PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH BACTERIOCIN TRONG HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG

TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH
BACTERIOCIN TRONG HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG








CBHD: ThS. TRẦN THỊ TƯỞNG AN
KS. QUÁCH ĐỨC TÍNH
SVTH:

NGUYỄN HỮU DOÃN

MSSV:

60600311
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

LỜI CẢM ƠN

Trong khoảng 4 tháng làm luận văn, tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:
Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ Nguyễn Thúy Hương – Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại
học Bách Khoa Tp HCM đã nhiệt tình giúp đỡ các vấn đề liên quan và tặng giống vi sinh
vật dùng trong đề tài.
Thạc Sĩ Trần Thị Tưởng An đã ân cần hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ trong suốt
quá trình làm luận văn.
Kỹ Sư Quách Đức Tính đã tặng giống và hướng dẫn tận tình trong quá trình thực
hiện đề tài này.
Các cán bộ phòng thí nghiệm 102, 108 và 117B2 đã tạo điều kiện cho tôi có thể
sử dụng các thiết bị và dụng cụ phục vụ cho đề tài.
Cha mẹ và người thân đã giúp đỡ về mặt tinh thần và kinh tế để tôi có thể an tâm
hoàn thành luận văn.
Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Đại học Bách Khoa Tp HCM đã cùng giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Và cuối cùng là gửi đến các quý thầy cô trong hội đồng phản biện đã giành thời
gian đọc và nhận xét luận văn này.

Tp HCM, ngày 10 tháng 01 năm 2011
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hữu Doãn







TÓM TẮT


Bacteriocin là một loại protein do vi khuẩn lên men tạo ra. Với mục tiêu tìm hiểu
thêm về tổ hợp vi khuẩn lactic trong hạt kefir và khả năng sinh bacteriocin của chủng
LAB nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập hệ vi khuẩn lactic có hoạt tính
bacteriocin trong hạt kefir và ứng dụng”. Quá trình thí nghiệm chúng tôi đã thực hiện
những nội dung và đạt kết quả như sau:
Nội dung đề tài:
1. Phân lập hệ vi khuẩn lactic từ hạt kefir có nguồn gốc từ bộ môn Công nghệ sinh
học – Đại học Bách Khoa Tp HCM, thử khả năng sinh hoạt tính bacteriocin, định
danh chủng mục tiêu bằng bộ kit API 50 CHL.
2. Lên men thu nhận bacteriocin.
3. Ứng dụng bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế.
Kết quả đề tài:

1. Kết quả phân lập hệ vi khuẩn lactic từ hạt kefir: Phân lập được bảy chủng vi
khuẩn. Có sáu chủng Gram dương (đều là vi khuẩn lactic) và một chủng Gram âm.
2. Thử khả năng sinh hoạt tính bacteriocin: có tất cả sáu chủng sinh hoạt tính
bacteriocin.
3. Kết quả khảo sát hoạt tính bacteriocin: Hoạt tính bacteriocin thô của chủng
Lactobacillus acidophilus (L2) là 457 AU/ml.
4. Khảo sát bảo quản cá Diêu Hồng:
So với mẫu đối chứng (không tác nhân bảo quản) thì mẫu bảo quản bằng dịch
bacteriocin thô kết hợp với dịch chitosan 1% bảo quản tối đa ba ngày.

i
MỤC LỤC
MỤC LỤC i
CÁC TỪ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC SƠ ĐỒ vi
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Kefir 2
1.1.1. Nguồn gốc và sự hình thành 2
1.1.2. Cấu tạo hạt kefir 2
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong hạt kefir 4
1.2. Vi khuẩn lactic 6
1.2.1. Khái niệm 6
1.2.2. Phân loại 6
1.2.3. Đặc điểm chung. 7
1.3. Bacteriocin 8
1.3.1. Giới thiệu chung 8
1.3.2. Phân loại 9

1.3.3. Tính chất 11
1.3.4. Hoạt động của bacteriocin 12
1.3.5. Tính kháng khuẩn và phương pháp xác định tính kháng khuẩn. 14
1.3.6. Một số loài vi khuẩn khác sinh bacteriocin 15
1.3.7. Ứng dụng của bacteriocin 16
1.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về sản xuất bacteriocin 17
1.4.1. Các nghiên cứu trong nước 17
1.4.2. Các nghiên cứu nước ngoài 20
1.5. Cá Diêu Hồng 22
1.5.1. Giới thiệu sơ lược 22
1.5.2. Tình hình nuôi ở Việt Nam 22
1.5.3. Hệ vi sinh vật cá 23
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25
2.1. Vật liệu 25

ii
2.1.1. Giống vi sinh vật 25
2.1.2. Môi trường nuôi cấy 25
2.1.3. Hóa chất 25
2.1.4. Thiết bị và dụng cụ 25
2.2. Nội dung đề tài 25
2.3. Phương pháp thí nghiệm 26
2.3.1. Phân lập hệ LAB trong hạt kefir 26
2.3.2. Quan sát đặc điểm đại thể và vi thể 27
2.3.3. Thử khả năng sinh acid lactic 28
2.3.4. Khảo sát đặc điểm sinh lý 28
2.3.5. Các thử nghiệm sinh hóa 28
2.3.6. Khảo sát khả năng sinh bacteriocin 29
2.3.7. Xác định hoạt tính bacteriocin 30
2.3.8. Định danh vi khuẩn bằng bộ kit định danh API 50 CHL 30

