tổng quan về sắc ký lỏng

13

CHƯƠNG 3: TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG
11

3.1 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
HPLC là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được sử dụng rộng rãi
và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do: có độ nhạy tương đối cao, có khả năng định
lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, có
phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong các phòng
thí nghiệm đến công nghiệp và một số l
ĩnh vực khác.
Hợp chất có thể phân tích bằng sắc ký lỏng như acid amin, protein, acid nucleic,
hydrocacbon, carbohydrate, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu, các hợp chất vô cơ… Dựa
vào sự khác nhau về cơ chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà người
ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký
rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến. Tùy theo độ
phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏng pha thường và
sắc ký lỏng pha đảo.
 Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung
môi pha động, dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử
lượng không lớn lắm.
 Sắc ký lỏng pha đảo: ngược với sắc ký pha thường, pha tĩnh có độ phân cực thấp,
pha động có độ phân cực cao hơn. Phương pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ
không phân cực đến phân cực vừa. Dung môi sử dụng là dung môi phân cực, trong đó
nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền, do đó sắc ký lỏng pha đảo được sử dụng
nhiều nhất.
3.2 CÁC THÔNG SỐ CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
12

3.2.1 Hệ số phân bố
Cân bằng của một cấu tử trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình đơn
giản sau:
A pha động
 A pha tĩnh


14
Hệ số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố và được tính như sau:

Cs: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh
Cm: nồng độ cấu tử trong pha động
S: Pha tĩnh
M: Pha động
K tùy thuộc bản chất pha tĩnh, pha động và chất hòa tan. K nhỏ: chất di chuyển
nhanh; K lớn: chất di chuyển chậm.
Thông thường K
 1 để chất có ái lực với pha tĩnh nếu không thì nó sẽ di chuyển
nhanh quá làm cho khó tách. Hai chất muốn tách ra khỏi nhau thì phải có K khác nhau.
3.2.2 Thời gian lưu t
R


Là thời gian để chất phân tích sau khi tiêm vào cột đến đầu dò được tính theo công
thức:
t
R
= t’
R
+ t

M

t
M
: thời gian lưu chết của cấu tử không bị giữ lại trên cột, được tính gần đúng theo công
thức:
2
M
0,5 ( )
t
Ldc
V



trong đó:
L: chiều dài cột, cm
time

M
S
C
C
K 


15
dc: đường kính cột, cm
V: tốc độ dòng pha động, mL/phút
Có thể nhận danh chất thông qua thời gian lưu vì trong điều kiện thí nghiệm trên

cột thiết bị sắc ký lỏng nhất định, thời gian lưu của chất đó là một đại lượng xác định.
Thời gian lưu càng lớn thì hệ số phân bố càng lớn.
3.2.3 Hệ số dung lượng
Để mô tả tốc độ lưu của cấu tử phân tích trong cột người ta sử dụng một hệ số
quan trọng gọi là hệ số dung lượng k’.
Cs.Vs
'
C.V
MM M
Vs
kK
V


Vs: thể tích pha tĩnh
Vm: thể tích pha động
k' có thể tính theo công thức
k’ phải > 1 để peak của chất tan tách khỏi peak của dung môi nhưng không quá
lớn vì lúc đó thời gian phân tích sẽ kéo dài và mũi bị tù do chất ở trong cột quá lâu.
Khoảng k’ lý tưởng là từ 2 đến 5 nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp chúng ta có
thể chấp nhận k’ trong khoảng từ 0,5 đến 20.
k’ tăng hoặc giảm tùy thuộc độ mạnh của dung môi pha động. Trong s
ắc ký phân
bố pha đảo ngược, độ mạnh của dung môi tăng theo phần trăm chất hữu cơ.
Thông thường trong sắc ký phân bố pha đảo ngược, khi giảm dung môi hữu cơ
trong pha động 10% thì k’ sẽ tăng lên gấp 2 đến 3 lần.
3.2.4 Hiệu năng
Khi nói đến hiệu năng của cột là nói đến khả năng tách mũi sắc ký của một cấu tử
trên cột. Độ hiệu năng N được biểu diễn như số đĩa lý thuyết của cột. N càng lớn hiệu
năng tách của cột càng lớn.

M
MR
'
t
tt
k


2
2
1
R
2
R
w
t
5,55
w
t
16
H
L
N



















16
Với W: bề rộng mũi sắc ký
W
1/2
: bề rộng của mũi ở phân nửa chiều cao
Số đĩa lý thuyết càng lớn, bề rộng W càng nhỏ, mũi càng nhọn.
3.2.5 Độ chọn lọc 


22 2
11 1
'
α
'
RM R
RM R
Ktt t

Ktt t

 


Độ chọn lọc
 là một thông số rất quan trọng, liên quan tới khả năng tách của các
cấu tử cần phân tích, nó tùy thuộc bản chất của pha tĩnh, pha động.
Hai chất tách được khi
 # 1 và  càng lớn, khả năng tách càng cao.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ chọn lọc như thành phần dung môi pha động,
pH của môi trường, bản chất của pha tĩnh, nhiệt độ. Trong đó sự thay đổi pha động từ
dung môi này sang dung môi khác sẽ làm
 thay đổi đáng kể.
3.2.6 Độ phân giải
Độ phân giải (R
s
) tùy thuộc vào điều kiện pha động, pha tĩnh và đặc tính của hợp
chất cần phân tích mà ta có được sắc ký đồ với những mũi phủ lên nhau hoặc tách hẳn
nhau. Độ phân giải R
s
là một thông số dùng để đánh giá mức độ tách phổ, khả năng tách
của các mũi sắc ký sẽ có ý nghĩa quan trọng trong việc phân tích một cách định lượng.


