Nghiên cứu nhân nhanh và ra rễ in vitro cây la hán quả

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
--------🙡 🕮 🙣--------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH
VÀ RA RỄ IN VITRO CÂY LA HÁN QUẢ
(Siraitia grosvenorii)

HÀ NỘI – 2023


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
--------🙡 🕮 🙣--------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH
VÀ RA RỄ IN VITRO CÂY LA HÁN QUẢ
(Siraitia grosvenorii)

Người thực hiện

: Lê Thanh Sơn

MSV

: 646105

Lớp

: K64CNSHB

Ngành

: Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn

: ThS. Vũ Hoài Sâm
TS. Nguyễn Thị Thúy Hạnh

HÀ NỘI – 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này
là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này
đã được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong khóa luận đều được ghi rõ
nguồn gốc.
Sinh viên

Lê Thanh Sơn

i


LỜI CẢM ƠN

Trong q trình thực hiện khóa luận, em đã nhận được sự quan tâm, giúp
đỡ của nhiều cá nhân và cơ quan đơn vị cùng với sự nỗ lực của bản thân em.
Nay khóa luận đã hồn thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc
nhất tới:
ThS. Vũ Hồi Sâm – Phó trưởng phịng Cơng nghệ sinh học của Trung
tâm Nghiên cứu Nguồn gen và Giống dược liệu Quốc gia - Viện Dược liệu - đã
dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em tận tình
trong suốt quá trình em thực tập tại Trung tâm.
TS. Nguyễn Thị Thúy Hạnh - Phó trưởng khoa, giảng viên Khoa Cơng
nghệ sinh học - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn
và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ em trong quá trình thực tập.
Em xin cảm ơn các anh chị cán bộ phịng thí nghiệm ni cấy mơ của
Trung tâm Nghiên cứu Nguồn gen và Giống dược liệu Quốc gia - Viện Dược
liệu đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình làm thực tập tại
Trung tâm.
Em xin cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Học viện Nơng nghiệp Việt
Nam đã tận tình dạy bảo em suốt 4 năm học qua.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và
bạn bè đã giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian học tập.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 05 tháng 02 năm 2023
Sinh viên

Lê Thanh Sơn

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................. v
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii
PHẦN I. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1
1.2. Mục đích...................................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu........................................................................................................ 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
2.1. Giới thiệu chung về cây la hán quả ............................................................. 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố .......................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm thực vật học .......................................................................... 3
2.1.3. Thành phần hóa học .............................................................................. 4
2.1.4. Bộ phận sử dụng làm thuốc và công dụng của cây la hán quả ............. 4
2.2. Cơ sở khoa học của đề tài ........................................................................... 5
2.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nhân giống in vitro............................. 5
2.2.2. Quy trình nhân giống vơ tính in vitro ................................................... 6
2.2.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình nhân giống in vitro ......... 8
2.2.3.1. Vật liệu nuôi cấy ............................................................................. 8
2.2.3.2. Điều kiện nuôi cấy .......................................................................... 8
2.2.3.3. Môi trường dinh dưỡng................................................................... 9
2.3. Ưu nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro ............................. 12
2.4. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro về cây la hán quả trong và ngoài
nước .................................................................................................................. 13
2.4.1. Trong nước .......................................................................................... 13
2.4.2. Ngoài nước .......................................................................................... 13
iii

PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
............................................................................................................................. 16
3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu.............................................................. 16
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 16
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 16
3.4. Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 17
3.4.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro ............................................................ 17
3.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................... 17
3.5. Các chỉ tiêu theo dõi.................................................................................. 19
3.6. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 19
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 20
4.1. Nghiên cứu nhân nhanh chồi .................................................................... 20
4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro
cây la hán ...................................................................................................... 20
4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi in
vitro cây la hán .............................................................................................. 21
4.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA/NAA đến khả năng
nhân nhanh chồi in vitro cây la hán .............................................................. 23
4.2. Nghiên cứu ra rễ ........................................................................................ 25
4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ khoáng MS đến khả năng ra rễ in
vitro cây la hán .............................................................................................. 26
4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ in vitro cây la
hán ................................................................................................................. 27
4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ in vitro cây la hán . 28
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 31
5.1. Kết luận ..................................................................................................... 31
5.2. Kiến nghị ................................................................................................... 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 32
PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU ............................................................................ 35

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BA

6-Benzyladenin

Cs

Cộng sự

CT

Công thức

CV%

Hệ số biến động

ĐC

Đối chứng

IBA

3-Indolebutiric axid

LSD5%

Giá trị sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa tại mức ý nghĩa 0.05