2.3.9. Thăm dò việc sử dụng bacteriocin thô để bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế 31
2.4. Phương pháp phân tích 32
2.4.1. Phương pháp đánh giá cảm quản 32
2.4.2. Phương pháp phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí 34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 35
3.1. Hệ vi khuẩn lactic phân lập từ hạt kefir 35
3.1.1. Đặc điểm đại thể và vi thể 35
3.1.2. Khảo sát khả năng sinh acid lactic 38
3.1.3. Đặc điểm sinh lý 39
3.1.4. Đặc điểm sinh hóa 40
3.1.5. Kiểm tra hoạt tính bacteriocin 42
3.1.6. Định danh vi khuẩn lactic bằng bộ kit API 50 CHL 45
3.2. Ứng dụng bacteriocin để bảo quản cá diêu hồng sơ chế tối thiểu 45
3.2.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin 45
3.2.2. Sử dụng bacteriocin để bảo quản cá diêu hồng 46
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 53
4.1. Kết luận 53
4.2. Kiến nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
PHỤ LỤC 57



iii




CÁC TỪ VIẾT TẮT

ATP : adenosine triphosphate
CFU : colony forming unit – Đơn vị hình thành một khuẩn lạc
DNA : deoxy nucleotide acid
ĐC: đối chứng
LAB : lactic acid bacteria - Vi khuẩn sinh acid lactic
rRNA : ribosome ribonucleotide acid
TSVKHK : tổng số vi khuẩn hiếu khí




















iv

DANH MỤC BẢNG


Bảng 1.1. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng trong 100g kefir. 3
Bảng 1.2. Tóm tắt hệ vi sinh vật phân lập trong hạt kefir. 5
Bảng 1.3. Một số đặc điểm phân loại LAB theo Orla-Jensen (1919). 7
Bảng 1.4. Bacteriocin của một số chủng vi khuẩn 15
Bảng 2.1. Các mẫu khảo sát phương pháp bảo quản cá 32
Bảng 2.2. Bảng đánh giá chất lượng cảm quan bảo quản cá sơ chế 33
Bảng 3.1. Đặc điểm đại thể và vi thể của hệ vi khuẩn lactic phân lập từ hạt kefir. 35
Bảng 3.2. Đặc điểm sinh lý của hệ vi khuẩn lactic phân lập được từ hạt kefir. 39
Bảng 3.3. Kết quả thử khả năng sinh catalase của các chủng vi khuẩn lactic phân lập
được từ hạt kefir. 40
Bảng 3.4. Khả năng sinh hơi của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ hạt kefir. 40
Bảng 3.5. Khả năng kháng khuẩn của chủng Lactobacillus acidophilus (L2) 45
Bảng 3.6. Các phương pháp bảo quản cá sơ chế tối thiểu 47

v


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hạt kefir. 3
Hình 1.3. Hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử. 4
Hình 3.1. Đặc điểm đại thể của hệ vi khuẩn phân lập từ hạt kefir. 36
Hình 3.2. Đặc điểm vi thể của hệ vi khuẩn phân lập từ hạt kefir 37
Hình 3.3. Khả năng sinh acid làm tan CaCO
3
trên môi trường carbonate agar của 6
chủng phân lập. 38
Hình 3.4. Khả năng sinh acid lactic làm đổi màu thuốc thử unphenmen của sáu chủng
phân lập 39
Hình 3.5. Khả năng lên men đường lactose của sáu chủng vi khuẩn. 41
Hình 3.6. Khả năng lên men đường sucrose của sáu chủng vi khuẩn. 41
Hình 3.7. Khả năng lên men đường sorbitol của sáu chủng vi khuẩn. 41
Hình 3.8. Khả năng lên men đường glucose của sáu chủng vi khuẩn. 42
Hình 3.9. Khả năng tạo vùng kháng khuẩn của các chủng phân lập 44
Hình 3.10. Kết quả bộ kit định danh chủng L2 phân lập từ hạt kefir 45
Hình 3.11. Khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của chủng Lactobacillus
acidophilus (L2) đối với E. coli 46
Hình 3.12. Bảo quản cá diêu hồng sơ chế tối thiểu bằng dịch bacteriocin thô 48
Hình 3.13. Biểu đồ so sánh điểm chung đánh giá cho các mẫu khảo sát 49
Hình 3.14. Biểu đồ tổng số vi khuẩn hiếu khí của các mẫu khảo sát trong ngày thứ nhất49
Hình 3.15. Biểu đồ tổng số vi khuẩn hiếu khí của các mẫu khảo sát trong ngày thứ hai 50
Hình 3.16. Biểu đồ tổng số vi khuẩn hiếu khí của các mẫu khảo sát trong ngày thứ ba . 51
Hình 3.17. Biểu đồ phần trăm độ hao hụt khối lượng của các mẫu khảo sát 51

vi



DANH MỤC SƠ ĐỒ


Sơ đồ 1.1. Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương theo Cotter và cộng sự. 9
Sơ đồ 2.1. Nội dung các bước thí nghiệm của đề tài. 26
Sơ đồ 2.2. Tiến trình thí nghiệm bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế 31

