[Kl-Hup] Nghiên Cứu Một Số Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Quá Trình Chiết Xuất Cao Đặc Giàu Acid Gallic Toàn Phần Từ Ngũ Bội Tử (Galla Chinensis).Pdf
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (16.56 MB, 57 trang )
BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐÀO THỊ HÀ LAN
NGHIÊN CỨU MỘT SƠ YẾU TỐ
ẢNH HƯỞNG ĐẾN Q TRÌNH
CHIẾT XUẤT CAO ĐẶC
GIÀU ACID GALLIC TOÀN PHẦN
TỪ NGŨ BỘI TỬ (Galla chin ensis)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ
HÀ NỘI - 2022
BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐÀO THỊ HÀ LAN
Mã sinh viên: 1701293
NGHIÊN CỨU MỘT SÔ YẾU TỔ
ẢNH HƯỞNG ĐÉN Q TRÌNH
CHIẾT XUẮT CAO ĐẶC
GIÀU ACID GALLIC TỒN PHÀN
TỪ NGŨ BỘI TỬ (Galla chinensis)
KHĨA LUẬN TƠT NGHIỆP DƯỢC sĩ
Người hướng dẫn:
1. TS. Hoàng Quỳnh Hoa
2. ThS. Phạm Thị Linh Giang
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực Vật
HÀ NỘI - 2022
LỜI CẢM ON
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lịng biết on tới TS. Hồng
Quỳnh Hoa - Trưởng bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, người hướng
dẫn và định hướng cho tôi trong nhũng ngày đầu tiên tôi nghiên cứu khoa học tại bộ
môn Thực vật.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Thị Linh Giang - Giảng viên
bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, người đã dành nhiều thời gian, tâm
huyết để hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tơi trong suốt q trình thực hiện khóa luận
tốt nghiệp. Cơ cịn chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm và truyền cho tôi niềm dam mê với
nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Trần Trọng Biên - Giảng viên bộ môn Công
nghiệp Dược đã cho tơi những nhận xét, góp ý để tơi hồn thiện khóa luận này. Tơi
cũng xin cảm ơn các thầy, anh chị đang công tác tại bộ môn Thực vật đã giúp đờ tơi
trong q trình thực hiện khóa luận.
Cảm ơn bạn Đỗ Bá Đại, cùng các bạn và các em đang nghiên cứu tại bộ môn Thực
vật và Dược học cổ truyền đã luôn động viên, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận này.
Tơi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, các phịng ban cùng tồn thể thầy cô
giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong thời gian qua.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè đà luôn ủng hộ, động
viên và là nguồn động lực to lớn để tôi học tập, rèn luyện và nghiên cứu tại trường Đại
học Dược Hà Nội.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2022
Sinh viên
Đào Thị Hà Lan
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẲT
DANH MỤC CÁC BANG
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỊ THỊ
ĐẬT VẤN ĐÈ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN............................................................................................ 2
1.1. Tổng quan về Ngũ bội tử...................................................................................... 2
1.1.1. Phân bố loài và đặc điềm dược liệu Gaỉỉa chinensis...................................... 2
1.1.2. Thành phần hóa học........................................................................................... 2
1.1.3. Tác dụng dược lý............................................................................................... 5
1.1.4. Tác dụng theo y học cổ truyền.......................................................................... 7
1.2. Phương pháp định lượng acid gallic toàn phần bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao.................................................................................................................................... 7
1.3. Các nghiên cứu về phương pháp chiết xuất acid gallic trong Ngũ bội tử
8
1.4. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất....... 9
1.4.1. Phương pháp thay đổi một yếu tố..................................................................... 9
1.4.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)............................................................... 9
1.5. Phương pháp điều chế cao đặc........................................................................... 12
1.5.1. Khái niệm.......................................................................................................... 12
1.5.2. Phương pháp điều chế cao đặc........................................................................12
CHƯƠNG 2: ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỦƯ........................ 15
2.1. Nguyên liệu, thiết bị............................................................................................. 15
2.1.1. Nguyên liệu.......................................................................................................15
2.1.2. Hóa chất, thiết bị và phần mềm...................................................................... 15
2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................ 15
2.2.1. Nội dung 1: Thẩm định phương pháp định lượng Acid gallic trong Ngũ bội
tử........................................................... ..................................................... .T.....T...... .16
2.2.2. Nội dung 2: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao
đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử.............................................................16
2.2.3. Nội dung 3: Khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết
xuất cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử..............................................16
2.2.4: Nội dung 4: Điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ dịch chiết Ngũ
bội tử........................................................................................................................... 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 16
2.3.1. Phương pháp định lượng acid gallic toàn phần..............................................16
2.3.2. Phương pháp thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần trong
Dược liệu Ngũ bội tử................................................................................................. 19
2.3.3. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất ...20
2.3.4. Phương pháp khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết
xuất.............................................................................................................................. 21
2.3.5. Phương pháp điều chế cao đặc Ngũ bội tử.................................................... 22
CHƯƠNG 3: THỤC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................. 24
3.1. Thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần trong dược liệu
Ngũ bội tủ...................................................................................................................... 24
3.1.1. Độ đặc hiệu...................................................................................................... 24
3.1.2. Sự phù hợp hệ thống........................................................................................24
3.1.3. Độ tuyến tính................................................................................................... 25
3.1.4. Độ lặp lại.......................................................................................................... 26
3.1.5. Độ đúng............................................................................................................ 27
3.1.6. Hàm lượng acid gallic toàn phần trong dược liệu Ngũ bội tử...................... 28
3.2. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hường đến quá trình chiết xuất.......... 28
3.2.1. Khảo sát tỉ lệ dược liệu/dung môi................................................................... 28
3.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết xuất............................................................................ 29
3.2.3. Khảo sát thời gian chiết xuất.......................................................................... 30
3.2.4. Khảo sát dung môi chiết xuất......................................................................... 30
3.3. Kết quả khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho q trình chiết xuất
acid gallic tồn phần tù’ Ngũ bội tử.......................................................................... 31
3.3.1 Kết quả thực nghiệm........................................................................................31
3.3.2. Kết quả tối ưu hóa q trình chiết xuất........................................................... 32
3.3.3. Kết quả lựa chọn điều kiện tối ưu của biến đầu vào...................................... 34
3.4. Kết quả điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần tù’ Ngũ bội tử............ 35
3.4.1. Quy trình điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bộitử........... 35
3.4.2. Kết quả............................................................................................................. 36
3.5. Bàn luận................................................................................................................36
3.5.1. về phương pháp chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử.................. 36
3.5.2. về nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết xuất acid gallic
tồn phần từ Ngũ bội tử............................................................................................. 37
3.5.3. về kết quả tối ưu hóa q trình chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội
tử.......................................................................................