Phương trình trên thích hợp cho việc tính R
s
khi 2 mũi tách hẳn nhau (R
s
 1,5).

Trong trường hợp R
s
nhỏ hơn, tức mũi bị trùng lấp thì việc xác định W
1
và W
2
sẽ
khó khăn hơn là W
1/2
(1) và W
1/2
(2) lúc này R
s
sẽ được tính theo:
21
1/2(1) 1/2(2)
1,18
RR
tt
Rs
WW




'
A
'
B
A

B
K
K
K
K
α

2
ww
tt
R
21
RR
S
12





17
2
2
'1
41 '1
s
k
RN
k





  







Khi k’
1
= k’
2
, →1:

1'
1
4'1
s
k
RN
k


  




Để có thể phân tích một cách định lượng thì 2 mũi kề nhau phải tách hẳn nhau, tức
R
s
 1,3. Khi R
s
 1 cần phải thay các thông số thực nghiệm để làm tăng R
s
.
Tóm lại: khi tiến hành một quy trình phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, thì
cần chú ý tới khả năng phân tách của các mũi trên sắc ký đồ. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng
lên phép xác định và tùy theo yêu cầu cần phân tích định tính, định lượng hay bán định
lượng mà chúng ta sẽ tối ưu hóa các thông số thực nghiệm của pha tĩnh cũng như pha
động cho hợp chất cần nghiên cứu.
3.3 GIỚI THIỆU CÁC BỘ PHẬN CỦA THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính: bơm, bộ phận tiêm
mẫu, cột sắc ký phân tích, đầu dò, bộ phận điều khiển và xử lý số liệu.

Hình 10: Mô hình cơ bản của HPLC.
Nguyên lý hoạt động: mẫu sau khi được tiêm vào cột sẽ được pha động lôi kéo qua
cột. Dựa vào khả năng tương tác khác nhau giữa các chất có trong nền mẫu với pha tĩnh
và pha động mà chúng được tách ra khỏi nhau và sau khi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi
bộ dò cụ thể.


18
Sắc ký lỏng có thể ghép với nhiều loại đầu dò khác nhau như đầu dò phổ tử ngoại
khả kiến UV-Vis, đầu dò huỳnh quang FLD, đầu dò chỉ số khúc xạ RID, đầu dò điện hóa
ECD, đầu dò khối phổ MS… Hiện nay đầu dò khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong

phân tích vết và các hợp chất nhận danh chính xác.
Tùy theo tính chất của chất cần khảo sát mà ta có thể chọn lựa pha tĩnh, pha động
(bảng 1).
Loại cột Pha tĩnh Dung môi Chất cần phân tích
C18 Octyldecyl ACN, MeOH, H
2
O Không phân cực
C8 Octyl ACN, MeOH, H
2
O Không phân cực
Phenyl Styryl ACN, MeOH, H
2
O Axit béo, chất có liên kết đôi
Cyano Cyanopropyl ACN,MeOH,H
2
O, THF Xeton, aldehyd
Amino Aminopropyl ACN, MeOH, H
2
O, THF,
CHCl
3
, CH
2
Cl
2

Đường, anion
Diol Dihydroxyhexyl ACN, MeOH, H
2
O, THF Protein

SAX Aromatic Quaterany Đệm Anion
Aromatic Đệm SCX
Acid sulfonic ACN, MeOH, H
2
O
Cation
Alkyl ether Đệm Diethyl
aminoethyl
DEAE
Diethylamine ACN, MeOH, H
2
O
Protein, anion
Alkyl ether Đệm CM
Acid acetic ACN, MeOH, H
2
O
Protein, cation

Si Hexane Silica
Silanol chloroform
Hợp chất hữu cơ
phân cực, đồng phân
Bảng 1: Loại cột, pha tĩnh, pha động và hợp chất phân tích thông dụng
13
.


19
Để định lượng anthocyanin trong các dịch trích bằng phương pháp HPLC người ta

còn kết hợp đầu dò UV/Vis với đầu dò ECD. Không giống HPLC bán định lượng chỉ để
làm sạch, HPLC- UV/Vis- ECD
dùng để phân tích. Chất phân tích được tiêm tự động và
cùng với pha động tới cột. Các hợp phần khác tương tác khác nhau với pha tĩnh và pha
động. Chất phân tích sau khi được rửa giải đi đến detector một cách riêng biệt. Phương
pháp HPLC-UV/Vis-ECD có một số đặc điểm sau:
 Pha động:
Pha động trong HPLC được đưa liên tục vào hệ thống. Pha động có thể theo
chương trình gradient dòng hoặc đẳng dòng, nhưng pha động cố định thường mất thời
gian lâu và khó tách các mũi. Hiện nay thường dùng nhất là dạng gradient. Khi rửa giải
trong sắc ký pha đảo, lượng dung môi hữu cơ tăng dần lên. Tại lúc tiêm mẫu, một lượng
pha động yếu hơn đi vào hệ (ít hợp phần hữu cơ hơn). Sau đó lại t
ăng tỉ lệ hữu cơ trong
pha động lên để rửa giải tất cả những chất bị giữ lại ở pha tĩnh.
 Cột
10
:
Có nhiều loại pha tĩnh khác nhau, dẫn đến cơ chế rửa giải cũng khác nhau. Trong
nghiên cứu này sử dụng cột pha đảo với pha tĩnh không phân cực và pha động phân cực.
Pha tĩnh chứa các hợp phần giống RMe
2
SiCl với R là các nhóm alkyl (C
18
H
37
hoặc
C
8
H
17

