Các phương pháp chuẩn đoán phân tử

Các quy trình chu n đoán mi n d chẩ ễ ị
•
Phép th h p ph mi n d ch liên k t v i enzymử ấ ụ ễ ị ế ớ

Đ c dùng r t nhi u trong chu n đoán g m các b cượ ấ ề ẩ ồ ướ
Các ph ng pháp ươ
chu n đoán phân tẩ ử

G n m u đang c n xét nghi m ắ ẩ ầ ệ
vào phi n r nế ắ

B sung kháng th đ c hi u ch t ổ ể ặ ệ ấ
ch thỉ ị

Cho các cho các c ch t không ơ ấ
màu

Quan sát và đo các s n ph m có ả ẩ
màu
Kháng th đ n dòngể ơ

T o và ch n l c t bào laiạ ọ ọ ế

Tiêm cho chu t kháng nguyênộ

Ki m traể

Gi t chu tế ộ

L y lách r a s chấ ử ạ


Nghi n và tách t ng t bào riêng ề ừ ế
lẽ

Tr n huy n d ch t bào t y ộ ề ị ế ủ
(thi u enzym hypoxanthin – ế
guamin
phosphoribosyltransferasa)

Tr n v i 35% polyethylen glycol ộ ớ
trong vài phút

Nuôi trong môi tr ng có ườ
hypoxanthin, amino pterin,
thymidin

Xác đ nh dòng t bào lai ị ế
sinh kháng th đ c hi uể ặ ệ
Dùng môi tr ng nuôi c y ườ ấ
ch a kháng th ti t raứ ể ế
Kháng th th 2 đ c ti p ể ứ ượ ế
h pợ
khi s d ng kháng th đ n ử ụ ể ơ
dòng thay cho đa dòng thì
tính đ c hi u c a quy ặ ệ ủ
trình tăng
Các h th ng chu n đoán ADNệ ố ẩ
*
Trình t nucleotit quy đ nh m t đ c đi m sinh h c c th s ự ị ộ ặ ể ọ ụ ể ẽ
là m t d u hi u phân đ nhộ ấ ệ ị
*

N u có th phát hi n đ c có th đ c dùng nh m t quy t ế ể ệ ượ ể ượ ư ộ ế
đ nh chu n đoán xác đ nhị ẩ ị
*
Lai nucleotit là c s c a các th nghi m nhanh và kh thiơ ở ủ ử ệ ả
*
S đ nh sau:ơ ồ ư

G n ADN s i đ n lên màng đắ ợ ơ ở

Thêm ADN s i đ n đã đánh d uợ ơ ấ

R a giá đử ỡ

Xác đ nh trình t lai t o thành gi a m u dò và AND đíchị ự ạ ữ ẫ
•
M u dò laiẫ

M u dò lai ph i có tính ẫ ả
đ c hi u caoặ ệ

M u dò có th là AND ẫ ể
hay ARN dài (h n 100 ơ
nucleotit) hay ng n (nh ắ ỏ
h n 50 nucleotit)ơ

Trình t làm m u dò hi u ự ẫ ệ
qu có th đ c phân ả ể ượ
l p b ng nhi u cáchậ ằ ề

Th c hi n tr c ti p trên ự ệ ự ế

m u có s nẫ ẳ

Chu n đoán b nh s t rétẩ ệ ố
*
ELISA không phân bi t đ c vi c nhi m đó là ệ ượ ệ ễ
cũ hay m iớ
*
Quy trình chu n đoán ADN ch tính đ n s ẩ ỉ ế ự
nhi m hi n t iễ ệ ạ
*
H n 100 m u dò ADN chu n đoán khác nhau đã ơ ẫ ẩ
đ c phân l p và xác đ nh tính ch t đ phát ượ ậ ị ấ ể
hi n các ch ng gây b nh khác nhauệ ủ ệ

phát hi n Trypanosoma cruziệ
*
Kí sinh trùng thu c đ ng v t nguyên sinh Trypanosoma cruzi ộ ộ ậ
là nhân t gây b nh trùng mũi khoanố ệ
*
Th nghi m PRC b nh trùng mũi khoan đ c dùng b tr cho ử ệ ệ ượ ổ ợ
các xét nghi m truy n th ngệ ề ố
*
Trong m t quy trình xét nhi m d a trên PCR đo n ADN 18 bp ộ ệ ự ạ
có m t trong nhi u b gen T. cruzi nh ng không có m t trong ặ ề ộ ư ặ
ADN b gen c a kí sinh trùng liên quan khác là trình t đíchộ ủ ự

quy trình lai không phóng xạ
*
Lai axit nucleotit đ c phát hi n b ng đánh d u m u dò ượ ệ ằ ấ ẫ
b ng đ ng v phóng x , th ng là phospho 32ằ ồ ị ạ ườ

*
Nh ng có th i gian s ng ng n, nguy hi m và đòi h i có phòng ư ờ ố ắ ễ ỏ
thí nghi m thi t k đ c bi tệ ế ế ặ ệ
*
Tín hi u đ c phát hi n h u h t trong các h th ng b ng ệ ượ ệ ầ ế ệ ố ằ
liên k t các nucleotit đánh d u biotin vào m u dò ADn theo ế ấ ẫ
quy trình