1


MỞ ĐẦU


Trong những năm gần đây, khi cuộc sống con người ngày càng được nâng cao thì
yếu tố sức khỏe là một vấn đề quan trọng. So với việc bảo quản thực phẩm bằng kháng
sinh đã gây ra nhiều tác động tiêu cực như khả năng kháng lại thuốc kháng sinh và
những dư lượng trong thực phẩm làm ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người thì
bảo quản bằng tác nhân sinh học mà tiêu biểu là bacteriocin đã thu hút được nhiều chú ý
ở các nước phát triển. Do đó việc bảo quản thực phẩm bằng bacteriocin ngày càng được
thay thế cho việc sử dụng chất kháng sinh. Tuy nhiên chỉ có nisin thu được từ
Lactococcus lactis và pediococin từ Pediococcus được FAD và WHO công nhận và ứng
dụng rộng rãi trong việc bảo quản. Việc tìm ra những loại bacteriocin mới để có thể ứng

dụng đã làm tốn rất nhiều công sức của các nhà khoa học. Trong khi đó, kefir với tổ hợp
các vi sinh vật sống cộng sinh với nhau mà chúng ta có thể xét đến đó là tổ hợp LAB có
trong hạt kefir có hoạt tính bacteriocin mạnh.
Do đó, nhiệm vụ của luận văn được giao: “ PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN
LACTIC CÓ HOẠT TÍNH BACTERIOCIN TRONG HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG ”
Luận văn gồm ba phần chính:
+ Phân lập hệ vi khuẩn lactic trong hạt kefir, khảo sát khả năng sinh
bacteriocin, định danh chủng mục tiêu.
+ Lên men thu nhận bacteriocin
+ Ứng dụng bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế.






Chương 1. Tổng quan tài liệu
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Kefir
1.1.1. Nguồn gốc và sự hình thành
Kefir là một sản phẩm truyền thống có nguồn gốc cách đây hàng ngàn năm từ
vùng núi Caucasian của đông Châu Âu. Kefir được biết đến như một thứ dùng chữa
bệnh, nó xuất xứ từ cách nuôi riêng của các tu sĩ Ấn Tạng. Đây là loại nấm có thể làm
biến đổi sữa nhờ một hệ vi sinh vật phức tạp gồm nhiều loài vi khuẩn và nấm men được
chứng minh là rất có lợi cho sức khoẻ. Sản phẩm kefir được những người dân tộc
Moslem của Caucasian xem như một loại thuốc có thể chữa rất nhiều loại bệnh vào
khoảng thế kỉ 18 [8].
Tháng 9/1908, trung tâm sản xuất sữa tại Moscow đã tiến hành sản xuất những
chai kefir uống đầu tiên. Một số lượng nhỏ kefir đã được sản xuất ở vài thành phố ở Nga,

và mọi người sử dụng kefir như một loại thuốc chữa bệnh.
Năm 1930 kefir đã được tiến hành nghiên cứu sản xuất hàng loạt. Tuy nhiên, quy
trình này cho chất lượng sản phẩm cũng không tốt như cách truyền thống. Vào 1950,
viện nghiên cứu của Nga đã phát triển quy trình sản xuất kefir thương mại.
Hiện tại kefir là một trong những loại sữa lên men rất được yêu thích ở Nga.
Ngoài ra kefir cũng đang được sản xuất một số lượng lớn ở Cộng Hòa Séc, Phần Lan,
Hungary, Na Uy, Hà Lan, Thụy Điển, Thụy Sĩ, Đan Mạch, Mĩ, Pháp, Canada,…[5].
1.1.2. Cấu tạo hạt kefir
FAO/WHO (2001) đã định nghĩa kefir dựa trên thành phần hệ vi sinh vật của cả
hạt kefir và trong sản phẩm kefir cuối cùng. Trong sản xuất kefir, người ta sử dụng tổ
hợp giống vi sinh vật dưới dạng hạt kefir. Các hạt kefir có màu từ trắng đến vàng nhạt,
hình dạng không ổn định và thường kết thành chùm với nhau tạo dạng tương tự hoa
chou-fleur với đường kính trung bình 0.3÷2 cm. Thành phần hóa học hạt kefir bao gồm
89-90% nước, 0.2% lipid, 3% protein, 6% đường (chủ yếu là polysaccharide) và 0.7%
chất tro.
Hạt kefir là phức hệ vi sinh vật gắn với nhau bởi chất polysaccharide. Các giống
này bao gồm vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc ) và nấm men.
Đôi khi, còn tìm thấy vi khuẩn Acetobacter cùng với các vi sinh vật khác tổ chức thành
khối cầu vi sinh vật.
Chương 1. Tổng quan tài liệu
3
Tuy vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn nhưng từ hàng nghìn năm qua sự tiêu
thụ đã chứng minh được rằng hệ vi sinh vật trong kefir là không gây bệnh mà còn có khả
năng ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh như Salmonella hay Sigella [8].

Hình 1.1. Hạt kefir [29].
Bảng 1.1. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng trong 100g kefir.
Năng lượng 65Kcal Thành phần khoáng (g)
Chất béo (%) 3.5 Ca 0.12
Protein 3.3 P 0.1

Lactose (%) 4.0 Mg 12
Nước (%) 87.5 K 0.15
Natri 0.05 Cl 0,1
Acid sữa (g) 0.8 Yếu tố vi lượng
Rượu (g) 0.9 Fe (mg) 0.05
Acid lactic (g) 1 Cu (µg) 12
Cholesterol (mg) 13 Mn (µg) 5
Phosphate (mg) 40 Zn (mg) 0.36
Molip (mg) 5.5 Thành phần tạo mùi thơm
Amino acid cần thiết Acetaldehyde
Trypyophan 0.05 Diacetyl
Phenylalanin 0.35 Acetoine
Leucine 0.34 Vitamin (mg)
Isoleucine 0.21 E 0.11
Threonine 0.17 D 0.08
Lysine 0.27 B6 0.05
Valine 0.22 B2 0.17
Vitamin C 1
A 0.06 B1 0.04
Carotene 0.02 B12 0.05
[22]


