như tiết và hấp thu các sản phẩm trao đổi chất, trao đổi vật liệu di truyền, sản xuất
các phân tử tín hiệu như peptide, autoinducer hoặc dựa vào cấu trúc bề mặt như tính kỵ
nước, roi, fimbriae, độ bám dính không đặc hiệu giữa các loài vi khuẩn, phối hợp các hoạt
động trong quá trình sinh trưởng và phát triển để có thể duy trì tính toàn vẹn của cộng
đồng đa loài màng sinh học (Costerton, 1995).
Các thành phần trong màng sinh học khác nhau phụ thuộc vào nhiều yếu tố, thông
thường thành phần chính là nước và vi khuẩn, tiếp theo là exopolysaccharides…là rào cản
vật lý giúp chóng lại các điều kiện bất lợi từ môi trường như: sự khô hạn, tia tử ngoại, sự
thay đổi của pH, các chất độc,…(Sutherland, 2001).
Các vi khuẩn trong màng sinh học thường có hoạt tính cao hơn vi khuẩn trong bùn
hoạt tính. Màng sinh học hiếu khí là một hệ vi sinh vật tùy tiện. Ở ngoài cùng của màng là
lớp vi khuẩn hiếu khí mà dễ thấy là trực khuẩn Bacillus, ở giữa là các vi khuẩn tùy tiện
như Alkaligenes, Pseudomonas, Flavobacterium, Micrococus và cả Bacillus. Lớp sâu bên
trong màng là các vi khuẩn kỵ khí khử lưu huỳnh và nitrat như Desulfovibrio. Vi sinh vật
trong màng sinh học sẽ oxi hóa các chất hữu cơ, sử dụng chúng làm nguồn dinh dưỡng và
năng lượng. Như vậy chất hữu cơ được tách ra khỏi nước, còn khối lượng của màng sinh
học tăng lên (Nguyễn Văn Phước, 2007). Màng sinh học được ứng dụng trong các hệ
thống lọc sinh học xử lý nước thải như: đĩa quay sinh học, lọc sinh học nhỏ giọt, lọc sinh
học ngập nước.
Hình 2. Hệ vi sinh vật trong màng sinh học.
(*Nguồn: Ngày 6/1/2014)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
7
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
2.4. Sự đông tụ
2.4.1. Khái niệm
- Sự đông tụ được định nghĩa là sự nhận biết và kết dính của các tế bào vi khuẩn
khác nhau về mặt di truyền (Kolenbrander and London, 1993), lần đầu tiên được Gibbons
và Nygaard (1970) phát hiện ở vi khuẩn gây ra mảng bám trên răng. Kể từ đó, nhiều

nghiên cứu đã chứng minh rằng sự đông tụ xảy ra giữa các loài vi khuẩn cụ thể trong
những môi trường khác nhau: diều của gà, đường tiết niệu ở phụ nữ, ruột người, trong
nước ngọt, nước thải… (Min và Rickard, 2009).
- Sự nhận biết và kết dính của các tế bào vi khuẩn còn xảy ra đối với các dòng vi
khuẩn giống nhau về mặt di truyền, được gọi là sự tự đông tụ (intrageneric coaggregation
hay autoaggregation).
Hình 3. Sự đông tụ giưa các dòng vi khuẩn.
(A) A. johnsonii S35 và B. natatoria S9; (B) A. johnsonii S35 và Mycobacterium sp. S19;
(C) A. junii S33 và B. natatoria S9; (D) A. junii S33 và Mycobacterium sp. S19
(*Nguồn: Kimchhayarasy et al., 2009).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
8
A
V
i
k
h
u
ẩ
n
d
ò
n
g
K
G.
05
ch
ụ
p

d
ư
ới
kí
n
h
hi
ển
vi
đi
ện
tử
(S
E
M
),

đ
ộ
p
h
ó
n
g
đ
ại
6.
50
0
lầ

n
B
V
i
k
h
u
ẩ
n
d
ò
n
g
K
G.
05
ch
ụ
p
d
ư
ới
kí
n
h
hi
ển
vi
đi
ện

tử
(S
E
M
),

đ
ộ
p
h
ó
n
g
đ
ại
6.
50
0
lầ
n
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
Hình 4. Vi khuẩn dòng VL.01 (A) và KG.05 (B).
(*Nguồn: Hồ Thanh Tâm và Cao Ngọc Điệp, 2013)
Bảng 3. Một số vi khuẩn có khả năng đông tụ.
Vi khuẩn có khả năng đông tụ Tác giả
Flavobacterium spp. Sakka et al. (1981)
Pseudomonas spp. Sakka et al. (1981)
lactobacillus Vandevoorde et al. (1992)
Acinetobacter johnsonii S35 Malik và Kakii (2003)
A junii S33 Malik và Kakii (2003)