MS

Murashige and Skoog

NDT

Nhân dân tệ (đơn vị tiền tệ Trung Quốc)

NXB

Nhà xuất bản

TB

Trung bình

TT

Thứ tự

α-NAA

α-Napthalene acetic axid

v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 4. 1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây la hán
(sau 6 tuần nuôi cấy). .......................................................................................... 20
Bảng 4. 2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây la
hán (sau 6 tuần nuôi cấy)..................................................................................... 22
Bảng 4. 3. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi in
vitro cây la hán (sau 6 tuần nuôi cấy). ................................................................ 23
Bảng 4. 4. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
in vitro cây la hán (sau 6 tuần nuôi cấy). ............................................................ 24
Bảng 4. 5. Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đến khả năng ra rễ in vitro cây la hán
(sau 6 tuần nuôi cấy). .......................................................................................... 26
Bảng 4. 6. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ in vitro cây la hán (sau 4
tuần nuôi cấy). ..................................................................................................... 27
Bảng 4. 7. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ in vitro cây la hán

(sau 4

tuần nuôi cấy). ..................................................................................................... 29

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2. 1. La hán quả - Siraitia grosvenorii ......................................................... 4
Hình 4. 1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây la hán
(sau 6 tuần ni cấy). .......................................................................................... 21
Hình 4. 2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây la
hán (sau 6 tuần ni cấy)..................................................................................... 23
Hình 4. 3. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi in
vitro cây la hán (sau 6 tuần ni cấy) ................................................................. 24

Hình 4. 4. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
in vitro cây la hán (sau 6 tuần nuôi cấy). ............................................................ 25
Hình 4. 5. Ảnh hưởng của nồng độ khống đến khả năng ra rễ in vitro cây la hán
(sau 6 tuần ni cấy). .......................................................................................... 27
Hình 4. 6. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ in vitro cây la hán (sau 4
tuần ni cấy). ..................................................................................................... 28
Hình 4. 7. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ in vitro của cây la hán (sau 4
tuần nuôi cấy). ..................................................................................................... 30

vii


TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu nhân nhanh và ra rễ in vitro cây la hán quả
(Siraitia grosvenorii)” được thực hiện nhằm hồn thiện quy trình nhân giống in
vitro cây la hán. Chồi la hán in vitro được nuôi cấy trên mơi trường cơ bản MS
(Murashige and Skoog) có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng để thăm dò khả
năng nhân nhanh và ra rễ của chúng. Kết quả nghiên cứu cho thấy:
Mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BA cho kết quả nhân chồi tốt nhất
với 6,75 chồi/mẫu, chiều cao chồi trung bình là 4,6 cm, số lá trung bình là 5,8 lá
sau 6 tuần ni cấy. Thí nghiệm cũng cho thấy, mơi trường ½ MS có bổ sung
0,1 mg/l IBA cho tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 100%, số rễ đạt nhiều nhất 5,33 rễ/chồi,
chiều dài rễ 5,15 cm.

viii


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
La hán (Siraitia grosvenorii) là cây thân thảo lâu năm đặc hữu ở tỉnh

Quảng Tây – Trung Quốc thuộc họ bầu bí (Cucurbitacea), quả của nó thường
được gọi là Luo hanguo – đã được sử dụng từ hàng trăm năm nay như một chất
làm ngọt tự nhiên và là loại thuốc truyền thống để điều trị viêm họng, cũng như
một phương thuốc chống ho, long đờm tự nhiên. Cho đến nay, người ta đã phân
lập được hơn 100 hợp chất từ la hán bao gồm các triterpenoids, flavonoid, axit
amin và polysaccharide (Gong et al., 2019) có vai trị quan trọng trong phịng
chống khối u, chống oxy hóa, tăng cường khả năng miễn dịch, bảo vệ gan, hạ
đường huyết và các tác dụng dược lý khác.
La hán là cây thuốc có giá trị kinh tế cao cả về thực phẩm và dược liệu.
Theo thống kê năm 1998, diện tích trồng cây Siraitia grosvenorii đạt 30.000 m2
cho sản lượng 110 triệu quả trị giá hơn 300 triệu NDT. Số liệu thống kê năm
2010 cho thấy diện tích trồng là 120.000 m2, sản xuất 400 triệu quả trị giá hơn 1
tỷ NDT (Zeng et al., 2011).
La hán được nhân giống bằng hạt và giâm hom, tuy nhiên việc giâm hom
mất nhiều thời gian, đặc biệt la hán rất nhạy cảm với các bệnh virus như bệnh
đốm lá, khảm, xoăn,… làm suy giảm giống cây trồng và giảm năng suất đáng
kể. Tháng 7 – tháng 8 năm 2002, bệnh virus trên cây S. grosvenorri xuất hiện ở
cả 9 thị trấn thuộc Vĩnh Phúc – Quảng Tây, Trung Quốc, 74.309 cây được phát
hiện. Kết quả cho thấy, cây bị nhiễm virus nặng chiếm tỷ lệ trung bình 52,8%,
trong khi bệnh giảm ở các cây nuôi cấy mô chỉ là 13,9% (Wei et al., 2003).
Tháng 9 năm 2013, các triệu chứng của bệnh đốm lá do nấm S. cucurbitacearum
đã được quan sát thấy: 80% các khu vườn trồng S. grosvenorri ở thành phố Quế
Lâm, cây bị bệnh nặng, rụng nhiều lá, dẫn đến các cây bị già sớm và không có
quả (Jiang et al., 2015).
Nhân giống vơ tính in vitro là phương pháp hiệu quả để tạo cây sạch bệnh
đặc biệt là các bệnh về virus, lưu giữ được các đặc tính quý của cây mẹ do đồng
1