). Hợp phần không phân cực có ái lực với pha tĩnh nên thời gian lưu dài hơn. Thời
gian lưu có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi độ phân cực của pha động. Đường kính
trong của cột lớn tạo sức chứa lớn, được dùng trong HPLC
bán điều chế để làm sạch
anthocyanin. Cột phân tích dùng trong HPLC-UV/Vis-ECD có đường kính trong ID nhỏ
hơn (C
18
250 x 4.6mm).
3.3.1. Đầu dò UV-Vis
Đầu dò có gắn đèn UV (thường là đèn deuterim 190-360nm) và đèn Vis (đèn
tungsten, 360-800nm). Vì vậy các hợp phần hấp thu ánh sáng từ khoảng 180- 800nm sẽ
được đầu dò phát hiện.
Chất phân tích sau khi rửa giải ra khỏi cột chuyển qua 1 tế bào cảm biến hình trụ.
Ánh sáng trong vùng UV/Vis truyền qua tế bào tới mảng quang điện. Nếu chất phân tích
hấp thu được ánh sáng ở 1 bước sóng nào đó, mảng quang điện sẽ phát hiện ra sự thay


20
đổi. Tín hiệu phát ra từ mảng quang điện sẽ chuyển tới bộ khuếch đại đến bộ ghi đo và hệ
thống thu dữ liệu.
Cường độ dòng sáng truyền qua cell đo (I) tỉ lệ với nồng độ của chất phân tích
theo định luật Lamber- Beer (
- hệ số hấp thu phân tử, c- nồng độ (mol/L), l- chiều dài
đường truyền quang (l luôn là 1 cm), I
o
là cường độ của tia sáng tới cell):
A=
  l  c
10
0

A log
tiem
I
I
DientichECD
C
FVn
DientichUV
C
l













Anthocyanin có 2 bước sóng hấp thu ở 530nm và 280nm, vì vậy có thể sử dụng
đầu dò UV/Vis. Trong HPLC định lượng, có thể dùng UV/Vis kết hợp với ECD hoặc với
MS.
3.3.2. Đầu dò ECD:
3.3.2.1 Tính chất điện hóa của anthocyanin:
Hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất thiên nhiên phụ thuộc vào số lượng các
phân tử hiện diện trong mẫu và cấu trúc của chúng, ví dụ vị trí nhóm -OH hay -OCH

3
.
Anthocyanin có đặc tính chống oxi hóa do các nhóm -OH trên vòng thơm. Chất chống
oxi hóa là một chất khử khi tương tác với các gốc tự do, nghĩa là chúng bị oxi hóa trên bề
mặt điện cực. Chất chống oxi hóa ngăn sự hình thành và hoạt động của oxi và nitơ.
Ta có thể thấy ở hình 11, nhóm catechol ở vòng B và các nhóm resorcinol ở vòng
A của catechin có thể bị oxi hóa. Vòng A và B không liên hợp nhau nên sự oxi hóa các
nhóm -OH của vòng này không ảnh hưởng tới các nhóm -OH trên vòng kia. Cấu trúc
catechin có các nhóm -OH gắn vào vòng thơm có thể bị oxi hóa. Vòng B dễ
bị oxi hóa
hơn vòng A, vì vậy khi áp thế 100 ÷ 800mV thì các -OH trên vòng B sẽ bị oxi hóa, trên
1500mV vòng A sẽ bị oxi hóa.



21



Hình 11: Sự oxi hóa của các nhóm catechol.
Một số nghiên cứu cho thấy các nhóm -OH ở vị trí meta (trên vòng A) khó bị oxi
hóa hơn ở vị trí para hoặc ortho (trên vòng B). Kết quả là, anthocyanin sẽ bị oxi hóa
nhiều bước ở các thế áp khác nhau, tùy vào thứ tự oxi hóa của các nhóm -OH khác nhau.
So với đầu dò UV/Vis, đầu dò ECD nhạy hơn và chọn lọc hơn đối với anthocyanin có
hàm lượng nhỏ.
Cơ chế của quá trình oxi hóa xảy ra theo thứ tự sau:
1.
Sự oxi hóa các nhóm -OH trên vòng B ở thế dương bé
2.
Sự oxi hóa các nhóm -OH trên vòng A ở thế cao hơn

Thế oxi hóa tùy thuộc vào pH, khi pH tăng lên sẽ làm giảm thế oxi hóa.
Nói chung, các nhóm -OH ở vị trí ortho trên vòng B bị oxi hóa ở 450mV. Nhóm
methoxyl và đường làm tăng khả năng chống oxi hóa của anthocyanin. Vòng A và B
không liên hợp nhau nên sự oxi hóa của các nhóm -OH trên vòng A không ảnh hưởng
đáng kể tới sự oxi hóa các nhóm -OH ở vòng B và ngược lại. Vì vậy từ phương pháp
quang phổ có thể kết luận rằng vòng A không ảnh hưởng trên tính chất phổ của các gốc
tự do t
ừ vòng B.
3.3.2.2 Nguyên lý của HPLC/ECD
6,14,15,16