Bacillus cereus Kimchhayarasy et al. (2009)
Blastomonas natatoria Kimchhayarasy et al. (2009)
Mycobacterium sp. Kimchhayarasy et al. (2009)
Thermomonas Kimchhayarasy et al. (2009)
Enterobacteriaceae Kimchhayarasy et al. (2009)
Sphingomonas natatoria 2.1gfp Min và Rickad (2009)
Micrococcus luteus 2.13 Min và Rickad (2009)
2.4.2. Vi khuẩn đông tụ trong các hệ thống xử lý nước thải bùn hoạt tính và
màng sinh học
Trong thí nghiệm của Malik (2003) có 52 dòng vi khuẩn được phân lập từ bùn hoạt
tính trong đó các dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ chiếm 31%, 11% là các dòng vi khuẩn
bị lắng tụ còn lại 58% là các dòng vi khuẩn không có khả năng kết tụ. Trong nhiều nghiên
cứu khác các dòng vi khuẩn này cũng chiếm một tỉ lệ cao và trước đây chúng bị xem là
một trong các nguyên nhân gây đục nước vì thế chúng ít được đề cập đến. Nhưng về sau,
nhiều nghiên cứu chứng minh chúng giữ một vai trò quan trọng trong quá trình làm sạch
nước trong các hệ thống bùn hoạt tính và màng sinh học nhờ vào khả năng đông tụ.
Sự đông tụ, kết dính (Adherence) và lắng (Settlement) là các quá trình quan trọng
trong vận hành bùn hoạt tính. Sự đông tụ và kết dính được biết là quá trình kết tụ sinh học
(Biofloculation), lắng xuống tạo thành bùn. Các quá trình được vận hành một cách tuần
hoàn. Vì vậy, quá trình bùn hoạt tính hoạt động hiệu quả phải đảm bảo các hạt bùn được
lắng tốt. Sự đông tụ và lắng tốt quyết định độ sạch và trong của nước sau xử lý. Tuy
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
9
A
V
i
k
h
u
ẩ