nhất về mặt di truyền, cho hệ số nhân giống cao, cung cấp giống một cách chủ

động với số lượng cây lớn, phát triển ở quy mô công nghiệp.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã tiến hành thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh và ra rễ in vitro cây la hán quả (Siraitia
grosvenorii)” nhằm hồn thiện quy trình nhân giống in vitro cây la hán làm cơ
sở cho việc sản xuất một lượng lớn cây giống đáp ứng nhu cầu sản xuất.
1.2. Mục đích
Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng
nhân nhanh, ra rễ cây la hán.
1.3. Yêu cầu
- Xác định được môi trường nhân nhanh in vitro tốt nhất cho hệ số nhân giống cao.
- Xác định được môi trường ra rễ in vitro tốt nhất.

2


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây la hán quả
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố
Cây la hán hay la hán quả có tên khoa học là Siraitia grosvenorii (Swingle)
C.Jeffrey ex A.M.Lu & Zhi Y.Zhang, thuộc chi Siraitia Merr., họ bầu bí
(Cucurbitacea) có nguồn gốc từ các vùng phía nam của Trung Quốc, chủ yếu ở tỉnh
Quảng Tây, nơi nó đã được trồng hơn 200 năm (Lu and Zhang, 1984).
2.1.2. Đặc điểm thực vật học
La hán quả là cây thân thảo lâu năm dạng thân leo, dọc thân mọc nhiều
tua cuốn có khả năng bám vào cây khác, có thể dài từ 3 – 5 m. Rễ phình to dạng
hình thoi hoặc cầu. Thân và cành hơi cứng. Lá rụng theo mùa, đầu nhọn, dài 10
– 20 cm, rộng 3,5 – 12 cm; cuống lá dài 3 – 10 cm, phiến lá có hình trứng dài
hay chóp nhọn, có màng, kích thước 12-23 x 5-17 cm. Hoa đực là cụm hoa dạng
chùm, có 6 – 10 hoa, cuống hoa dài 7 – 13 cm, cuống mảnh 5 – 15 mm; đài 5,
dạng ống rộng hình chng, thường có 3 vảy bắc mỏng, phân đoạn hình tam

giác, đỉnh đài thn nhọn kích thước 4,5 x 3 mm, có 3 gân; tràng hoa màu vàng,
thn dài, kích thước 10-15 x 7-8 mm, 5 gân, đỉnh nhọn. Hoa cái đơn độc, đài
hoa và tràng hoa giống hoa đực nhưng lớn hơn, nhị lép, dài 2 – 2,5 mm, nhụy
bầu thuôn dài kích thước 10-12 x 5-6 mm, màu vàng nâu đậm, mịn như nhung,
gốc tròn tù, vòi nhụy 4 – 5 mm, đầu nhụy chẻ 3 mở rộng, bầu hạ 3 ơ. Quả hình
cầu, 6-11 x 4-8 cm, vỏ có màu xanh khi cịn xanh và có màu nâu sẫm khi chín,
sáng bóng, trên lớp vỏ vẫn giữ lớp lơng nhung. Thịt quả màu trắng, mọng nước,
có vị ngọt và mùi thơm, trong chứa nhiều hạt màu vàng nhạt, hình trứng rộng và
dẹt, 15-18 × 10-12 mm, gốc hình tù, có 2 lớp cánh, lượn sóng, các cánh có rãnh.
Mùa hoa tháng 6 - tháng 8, mùa quả tháng 8 - tháng 10 (Flora of China Editorial
Board of the Chinese Academy of Sciences, 2004).