22
Thiết kế máy HPLC - ECD về mặt cơ bản không khác gì HPLC truyền thống,
ngoại trừ đầu dò quang học được thay bằng đầu dò ECD. Đầu dò ECD được dùng từ
1974. Lược đồ về cơ chế mô tả hệ thống HPLC - ECD ở hình 14. Thiết bị gồm bơm để
đẩy dung môi động bằng áp suất hệ thống. Cột phân tích chứa vật liệu nhồi cột (thường là
lớp nền trơ đượ
c phủ với bề mặt kị nước, chẳng hạn các dẫn xuất của hydrocacbon đa
vòng) để phân tách chất dựa trên thời gian lưu. Đầu dò điện hóa nối trực tiếp với cột. Để
tăng hiệu suất và độ lặp lại, mẫu được tiêm bằng hệ thống tiêm mẫu tự động, bộ tạo
gradient điều khiển thành phần pha động, tất cả
các hệ thống này đều phục vụ cho máy
tính và máy tính thu phổ sắc ký đồ. Để làm phong phú phần dữ liệu, đầu dò PDA nối trực
tiếp và đặt trước đầu dò ECD. Thành phần pha động chứa nồng độ chất điện ly cao để
thuận tiện cho dòng đi qua đầu dò ECD. Thường pha động ở môi trường acid chứa
Li
3
PO
4

hoặc Na
3
PO
4
. Li
3
PO
4
dễ tan trong dung môi hữu cơ (MeOH hoặc ACN) và vi
khuẩn không phát triển khi có mặt Li nên Li
3
PO
4
thường ưa dùng trong dung môi động.
Cần làm sạch dung môi động với khí trơ He để loại oxi vì oxi cản trở việc phát hiện chất
phân tích siêu nhạy.
Khi chất phân tích đi qua điện cực làm việc (điển hình là điện cực Cacbon nhưng
thường là điện cực kim loại), phản ứng hóa học xảy ra nhờ đó chất phân tích mất một
(hoặc nhiều) điện tử. Nhữ
ng điện tử này được phát hiện bằng một dòng chảy qua điện
cực làm việc. Vì thế, tín hiệu hóa học chuyển thành tín hiệu điện tử mà không cần chất
mang từ tính trung gian. Dòng chảy qua điện cực làm việc vào một thời điểm nào đó là
một hàm tuyến tính với số phân tử bị oxi hóa tại bề mặt điện cực. Thế điện hóa củ
a điện
cực làm việc có thể biến đổi để xác định một cách chọn lọc chất phân tích; bất kì chất nào
ra khỏi cột sắc ký mà không bị oxi hóa dưới thế áp vào thì đầu dò sẽ không phát hiện
được. Do đó ECD có một chức năng chọn lọc nội tại mà các hệ thống đầu dò khác không
có. Thêm vào đó, ECD cực kỳ nhạy, giới hạn phát hiện nhỏ gấp 10 ÷ 1000 lần độ nhạy
c
ủa đầu dò UV/Vis và gấp 10 lần đầu dò huỳnh quang.

23

Hình 12: Hệ thống LC-UV-ECD tại phòng thí nghiệm

Hình 13: Nguyên lý hoạt động của đầu dò điện hóa.
A: ECD loại ampe gồm đầu dò gắn vào thành của rãnh hẹp, chất phân tích được chuyển
qua. Phản ứng điện hóa chuyển chất X thành sản phẩm bị oxi hóa Y.
B: ECD dạng coulom gồm một điện cực xốp mà chất phân tích sẽ chuyển qua, phản ứng
điện hóa hiệu quả hơn và cải thiện được sự truyền khối.
Đầu dò điện hóa ở hình 13A là loại đầu dò ampe. Đây là dạng cơ bản nhất của
ECD. Khi chất phân tích chảy qua điện cực làm việc (thường là Cacbon nhưng cũng có


24
khi là kim loại), phản ứng hóa học xảy ra lúc này chất phân tích mất đi một hoặc nhiều
điện tử (tức là chất phân tích bị oxi hóa). Những điện tử này được phát hiện dưới hình
thức dòng điện chạy qua điện cực làm việc. Do đó thông tin hóa học về chất phân tích
được chuyển thành tín hiệu điện mà không cần chất mang từ tính hoặc quang học trung
gian. Dòng chạy qua pin điện hóa
ở bất kì thời điểm nào đều tuyến tính với số mol được
oxi hóa trên bề mặt pin tại thời điểm đó. Thế điện hóa của điện cực làm việc có thể biến
đổi cho phép xác định chất phân tích chọn lọc hơn dựa trên thế oxi hóa; bất kì hợp chất
nào đi ra khỏi cột mà không oxi hóa dưới thế áp vào cell đo thì đầu dò sẽ không nhận ra.
Do vậy đầu dò ECD có m
ột chức năng chọn lọc nội tại mà các đầu dò quang học không
có. Tuy nhiên, loại đầu dò này ít nhiều không hiệu quả vì chỉ có 5 - 10% chất phân tích
chuyển qua điện cực làm việc sẽ khuếch tán đến bề mặt điện cực và thực hiện quá trình
điện hóa. Do dạng hình học của đầu dò nên chỉ cho phép sự oxi hóa tại lớp phân cách

