Lời cảm ơn và mục lục

i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo, Các phịng
chức năng Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hồn thành luận án.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà và TS.
Lê Văn Sơn những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận
lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hồn thành luận án.
Tơi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Lê Trần Bình, người thầy đã đào tạo
và tạo mọi điều kiện thuận lợi, ủng hộ và giúp đỡ tơi trong suốt q trình học
tập và nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn Tập thể cán bộ Phịng Cơng nghệ Tế bào
thực vật, đã tạo những điều kiện tốt nhất để tôi được thực hiện và hồn thành
đề tài luận án.
Trong q trình làm luận án, tôi đã nhân được sự giúp đỡ nhiệt tình của
tồn thể cán bộ Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm
nghiệp. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tơi xin chân thành cảm ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Lâm
nghiệp đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để cho tôi yên tâm học tập và thực hiện
luận án.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn
động viên, giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện thành công
luận án này.
Hà Nội, ngày …. tháng …… năm 2013
Nghiên cứu sinh

Bùi Văn Thắng


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
-

Đây là cơng trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;

-

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
cơng bố trên các tạp chí khoa học chun ngành với sự đồng ý và cho phép của
các đồng tác giả;

-

Phần kết quả còn lại của luận án chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình
nào khác.

Hà Nội, ngày …. tháng …… năm 2013
Tác giả

Bùi Văn Thắng


iii

MỤC LỤC
Trang

MỞ ĐẦU

1

1. Tính cấp thiết của đề tài
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

1

3. Nội dung nghiên cứu

4

4. Đóng góp mới của luận án

5

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

6

1.1. TÁC ĐỘNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI ĐẾN
CÂY TRỒNG

6

1.1.1. Tác hại của hạn đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng

6

1.1.2. Tác hại của đất nhiễm mặn đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng

7

1.1.3. Tác hại của nhiệt độ cao đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng

8

1.1.4. Tác hại của nhiệt độ thấp đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng

10

1.1.5. Phản ứng của thực vật đối với các điều kiện mơi trường bất lợi

10

1.2. TÍNH CHỐNG CHỊU VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI
CỦA THỰC VẬT
1.2.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện môi trường bất lợi

4

12
12

1.2.2. Cơ chế phân tử liên quan đến tính chống chịu điều kiện mơi trường bất lợi

13

1.2.3. Vai trị của proline và con đường sinh tổng hợp proline ở thực vật

16

1.2.4. Vai trò của glycine betaine và con đường sinh tổng hợp glycine betaine ở
sinh vật

25

1.3. CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỐNG
CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI

28

1.3.1. Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp proline chống chịu tốt với điều
kiện môi trường bất lợi

28

1.3.2. Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp glycine betaine tăng cường khả
năng chống chịu điều kiện môi trường bất lợi
1.4. PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ THÀNH
TỰU VỀ CÂY LÂM NGHIỆP CHUYỂN GEN CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN
MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI

31
39


iv

1.4.1. Điều kiện về cấu trúc gen chuyển vào tế bào thực vật

39

1.4.2. Promoter cảm ứng rd29A

40

1.4.3. Vector chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens

41

1.4.4. Các loại gen công cụ sử dụng trong sàng lọc các thể nhận gen

43

1.4.5. Chuyển gen gián tiếp vào cây trồng thông qua Agrobacterium

45

1.4.6. Một số thành tựu tạo giống cây lâm nghiệp chuyển gen chống chịu với
điều kiện bất lợi
1.5. CÂY XOAN TA VÀ CHỌN CÂY XOAN TA LÀM ĐỐI TƯỢNG
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN
1.5.1. Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm sinh học của cây Xoan ta
1.5.2. Chọn cây Xoan ta làm đối tượng nghiên cứu chuyển gen
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

50

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

55

2.1.1. Vật liệu thực vật

55

2.1.2. Chủng vi khuẩn và các ngun liệu DNA

55

2.1.3. Hóa chất thí nghiệm

56

2.1.4. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

56

2.1.5. Địa điểm thí nghiệm

57

2.2.