Chương 1. Tổng quan tài liệu
4
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong hạt kefir
Nhóm vi khuẩn Lactobacillus chiếm khoảng 65-80% tổng số vi sinh vật trong hạt.
Chúng gồm những loài ưa ấm và ưa nhiệt. Nhóm Lactococcus chiếm 20% tổng số tế
bào. Nấm men chiếm 5-10% trong tổng số vi sinh vật trong hạt bao gồm những loài lên
men hoặc không lên men được đường lactose. Mật độ nhóm vi khuẩn lactic

Lactobacillus đạt 10
8
–5x10
9
(cfu/g) gồm nhóm lên men đồng hình và dị hình. Nhóm vi
khuẩn lactic Lactococcus và Leuconostoc với mật độ 10
8
–10
9
(cfu/g) và nấm men với
mật độ 10
6
–10
8
(cfu/g) gồm nhóm nấm men có khả năng chuyển hóa đường lactose và
nhóm nấm men không có khả năng chuyển hóa đường lactose.
Ngoài ra, một số nghiên cứu còn phát hiện sự hiện diện của nhóm vi khuẩn
Acetobacter với mật độ 10
5
– 10
6
(cfu/g). Tỉ lệ vi khuẩn lactic: nấm men thường đạt là
250:1. Có sự khác biệt về sự phân bố nấm men và Lactobacillus. Ở vùng nấm men
chiếm ưu thế thì có ít Lactobacillus và ở vùng Lactobacillus chiếm ưu thế thì có ít nấm
men. Nấm men không phân bố dày đặc ở bên ngoài hạt kefir, chủ yếu tồn tại ở bên trong
hạt. Các loài nấm men lên men được đường lactose thường được tìm thấy tại các vị trí
gần bề mặt hạt kefir. Ngược lại, các loài nấm men không lên men được đường lactose lại
tìm thấy tại các vị trí sâu bên trong tâm hạt [12].

Hình 1.3. Hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử [25].

(A, C) Cấu trúc trong của hạt kefir Tây Tạng (gồm nấm men và họ vi khuẩn Lactobacillus
hình que dài, cong) với mật độ dày đặc.
(B, D) Cấu trúc ngoài của hạt kefir Tây Tạng (gồm nấm men và những vi khuẩn Lactobacillus
hình que ngắn) với mật độ thưa thớt hơn.

Chương 1. Tổng quan tài liệu
5
Bảng 1.2. Tóm tắt hệ vi sinh vật phân lập trong hạt kefir.
NẤM MEN
Brettanomyces anomalus
Candida kefir
C. pseudotropicalis
C. rancens
C. tenuis
C. inconspicua
C. maris
C. lambica
C. tannotelerans
C. valida
Debaryveromyces lactic
Kluyveromyces lactic
K. bulgaricus
Saccharomyces subsp. torulopsis holmii
S. Carlsbergensis
S.Uniporus
Zygosaccharomyces rouxii

LACTOBACILLUS
Lactobacillus acidophilus
Lb.

b
r
e
v
is

Lb. casei
Lb. casei subsp.
rhamnosus

Lb. casei subsp.
pseudoplantarum

Lb.
paracasei
subsp.
paracasei

Lb. cellobiosus
Lb.
de
l
b
r
uec
k
ii
subsp.
bulgaricus

Lb.
de
l
b
r
uec
k
ii
subsp. lactis
Lb.
f
r
uc
ti
v
o
r
a
n
s

Lb. helveticus subsp. lactis
Lb.
hilgardii

Lb.
k
e
f
i

r
i

Lb.
k
e
f
i
r
a
no
f
a
c
i
en
s
subsp. k
e
f
i
r
g
r
a
nu
m
subsp.
Lb.
k

e
f
i
r
g
r
a
nu
m
sp.
Lb.
p
a
r
a
k
e
f
i
r
sp.
Lb. lactis
Lb.
plantarum

ACETOBACTER
Acetobacter aceti
A. rasens
A. pasteurianus

STREPTOCOCCUS/LACTOCOCCUS

Lactococci lactis subsp. lactis
Lc. lactis var. diacetylactis
Lc. lactis subsp. cremoris
Streptococc lactis
St. salivarius subsp. thermophilus
Enterococcus durans
Leuconostoc cremoris
Leuc. mesenteroides

Các chủng khác
Enterococcus durans
Leuconostoc cremoris
Leuconostoc mensenteroides
Micrococcus sp.
Bacillus subtilis
Escherichia coli
[6,11]