(boundary), chỉ một phần chất phân tích truyền qua đầu dò được oxi hóa. Loại
đầu dò
coulom tốt hơn (hình 13B), loại này có matrix xốp, thường là Cacbon. Điện cực so sánh
và điện cực bổ trợ (counter) dạng kim loại (thường là Paladium). Đối với dung dịch
loãng, đầu dò coulom gần như đẩy hết chất phân tích chuyển hóa trên điện cực dưới thế
áp của đầu dò. Dòng được hướng trực tiếp vào đầu dò chứ không phải truyền qua. Diện
tích bề mặt điện cực t
ăng đáng kể, dòng chuyển động mạnh nên pha trộn lớp dung dịch ở
phần biên giúp các điều kiện được thỏa mãn. Vì vậy, đầu dò nhạy hơn 10 - 20 lần đầu
dò ampe vì cải thiện được sự truyền khối. Trong thực hành đầu dò ampe và đầu dò
coulom không khác nhau nhiều về độ nhạy nhưng nhìn chung đầu dò culong được ưa
chuộng hơn.
3.3.2.3 Cơ chế
Các chất có thể khử hoặc oxi hóa trải qua phản ứng oxi hóa trên bề mặt điện cực,
tạo sự thay đổi dòng và được đầu dò ECD ghi nhận. Hình 14 mô tả cơ chế của pin điện
hóa: 1 cặp điện cực được đặt vào trong pin và áp thế dọc theo điện cực. Khi thế đủ lớn,
phản ứng diễn ra và xuất hiện dòng điện.
Cường độ dòng I được ghi
đo theo thời gian, diện tích peak ứng với tổng điện tích
Q trao đổi giữa điện cực và chất có hoạt tính điện hóa, được tính theo công thức sau:
Diện tích peak = Q =
i
.
dt


25
Định luật điện phân Faraday liên kết Q với nồng độ chất hoạt động điện cực qua
phương trình:
Q = n

 F n
tiêm

Với n
tiêm
= [C]  V
tiêm

 Q = n  [C]  V
tiêm
F
Trong máy Dionex chúng tôi biểu diễn theo hiệu điện thế V thay vì cường độ I,
cường độ dòng này được biến đổi thành hiệu thế bằng cách nhân với điện trở R
 Diện tích peak = R ∫i
.
dt =   n × [C] × V
tiêm
× F
Với:
R: là điện trở của thiết bị (có thể tính toán hoặc biết được từ nhà sản xuất), còn gọi
là hệ số

i: dòng đo được bởi đầu dò điện hóa.
n: số electron trao đổi liên quan tới quá trình điện cực.
C: nồng độ của chất hoạt động điện cực.
V
tiêm
: thể tích tiêm (L)
F: hằng số Faraday = 96500 (C/mol).
n

tiêm
là số mol chất phân tích được tiêm vào máy.
Nếu biết được số electron trao đổi n trong hợp chất có tính điện hóa, sẽ biết được
nồng độ chất phân tích từ diện tích peak ở sắc ký đồ HPLC- ECD.



26
Hình 14: Sơ đồ của hệ HPLC- ECD. Đường mũi tên đậm là pha động. Đường đứt nét chỉ
mối liên hệ giữa các thiết bị.

Hình 15: (a) mô phỏng phản ứng trên pin điện hóa (2 điện cực đặt trong dung dịch chứa
hợp chất có hoạt tính điện hóa); (b) pin điện hóa thật- điện cực bổ trợ (A) áp thế cố định bởi
Amp.1, thế được chọn lọc từ máy điện thế (P) kết nối với nguồn điện. Dòng chảy qua điện cực
làm việc được đ
iều khiển bằng bộ ampe thứ 2 (Amp.2) và dữ liệu đi ra hướng vào đầu đọc hoặc
hệ thống quản lý dữ liệu; (c) hệ điện cực culong sử dụng điện cực carbon graphite lỗ xốp, trên
mỗi đơn vị điện cực có 1 điện cực carbon lỗ xốp, trên cả 2 mặt có gắn điện cực so sánh và điện
cực bổ
trợ. Khi áp suất dọc theo điện cực khá nhỏ, các đơn vị điện cực có thể kết nối lại thành
chuỗi, tạo mảng array.
Một pin điện hóa cơ bản cần 3 điện cực: điện cực làm việc (ở đây sẽ diễn ra quá
trình oxi hóa hoặc khử), điện cực bổ trợ và điện cực so sánh (dòng điện chạy qua rất bé,
để dung hòa bất kì sự thay đổi trong độ dẫn nền của pha động). Pin điện hóa được sử
dụng có độ nhạy cao, bề mặt r
ộng đảm bảo 100% chất phân tích hoạt tính điện cực sẽ bị
oxi hóa hoặc khử. Dòng đo ở đầu ra có đơn vị mV (U = I
 R, U có đơn vị là mV, I có
đơn vị là mA, R có đơn vị là
).

Việc trao đổi điện tử xảy ra tại ranh giới của điện cực làm việc và chất hoạt động
trong dung dịch điện dẫn. Tỷ lệ trao đổi điện tử, tức độ lớn của dòng chuyển qua, chính là
tốc độ phản ứng tại thế áp. Tỷ lệ này cũng tùy thuộc vào tốc độ của chất khảo sát đến bề
m
ặt điện cực bằng khuếch tán và đối lưu.
Số electron trao đổi n của các chất điện hoạt có thể được xác định bằng phương
pháp vol-ampe. Nguyên tắc của phương pháp được mô tả như sau:


27
 Cách xác định số electron trao đổi bằng vol-ampe
19,20,21
:
Các phương pháp điện hóa sử dụng trong hệ sinh học mô phỏng bản chất chống
oxi hóa dựa trên mối liên hệ chặt chẽ giữa khả năng oxi hóa khử của hóa chất trong dung
dịch và hoạt tính điện hóa tại bề mặt điện cực, cường độ của chất chống oxi hóa trong
môi trường và thế áp để chúng bị khử trên bề mặt điện cực (chất khử
càng mạnh thế áp
càng ít dương). Thực tế một chất chống oxi hóa là chất khử trong tương tác với gốc tự do,
lúc này chúng sẽ bị oxi hóa, tuy nhiên không phải lúc nào cũng vậy. Những chất chống
oxi hóa khác nhau phản ứng với các gốc tự do và các chất oxi hóa khác nhau ở nhiều mức
độ, cũng như chúng sẽ hoạt động trên các bề mặt điện cực khác nhau với mức độ khác
nhau. Dù biến đổi như v
ậy nhưng chúng cũng cho phép định danh và định lượng. Mặc
khác, chất chống oxi hóa ngăn sự hình thành và khả năng hoạt động của nitrogen và
oxygen từ những dạng hoạt động khác.
Trong phương pháp vol-ampe, thế áp của điện cực làm việc thay đổi tuyến tính với
thời gian, bắt đầu từ thế E mà ở đó không xảy ra phản ứng điện hóa đến giá trị E xảy ra
sự khử/oxi hóa ch
ất nghiên cứu. Sau khi đi ngang qua vùng thế có một hoặc hai phản ứng

điện hóa xảy ra, hướng quét tuyến tính đảo lại, các sản phẩm cũng như sản phẩm trung
gian tạo ra từ lần quét đầu sẽ thực hiện phản ứng điện hóa và được ghi nhận. Khoảng thời
gian thí nghiệm (chính là vận tốc quét và thế E nghiên cứu) có thể biến đổi 10
2
-10
-3
s mặc
dù các phản ứng định lượng thường giới hạn 10-10
-3
s. Chất điện ly bổ trợ có mặt để kìm
hãm sự di chuyển của các điện tích.
Các thí nghiệm được thực hiện trên cell 3 điện cực kín khí nối với dòng argon,
dung dịch được sục khí argon 5-10 phút để đuổi oxi trước mỗi lần đo, thể tích cell là
10mL. Quét thế từ -200 tới 1200mV và -200 tới 600mV. Điện cực so sánh là calomen
bão hòa cách biệt với dung dịch bởi cầu nối, bên trong cầu nối có cùng dung môi và chấ
t
điện ly bổ trợ. Điện cực bổ trợ có dạng xoắn diện tích bề mặt 1cm
2
, là 1 sợi platium dài
khoảng 5cm đường kính 1mm. Điện cực làm việc gồm những đĩa thu được từ mặt cắt
ngang của sợi dây bằng vàng có các đường kính khác nhau đặt bên trong vật liệu thủy
tinh. Giữa các lần chạy, điện cực làm việc được đánh bóng bằng bột alumina trong 3 phút
để loại bỏ các sản phẩm oxi hóa hấp thụ mạnh trên bề mặt điện cực, những sản phẩ
m này
sẽ cản trở bề mặt điện cực, ảnh hưởng tới lần thế thứ 2 dù là ở pH nào. Điện cực làm việc


28
cũng có thể làm bằng Cacbon đường kính 3mm hoặc có dạng đĩa quay đường kính 2mm
nằm giữa lõi Teflon, hoạt động ở vận tốc góc

 = 105rad/s, quét thế 20mV/s đảm bảo
trạng thái ổn định.
Số electron trong phản ứng điện hóa có thể được xác định bằng nhiều cách.
Phương pháp phổ biến nhất dùng phép đo điện lượng coulometry, xác định số lượng của
chất điện phân giải phóng trong thời gian điện phân bằng cách đo số culong đã sử dụng.
Tuy nhiên khi sử dụng giá trị n từ phương pháp culong để giả
i thích phổ CV thường gặp
trở ngại, vì khoảng thời gian và các điều kiện phản ứng tương đối khác nhau. Trong phép
đo điện lượng coulometry thời gian là 1 giờ và lớp phản ứng là dung dịch gốc của cell đo,
còn trong phương pháp CV thời gian ngắn hơn 1 giây và lớp phản ứng khoảng một vài
mm tính từ bề mặt điện cực.
Các bài báo trước đây thường dùng một phương pháp rất ph
ổ biến để xác định n
trong CV là: chất chuẩn, thường là ferrocene (n = 1), được thêm vào cùng với mẫu trong
cell đo CV, rồi so sánh trực tiếp cường độ peak của chuẩn và chất nghiên cứu. Tuy nhiên
việc so sánh này dựa trên giả thiết hệ số khuếch tán của chuẩn và mẫu là như nhau
(thường hệ số khuếch tán rất khó biết trước). Ngoài ra cũng phải tính đến các phản ứng
hóa học đồng thể và dị thể có th
ể ảnh hưởng tới hình dạng và chiều cao của sóng điện
thế. Do đó phương pháp này luôn thiếu chính xác. Tuy nhiên, nếu đo lường từ kỹ thuật
tức thời:
I
transient
= n  D
1/2
 F  A  c
o
 (  T
c
)

-1/2

 i
transient
tỉ lệ với n  D
1/2

Với T
c
: thời gian khảo sát riêng.
A: diện tích bề mặt điện cực.
F: hằng số Faraday = 96500.
D: hệ số khuếch tán bề mặt.
c
o
: nồng độ của dung dịch.
Kết hợp với phép đo điện lượng voltametry trạng thái tĩnh (đo dòng Faraday đi
qua dung dịch điện phân khi áp thế thích hợp vào điện cực làm việc)


29
i
steady state
= n  D  4F  c
o
 r
o

 i
steady state

tỉ lệ với n  D.
D: hệ số khuếch tán cầu.
r
o
: bán kính.