........ ..39
3.5.4. về ứng dụng của việc tối ưu hóa q trình chiết xuất acid gallic toàn phần từ
Ngũ bội tử bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)........................................... 40
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................... 42
TÃI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT
ANOVA
Phương pháp phân tích phương sai (Analysis of variance)
AOAC
Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống
CCD
Mơ hình phức họp trung tâm (Central composite design)
GC
Galla chỉnensỉs
HPLC
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)
OFAT
Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time)
KL
Khối lượng
RSD
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
RSM
Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology)
SD
Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
Spic
Diện tích pic
STT
Số thứ tựI
TB
Trung bình
tR
Thời gian lưu
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng
STT
Kí hiệu
1
1.1
Một số hợp chất tanin được phân lập từ Ngũ bội tử
3
2
3.1
Kết quả khảo sát sự phù hợp hệ thống
24
3
3.2
Kết quả khảo sát độ tuyến tính
25
4
3.3
5
3.4
6
3.5
7
3.6
8
3.7
10
3.8
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định
lượng acid gallic_______________________________
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định
lượng acid gallic
Tóm tắt kết quả thấm định phương pháp định lượng
acid gallic toàn phần trong dịch chiết ngũ bội tử_____
Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm
Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mơ hình
biếu thị sự phụ thuộc của hiệu suất chiết acid gallic
vào các biến đầu vào
Kết quả kiểm định mơ hình bằng thực nghiệm
11
3.9
Kết quả điều chế cao đặc Ngũ bội tử
Trang
26
27
27
32
33
35
36
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỊ THỊ
STT
Kí hiệu
1
1.1.
2
1.2.
3
2.1.
4
3.1.
5
3.2.
6
Tên hình
Quy trình tối ưu hóa bằng phuơng pháp bề mặt đáp ứng
(RSM)
Phương pháp điều chế cao đặc
Trang
10
12
23
3.3.
Quy trình chiết xuất cao đặc Ngũ bội tử dự kiến
Kết quả thấm định độ đặc hiệu của phương pháp định
lượng__________________________________________
Đồ thị biếu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện
tích pic của acid gallic_____________________________
Kết quả khảo sát tỉ lệ dược liệu/dung môi
7
3.4.
Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết xuất
29
8
3.5.
Kết quả khảo sát thời gian chiết xuất
30
9
3.6.
31
10
3.7.
11
3.8.
Kết quả khảo sát dung môi chiết xuất
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất chiết acid
gallic toàn phần vào các biến đầu vào
Quy trình điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ
Ngũ bội từ______________________________________
24
26
29
34
35
ĐẬT VẤN ĐÈ
Ngũ bội tử (Galla chinensis) là dược liệu được sử dụng phổ biến trong Y học cổ
truyền Trung Quốc để chữa các bệnh như tiêu chảy, chảy máu, ho, nôn mửa, bệnh trĩ,
sa hậu môn, sa tử cung. Kinh nghiệm sử dụng và các nghiên cứu theo y học hiện đại
cũng cho thấy Ngũ bội tử là một dược liệu tiềm năng trong việc điều trị các bệnh lý có
triệu chứng nhiễm khuẩn đặc biệt là các nhiễm khuẩn tiêu hóa, hơ hấp và sâu răng [22].
Trong Ngũ bội tử, tanin được xem là nhóm hoạt chất chính với nhiều tác dụng
dược lý quan trọng như kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, chống ung thư [22].
Mặt khác, nhóm hoạt chất này sau khi thủy phân tạo thành các phân tử acid gallic. Acid
gallic đã được nhiều nghiên cứu chứng minh các tác dụng như chống sâu răng, kháng
khuẩn, kháng virus và chống oxy hóa... [19].
Hiện nay, điều chế cao dược liệu với hàm lượng hoạt chất cao đang là xu hướng
phát triển của dược phẩm. Do đó, để có thể ứng dụng dược liệu Ngũ bội tử nhiều hơn
trong quá trình nghiên cứu phát triển các chế phẩm chăm sóc sức khoe với hướng tác
dụng kháng khuẩn, việc nghiên cứu bào chế cao bán thành phẩm giàu acid gallic toàn
phần từ Ngũ bội tử là hết sức cần thiết.
Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử (Galla chin ensis)” được thực hiện
với hai mục tiêu:
1. Khảo sát một so yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa điều kiện chiết xuất acid gallic
toàn phần từ Ngũ bội tử.
2. Bước đầu điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử quy mô
50g/mẻ dựa trên các điều kiện chiết xuất đã khảo sát.
CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Ngũ bội tủ’
1.1.1. Phân bố lồi và đặc
• điếm dược
• liệu
• Galla chỉnensis
Tên Việt Nam: Ngũ bội tử
Tên khoa học: Galla chinensis
1.1.1.1. Phân loại
Trên thị trường có hai loại Ngũ bội tử là Ngũ bội tử Âu và Ngũ bội tử Á [2]:
Ngũ bội tử Ảu là tổ của Cynips gallae tinctoriae Olivier - lồi cơn trùng kí sinh
trên chồi cây sến (Quercus lusitanica Lamk.var.inf'ectoria Olivier). Trong quá trình phát
triển của sâu non, các mô thực vật bao quanh sâu non phát triển to dần tạo thành tổ sâu.