Chương 1. Tổng quan tài liệu
6
1.2. Vi khuẩn lactic

1.2.1. Khái niệm
Vi khuẩn lactic (LAB) thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả
năng lên men đường để tạo acid lactic. Nhóm LAB được xếp chung vào họ
Lactobacteriaceae và được xếp vào bốn chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus
và Leuconostoc. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau: có hình que ngắn
hoặc dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi; hình cầu ở dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp
thành chuỗi. Khuẩn lạc của LAB tròn nhỏ, bóng trắng sữa, màu trắng đục hoặc màu
vàng kem; hoặc khuẩn lạc có kính thước to, hơi tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa
ra mùi chua của acid.
1.2.2. Phân loại
Việc phân loại LAB được thực hiện đầu tiên vào năm 1919 bởi Orla-Jensen và
cho đến nay vẫn dựa chủ yếu vào các tiêu chuẩn hình học, trao đổi chất và sinh lý. LAB
gồm một nhóm đa dạng vi sinh vật Gram dương, không hình thành bào tử, hình cầu và
hình que không di động, sử dụng năng lượng từ sự oxy hóa của các hợp chất hữu cơ và
chỉ phát triển trên môi trường hỗn hợp. LAB có thể lên men carbohydrate và lượng cồn
cao được sử dụng như là nguồn năng lượng để hình thành nên chủ yếu là acid lactic.
LAB phân giải hexose thành lactate và những sản phẩm phụ như là acetate, ethanol, CO
2
,
formate hoặc succinate.
Những phương pháp nghiên cứu hiện tại được sử dụng cho việc phân loại LAB
chủ yếu dựa vào phân tích16S rRNA và giải trình tự. Dựa vào những kỹ thuật này, vi
khuẩn Gram dương được chia thành hai nhóm tùy thuộc vào lượng G + C của chúng.
Actinomyces có lượng G + C trên 50% mol và chứa những loài như là Atopobium,
Bifidobacterium, Corynobacterium và Propionibacterium. Mặc khác, nhánh Clostridium
có lượng G + C dưới 50% mol và bao gồm những loài LAB tiêu biểu như
Carnobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus và
Streptococcus [21].

Chương 1. Tổng quan tài liệu
7
Bảng 1.3. Một số đặc điểm phân loại LAB theo Orla-Jensen (1919).
Loài
Hình
dạng
Catalase
Khử
nitrite
Lên men Loài hiện tại
Betabacterium Que - - Dị dưỡng
Lactobacillus
Weissella
Thermobacterium

Que - - Tự dưỡng Lactobacillus
Streptobacterium Que - - Tự dưỡng
Lactobacillus
Carnobacterium
Streptococcus Cầu - - Tự dưỡng
Streptococcus
Enterococcus,
Lactococcus
Vagococcus
Betacoccus Cầu - - Dị dưỡng

Leuconostoc
Oenococcus weissella
Microbacterium Que + + Tự dưỡng Brochothrix
Tetracoccus Cầu + + Tự dưỡng
Pediococcus
Tetragenococcus
[21]
1.2.3. Đặc điểm chung.
Về mặt hình thái LAB có rất nhiều điểm khác nhau nhưng nhìn chung về mặt sinh
lý chúng tương đối đồng nhất:
Vi khuẩn Gram dương, bất động và không sinh bào tử.
Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất của vi khuẩn này rất yếu.
Là loại vi khuẩn kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men kỵ khí cũng như hiếu khí.
Có khả năng chịu đựng cao với môi trường acid.
Thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydrocacbon và tiết ra acid lactic; chúng là
nhóm lên men bắt buộc, không chứa Cytochrom và enzyme Catalase.
LAB có thế sống từ kỵ khí tới vi hiếu khí.
LAB có nhu cầu về chất sinh trưởng rất phức tạp, không một đại diện nào của
nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose và đa
số chúng cần hàng loạt các vitamin (lactoflavin, thiamin, acid pantotenic, acid nicotinic,
acid folic, biotin ) và các acid amin,…
LAB lên men được mono và disaccharide.
Chương 1. Tổng quan tài liệu
8
Các LAB không lên men được tinh bột và các polysaccharide khác (Chỉ có loài
L .delbrueckii là đồng hóa được tinh bột). Một số khác sử dụng được pentose và acid
citric mà chủ yếu là các vi khuẩn lên men lactic dị hình.
Có hoạt tính protease: thủy phân được protein của sữa thành peptide và acid amin.
Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường trực khuẩn là cao nhất.
LAB có khả năng sinh ra các hợp chất có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh.

1.3. Bacteriocin
1.3.1. Giới thiệu chung
Trong những năm gần đây, khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn khá
phổ biến trong điều trị bệnh của con người và động vật. Vì thế việc tiếp tục tìm ra những
chất kháng vi khuẩn mới đang trở nên quan trọng trong lĩnh vực y dược. Để hạn chế sử
dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự
lựa chọn hợp lý là ứng dụng của một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh.
Trong số đó, sự sản xuất bacteriocin từ LAB đã thu hút nhiều chú ý.
Bacteriocin có bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại
vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng
lại chính bacteriocin đó. Bacteriocin được A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong
quá trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúc đẩy
sự phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi
khuẩn. Ông gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin do E.coli sinh tổng hợp nên.
Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn Gram
dương với những đặc điểm:
Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm: gồm nhiều loại protein khác nhau về kích
thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch.
Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm được nghiên cứu nhiều nhất là colicin, do vi
khuẩn E.coli tổng hợp. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm có khả năng kháng
khuẩn yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương.
Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi
khuẩn Gram âm. Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn Gram âm ở hai điểm sau: việc
tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật chủ và sự sinh tổng
hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram
âm.
Bacteriocin khác biệt với kháng sinh ở những điểm chủ yếu sau:
- Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome.
Chương 1. Tổng quan tài liệu
9

- Tế bào chủ miễn dịch với chúng.
- Phương thức hoạt động khác biệt với kháng sinh.
- Phổ kháng khuẩn hẹp, vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những
chủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất.
Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đó có LAB được
quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng và có tiềm năng
được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm [1].
1.3.2. Phân loại
Có một lượng lớn những bacteriocin được sản xuất từ LAB và được phân loại
theo những đặc tính hóa sinh và di truyền học của chúng.
Sơ đồ 1.1. Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương theo Cotter và cộng sự.