57

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

52
52
53
55

2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử
2.2.2. Xây dựng và tối ưu quy trình chuyển gen vào Xoan ta bằng
Agrobacterium
2.2.3. Phương pháp tạo cây Xoan ta chuyển gen mục tiêu

57

2.2.4. Phương pháp tạo cây thuốc lá chuyển gen

66

2.2.5. Phương pháp phân tích và đánh giá cây chuyển gen

67

2.2.6. Phương pháp tính tốn và xử lý số liệu

74

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

75

3.1. XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN CHO CÂY
XOAN TA

75

3.1.1. Xác định nồng độ kanamycin thích hợp để sàng lọc Xoan ta chuyển
gen

75

63
65


v

3.1.2. Xác định loại vật liệu thích hợp làm thể nhận gen

77

3.1.3. Xác định thời gian tiền nuôi cấy thể nhận gen

78

3.1.4. Xác định mật độ tế bào Agrobacterium tumefaciens (OD600nm)

79

3.1.5. Xác định thời gian nhiễm khuẩn Agrobacterium tumfaciens với thể nhận
gen

80

3.1.6. Xác định thời gian đồng nuôi cấy Agrobacterium tumfaciens với thể nhận
gen

80

3.1.7. Xác định chủng Agrobacterium thích hợp cho chuyển gen vào Xoan ta

81

3.2. TẠO CÂY XOAN TA CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC
RD29A::GUS VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER RD29A

84

3.2.1. Tạo dòng cây Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc rd29A-gus

84

3.2.2. Đánh giá hoạt động của promoter rd29A ở cây Xoan ta chuyển gen

85

3.3. TẠO CÁC DÒNG CÂY XOAN TA CHUYỂN GEN MANG CẤU
TRÚC RD29A:: P5CSm VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN

87

3.3.1. Tạo dòng cây Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSm

87

3.3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm

88

3.4. TẠO CÁC DÒNG THUỐC LÁ VÀ XOAN TA CHUYỂN GEN CODA
VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN, HẠN

92

3.4.1. Thiết kế gen codA thích hợp với biểu hiện ở thực vật

92

3.4.2. Thiết kế vector Ti-plasmid mang gen codA và biến nạp vào
Agrobacterium

94

3.4.3. Tạo các dòng Xoan ta chuyển gen TP-codA và đánh giá khả
năng chịu mặn, hạn

112

Chương 4. THẢO LUẬN

123

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

135

NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

137

SUMMARY

138

TÀI LIỆU THAM KHẢO

141


vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ABA
AS
BAP
Bt
bp
cDNA
codA
TP
CNSH
CTMT
Cry

CaMV
ĐC
đtg
Gus
GB
IBA
KDa
kb
Kin
LB
MS
NAA
nptII
OD
PCR
P5CS
P5CSm
RB
Rd29A
TB
T-DNA
Ti-Plasmid
Vir
WT
X-gluc

Abscisic acid
Acetosyringone
6-Benzyl amino purine
Bacillus thuringiensis

Base pair
Sợi DNA bổ sung được tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzyme sao mã
ngược (Complementary cDNA)
Choline Oxidase gene
Transit peptide
Công nghệ sinh học
Công thức môi trường
Crystal gene = Gen mã hố protein độc tố diệt cơn trùng
Cauliflower mosaic virus – Virút khảm súp lơ
Đối chứng
Đồng tác giả
β-Glucuronidase gene = Gen mã hoá β- Glucuronidase
Glycine betaine
Indolyl acetic acid
Kilo Dalton
Kilobase
Kinetin
Left border = Biên trái
Môi trương nuôi cấy cơ bản theo Murashinge và Skoog, 1962
Naphtyl acetic acid
Neomycin phosphotransferase = Gen kháng kanamycin
Opitical density
Polymerase chaine reaction = Phản ứng chuỗi trùng hợp
pyroline – 5 – carboxylate synthetase
Gen P5CS đột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngược
Right border = Biên phải
Responsive Dehydration promoter
Trung bình
Transfer – DNA = Vùng DNA plasmid chuyển thực vật
Tumor inducing plasmid = Plasmid gây khối u thực vật

Virulence Region = Vùng gây độc có khả năng tạo khối u
Wild type – Cây không chuyển gen
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1

Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa các enzyme tham gia
sinh tổng hợp proline, chống chịu tốt với điều kiện môi trường
bất lợi