Ngũ bội tử Á là tố của lồi sâu Schlechtendalỉa chinensis Bell, kí sinh trên cây
Muối (Rhus chinensis Mill, hay Rhus semialata Murr.)
Theo Dược điển Việt Nam V, dược liệu Ngũ bội tử là tổ đã phơi hay sấy khô của
ấu trùng sâu Ngũ bội tử (Melaphis clỉinensis (Bell.) Baker Schlechtendalỉa chinensis
Bell), ký sinh trên cây Muối, tức cây Diêm phu mộc (Rhus chinensis Muell.), họ Đào
lộn hột (Anacardiaceae) [3].
Ở nước ta, cây Muối có ở các tỉnh miền núi như Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai.
Tuy nhiên, hiện nay ta vẫn nhập Ngũ bội tử của Trung Quốc [21.
1.1.1.2. Đặc điểm dược liệu
Ngũ bội tử có hình dạng đa dạng. Loại Ngũ bội tử Âu thường là hình cầu có đường
kính 10-25 mm, trên bê mặt có những nơt nhơ lên, có một cng ngăn. Thành dày, răn
chắc, màu thay đổi từ xám, xanh nâu đến vàng nâu và thường có một lỗ do sâu khi
trưởng thành cắn để chui ra. Loại Ngũ bội tử Á thì to hơn, thành mỏng hơn, dễ vờ vụn,
màu xám hồng, bên ngồi có lơng tơ ngắn và rậm. VỊ của cả hai loại Ngũ bội tử đều rất
chát [2].
Dược điển Việt Nam V mô tả Ngũ bội tử có dạng túi hình trứng (đỗ bội) hoặc hình
củ ấu (giác bội), phân nhánh nhiều hay ít, nguyên hoặc vỡ đơi, vờ ba. Đỗ bội hình trứng,
hoặc hình thoi, dạng nang, dài 2,5 cm đến 9 cm, đường kính 1,5 cm đến 4 cm. Mặt ngoài
màu nâu xám, hơi có lơng tơ mềm. Chất cứng giịn, dễ vỡ vụn. Mặt gày có dạng chất
sừng, sáng bóng, dày 0,2 cm đến 0,3 cm; mặt trong phang, trơn, khoang rỗng có chứa
xác chết của ấu trùng màu nâu đen và chất bột màu xám. Đổ bội có mùi đặc biệt, vị se.
Giác bội hình củ ấu, phân nhánh, khơng đều, dạng sừng, mặt ngồi có lơng tơ mềm,
vách tổ tương đối mỏng [3].
1.1.2. Thành phần hóa học
Ngũ bội tử chứa các thành phần hóa học như: tanin, acid phenolic và một số hợp
chắt polyphenol [22].
2
1.1.2.1. Tanin
Ngũ bội tử chứa đến 50-70% tanin. Đây là họp chất có hoạt tính sinh học chính
[2], [3], [22]. Tanin trong Ngũ bội tử chủ yếu thuộc loại tanin thủy phân đuợc, có thể
thủy phân bằng kiềm, acid hoặc enzym tạo ra acid phenolic, chủ yếu là acid gallic. Do
đó, theo Dược điển Trung Quốc 2015 và Dược điển Việt Nam V, acid gallic được sử
dụng là chất chuẩn để đánh giá hàm lượng acid gallic toàn phần trong dược liệu Ngũ bội
tử [3].
Tanin trong Ngũ bội tử thường gồm một lõi trung tâm glucose và được bao quanh
bởi các đon vị acid gallic, thường từ 1-14 phân tử acid gallic. Hầu hết các hợp chất này
có độ phân cực yếu. Khi số lượng galloyl phân bố trên lõi tăng, độ phân cực của tanin
càng giảm [22].
Một số hợp chất tanin hiện đã được phân lập từ Ngũ bội tử được thể hiện trong
bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số hợp chất tanin được phân lập từ Ngũ bội tủ’
STT
Tên thành phần
1
1,2,6-Tri-O-galloyl-P-D-glucose
Công thức phân tử
OH
Tài liệu
tham khảo
[9]
oJGC
OH
ỐH
OH
2
1,2,3,6-Tetra-O-galloyl-
p -D-
[9]
ỌH
H0yU°H
glucose
OH
/k/OH
oTT
I
O^O
Y'OH
Yr s
jf’'0^YYr0H
HO''
/k
r1
OH
HO^Y^OH
OH
3
1,2,4,6-Tetra-O-galloyl-yổ-D-
OH
z.
II
glucose
ỔH
~
OH
3
.OH
?'■ V"oW
HOỴyAo ỔH
HO^V
il
lyl-OH
ỔH
[14]
Tên thành phần
STT
4
Công thức phân tử
1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-yổ-D-
Tài liệu
tham khảo
[9]
glucose
Punicalin
6
[27]
1,3-Digalloyl-4,6-HHDP-glucose
HO
7
[27]
OG
OH OHOH
[27]
2-O-Digalloyl-l ,3,4,6-tetra-Ogalloyl-yổ-D-glucose
Acid
benzoic,3,4-dihydroxy-5-
[(3,4,5-trihydroxybenzoyl) oxy] 5-ethoxycarbonyl-2,3dihydroxyphenyl este
9
OH
[34]
Trigallic acid
4
Tanin hầu như không tan trong các dung môi kém phân cực như ether, n-hexan,
cloroform, tan trong acetone, cồn, cồn lồng và nước, tan tốt nhất là nước nóng [2].
1.1.2.2. Acid phenolic
Theo nhiều nghiên cứu, một số họp chất nhóm acid phenolic đã được tìm thấy
trong Ngũ bội tử như acid gallic [15], acid protocatechuic [27], acid 2-hydroxy-6pentadecyl benzoic [15] và acid 4-hydroxy-3-methoxybenzoic [15]. Trong đó, acid
gallic chiếm tỷ lệ gần 20% trong Ngũ bội tử [5].