[17]
Lớp 1: Lantibiotics (< 5kDa) là những peptide nhỏ, ổn định nhiệt hoạt động theo
những cấu trúc màng tế bào. Lantibiotics chứa những amino acid hiếm và một số amino
acid khử nước. Lantibiotic có thể được chia thành hai phân lớp dựa vào những đặc điểm
cấu trúc và chức năng:

Lớp 1a: là những phân tử peptide tích điện dương, dài 43 amino acid. Những peptide
này hoạt động chủ yếu hoạt động phá vỡ trạng thái nguyên vẹn của màng tế bào đích. Có
thể chia lantibiotic A thành hai phân nhóm dựa trên kích thước, điện tích và trình tự
peptide dẫn.
Lớp 1: peptide của
lantibiotic

Loại 2a: giống
pediocin
Loại A: eptide
thẳng
Lớp 4: peptide
vòng

Lớp 3: protein lớn
(>10 kDa
)

Loại 3b:
không phân
gi
ả
i

Loại 2b: đa
thành phần
Loại 3a:
Lysin

Loại 2c:

h
ỗ
n h
ợ
p

Phân loại A1:
giống nisin
Phân loại A2:
giống SA-FF22
Loại C: peptide
đa thành ph
ầ
n

Loại B: peptide
hình c
ầ
u

Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương
Lớp 2: peptide nhỏ
(<10

kDa)

Chương 1. Tổng quan tài liệu
10
Lớp 1b: là những phân tử peptide hình cầu, có thể chứa đến 19 amino acid. Hoạt
động của chúng chủ yếu là phá vỡ chức năng của các enzyme.

Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự peptide dẫn ở đầu N,
trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích phân tử peptide hoạt
hóa.
Lớp 2: là những phân tử bacteriocin phân tử nhỏ (< 10kDa), thường gồm những
phân tử peptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa lanthionine và bền nhiệt.
Bacteriocin lớp hai có phổ kháng khuẩn hẹp. Lớp hai có thể chia thành ba phân lớp:
Lớp 2a: bacteriocin lớp này rất đa dạng, điểm đặc trưng là trình tự bảo tồn ở đầu
N và hoạt tính kháng Listeria.
Lớp 2b: những bacteriocin này cần có sự kết hợp của hai hoặc nhiều peptide trong
hoạt động để có hoạt tính kháng khuẩn hoàn chỉnh. Trong hầu hết các trường hợp, các
peptide rời cũng biểu hiện hoạt tính bacteriocin, nhưng hoạt tính sẽ cao khi có sự hiện
diện của peptide thứ hai. Ví dụ như hoạt động của hai peptide enterocin L50A và
enterocin L50B.
Lớp 2c: bacteriocin phụ thuộc vào nhân tố sec. Phân tử bacteriocin lớp 2c được
đưa ra ngoài tế bào xuyên qua màng tế bào chất bằng con đường tiết phụ thuộc nhân tố
sec.
Bacteriocin lớp 2a có tiềm năng ứng dụng quy mô công nghiệp do khả năng
kháng Listeria mạnh, thậm chí chúng còn được quan tâm nhiều hơn các bacteriocin lớp
1 (nisin), do chúng có phổ kháng khuẩn không rộng và không tiêu diệt những chủng
khởi động. Pediocin PA-1 là một ví dụ điển hình và được nghiên cứu phổ biến nhất
trong số các bacteriocin lớp 2a.
Lớp 3: bacteriocin lớp 3 là những phân tử protein lớn (>30kDa) và bền nhiệt. Lớp
này gồm những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của
bacteriocin. Bacteriocin lớp 3 được thu nhận từ một số giống Lactobacillus. Chỉ một vài
bacteriocin thuộc lớp này được định danh.
Lớp 4: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành phần lipid
và carbohydrate. Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năng
của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào thuộc lớp này được tinh sạch.
Bacteriocin lớp 4 là kết quả của sự tương tác đặc tính kỵ nước và tích điện dương của
bacteriocin với các phân tử khác trong dịch mô. Lớp này bao gồm cả glycoprotein hoặc

lipoprotein.
Chương 1. Tổng quan tài liệu
11
Lc. lactis có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Bacteriocin của Lc. lactis gồm
hai loại là lantibiotic và các bacteriocin có kích thước nhỏ, bền nhiệt không phải
lantibiotic.
Nisin, một loại lantibiotic do Lc. lactis sản xuất và là bacteriocin được tổ chức
lương nông thế giới (FAO) và tổ chức y tế thế giới (WHO) chấp nhận cho phép sử dụng
như một chất phụ gia thực phẩm (1969). Nisin có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết
các chủng LAB, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, tế bào dinh dưỡng của
Bacillus spp. và Clostridium spp cũng như ức chế nảy chồi của các bào tử các loài
Bacillus và Clostridium.
Ngoài lantibiotic, Lc. lactis còn có khả năng sinh tổng hợp những phân tử
bacteriocin có kích thước nhỏ và bền nhiệt, điển hình là lactococcin A, B và M.
Lactococcin có phổ kháng khuẩn hẹp hơn nisin, chúng chỉ có thể ức chế những chủng
Lactococcus khác với chủng sản xuất [1].
1.3.3. Tính chất
1.3.3.1. Thành phần cấu tạo hóa học
Tất cả các loại bacteriocin đều có chứa protein hoặc các peptide trong phân tử.
Protein hoặc các peptide đóng vai trò quan trọng trong chức năng diệt vi khuẩn của
bacteriocin. Một số loại bacteriocin chứa tổ hợp nhiều phân tử protein liên kết lại với
nhau.
Các nhóm amino acid không thường xuyên (unusual amino acid) có trong phân tử
của một số loại bacteriocin giúp tạo nên một cấu trúc phân tử bền vững hơn (lanthionine
hay -methyllanthionine), hoặc làm tăng hoạt tính sinh học của phân tử
(didehydroalanine, didehydrobutyrine, cysteine).
Một số loại bacteriocin còn chứa các amino acid chưa bão hòa trong phân tử như
didehydroalanine, didehydrobutyrine. Các acid amin này là sản phẩm của phản ứng
dehydrate hóa các hydroxylamino acid serine và threonine.
Một số loại bacteriocin nhạy cảm với không chỉ protease mà còn nhạy cảm với