n
d
ò
n
g
K
G.
05
ch
ụ
p
d
ư
ới
kí
n
h
hi
ển
vi
đi
ện
tử
(S
E
M
),

đ
ộ

p
h
ó
n
g
đ
ại
6.
50
0
lầ
n
B
V
i
k
h
u
ẩ
n
d
ò
n
g
K
G.
05
ch
ụ
p

d
ư
ới
kí
n
h
hi
ển
vi
đi
ện
tử
(S
E
M
),

đ
ộ
p
h
ó
n
g
đ
ại
6.
50
0
lầ

n
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
nhiên, quá trình bùn hoạt tính thường gặp nhiều sự cố như sự phát triển quá nhiều của vi
khuẩn dạng sợi hoặc bùn kém chất lượng như bùn lắng kém hay bùn tạo khối
(Kimchhayarasy et al., 2009).
Nhiều nghiên cứu về sự đông tụ của vi sinh vật trong các hệ thống sinh học đã cho
thấy vai trò sự đông tụ là yếu tố cần thiết cho sự hình thành màng sinh học (Saginur et al.,
2006). Sự đông tụ góp phần tham gia vào quá trình hình thành và phát triển màng sinh
học, bước đầu tiên là sự kết dính (Coadhesion) của tế bào đơn trong môi trường đến bề
mặt vật liệu. Sau đó chủ yếu là sự đông tụ, từ các tế bào đơn lẻ hoặc từ một nhóm các tế
bào khác nhau hoặc một nhóm các tế bào giống nhau về mặt di truyền sẽ kết dính với
những tế bào kết dính với bề mặt vật liệu trước đó. Quá trình này được tiếp diễn và tạo
thành màng sinh học đa chủng vi sinh vật. Min và Rickard (2009) đã chứng minh rằng sự
đông tụ tăng cường độ bám dính giữa các màng sinh học nước ngọt phù du, vi khuẩn và
nó có khả năng đóng góp vào sự phát triển của màng sinh học trong môi trường tĩnh hay
chảy.
2.4.3. Cơ chế của sự đông tụ
Quá trình đông tụ chủ yếu phụ thuộc vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào và các
thành phần cấu tạo tham gia vào các liên kết giữa các tế bào vi khuẩn với nhau.
Lipopolysaccharides (LPSs) là thành phần cấu trúc bề mặt quan trọng của vi khuẩn
Gram âm, nằm giữa các protein và phospholipid chiếm gần 75% diện tích bề mặt ngoài tế
bào vi khuẩn. Một LPS gồm có ba thành phần: lipid A, oligosaccharides và O-kháng
nguyên. Thường cấu trúc O-Kháng nguyên không đồng nhất trong các LPSs giúp tế bào
vi khuẩn có thể thích nghi trong các trường hợp môi trường có biến động. Cấu trúc của
LPS bị biến đổi sẽ ảnh hưởng đến khả năng đông tụ của các dòng vi khuẩn thông qua làm
thay đổi tính kỵ nước của bề mặt tế bào (Sutherland, 2001). Để làm rõ hơn vấn đề này,
một nghiên cứu của Kimchhayarasy et al. (2009) được tiến hành. Ông gây đột biến dòng
A. johnsonii S35 có bề mặt gồ ghề hiệu suất đông tụ 88% bằng cách cấy chuyển nhiều
lần; kết quả kiểm tra hiệu suất đông tụ chỉ còn 20% gần như mất khả năng đông tụ, và
đặc điểm bề mặt tế bào vi khuẩn được quan sát có sự thay đổi từ lồi lõm thành bề mặt tế

bào tương đối nhẵn hơn.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
10
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
Sự kết dính của hai tế bào thông qua sự liên kết của một dạng protein loại lectin trên
tế bào này với một oligosaccharide trên tế bào kia. Sự đông tụ ngừng lại nếu protein lectin
bị biến tính do nhiệt độ hoặc các enzyme protease; hoặc sự xuất hiện của đường (lactose,
galactose, hoặc các đường đơn khác), chúng liên kết với protein lectin khóa hoạt động của
protein này (Kolenbrander and Anderson, 1989; Kinder and Holt, 1993; Shaniztki et al,
1997). Để làm rõ vai trò liên kết protein lectin-oligosaccharide, các tế bào vi khuẩn có khả
năng đông tụ được xử lý với actinase E để phân hủy protein lectin, và xử lý với periodate
để cắt cầu nối carbon trên oligosaccharide, kết quả đã làm ngăn cản quá trình đông tụ.
(Malik et al., 2003).
Hình 5. Hoạt động liên kết của protein Lectin trên bề mặt tế bào vi khuẩn đông tụ.
(*Nguồn: Malik et al. 2003)
2.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự đông tụ
Dòng vi khuẩn Sphingomonas natatoria 2.1gfp và Micrococcus luteus 2.13 có khả
năng đông tụ với nhiều dòng vi khuẩn khác và khả năng tạo màng sinh học trong điều
kiện phòng thí nghiệm, đồng thời sự đông tụ này bị ngăn chặn bởi galactosamine (Min và
Rickad, 2009).
Một nghiên cứu khác của Min et al., (2010) đã khảo sát các yếu tố lý hóa học ảnh
hưởng đến sự đông tụ của hai dòng vi khuẩn Sphingomonas natatoria 2.1gfp và
Micrococcus luteus 2.13. Khi tế bào vi khuẩn được pha loãng trong các dung dịch có
nồng độ khác nhau của các muối CaCl
2
, MgCl
2
, MgSO
4
và NaCl, cho thấy sự đông tụ bị