1.1.2.3. Các thành phần khác
Ngoài ra, methyl gallate, ethyl gallat, acid ellagic, myricetin-3-O-rhamnoside và
epigallocatechin là những thành phần khác đã được phát hiện trong Ngũ bội tử [15],
[27], [34].
1.1.3. Tác dụng dược lỷ
Các nghiên cứu chỉ ra Ngũ bội tử có nhiều tác dụng sinh học khác nhau. Dịch chiết
hay sản phẩm thô từ Ngũ bội tử đều có hoạt tính quan trọng trên mơ hình in-vivo và invitro với những tác dụng được nghiên cứu nhiều như kháng khuẩn, kháng virus, chống
ung thư và chống oxy hóa [15].
1.1.3. ỉ. Tác dụng khảng khuẩn
Acid gallic và methyl gallate là hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh trong Ngũ
bội tử [4], [8], [26], [30]. Hai hoạt chất này kháng khuẩn dựa trên hai cơ chế chính là ức
chế các enzym ngoại bào cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật và ức chế q trình
phosphoryl hóa, ảnh hưởng trực tiếp đến q trình trao đổi chất của vi sinh vật. Ngồi
ra, hai hợp chất này cịn có tác dụng chống bám dính, ngăn ngừa vi khuẩn bám dính và
gây bệnh [38].
Ngũ bội tử ức chế sự phát triển và tiết acid của các vi khuẩn bám miệng như
Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Actinomyces
viscosus và Lactobacillus rhamnosus, do đó có tác dụng chống sâu răng [11]. Những vi
khuấn này bám thành mảng trên răng, lên men carbohydrate tạo acid, acid khuếch tán
vào các mơ và hịa tan một phần men răng, ngà răng, gây ra hiện tượng sâu răng [17].
Kang và cộng sự đã chỉ rõ methyl gallate và acid gallic ức chế sự bám dính của vi khuấn
Streptococcus mutans, nên có vai trò quan trọng trong chống sâu răng [13].
Dịch chiết Ngũ bội tử trong methanol được chúng minh có khả năng ức chế vi
khuân Clostridium perfringens và Escherichia coli, nhưng lại khơng tác động đến vi
khuẩn có lợi như Bifidobacterium teencentis và Lactobacillus acidophilus trên đường
ruột [4J. Ngoài ra, thành phần acid gallic trong Ngũ bội tử có tác dụng ngăn cản độc tố
gây tiêu chảy của vi khuẩn E.coli gắn vào thụ thể ganglioside GM1 ở ruột, chống tiêu
chảy hiệu quả [6].
5
Ngồi ra, dịch chiết Ngũ bội tử có tác dụng ức chế một số vi khuẩn khác như Vibrio
parahaemolyticus, Listeria monocytogenes (vi khuấn gây bệnh đường ruột có trong hải
sản) [31], Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Salmonella, Bacillus
subharveyi, Vibrio urê, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes và
Escherichia coli sinh ESBLs [22], Staphylococcus aureus kháng methicillin [32], Vibrio
harveyi [20]. Bên cạnh đó, một số vi khuẩn kỵ khí trong đường sinh dục phụ nữ cũng bị
ức chế như Peptostreptococcus, Veronococcus minor, Peptococcus, Melanobacterium
[22].
Các nhà nghiên cứu còn phát hiện ra rằng, chiết xuất của Ngũ bội tử trong ethanol,
ethyl acetate hay nước đều có tác dụng kháng khuẩn tốt. Trong đó, dịch chiết ethyl
acetate có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất, rồi đến dịch chiết ethanol và kháng khuẩn
yếu nhất với dịch chiết nước [16].
Tian và cộng sự chỉ ra mối liên quan giữa hoạt tính kháng khuẩn và số lượng nhóm
galloyl: Các gallotannins có khối lượng phân tử càng lớn, càng nhiều nhóm galloyl thì
hoạt tính kháng khn càng mạnh [26].
1.1.3.2. Tác dụng khảng virus
Các nghiên cứu cho thấy Ngũ bội tử có hoạt tính ức chế các loại virus: Virus viêm
gan c (HCV), virus họp bào hô hấp (RSV), virus herpes (HSV), kháng nguyên bề mặt
virus viêm gan B (HBsAg) và virus cúm [22].
Qua phân lập và xác định hoạt tính sinh học, người ta thấy hợp chất có hoạt tính
kháng virus cao nhất trong Ngũ bội tử là acid gallic. Acid gallic không chỉ ức chế tống
họp acid nucleic của virus mà cịn tác động đến q trình trùng họp của tiểu đơn vị
capsid virus, do đó cản trở q trình lắp ráp và nhân lên của virus. Chính vì vậy, Galla
chinensis có thể được sử dụng trong điều trị một số bệnh do virus [22].
1.1.3.3. Tác dụng chống ung thư
Gần đây, Ngũ bội tử còn được biết đến với tác dụng ức chế nhiều loại tế bào ung
thư ở người. Trong đó, acid gallic có tác dụng chống ung thư phụ thuộc vào liều lượng
trên nhiều dòng tế bào như ung thư miệng [29], bệnh bạch cầu [36], u nguyên bào thần
kinh đệm [21], ung thư tuyến tiền liệt [23], ung thư vú [28] và ung thư cổ tử cung [37].
1.1.3.4. Tác dụng chống oxy hóa
Trong điều kiện bình thường, các gốc tự do được sinh ra trong quá trình trao đổi
chất và có tác dụng duy trì chức năng của tế bào. Tuy nhiên, trong điều kiện stress oxy
hóa, các gốc oxy hóa sản sinh quá mức khiến tế bào bị tổn thương, tăng chết theo chu
trình. Do đó, stress oxy hóa là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh lý nguy hiềm [43].