31

Bảng 1.2

Một số lồi cây trồng chuyển gen mã hóa enzyme tham gia sinh
tổng hợp glycine betaine, tăng khả năng chống chịu với điều
kiện mơi trường bất lợi

38

Bảng 1.3

Một số lồi cây rừng đã được nghiên cứu chuyển gen

51

Bảng 2.1

Trình tự cặp mồi và thông số các cặp mồi

58

Bảng 2.2

Thành phần phản ứng PCR nhân gen TP-codA và codA

59

Bảng 2.3

Thành phần phản ứng cắt gen và vector

60

Bảng 2.4

Thành phần phản ứng ghép nối gen với vector pBI121

60

Bảng 2.5

Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp

62

Bảng 2.6

Môi trường nuôi và chọn lọc cây Xoan ta chuyển gen

63

Bảng 2.7

Môi trường nuôi và chọn lọc cây thuốc lá chuyển gen

66

Bảng 2.8

Thành phần phản ứng PCR nhân promoter rd29A

68

Bảng 2.9

Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ở ống 1

69

Bảng 2.10

Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ở ống 2

70

Bảng 2.11

Thành phần phản ứng PCR nhân gen P5CSm từ cDNA

70

Bảng 2.12

Thành phần phản ứng PCR nhân gen TP-codA và codA từ
cDNA

71

Bảng 3.1

Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến khả năng ra rễ chồi
Xoan ta

77

Bảng 3.2

Ảnh hưởng của loại vật liệu đến hiệu suất chuyển gen vào Xoan
ta.

78


viii

Bảng 3.3

Ảnh hưởng thời gian tiền nuôi cấy thể nhận gen đến hiệu suất
chuyển gen

79

Bảng 3.4

Ảnh hưởng của mật độ khuẩn đến hiệu suất chuyển gen

79

Bảng 3.5

Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu suất chuyển gen

80

Bảng 3.6

Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy giữa vi khuẩn với thể
nhận gen

80

Bảng 3.7

Ảnh hưởng của chủng Agrobacterium đến hiệu suất chuyển gen

81

Bảng 3.8

Kết quả thí nghiệm chuyển cấu trúc rd29A-gus vào Xoan ta

85

Bảng 3.9

Kết quả tạo dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm

88

Bảng 3.10

Hàm lượng proline tích lũy trong các dòng Xoan ta chuyển gen
và đối chứng khi xử lý hạn nhân tạo

90

Bảng 3.11

Kết quả chuyển gen TP-codA/codA vào thuốc lá

102

Bảng 3.12

Dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA/codA ra rễ trên mơi trường
200 mM NaCl

105

Bảng 3.13

Sinh trưởng của dịng thuốc lá chuyển gen và WT trên môi
trường xử lý NaCl ở các nồng độ khác nhau

107

Bảng 3.14

Nồng độ GB trong lá của các dịng thuốc lá chuyển gen và WT
trên mơi trường xử lý NaCl

110

Bảng 3.15

Tổng hợp kết quả chuyển gen TP-codA vào Xoan ta

112

Bảng 3.16

Khả năng chịu mặn của các dịng Xoan ta chủn gen
TP-codA trên mơi trường dinh dưỡng bổ sung NaCl nồng độ
khác nhau

115

Bảng 3.17

Sinh trưởng của các dòng Xoan ta chuyển gen và WT xử lý
NaCl ở các nồng độ khác nhau sau 2 tháng

119

Bảng 3.18

Nồng độ GB trong lá của các dòng Xoan ta chuyển gen và WT
trên môi trường xử lý NaCl nồng độ khác nhau.