transient
steadystate
i
n
i
 , lúc này hệ số khuếch tán D được giản lược.
Nếu sử dụng các điện cực khác nhau cho phép đo tức thời và trạng thái tĩnh, cần
điều chỉnh dòng đo được vì có hiệu ứng diện tích điện cực. Tuy vậy chúng ta có thể tránh
việc chuẩn hóa này nếu các phép đo giống nhau thực hiện trên cùng điện cực và cùng một
chất chuẩn đã biết n và D giống như ferrocene.
3.3.3 Gi
ới thiệu về LC/MS/MS
12
Sắc ký lỏng ghép khối phổ là một thiết bị lý tưởng cho các phòng thí nghiệm.
LC/MS là phương pháp được dùng trong phân tích vết và các hợp chất cần nhận danh
chính xác vì trong những điều kiện vận hành nhất định ngoài thời gian lưu đặc trưng, hóa
chất còn được nhận danh bằng khối phổ của nó. Độ nhạy LC/MS tùy thuộc vào hợp chất
cần phân tích và giao diện sử dụng. Trong sắc ký lỏng ghép khối phổ, hỗn h
ợp chất phân
tích sau khi tách ra khỏi cột sẽ đi qua một đường truyền đến đầu dò khối phổ. Cột sắc ký
lỏng cho phép tách chất cần quan tâm, khối phổ cho phép tách ion cần quan tâm và cho
biết phân tử lượng của chất phân tích. Một hệ thống LC/MS/MS sẽ phân mảnh ion mẹ
thành các ion con và tách các ion con để định danh và định lượng.
Một hệ LC/MS cơ bản gồm hệ thống bơm sắc ký lỏng, bộ phận tiêm m

ẫu, cột sắc
ký, đầu dò khối phổ.
Nhiệm vụ của đầu dò khối phổ:
 Nhận danh hóa chất:
Một mũi trên sắc ký đồ với thời gian lưu xác định đặc trưng cho hóa chất, t
R
này
chính là thời gian từ lúc hóa chất bắt đầu vào cột và ra khỏi cột để vào đầu dò khối phổ.


30
Mũi này biểu diễn tổng cường độ các ion sinh ra từ phân tử hóa chất thông qua kỹ
thuật ion hóa xác định. Tổng các mũi này trên sắc đồ hợp thành sắc đồ tổng ion (total ion
chromatogram).
Mũi này cũng có thể biểu diễn cường độ của một loại ion sinh ra từ sự phân mảnh
của phân tử hóa chất hoặc từ sự phân mảnh của một loại ion của hóa chất.
Khối phổ tươ
ng ứng của hóa chất hoặc khối phổ biểu diễn cường độ các ion sinh
ra từ một ion nhất định. Như thế việc nhận danh thông qua vừa thời gian lưu vừa khối
phổ sẽ chính xác hơn là chỉ dựa vào thời gian lưu.
 Định lượng nồng độ của hóa chất trong mẫu.
 Các bộ phận chính của khối phổ gồm: bộ tạo ion, bộ tách ion, bộ dò ion.
So sánh 2 kỹ thuật ion hóa APCI và ESI:
Giống nhau:
-
Đều thuộc loại ion hóa mềm, ít tạo sự phân mảnh, trong nhiều trường hợp còn thấy
được phân tử ban đầu.
-
Nếu có sự phân mảnh ion thì cách phân mảnh cũng đơn giản, giúp đoán nhận cấu
trúc chất ban đầu dễ dàng hơn.

-
Cả hai kỹ thuật đều có thể tạo ion âm hoặc dương tùy theo cấu trúc hợp chất khảo
sát.
31
Khác nhau:
Kỹ thuật phun ion (ESI: electrospray
ionization)

- Ion tạo trong pha dung dịch
- Thích hợp cho chất không bền nhiệt
- Có thể tạo sự phân mảnh ít hơn APCI
- Thích hợp cho chất khá phân cực
- Thích hợp cho chất có phân tử khối
lớn
Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất thường
(APCI: atmospheric pressure chemical
ionization)
- Ion tạo trong pha hơi
- Thích hợp cho chất không bền nhiệt
- Có thể tạ
o sự phân mảnh nhiều hơn ESI
- Thích hợp cho chất ít phân cực
- Thích hợp cho chất có phân tử khối nhỏ


32

 Kỹ thuật APCI: khi phân tử chất phân tích và dung môi đi qua một lò sấy sẽ hóa hơi,
các phân tử hơi được khí N
2

phun ra và đi vào vùng phóng điện (corona discharge). Hiện
tượng ion hóa xảy ra:
 Cơ chế tạo ion dương:
N
2
+ e
-
→ N
2
+ 2e
-

H
2
O + e
-
→ H
3
O
+
+2e
-

H
2
O + H
3
O
+
→ H

3
O
+
+ OH
·

M + H
3
O
+
→ MH
+
+ H
2
O
 Cơ chế tạo ion âm: với những phân tử có H linh động, trong vùng phóng
điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H
+
, phần còn lại là một anion:
OH
·
+ M → (M-H)
-
+ H
2
O
 Kỹ thuật phun ion ESI:
- Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao
quản bằng kim loại cao thế và sau đó được phun mịn bằng khí N
2

thoát ra chung quanh ống
mao quản.
- Dưới tác dụng của điện thế cao, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện tích
thoát ra từ đầu ống mao quản.
- Sau đó các phân tử dung môi từ từ bốc hơi. Các hạt mang điện có thể tích nhỏ dần
và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu, chúng sẽ bể ra thành những hạt nhỏ mang
điện tích.
- Sau
đó các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một
cửa rất nhỏ. Dung môi và khí N
2
bị bơm hút ra ngoài.