Các tanin trong Ngũ bội tử đã được chứng minh tác dụng chống oxy hóa thơng qua
nhiều nghiên cứu trên các mơ hình in-vitro khác nhau. Cơ chế chống oxy hóa được cho
là:
6
-
Các nhóm hydroxyl phenolic cung cấp hydro, giúp loại bỏ các gốc oxy hóa [42].
-
Tanin tạo phức với ion kim loại như Fe, Cu và các kim loại khác, làm giảm phản
ứng tạo gốc oxy hóa, bảo vệ cơ thế khỏi stress oxy hóa [44].
Các tanin khác nhau có hoạt tính chống oxy hóa khác nhau, phụ thuộc vào số phân
tử acid gallic gắn vào. số phân tử acid gallic càng nhiều, hoạt tính chống oxy hóa càng
cao.
1.1.3.5. Một số tác dụng khác
Ngoài các tác dụng kể trên, Ngũ bội tử cịn có một số tác dụng khác như chống
béo phì, chống tiêu chảy, chống hạ đường huyết và chống viêm, giảm đau [22].
Trong đó, Ngũ bội tử chống viêm bằng cách ức chế giải phóng các yếu tố gây viêm
và tăng biểu hiện của yếu tố chống viêm [25].
1.1.4. Tác dụng theo y học cổ truyền
Theo y học cổ truyền, Ngũ bội tử có vị chua, chát, mặn, tính bình. Quy kinh phế,
thận, đại tràng [1].
Cơng năng chủ trị:
-
Làm ngừng ra mồ hôi, cầm máu, trị mồ hôi trộm.
-
Làm ngừng ỉa chảy, cố thoát: dùng trị ỉa chảy lâu ngày, lỵ lâu ngày, chữa lòi dom,
sa tử cung.
-
Giải độc, sát khuẩn: dùng để trị mụn nhọt, ung độc; viêm niêm mạc miệng, viêm
lợi răng hoặc bị bỏng.
Ngoài ra, theo Dược điển Trung Quốc Ngũ bội tử có tác dụng giảm ho và long
đờm do phổi bị nhiệt, ho mãn tính; kiết lỵ mãn tính và tiêu chảy; đổ mồ hơi ban đêm;
tiêu chảy có máu, chảy máu trĩ; chảy máu do chấn thương, áp xe, vết loét và các tổn
thương da có tiết dịch.
1.2. Phương pháp định lượng acid gallic toàn phần bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Theo dược điển Việt Nam V và Dược điển Trung Quốc 2015, chất lượng Ngũ bội
tử được đánh giá thông qua hàm lượng acid gallic toàn phần, xác định bằng phương
pháp sắc ký long hiệu năng cao HPLC với quy trình:
Chuẩn bị dung dịch thử
Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu (qua rây số 355) cho vào bình nón nút
mài khơ, thêm chính xác 50 ml dung dịch HC1 0,4M, đun cách thủy trong 3,5 giờ để
thủy phân. Làm nguội, cân lại và thêm dung dịch HC1 0,4M đến khối lượng ban đầu.
Lắc đều, lọc. Lấy chính xác 1,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml, thêm dung
môi methanol 50% vào đến vạch. Lắc đều làm dung dịch chạy sắc ký.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn
7
Cân chính xác khoảng 4 mg acid gallic chuẩn, pha lỗng bằng bình định mức 100
ml bằng dung mơi methanol 50%. Lắc đều.
Điêu kiện săc kỷ
-
Cột sắc kỷ: Cột kích thước (25cm X 4,6 mm), được nhồi pha tĩnh c (5 pm)
-
Pha động: Methanol- Acid phosphoric 0,1% tỉ lệ 15:85
-
Bước sóng phát hiện: 273 nm
Tốc độ dịng: 1,0- 2,0 ml/phút
Trong một nghiên cứu khác, hàm lượng lượng acid gallic toàn phần trong Galla
japonica (thành phần trong viên nang Fufang Puhuangchangkang) được xác định bằng
kỹ thuật HPLC với quy trình tương tự, có sự thay đồi điều kiện sắc ký. Cụ thể:
Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Cân chính xác khoảng 2 mg acid gallic chuẩn, cho vào bình định mức 50ml. Thêm
methanol 50% để được dung dịch có nồng độ 40 pg/ml.
Chuẩn bị dung dịch thử:
Nghiền mịn viên nang, cân chính xác khoảng Ig, thêm chính xác 50ml dung dịch
HC1 4M, đun nóng và thủy phân trong 3,5 giờ. Sau đó để nguội. Lấy chính xác Iml dịch
lọc, cho vào bình định mức 100ml, thêm methanol 50% đến vạch. Lắc đều.
Điểu kiện sắc ký:
-
Cột sắc ký: Hypersil ODS2 (200mm X 4,5mm, 5pm)
-
Pha động: Methanol - Acid phosphoric 0,1% tỉ lệ 10:90
-
Bước sóng phát hiện: 273 nm
-
Tốc độ dòng: 1,0 - 2,0 ml/phút
Hai quy trình định lượng acid gallic tồn phần trên đều có bước thủy phân với HC1
4M trước khi tiến hành định lượng.
1.3. Các nghiên cứu về phương pháp chiết xuất acid gallic trong Ngũ bội tử
Các nghiên cứu trên thế giới đã được tiến hành nhằm tối ưu hóa các điều kiện chiết
xuất acid gallic dạng tự do và dạng toàn phần từ Ngũ bội tử [33].
Acid gallic được chiết xuất từ Ngũ bội tử với dung môi nước, tỉ lệ dược liệu/dung
môi là 1/30, trong điều kiện nhiệt độ 60°C trong thời gian 3 giờ cho hiệu suất 49,3%.
Nếu sử dụng dung mơi là acetone, hiệu suất chiết có thể lên đến 93,91%.
Qua khảo sát một số yếu tố và sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng để tối ưu hóa
điều kiện chiết xuất có hỗ trợ siêu âm cho kết quả: Với 5g dược liệu, tỷ lệ dược liệu/dung
môi là 1/38, thời gian 32 phút, công suất siêu âm 250W, hiệu suất chiết là 66,0%.