120


ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Sơ đồ cơ chế biểu hiện gen khi thực vật bị tác động bởi điều
kiện mơi trường bất lợi

15

Hình 1.2

Vai trị của proline ở thực vât

17

Hình 1.3

Con đường sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao

20

Hình 1.4

Cơ chế điều hịa q trình trao đổi proline ở thực vật

22

Hình 1.5
Hình 1.6

Sinh tổng hợp glycine betaine ở thực vật bậc cao
Sinh tổng hợp glycine betaine ở E.coli

26
27

Hình 1.7

Sinh tổng hợp glycine betaine ở A. globiformis

27

Hình 1.8

Sinh tổng hợp glycine betaine ở Actinopolyspora halophilia

28

Hình 1.9

Mơ hình chuyển gen vào thực vật nhờ Agrobacterium
tumefaciens

48

Hình 1.10

Cây Xoan ta trưởng thành

52

Hình 2.1

Sơ đồ cấu trúc đoạn T-DNA của vector chuyển gen nhị thể
pBI121

56

Hình 2.2

Sơ đồ thí nghiệm tổng qt

57

Hình 2.3

Vector pBluescript II SK chứa trình tự gen codA tổng hợp nhân
tạo

58

Hình 2.4

Mơ hình các dịng thuốc lá trồng trong chậu đất, đặt trong
khay nhựa để xử lý mặn.

73

Hình 2.5

Mơ hình các dòng Xoan ta trồng trong chậu đất, đ ặt trong
khay nhựa để xử lý mặn.

73

Hình 3.1

Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến khả năng tái sinh chồi
của thân mầm và lá mầm Xoan ta.

75


x

Hình 3.2

Đoạn thân và mảnh lá mầm ni trên mơi trường có kanamycin

75

Hình 3.3

Biểu hiện gen gus ở Xoan ta chuyển ở các giai đoạn khác nhau

82

Hình 3.4

Biểu hiện gen gus ở cây Xoan ta chuyển. a: thân; b: lá; c: cây

hồn chỉnh

83

Hình 3.5
Hình 3.6
Hình 3.7
Hình 3.8

gen

PCR nhân promoter rd29A từ các cây Xoan ta chuyển

Biểu hiện GUS ở lá cây Xoan ta chuyển gen rd29A-gus
gen

Hoạt tính của enzyme GUS ở các cây Xoan ta chuyển
Các dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm

85
86
86
88

Hình 3.9

Các dịng Xoan ta chuyển gen P5CSm và dịng WT sau xử lý
hạn 10 ngày (khơng tưới nước)

89

Hình 3.10

Hàm lượng proline tính lũy trong các khoảng thời gian
gây hạn nhân tạo

90

Hình 3.11

Sản phẩm RT-PCR từ mRNA của các dịng Xoan ta chuyển gen
và đối chứng

90

Hình 3.12

Biểu hiện hình thái của các dịng Xoan ta chuyển gen và dịng
WT trước và sau xử lý hạn 10 ngày

91

Hình 3.13

Trình tự gen codA tổng hợp nhân tạo (CODA-TT-NT) so sánh
với tình tự gen codA gốc (AY304485)

92

Hình 3.14

So sánh trình tự amino acid của choline oxidase được mã hóa
bởi gen codA tổng hợp nhân tạo (CODA-TT-NT) và gen codA
gốc (AY304485)

94

Hình 3.15

Sản phẩm PCR nhân gen TP-codA và codA

95

Hình 3.16

Sản phẩm cắt vector pB121 bằng XbaI và SacI

96

Hình 3.17

Sản phẩm thơi gel gen TP-codA/codA và vector pBI121
mở vịng

97

Hình 3.18

Plasmid tái tổ hợp

98


xi

Hình 3.19

Sản phẩm PCR nhân gen TP-codA và
pBI121::TP-codA

và cắt plasmid

Hình 3.20

Sản phẩm PCR nhân gen codA
pBI121::codA

và cắt plasmid

Hình 3.21

gen

Sơ đồ thiết kế cấu trúc đoạn T-DNA của vector chuyển

98
99
99

Hình 3.22

Khuẩn lạc A. tumefacies LBA4404 biến nạp vector chuyển gen
mọc trên môi trường LB bổ sung 50 mg/l kanamycin và 50 mg/l
rifamycin

100

Hình 3.23

Sản phẩm PCR gen TP-codA và codA

101

Hình 3.24

Mảnh lá chuyển gen tái sinh trên MT có 100 mg/l kanamycin
sau 3 tuần

102

Hình 3.25

Cụm chồi tái sinh từ mảnh lá trên MT có 100 mg/l knanamycin
sau 5 tuần

103

Hình 3.26

Chồi thuốc lá ni trên mơi trường ra rễ có 50 mg/l knanamycin

103

Hình 3.27
Hình 3.28

gen
gen

Sản phẩm PCR nhân gen TP-codA từ cây thuốc lá chuyển
Sản phẩm PCR nhân gen codA từ cây thuốc lá chuyển