M u dò đánh d u biotin ẫ ấ
lai v i AND đích ớ

Avidin, protein lòng
tr ng tr ng gà ho c ắ ứ ặ
strepvidin, ch t t ng ấ ươ
t avidin vi khu n đ c ự ẩ ượ
thêm vào

Enzym đánh d u biotin ấ
đ c cho vào ượ

C ch t có màu ho c ơ ấ ặ
hóa phát quang đ c ượ
thêm vào
*
u đi m:Ư ể

B n ít nh t m t năm nhi t m t năm nhi t ề ấ ộ ở ệ ộ ở ệ
đ phòng ộ


Nhanh

Nh yạ

đèn hi u phân tệ ử
•
Đèn hi u phân t không ệ ử
dùng phóng x đ phát ạ ể
hi n trình t đ c hi uệ ự ặ ệ
•
Các quy trình thí
nghi m d a trên đèn ệ ự
hi u phân t đã đ c ệ ử ượ
phát tri nể

xác đ nh d u vân tay ị ấ
ADN
•
K tình nghiẻ
•
Ph ADN ti u v tinh ổ ể ệ
bi u di n t p h p đ ể ể ậ ợ ộ
dài c a m t s chu i ủ ộ ố ổ
trong m t s cá thộ ố ể

Nhân b i ng u nhiên các AND đa hìnhộ ẫ
Phân bi t các gi ng cây tr ng khác nhauệ ố ồ

u đi m:Ư ể

M i oligonucleotit dùng chung cho m i lo i th c ồ ọ ạ ự
v tậ

Không c n ngân hàng b gen, phóng x , chuy n ầ ộ ạ ể
souther hay lai AND

Quy trình có th th c hi n t đ ngể ự ệ ự ộ

th c m bi n sinh h c vi ể ả ế ọ
khu nẩ
•
C n có ph ng pháp ầ ươ
xác đ nh d dàng, ị ễ
nhanh chóng v i l ng ớ ượ
l n h p ch t có ti m ớ ợ ấ ề
năng đ c gây nhi m ộ ễ
đ c môi tr ng.ộ ườ
•
Khi v trí nhi m b n ị ễ ẩ
đ c xác đ nh, chúng ượ ị
s đ c khoanh vùng.ẽ ượ
•
M t s k thu t phân ộ ố ỹ ậ
tích có đ tinh vi cao ộ
đ c s d ng đ phát ượ ử ụ ể
hi n và đánh giá s ệ ố
l ng ch t ôi nhi m.ượ ấ ễ

Chu n đoán phân t các b nh di truy nẩ ử ệ ề
*
giúp phát hi n nguy c b b nh b n thân, con cháuệ ơ ị ệ ả

Sàng l c b nh x nangọ ệ ơ

B nh gây ra do m t trong s l n các thay đ i di truy n trong ADN ệ ộ ố ớ ổ ề
bình th ng c a gen đóườ ủ

Th ng sàng l c b nh di truy n khá ph c t pườ ọ ệ ề ứ ạ

Thi u máu t bào hình ế ế
li mề

B nh gay ra do thay ệ
đ i nucleoeti trong ổ
cođon c a axit amin ủ
th sáu chu i β ứ ở ỗ
c a phân t ủ ử
hemoglobin

Thay đ i nucleotit ổ
trong gen β-globin
gây ra b nh thi u ệ ế
máu t bào hình li m ế ề
làm m t v trí nh n ấ ị ậ
bi t enđonucleaza ế
gi i h n Cvnớ ạ I

Sau khi hai trình t ự

m i oligonucleotit ồ
bên c ch v trí Cvnạ ị I
đ c thêm vào, m t ượ ộ
s l ng nh ADN ố ượ ỏ
m u có th đ c ẫ ể ượ
nhân b i b ng PCRộ ằ
*
Quy trình PCR/OLA
*
Không ph i m i bi t đ i di truy n đ u sinh ra các gen khi m ả ọ ế ổ ề ề ế
khuy t nh h ng đ n s t n t i c a v trí nh n bi t ế ả ưở ế ự ồ ạ ủ ị ậ ế
enđonucleaza gi i h n=> C n có ph ng pháp khác đ phát hi n ớ ạ ầ ươ ể ệ
ra các bi n đ i nucleotitế ổ
*
Đ xác đ nh li u s g n n i có xu t hi n gi a hai m u ch th , ể ị ệ ự ắ ố ấ ệ ữ ẫ ỉ ị
m u dò X đ c đánh d u 5’ b ng biotin và m u dò Y đ c ẫ ượ ấ ở ằ ẫ ượ
đánh d u đ u 3’ b ng đigoxigeninấ ầ ằ
*
V i hai c p m u dò có th xác đ nh ch c ch n b n ch t di ớ ặ ẫ ể ị ắ ắ ả ấ
truy n c a cá th c n ki m tra b t kỳề ủ ề ầ ể ấ
*
H PCR/OLA nhanh, nh y, đ c hi u cao. Có th th c hi n t ệ ạ ặ ệ ể ự ệ ự
đ ng v i s tr giúp c a các robot các b c c a quy trình th ộ ớ ự ợ ủ ở ướ ủ ử
nghi m. Trong đi u ki n nh v y có th th c hi n đ c 1.200 ệ ề ệ ư ậ ể ự ệ ượ
ph n ng g n n i m i ngàyả ứ ắ ố ỗ