8
Với công nghệ chiết xuất bằng CƠ2 siêu tới hạn, nghiên cứu thực hiện ở điều kiện
nhiệt độ 44°c, áp suất 25 MPa, trong thời gian 120 phút cho hiệu suất chiết xuất là
57,83%.
Nếu chiết xuất acid gallic từ Ngũ bội tử trong điều kiện áp suất tuần hoàn liên tục,
thời gian 100 phút, hiệu suất chiết có thể đạt được hơn 99%.
Như vậy, dược liệu Ngũ bội tử đã được tiến hành chiết xuất với các phương pháp
khác nhau như chiết xuất trực tiếp với dung môi (nước, acetone), chiết xuất bằng CO2
siêu tới hạn, chiết xuất có áp suất. Các nghiên cứu được tiến hành tại các điều kiện về
dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỳ lệ dược liệu dung môi xác định và hiệu suất chiết acid
gallic trong các nghiên cứu cũng có nhiều sự khác biệt. Tuy nhiên chưa thấy có các
nghiên cứu tiến hành trên dung mơi ethanol là dung mơi an tồn, được sử dụng khá phổ
biến trong ngành chiết xuất tại Việt Nam hiện nay.
1.4. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
1.4.1. Phương pháp thay đổi một yếu tố
Phương pháp thay đổi một yếu tố {one factor at the time - OF AT) là phương pháp
khảo sát các yếu tổ các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất thường được sử dụng.
Nguyên tắc của phương pháp là chỉ thay đối giá trị của một thông số cần khảo sát, trong
khi giừ nguyên các thông số còn lại ở điều kiện tối ưu đã khảo sát trước đó. Điều kiện
tối ưu được xác định bởi phương pháp OFAT là thông số mang lại kết quả cao nhất, với
giả định rằng khơng có tương tác giữa mỗi biến [35].
về thiết kế thí nghiệm theo phương pháp OF AT, chỉ thay đổi một yếu tố cần khảo
sát, các yếu tố còn lại được giữ cố định. Ảnh hưởng của những yếu tố này đến quy trình
chiết xuất được chuẩn hóa, loại trừ hoặc đảm bảo khơng đổi giữa các thí nghiệm. Nếu
khơng, việc phân tích ảnh hưởng của yếu tố đang xét đến quy trình chiết xuất sẽ gặp
nhiều khó khăn.
1.4.2. Phương pháp bể mặt đáp ứng (RSM)
Phương pháp bề mặt đáp ứng {Response surface methodology - RSM) là mơ hình
thống kê giúp tối ưu hóa q trình chiết xuất bằng cách kết hợp tất cả các yếu tố có trong
phân tích thử nghiệm để tìm ra điều kiện tối ưu [10].
Quy trình tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được thể hiện trong
hình 1.1.
9
Lựa chọn biến đầu vào, đầu ra
◄----------------
Thiết kế thí nghiệm
Xây dựng mơ hình
ĩ
Đánh giá mơ hình
ì
Khơng
Mơ hình cơ đạt chất lượng tốt ?
_ Có
Tối ưu hóa
I
Kiểm chứng bằng thực nghiệm
Hình 1.1. Quy trình tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Lựa chọn biến đầu vào, biến đầu ra
Biến đầu vào (biến độc lập): Là thông số khi thay đổi sẽ ảnh hưởng đến giá trị của
biến đầu ra. Biến đầu vào bao gồm 2 loại: Biến kiểm sốt được (Ví dụ: Nhiệt độ, dung
mơi, thời gian...) và biến khơng kiểm sốt được (Ví dụ: Độ ẩm mơi trường...)
Biến đầu vào được lựa chọn cần thỏa mãn các điều kiện:
-
Là biến độc lập, khi điều chỉnh giá trị không làm thay đối giá trị của yếu tố khác.
-
Là các biến có thể định lượng được.
Biến đầu ra (biến phụ thuộc): Là kết quả của thí nghiệm, cần phải đo đạc và đánh
giá. Ví dụ: Hàm lượng hoạt chất...
Mục tiêu lựa chọn biến đầu vào, biến đầu ra: Từ các yếu tố ảnh hưởng, chọn ra các
biến đầu vào có ảnh hưởng lớn đến biến đầu ra. Việc này giúp giảm đáng kể số thí
nghiệm cần phải thực hiện.
Thiết kế thí nghiệm
Có nhiều phương pháp thiết kế thí nghiệm như Box-Behnken (BBD), Doehlert
(DD), mơ hình đầy đủ... Trong số đó, mơ hình phức họp trung tâm (Central composite
design - CCD), hay cịn gọi là mơ hình Box-Wilson là một trong những mơ hình thơng
dụng và phổ biến nhất.
Trước khi thiết kế thí nghiệm, các biến đầu vào cần được mã hóa các giá trị khảo
sát, chuyển thành khoảng giá trị [-1; 1 ] đế đảm bảo thiết kế thí nghiệm có tính trực giao
10
và tính xoay cũng như giảm thiểu sai số trong q trình tính tốn, hạn chế sai sót do
chênh lệch đơn vị của các biến độc lập [18].
Số lượng thí nghiệm phải thực hiện theo mơ hình, với k biến là
N = 2k + 2,k + Co
Trong đó:
•
2k là số thí nghiệm mà các biến đầu vào nhận lần lượt các giá trị -1 hoặc 1.
•
2.k là số thí nghiệm trong đó 1 biến đầu vào nhận giá trị a, các biến cịn lại đều
bằng 0.
Co là số thí nghiệm tất cả các biến đều bằng 0.
•
(Giá trị a có thể được lựa chọn tùy ý để đảm bảo mô hình có tính trực giao và tính
xoay.)