104
104

Hình 3.29

Các dịng thuốc lá chuyển gen TP-codA và khơng chuyển
gen trên mơi trường ra rễ có 200 mM NaCl

105

Hình 3.30

Các dịng thuốc lá chuyển gen codA trên mơi trường ra rễ có
200 mM NaCl

105

Hình 3.31

Mảnh lá thuốc lá tái sinh trên mơi trường có 200 mM NaCl

106

Hình 3.32

Các dòng thuốc lá chuyển gen và đối chứng trồng trên giá thể
NT1 sau 10 ngày ở nhà lưới (trước xử lý mặn)

107

Hình 3.33

Dịng thuốc lá chuyển gen (TPC-To12) và đối chứng không
chuyển gen (WT) sinh trưởng trên môi trường xử lý NaCl nồng
độ khác nhau sau 3 tháng

108

Hình 3.34

Hình thái lá của dòng thuốc lá chuyển gen (TPC-T3) và đối

108


xii

chứng không chuyển gen (WT) sinh trưởng trên môi trường xử

lý 300 mM NaCl
Hình 3.35

Hàm lượng Chlorophyll của dịng thuốc lá chuyển gen và đối
chứng không chuyển gen (WT) trên mơi trường xử lý NaCl
nồng độ khác nhau

109

Hình 3.36

Sản phẩm RT-PCR từ mRNA của các dòng thuốc lá
chuyển gen và đối chứng

109

Hình 3.37

Nồng độ glycine betaine tính lũy trong lá của các dòng thuốc lá
chuyển gen và đối chứng (WT) trồng ở điều kiện mơi trường
bình thường

110

Hình 3.38

Nồng độ glycine betaine tính lũy trong lá của các dịng thuốc lá
chuyển gen và đối chứng (WT) trồng ở điều kiện môi trường xử
lý NaCl nồng độ khác nhau

111

Hình 3.39

Sinh trưởng và phát triển của dòng thuốc lá chuyển gen (TPCTo12) và đối chứng (WT) trồng ở điều kiện môi trường xử lý
NaCl sau 5 tháng

111

Hình 3.40

Các dịng cây Xoan ta chuyển gen TP-codA

113

Hình 3.41

Sản phẩm PCR nhân gen TP-codA từ DNA tổng số tách chiết từ
cây các dòng Xoan ta chuyển gen và cây khơng chuyển gen

114

Hình 3.42

Sinh trưởng của dịng Xoan ta chuyển gen và cây WT không
chuyển gen trên mơi trường tái sinh có nồng độ NaCl khác nhau

115

Hình 3.43

Các dòng Xoan ta chuyển gen phản ứng khác nhau trong điều
kiện xử lý hạn nhân tạo 10 ngày

116

Hình 3.44

Dịng Xoan ta chuyển gen (TX4) và đối chứng (WT) sau xử lý
hạn 10 ngày

117

Hình 3.45

Sự biểu hiện của gen TP-codA trong các dòng cây Xoan ta
chuyển gen bằng phản ứng RT-PCR

118

Hình 3.46

Nồng độ glycine bataine tính lũy trong lá của các dòng Xoan ta
chuyển gen và đối chứng sau 10 ngày xử lý hạn

118

Hình 3.47

Sinh trưởng và hàm lượng Chlorophyll của các dòng Xoan ta

chuyển gen và WT xử lý NaCl nồng độ khác nhau sau 2 tháng

119


xiii

Hình 3.48

Nồng độ GB tính lũy trong lá của các dòng Xoan ta chuyển gen
và đối chứng (WT) trồng ở điều kiện mơi trường xử lý NaCl
nồng độ khác nhau

121

Hình 3.49

Dịng Xoan ta chuyển gen và đối chứng khơng chuyển gen sau 2
tháng xử lý mặn nhận tạo ở các nồng độ NaCl khác nhau

121

Hình 3.50

Dịng Xoan ta chuyển gen và đối chứng không chuyển gen sau 3
tháng xử lý mặn nhận tạo ở các nồng độ NaCl khác nhau

122