lipase, phospholipase, amylase. Điều đó chứng tỏ ngoài sự có mặt của các chuỗi protein
liên kết lại với nhau, trong cấu trúc bacteriocin còn chứa nhiều cấu tử khác như glucid,
lipid, phospholipid kết hợp với protein tạo thành một phức hợp phức tạp. Ví dụ:
Lactocin 27 được cấu tạo từ phức hợp lipocarbohydrate protein. Caseicin LSH và
leuconocin S là các glycoprotein.
Sự hiện diện của cầu nối disulfide hoặc thioether trong cấu trúc ảnh hưởng tới độ
bền và hoạt tính của bacteriocin.
Chương 1. Tổng quan tài liệu
12
Thành phần, số lượng, trình tự các amino acid trong phân tử peptide tạo ra những
đặc điểm khác nhau giữa các loại bacteriocin, bao gồm khối lượng phân tử, điểm đẳng
điện pI, tính kỵ nước, điện tích của phân tử ở một điều kiện pH xác định… Trên cơ sở
những đặc điểm này, người ta lựa chọn phương pháp tinh sạch cho từng loại bacteriocin.
1.3.3.2. Kháng nguyên
Bacteriocin có khối lượng phân tử lớn, thành phần cấu tạo là protein và nhiều
bacteriocin có tính kháng nguyên cao. Tuy nhiên hiện nay chỉ có duy nhất một vài báo
cáo trong nghiên cứu tính kháng nguyên của bacteriocin sinh bởi loài Gram dương.
Megacin A- 216 là một kháng nguyên và tế bào cũng sinh ra một kháng thể có khả năng
chống lại ảnh hưởng giết chính nó. Việc nghiên cứu những kháng thể đến bacteriocin
trong huyết thanh của con người có lẽ là một lĩnh vực thú vị cho những nghiên cứu sau
này [27].
1.3.3.3. Tính chất ổn định của bacteriocin
Một số nghiên cứu về những đặc tính của bacteriocin cho thấy rằng những phân
tử này có thể hoạt động tốt dưới những khoảng nhiệt độ và độ pH nhất định. ST28MS và
ST26MS được sản xuất bởi Lactobacillus plantarum có thể hoạt động ổn định trong 2
giờ tại những giá trị pH từ 2.0 đến 12.0. Không giảm khả năng hoạt động chống vi
khuẩn sau 90 phút tại 100ºC hay 20 phút tại 121ºC. Đặc tính chịu nhiệt có thể liên quan
đến cấu trúc phân tử của bacteriocin.
1.3.4. Hoạt động của bacteriocin
1.3.4.1. Phạm vi hoạt động của bacteriocin

Xem xét phạm vi kháng khuẩn, giống vi sinh vật sinh ra, khối lượng phân tử, tính
ổn định, tính chất hóa sinh, và kiểu hoạt động của bacteriocin. Hầu hết các bacteriocin
được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram âm có hoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng. Đối
với bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương có hoạt tính ức chế các
loại vi khuẩn Gram dương. Tuy nhiên một vài loại vi khuẩn Gram âm bị ức chế bởi
bacteriocin hay chất giống bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn Gram dương. Những vi
khuẩn Gram dương có khả năng ức chế vi khuẩn Gram âm như Lactobacillus
acidophilus, Bacillus cereus, Streptococci, Staphylococci, Corynebacteria.
1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của bacteriocin
Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm
thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải
ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Đầu tiên với
thành tế bào. Đó là nguyên nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K
+
và
Chương 1. Tổng quan tài liệu
13
phosphate vô cơ đi ra khỏi tế bào. Trong sự nỗ lực để tái tích lũy lại những ion này,
những hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới thủy phân của ATP bên trong. Khi ATP
được yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan trọng tế bào, như gradient pH tại
màng tế bào, những chức năng tế bào bị phá vỡ và tế bào dần dần mất năng lượng và
chết.
1.3.4.3. Sự miễn dịch của bacteriocin
Một thuộc tính cần thiết để bảo đảm sự sống sót của vi sinh vật sinh bacteriocin là
có sự miễn dịch đặc biệt. Theo Koponen (2004) tế bào vi khuẩn có một số cơ chế miễn
dịch, đây là khả năng của tế bào trong việc bảo vệ chính nó để chống lại bacteriocin sinh
ra bởi sự trao đổi chất của chính mình. Cả cấu tạo thành tế bào và thành phần cấu tạo của
màng lipid của vi khuẩn cho thấy sự liên quan đến hoạt động của bacteriocin cũng như
sự kháng cự bacteriocin. Sự biến đổi nhạy cảm của vi khuẩn Gram dương về phía những
bacteriocin đáng kể. Hoạt động kìm hãm của bacteriocin có thể thay đổi giữa những gen