Xây dựng và đánh giá mơ hình
Mơ hình là một phương trình biểu diễn sự phụ thuộc của biến đầu ra vào biến đầu
vào. Mơ hình bậc 2 thường được sử dụng đề xác định giá trị tối ưu của biến đầu ra và
có dạng:
Y = S?=1 «/X- + xp=1 auXi2 +
Z;=i+1 UijXiXj
Trong đó:
Y: Biến đầu ra
X: Các biến đầu vào
a: Các hệ số tương ứng
Sau khi có kết quả thực nghiệm, sử dụng các phương pháp toán học khác nhau đế
xác định giá trị của các hệ số trong mơ hình. Một trong số những phương pháp hay được
sử dụng nhất hiện nay là hồi quy tuyến tính đa biến.
Đánh giá mơ hình vừa xây dựng dựa trên độ tương thích và khả năng dự đoán,
được đặc trưng bằng các hệ số R2, R2hiệu chinh, R2dự đốn, mức độ khơng tương thích (lack
of fit). Mơ hình chi có thể sử dụng sau khi đã thỏa mãn các tiêu chuẩn thống kê.
Trong đó:
-
Sự khơng phù họp (Lack of fit) nhằm đánh giá mức độ phù họp của mơ hình. Mơ
hình được coi là phù họp nếu p > 0,05. Nếu p < 0,05, mô hình khơng được chấp
nhận.
-
R2 đặc trưng cho mối tương quan giữa biến đầu vào và biến đầu ra. R2 càng gần
1, mơ hình có độ tuyến tính càng cao.
R~hiệu chỉnh đặc trưng cho mức độ bền vững của mơ hình. R2hiệu chỉnh càng gần R2 mồ
hình càng bền vững.
R2dự đốn đặc trưng cho khả năng dự đốn của mơ hình. R2dựđốn càng gằn R2hiệu
chỉnh mơ hình dự đốn càng tốt.
11
Tối ưu hóa
Từ mơ hình, cần xác định hàm mục tiêu và tìm nghiệm tối ưu bằng phương pháp
thích họp. Hàm mục tiêu là hàm thể hiện kết quả mà người thực hiện phải đạt được, ví
dụ biến đầu ra Y đạt giá trị lớn nhất.
Sau khi tìm được giá trị tối ưu, tiến hành phân tích và đánh giá kết quả thu được.
Nếu kết quả phù họp, kiểm chứng lại bằng thực nghiệm. Nếu kết quả không phù hợp,
xem lại từng bước để tìm ra vấn đề.
Ngày nay, phương pháp đáp ứng bề mặt được ứng dụng rộng rãi trong xây dựng
và phát triển các quy trình sản xuất, giúp giảm thiểu các yếu tố gây nhiễu, nâng cao và
tối ưu hóa chất lượng sản phẩm. Trong ngành Dược, phương pháp bề mặt đáp ứng cũng
được sử dụng rộng rãi, đặc biệt trong bào chế hay nghiên cứu chiết xuất dược liệu như
Phát triển và tối ưu hóa các hạt nano lipid rắn chứa baicalin được điều chế bằng phương
pháp đơng tụ sử dụng mơ hình thiết kế trung tâm CCD [401, chiết xuất phenolic trong
sả chanh, riềng, húng quế và hương thảo sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng [41].
1.5. Phương pháp điều chế cao đặc
1.5.1. Khái niệm
Theo Dược điển Việt Nam V, cao thuốc là những chế phẩm được điều chế bằng
cách cô hoặc sấy đến thề chất quy định dịch chiết thu được từ dược liệu, thực vật hay
động vật với dung mơi thích hợp [3].
Theo thể chất, cao dược liệu được phân thành 3 loại: Cao lỏng, cao đặc và cao khơ.
Trong đó, cao đặc có thể chất đặc qnh. Tỉ lệ dung mơi cịn lại trong cao đặc thường
khơng q 20% [3].
1.5.2. Phương pháp điều chế cao đặc
Quy trình điều chế cao đặc được mơ tả trong hình 1.2.
-
Chuẩn bị dược liệu,
dung mơi
Chiết xuất hoạt chất
-
Loại bớt tạp chất
Làm trong dịch chiết
Tinh chế giảm vi sinh vật
■ 1
.í
...
'
Điêu chê dịch chiêt
Tinh chê dịch chiêt
Cơ đặc
•
Cao dặc
F
Hình 1.2. Phưong pháp điêu chê cao đặc
A
Điều chế dịch chiết
12
Chuân bị dược liệu
Dược liệu dùng điều chế cao đặc phải đạt tiêu chuấn quy định. Sau đó, dược liệu
được sấy khơ và chia nhỏ tới độ mịn thích họp. Một số dược liệu có thế phải diệt enzym
hoặc loại chất béo trước khi chiết xuất.
Trong trường họp cao dược liệu gồm nhiều thành phần, các bột dược liệu có thể
được trộn lẫn trước khi chiết.
Chuẩn bị dung môi
Dung môi để điều chế cao đặc phải đạt tiêu chuẩn dược điển, thường dùng nước
và Ethanol. Trong đó, nước là dung môi thông dụng, rẻ tiền. Nước dùng làm dung môi
điều chế cao đặc phải là nước tinh khiết đạt tiêu chuẩn Dược điển hoặc nước uống được.
Ngồi ra, Ethanol hịa tan nhiều loại hoạt chất, hịa tan ít tạp chất nên cao dễ bảo quản
hơn, do đó được dùng rộng rãi.
Chiết xuất hoạt chất
Phương pháp chiết xuất hoạt chất được lựa chọn căn cứ vào: Bản chất của dược
liệu và dung môi, tiêu chuẩn chất lượng thành phấm, điều kiện trang thiết bị và quy mô
sản xuất. Một số phương pháp chiết xuất thường được sử dụng trong điều chế cao đặc:
ngâm, ngấm kiệt, chiết xuất có hỗ trợ siêu âm, ...
Tinh chế dịch chiết
Tinh chế dịch chiết nhằm đảm bảo hàm lượng hoạt chất và chất lượng cao, giúp
tăng độ ốn định, giảm vi sinh vật đồng thời loại bỏ dung môi và các thành phần độc hại.