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
11
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
hạn chế khi nồng độ muối NaCl (cation hóa trị 1) đạt 90 mM, trong khi đó nồng độ các
muối CaCl
2
, MgCl
2
, MgSO
4
(cation hóa trị 2) chỉ cần 40 mM, điều này do sự chênh lệch
về điện tích các ion. Sự thay đổi nồng độ ion hay thay đổi điện tích sẽ làm thay đổi cấu
trúc bề mặt vỏ tế bào sẽ ảnh hưởng đến sự đông tụ. Hơn nữa protein dạng lectin cũng sẽ
ảnh hưởng bởi nồng độ ion xung quanh nó, điều này làm thay đổi khả năng đông tụ.
Ngược lại khi bổ sung EDTA, mục đích là để hấp thu các ion, sự đông tụ bị giới hạn lại.
Do đó, nồng độ ion có giới hạn trên và giới hạn dưới đến sự đông tụ. Yếu tố của pH được
khảo sát kết quả là sự đông tụ xảy ra ở khoảng giá trị khá rộng 3-9. Giá trị pH trong dung
dịch ảnh hưởng đến khả năng đông tụ của các dòng vi khuẩn do bề mặt các chất phân tán
thay đổi theo giá trị pH.
Các nguyên tố K, Mg, Ca, S, Fe, Mn, Zn,… đều cần cho vi sinh vật sống. Nếu
thiếu nitơ quá lâu làm cho vi sinh vật không sinh sản, sinh khối không tăng, ngoài ra còn
làm cản trở các quá trình hóa sinh và bùn hoạt tính khó lắng, trôi theo nước khỏi bể lắng.
Nếu thiếu phospho sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật sinh ra dạng sợi làm cho quá trình lắng
chậm, giảm hiệu suất oxy hóa các chất hữu cơ của bùn hoạt tính (Lương Đức Phẩm,
2009).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
12
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện từ 10/2013 - 04/2014 tại phòng vi sinh vật môi trường và vi sinh
vật đất thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần
Thơ.
3.2. Phương tiện nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu
Bốn dòng vi khuẩn KG.05, VL.01, VL.05, ST.02 được cung cấp bởi Viện Nghiên
cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ: cốc 250 ml, 1000 ml; ống đông 10 ml, 25 ml, 200 ml; eppendorf 2 ml;
bình tam giác 150 ml, 250 ml, 500 ml; micropipette: 10 µl, 200 µl, 1000 µl; đầu côn xanh,
vàng.
- Thiết bị: máy khuấy từ; máy microwave; pH kế Orion 420A; máy vortex IKA; cân
điện tử Sartorius; tủ sấy EHRET; tủ ủ vi sinh vật Incucell 111; máy lắc GFL 3005; nồi
khử trùng nhiệt ướt Pbi-international; tủ lạnh trữ mẫu-Sanyo; lò vi sóng Panasonic; máy
đo OD BecKman coulter DU 640B; máy ly tâm; tủ cấy.
3.2.3. Hóa chất
Bảng 3. Thành phần môi trường Polypepton lỏng nhân sinh khối vi khuẩn đông tụ.
Thành phần Giá trị Đơn vị
Polypepton 10 G
(NH
4
)
2
SO
4
1 G
NaNO
3
0.5 G
NaCl 0.1 G

MgSO
4
·7H
2
O 0.2 G
CaCl
2
·2H
2
O 0.05 G
FeCl
3
·6H
2
O 0.01 G
K
2
HPO
4
1 G
Nước cất 1 L
pH 7
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
13
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
(*Nguồn: Kimchhayarasy et al., 2009).
Môi trường thạch nuôi cấy vi khuẩn đông tụ được pha bằng cách thêm vào môi
trường polypepton lỏng 20 g agra trong 1 lít nước cất (Kimchhayarasy et al., 2009).
- Muối sử dụng trong kiểm tra cation: CaCl
2