khác nhau, những loài cùng bộ gen và thậm chí đến môi trường nuôi cấy từ những điều
kiện ngoại cảnh khác. Hai kiểu miễn dịch được thấy ở lantibiotic. Một kiểu miễn dịch
dựa vào protein miễn dịch đặc trưng (LanI) trong khi kiểu miễn dịch khác dựa một vật
chuyên chở nhiều thành phần riêng biệt (LanEFG). Bacteriocin sẽ nhận biết được vi sinh
vật sinh bacteriocin nhờ sự không có mặt của những thụ quan đặc biệt và kết quả là
chúng không thể bám vào tế bào vi sinh vật.
Di truyền học của sự sản xuất lacticin 3147 và sự miễn trừ. Lacticin 3147 được
sản xuất từ vi khuẩn Lactococcus lactis ssp. lactis 3147 và được mã hóa trên plasmid.
Plasmid mà mã hóa sự sản xuất lacticin 3147 và sự miễn trừ là pMRC01. Plasmid này có
thể sẵn sàng được kết hợp giữa giống Lactococcus và sự biến dạng khác. Toàn bộ trình
tự nucleotide 60, 232 của plasmid pMRC01 này được xác định, đại diện cho trình tự lớn
nhất của plasmid Lactococcus cho đến nay. Sự phân tích chi tiết của quỹ tích di truyền
học liên quan trong sự sản xuất của lacticin 3147 được cung cấp trong giấy bởi
Dougherty v.v , 1998.
Những gen này được chia làm hai cụm, với ltnA1, ltnA2, ltnM1, ltnT, ltnM2 và
ltnD được sao chép cùng một hướng và ltnH, ltnJ, ltnF và ltnE được sao chép theo
hướng ngược lại.
Những gen trong cụm lớn, ltnA1 và ltnA2 mã hóa hai peptide tương đối ngắn mà
nó là điểm khởi đầu cho bacteriocin lacticin 3147 hoạt động. Những peptide này có lẽ
đòi hỏi trải qua một số cải biến trước khi chúng hoạt động. Sản phẩm gen ltnM1 và
ltnM2 (các protein cải biến) có thể thực hiện vai trò này. Lacticin 3147 là khác thường
trong trường hợp này cho đến nay, nó là bacteriocin duy nhất được biết có hai protein cải
biến, một đặc tính là nối hai thành phần peptide khác nhau của sự hoạt động bacteriocin.
Chương 1. Tổng quan tài liệu
14
Sau khi peptide LtnA1 và LtnA2 được cải biến thì tế bào cần đưa chúng ra ngoài để
bacteriocin có thể làm làm giảm đi một số ảnh hưởng chống lại vi sinh vật khác. Sự vận
chuyển này nhờ vào hệ thống vận chuyển ABC (ATP Binding Cassette) mà được mã
hóa bởi ltnT. Nếu sự tập trung của lacticin 3147 ở sát vùng lân cận của tế bào sản xuất
trở nên quá cao, nó có thể giết tế bào sản xuất. Để tránh trường hợp này, tế bào sản xuất

phải có một mức độ miễn dịch nào đó hoặc chống cự lại những bacteriocin của nó. Sự
miễn dịch có được bởi sản phẩm của ltnE và ltnF. Sản phẩm gen của những gen khác,
ltnH, có đặc điểm của protein điều hòa mà DNA cho biết tế bào có một cơ chế điều
khiển để thay đổi sự biểu hiện của những genl liên quan đến hoạt động của bacteriocin.
Chức năng của hai gen ltnD và ltnJ là không được biết. Tuy nhiên, những vùng gen của
chúng có liên quan đến chức năng của lacticin 3147. Lacticin 3147 được mã hóa bởi
plasmid tiếp hợp là pMRCO1. Vùng lacticin 3147 mã hóa ít nhất 10 protein, mà nó liên
quan đến chức năng của bacteriocin [28].
1.3.5. Tính kháng khuẩn và phương pháp xác định tính kháng khuẩn.
Tính kháng khuẩn là khả năng ức chế sự phát triển của một vi sinh vật nào đó.
Hiện nay người ta đã xác đinh được nhiều chất có khả năng ức chế sự phát triển của vi
sinh vật như bacteriocin, chất kháng sinh, virus xâm nhiễm vi khuẩn Vì vậy trong
nghiên cứu bacteriocin thì vấn đề quan trọng là phải xác định xem loại vi khuẩn mà
mình nghiên cứu có tính đối kháng đối với một loài vi sinh vật nào đó hay không. Hiện
nay người ta đã xác định được một số loại bacteriocin có thể kháng đồng thời nhiều loại
vi sinh vật.
1.3.5.1. Phương pháp xác định tính kháng khuẩn
Để xác định tính kháng khuẩn, việc thử nghiệm được tiến hành trên môi trường
thạch đĩa có chủng chỉ thị. Tính kháng khuẩn thể hiện khi chủng chỉ thị bị ức chế trên
môi trường đó. Hai phương pháp xác định tính kháng khuẩn thường được sử dụng là
phương pháp kháng khuẩn đồng thời và phương pháp kháng khuẩn dần dần.
Phương pháp kháng khuẩn đồng thời đơn giản nhất do A.Gratia đưa ra. Trong
phương pháp này chủng thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được nuôi cấy trên một môi
trường, và tính kháng khuẩn thể hiện ở việc chất ức chế của chủng thử nghiệm khuếch
tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị. Sử dụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ
thị, sau đó tạo giếng trên đĩa thạch và cho chủng thử nghiệm đã được nuôi ủ vào giếng.
Phương pháp này thích hợp đối với kiểm tra những khuẩn lạc riêng lẽ và áp dụng rộng
rãi trong nghiên cứu về mặt di truyền.