Nguyên tắc khi tinh chế dịch chiết là loại bỏ tối đa tạp chất mà không làm ảnh hưởng
đáng kể đến hiệu suất và độ ổn định của hoạt chất.
Phương pháp tinh chế dịch chiết:
- Loại bớt tạp chắt: Tùy bản chất của tạp chất tan trong nước hay tạp chất tan trong
ethanol mà có phương pháp loại tạp thích họp.
- Làm trong dịch chiết: Một số phương pháp làm trong dịch chiết như lắng gạn, lọc,
ly tâm...
-
Tinh chế giảm vi sinh vật: Phương pháp lọc qua màng lọc hoặc dùng bức xạ uv
có thể làm giảm lượng vi sinh vật có trong dịch chiết dược liệu.
Cơ đặc
Cơ đặc là q trình tăng tỉ lệ hoạt chất trong dịch chiết bằng cách bốc hơi dung
môi nhưng chưa làm khô sản phẩm. Đây là bước quan trọng, quyết định thể chất cao
đặc. Dược điển Việt Nam V quy định cô ở áp suất giảm, nhiệt độ không quá 60°C hoặc
cô cách thủy.
13
Ở quy mơ nhỏ, có thể cơ đặc dịch chiết bằng máy cơ quay chân khơng. Quy mơ
sản xuất có thể cô đặc bằng một số thiết bị như nồi cơ tuần hồn, thiết bị cơ đặc loại
màng, thiết bị cô ly tâm....
Cao đặc được tạo ra sau khi cô đặc dịch chiết cần đạt một số chỉ tiêu chất lượng
theo dược điển Việt Nam V về cảm quan, mất khối lượng do làm khơ, định tính, định
lượng... [5].
14
CHƯƠNG 2: ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Mầu Ngũ bội tử Trung Quốc do Công ty cố phần Dược liệu Indochina Herb cung
cấp và được giám định tên khoa học bởi ThS. Nghiêm Đức Trọng, bộ mơn Thực Vật.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị và phần mềm
2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuấn phân tích bao gồm:
-
Các dung mơi/hóa chất hữu cơ: Ethanol, methanol.
-
Hóa chất vơ cơ: Acid hydrochloric, acid phosphoric.
-
Acid gallic chuẩn, độ tinh khiết 98%, được cung cấp bởi công ty TNHH Khoa
học và Kỹ thuật Vietphyto.
2.1.2.2. Dụng cụ
-
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Shimadzu, Nhật Bản)
-
Hệ thống lọc chân không, màng lọc 0,45pm X 47mm Supelco (Mỹ), màng lọc
syringe 0,45pm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản), lọ đựng mẫu (vial) l,5ml
Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản).
-
Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg.
-
Cân kỹ thuật Precisa XT 620M độ chính xác 0,01 g (Thụy Sĩ)
-
Tủ sấy Memmert (Đức)
-
Máy siêu âm WUC-D22H (Daihan Scientific, Hàn Quốc).
-
Máy đo hàm ẩm Precisa SM60 (Thụy Sĩ)
-
Bếp hồng ngoại Kangaroo điều chỉnh được nhiệt độ.
-
Bình thủy tinh chịu nhiệt lOOml
-
Ống falcon 50ml
-
Bình định mức, bình nón, pipet chính xác các loại...và các dụng cụ thủy tinh cần
thiết khác cần cho phân tích.
2.1.2.3. Phần mềm
Sử dụng phần mem Design Expert 11.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
15
2.2.1. Nội dung 1: Thẩm định phương pháp định lượng Acid gallic trong Ngũ bội tử
Thẩm định phương pháp định lượng acid gallic trong Ngũ bội tử bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) theo dược điển Việt Nam V trên các chỉ tiêu: Độ đặc hiệu, khoảng
tuyến tính và đường chuấn, sự phù họp của hệ thống, độ lặp lại và độ đúng.
Định lượng acid gallic toàn phần trong nguyên liệu Ngũ bội tử.
2.2.2. Nội dung 2: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc
giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử.
Khảo sát một số yếu tố bằng phương pháp thay đối một yếu tố (OFAT):
-
Tỉ lệ dược liệu/dung môi (g/ml)
-
Thời gian chiết xuất (phút)
-
Nhiệt độ chiết xuất (°C)
-
Nồng độ Ethanol trong dung môi chiết (%) (tt/tt)
Thông số đánh giá: Hiệu suất chiết acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử (%).
Từ kết quả thu được, lựa chọn khoảng khảo sát yếu tố đầu vào của quá trình chiết
xuất để tiến hành khảo sát trong bước tiếp theo.
2.2.3. Nội dung 3: Khảo sát và lựa chọn các điều kiện toi ưu cho q trình chiết xuất
cao đặc giàu acid gallic tồn phần từ Ngủ bội tủ'
Khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất với mục tiêu
hiệu suất chiết acid gallic toàn phần lớn nhất.
2.2.4: Nôi dung 4: Điều chế cao đặc giàu acid gallic tồn phần từ dịch chiết Ngũ bội
tử
Xây dựng quy trình chiết xuất và điều chế cao ở quy mô 50g dược liệu/mẻ để thu
được cao đặc Ngũ bội tử có hàm lượng acid gallic toàn phần cao.
2.3. Phuong pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp định lượng acid gallic toàn phần
Hàm lượng acid gallic toàn phần trong dược liệu Ngũ bội tử, dịch chiết Dược liệu
Ngũ bội tử và cao đặc Ngũ bội tử bằng phương pháp HPLC như sau:
Điều kiện sắc kỷ
-
Cột sắc ký: Cột C18 Inersustain GL Sciences (250 X 4,6 mm; 5 pm)
-
Pha động: Methanol - Acid phosphoric 0,1% tỉ lệ 15:85
-
Bước sóng phát hiện: 273 nm
Tốc độ dịng: 1,2 ml/phút
Thể tích tiêm mẫu: 10 pl
16