, MgCl
2
, NaCl, KCl.
- Dung dịch chuẩn pH: acid acetic, NaOH.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn
- 50 ml môi trường polypepton đặt sau khi microwave được chế vào các ống thạch
nghiêng và được khử trùng trong nồi nhiệt ướt ở 121
0
C trong 15 phút.
- Khuẩn lạc đã ròng từ ống thạch nghiêng đang trữ trong tủ lạnh được chuyển sang
ống thạch nghiêng mới bằng que cấy và ủ trong tủ ủ ở 30
0
C trong 2 ngày.
- Mỗi ống thạch nghiêng được thêm vào 1 ml nước cất, lắc đều. 100 µl dịch huyền
phù vi khuẩn được hút cho vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường polypepton
lỏng (môi trường đã được khử trùng trong nồi nhiệt ướt ở 121
0
C trong 15 phút) và đặc
trên máy lắc có tốc độ quay 120 vòng/phút ở nhiệt độ 30
0
C trong 24 giờ-thời gian sự tự
đông tụ đạt tối ưu (Hồ Thanh Tâm và Cao Ngọc Điệp, 2013).
3.3.2. Phương pháp tính hiệu suất đông tụ
Khả năng đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo
quang phổ kế ở bước sóng 660 nm (OD
660
) trước và sau ly tâm 650 vòng/phút trong 2
phút. Chỉ số đo OD
660

trước ly tâm (OD
0
) là để xác định mật số vi khuẩn trong dung dịch,
trong đó có sự hiện diện đồng thời của các tế bào vi khuẩn đã đông tụ và tế bào chưa tham
gia vào đông tụ. Chỉ số do OD
660
của phần trên dung dịch sau ly tâm (OD
S
) là mật số tế
bào vi khuẩn chưa đông tụ. Công thức tính hiệu suất đông tụ như sau:
100
0
0
×
−
OD
ODsOD
(%) (*)
3.4. Tiến hành thí nghiệm
3.4.1. Thí nghiệm 1: xác định cặp dòng vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất
đông tụ cao nhất
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
14
Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ
Mục đích: chọn được cặp dòng vi khuẩn có khả năng đông tụ cao nhất, xác định
thời gian tối ưu nhất để sự đông tụ đạt được hiệu suất đông tụ cao.
Từ các dòng vi khuẩn: KG.05, ST.02 , VL.01, VL.05 có khả năng tự đông tụ cao đã
được xác định qua các thí nghiệm của Hồ Thanh Tâm và Cao Ngọc Điệp (2013), chúng
được tổ hợp theo từng cặp để kiểm tra khả năng đông tụ theo phương pháp của
Kimchhayarasy et al. (2009).

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoan toàn với 3 lần lập lại, gồm 2
nhân tố tác động là thời gian có 5 mức: 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ và cặp dòng vi khuẩn
với 4 dòng vi khuẩn: KG.05, ST.02 , VL.01, VL.05 được tổ hợp thành 6 cặp dòng vi khuẩn:
KG.05-VL.05; KG.05-VL.01; KG.05-ST.02; VL.01-VL.05; VL.01-ST.02; VL.05-ST.02.
Tổng cộng có 30 nghiệm thức, 90 đơn vị thí nghiệm được thực hiện.
Các bước tiến hành:
- Mỗi dòng vi khuẩn được chủng vào bình tam giác 500 ml chứa 200 ml môi trường
lỏng và đặt trên máy lắc 120 vòng/phút trong 24 giờ.
- Chuẩn bị dịch vi khuẩn:
+ 1000 ml dung dịch muối (3 mM NaCl + 0.5 mM CaCl
2
), pH = 7 được chuẩn bị.
+ Micropipette 1000 µl được sử dụng để hút (n-1) x 50 ml dịch vi khuẩn sau khi
nhân tăng sinh khối cho vào tube eppendorf 2 ml (tổng n là số dòng vi khuẩn).
+ Sinh khối tế bào sau khi thu được bằng cách ly tâm 11000 vòng/phút trong 10
phút được rửa 2 lần với dung dịch muối và hòa tan bằng dung dịch muối này (để các tế
bào vi khuẩn tách rời nhau, dịch vi khuẩn trong tube được trộn đều bằng máy vortex).
+ Sinh khối tế bào được chứa trong bình tam giác có dung tích 250 ml thêm dung
dịch muối đến 50 ml và lắc đều.
+ 50 ml dung dịch muối chứa vi khuẩn được chuyển vào tube enppendorf 2 ml, ly
tâm nhẹ 700 vòng/phút trong 2 phút. 1.5 ml dịch vi khuẩn lơ lửng phía trên mỗi tube được
chuyển vào bình tam giác có dung tích 250 ml (để loại bỏ các tế bào tự đông tụ ở đáy tube
ly tâm) và điều chỉnh OD
660
= 0.3.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
15