33
- Điện thế dương ở đầu kim tạo ion dương, điện thế âm thì tạo ion âm và được quyết
định tùy theo chất khảo sát.
- Các chất có tính acid tạo ion âm ở pH cao, còn chất có tính baz tạo ion dương ở pH
thấp.
3.3.4 Giới thiệu thiết bị khối phổ FINNIGAN LCQ deca
17
(hãng Thermo Quest
Finnigan).
Thiết bị HPLC (TPS Spectra system) bao gồm bộ lấy mẫu tự động (spectra system
AS3000), bơm P4000 gradient pump (spectra system P4000) và bộ loại khí chân không,
đầu dò UV 6000 (spectra system SN4000) LP flow cell 5cm nối với đầu dò MS (LCQ
Deca). Thể tích anthocyanin khoảng 10L tiêm vào cột Phenomenex (Torrance, California,
USA) Luna C18 (150mm  2.0mm, kích thước hạt 3m), chương trình rửa giải ở bảng 3.

Hình 16: Hệ thống LC-UV- MS tại phòng thí nghiệm

Đầu dò MS là một bẫy ion LCQ-Deca (ThermoFinnigan) với giao diện ion hóa phun
điện tử chạy ở dạng ion dương. Áp thế dương +3 → +4kV vào kim silica, dung môi tạo
giọt bay lên, khí Helium đẩy các hạt khí và giúp phân nhỏ, các hạt khí này va chạm nhau,
dòng điện 80mA, thế mao quản 23mV, nhiệt độ mao quản 225
o
C, thấu kính (tube lens) cài


34
đặt ở hiệu thế -5V, sheath gas (He) 1.2 L/phút và khí bổ trợ (He) 6 L/phút. Phổ hấp thu
DAD đặt ở bước sóng 200 tới 800nm. Bẫy ion chạy ở dạng quét scan MS/MS tùy thuộc dữ
liệu, lần quét đầu cài đặt ở khoảng m/z= 200-1200. Lần quét thứ hai khai báo ion có cường
độ cao nhất từ lần quét đầu và thu phổ MS lần hai, tương tự lần quét 3 MS
3
khai báo ion
cường độ cao ở lần 2. Năng lượng va chạm 28%, thời gian kích hoạt 30ms. Sau khi được
tách nhỏ, ion con có điện tích lớn hơn điện tích của phân tử mẹ, ESI là kỹ thuật ion hóa
mềm, chỉ cần vài giây để thực hiện sự phân mảnh.

Hình 17: Sơ đồ của giao diện ESI
14
Nhìn chung, 1 chất đi vào máy MS trải qua 3 bước:
 Đầu tiên, phân tử được bắn phá bởi dòng electron năng lượng cao, chuyển phân tử
thành ion. Ion phân tử tăng tốc đến trường tĩnh điện.
 Tiếp theo, trong trường tĩnh điện hay nam châm điện, các ion gia tốc được phân tách
tùy theo tỉ lệ khối lượng/điện tích.
 Cuối cùng, các ion có tỉ lệ khối lượng/điện tích đặc trưng
được phát hiện. Dòng ra
của đầu dò được khuếch đại và ghi đo.
Chất phân tích từ sắc ký lỏng hoặc bơm xy lanh chuyển qua kim phun, tạo các giọt

tích điện ở cuối đầu kim. Dòng He không tích điện trung hòa chất lỏng và giúp dung môi
bay hơi thành giọt. Khi dung môi bay hơi, các phân tử chất phân tích bị đẩy gần nhau hơn,


35
chúng đẩy lẫn nhau và các giọt bị vỡ ra. Quá trình này do lực kháng culong giữa các ion
gây ra. Quá trình này sẽ dừng lại khi các phân tử không còn liên kết với dung môi và trở
thành các ion riêng rẽ. Sau đó chúng được phát hiện. Anthocyanin ở dạng ion dương, vì
vậy chúng không cần ion hóa mà trực tiếp đi vào máy MS sau khi bay hơi dung môi. Quá
trình như sau:

Thí nghiệm khối tandem mass chính là các bước lựa chọn khối phổ với các dạng vỡ
xuất hiện giữa các quá trình. Trong thí nghiệm tandem mass, thông tin về cấu trúc được tìm
thấy qua các mảnh vỡ lần 2 và 3 (MS
2
, MS
3
). Với anthocyanin, khi các nhóm đường mất
đi, tùy vào khối lượng phân tử bị mất, có thể xác định đó là đường hexose hay pentose. Sau
khi mất gốc đường, sẽ nhận biết nhóm aglycone. Loại aglycone được nhận danh khi so
sánh với những nhóm đã biết.

Hình 18: Mô tả phương pháp tandem mass tạo ra các mảnh vỡ ion từ MS
2
trong thiết bị
triple quadropole.
Trong ion trap, các ion bị loại ra khỏi bẫy ngoại trừ ion cần được bắn phá ở lần 2.
Thiết bị áp một tần số sóng radio svới tần số cộng hưởng bằng với vận tốc góc  của ion
trong bẫy. Nhờ tần số sóng này, năng lượng động lực được chuyển vào ion và ion bắt đầu
luân chuyển trong ion trap ở một bán kính lớn hơn.

E
kinetic
= m × r × 
2



36
Ion có nguồn năng lượng động học này sẽ va chạm với một trong các nguyên tử He
vốn ở sẵn trong ion trap, lúc này quá trình bắn phá xuất hiện. Năng lượng động học này tùy
vào độ khuếch đại của tín hiệu sóng radio và được hiệu chỉnh bởi số % do bộ vận hành MS,
trong máy LC-UV-MS tại trường Roskidle khoảng 25-50%.