3


Hình 2. 1. La hán quả - Siraitia grosvenorii
(1. quả; 2. lá; 3.hoa; 4. thân; 5. hạt)
(Gong Xue et al., 2019)
2.1.3. Thành phần hóa học
Có hơn 100 hợp chất được phân lập từ la hán bao gồm :
+ 71 triterpenoids đã được phân lập từ quả bao gồm 56 cucurbitanes, 9 norcucurbitanes, 1 lanostane, and 5 oleananes.
+ 8 flavonoid đã được phân lập từ hoa, lá và quả (kaempferol ; kaempferol7-O-α-L-rhamnopyranoside ; grosvenorine ; kaempferitrin ; quercetin 3-O-β-Dglucopyranosyl 7-O-α-L-rhamnopyranoside ; 7-methoxy-kaempferol 3-O-α-Lrham-nopyranoside ; 7-methoxy-kaempferol 3-O-β-D-gluco-pyranoside ; afzelin).
Các thành phần hóa học chính trong S. grosvenorii là triterpenoids,
flavonoids và glycosides, trong khi các thành phần khác ít được báo cáo hơn.
Cho đến nay, có 3 acid phenolic, 2 anthraquinones, 3 alkaloids ; 3 acid béo và
một số hợp chất khác đã được phân lập và xác định (Gong et al., 2019)
2.1.4. Bộ phận sử dụng làm thuốc và công dụng của cây la hán quả
Quả la hán đã được sử dụng làm thuốc trong hơn 300 năm kể từ khi được
ghi nhận, có giá trị dinh dưỡng cao, là một trong những loại thảo dược đầu tiên
được sử dụng cho cả mục đích y học và thực phẩm ở Trung Quốc.

4


Theo ghi nhận trong Ủy ban Dược điển Trung Quốc (2015), S.
grosvenorii có hiệu quả đáng kể trong điều trị ho, đau họng. Bencao Gangmu, là
cuốn sách chuyên khảo nổi tiếng viết về y học cổ truyền Trung Quốc trong thời
nhà Minh, là cuốn sách đầu tiên liệt kê các ứng dụng của loại cây này ở Trung
Quốc. Ghi chép về việc sử dụng S. grosvenorii làm thuốc long đờm để giảm đau
họng, thanh nhiệt và làm ấm phổi có từ 2.000 năm trước.
Ngồi ra, nó cịn được sử dụng như một chất làm ngọt tự nhiên với lượng
calo thấp và độ ngọt cao so với đường sucrose (Lu et al., 2012). Chiết xuất quả
la hán đã được báo cáo thể hiện các hoạt tính sinh học khác nhau như chống ho,
chống các bệnh về tim, chống oxy hóa, tiểu đường, chống viêm và chống ung
thư bên cạnh các hoạt động bảo vệ gan và điều hòa miễn dịch (Chun et al., 2014;
Liu et al.,2018).
Trong số các thành phần mogroside, mogroside – V chiếm hàm lượng cao
nhất, khoảng 0,5 – 1,4% có độ ngọt cao gấp khoảng 300 – 400 lần so với sucrose
(Suzuki et al., 2005). Mogroside – V khơng chứa calo, cung cấp một chất thay thế
hồn hảo cho các bệnh nhân tiểu đường, người béo phì và những người đang ăn
kiêng (Chen et al., 2007). Ngoài các hoạt động chống ung thư và chống oxy hóa,
mogroside – V cịn được chứng minh có liên quan đến việc điều chỉnh sự tiết
insulin trong ống nghiệm (Takasaki et al., 2003; Takeo et al., 2002).
2.2. Cơ sở khoa học của đề tài
2.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nhân giống in vitro
Cơ sở lí luận của phương pháp nhân giống in vitro là tỉnh toàn năng
(totipotence) của tế bảo. Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm
rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng
để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại
thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền

cần thiết và đầy đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện phù hợp, mỗi tế bào đều
có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.

5


Tính tồn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận
của phương pháp ni cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hoàn
toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một
tế bảo riêng rẽ thơng qua q trình phát sinh hình thái (Ngơ Xuân Bình, 2010).
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thế thống nhất bao gồm nhiều
cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều tế bào khác nhau. Tuy
nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp
tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào
phơi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó từ các tế bào
phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu
cho các mơ, cơ quan có chức năng khác nhau.
Sự phân hóa tế bào là tiến tình quy định biến đổi các tế bào phơi sinh
thành các tế bào mơ chun hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. Tuy nhiên,
khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chun biệt, chúng khơng
hồn tồn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều
kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phơi sinh và phân chia mạnh
mẽ. Q trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào.
Q trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất
là kết quả của q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật ni cấy mơ
tế bào xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực
vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa tế bào trên cở
sở tính tồn năng của tế bào thực vật (Ngơ Xn Bình, 2010).
2.2.2. Quy trình nhân giống vơ tính in vitro
Quy trình nhân giống in vitro gồm 5 giai đoạn:

Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị mẫu
Cây mẹ phải là cây có phẩm chất vượt trội, ở giai đoạn sinh trưởng mạnh,
sạch bệnh đặc biệt là bệnh virus với chế độ chăm sóc và phịng trừ sâu bệnh hiệu
quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống, sinh
trưởng của mẫu nuôi cấy in vitro. Cơ quan chọn để lấy mẫu thường là chồi, mắt
6


ngủ, hoa non, lá non, vảy củ, phôi hạt… Mỗi cây đều có ngưỡng nhiệt độ và độ
ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu. Với cây nhiệt đới thì nhiệt độ 25°C, độ
ẩm 75% là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp.
Bước 1: Nuôi cấy khởi động
Đây là giai đoạn khử trùng mẫu và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai
đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại
và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát
triển của cây: mơ non, ít chun hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ...).
Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh truởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa,
đoạn thân, mảnh lá, rễ… Xác định chế độ khử trùng cũng như chất khử trùng
mẫu thích hợp. Hóa chất thường dùng là HgCl2 0,1%; NaOCI, Ca(OCl)2 hoặc
H2O2, dung dịch Brom … Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ
sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng
nhanh.
Bước 2: Nhân nhanh
Đây là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh
số lượng thơng qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo
phơi vơ tính. Trong giai đoạn này cần phải xác định được môi trường và điều
kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo ngun tắc chung mơi
trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi (tỷ lệ auxin/cytokinin < 1). Chế
độ nuôi cấy thường là 22 - 26°C, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ
ánh sáng 2000 - 3000 lux.

Bước 3: Ra rễ
Khi chồi đạt đến một kích thước nhất định, mẫu được chuyển từ môi
trưởng nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường ra rễ thường bổ sung 1
lượng nhỏ auxin. Tuy nhiên có một số chồi có thể phát sinh ra rễ ngay sau khi
chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa
chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các phơi vơ tính thường chỉ gieo trên mơi
trường khơng có chất điều tiết sinh trưởng hoặc mơi trường có nồng độ
7


cytokinin thấp (tỷ lệ auxin/cytokinin > 1) để phôi phát triển thành cây hồn
chỉnh.
Bước 4: Thích nghi với điều kiện tự nhiên
Ở giai đoạn này, cây được chuyển từ điều kiện vơ trùng của phịng thí
nghiệm ra ngồi tự nhiên. Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống
cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm đã đạt một số tiêu chuẩn về hình thái nhất định:
số lá, số rễ, chiều cao cây.
+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, đủ ấm
và thoát nước tốt.
+ Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm
cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp (Trần Văn Hồng và cs., 2008).
2.2.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến q trình nhân giống in vitro
2.2.3.1. Vật liệu ni cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho q trình nhân giống
in vitro, có thể là hầu hết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên,
phiến lá,…), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ
(củ, thân rễ…). Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mơ
khác nhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong q trình
ni cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu ni cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh

lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục
đích và khả năng ni cấy (Vũ Văn Vụ, 2009).
2.2.3.2. Điều kiện nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của tế bào và mơ
trong q trình ni cấy in vitro. Trong đó ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm là 3 yếu
tố có vai trị quan trọng nhất:
+ Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và
các q trình trao đổi chất trong ni cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường giữ ổn
định ở 24 ± 20C.
8


+ Ánh sáng: Các nghiên cứu cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát
sinh hình thái mẫu ni cấy. Các mẫu cấy khác nhau có nhu cầu về thời gian
chiếu sáng, cường độ ánh sáng khác nhau. Thời gian chiếu sáng với đa số các
lồi cây thích hợp là 12 – 18h/ngày. Cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi
cấy là 2.000 lux.
+ Độ ẩm tương đối: 70%.
2.2.3.3. Môi trường dinh dưỡng
Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết và là yếu tố quyết định đến
quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Thành phần của môi trường
nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo lồi thực vật, loại tế bào, mơ và cơ quan được
nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích ni cấy khơng
giống nhau, mơi trường nuôi cấy sử dụng cũng khác nhau. Môi trường ni cấy
cịn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy. Hầu hết
các môi trường dinh dưỡng sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm
các thành phần chính sau:
- Nguồn Cacbon
Mơ và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương
thức dị dưỡng mặc dù chúng có thể sống bán dị dưỡng trong điều kiện ánh sánh

nhân tạo và lục lạp vẫn có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc bổ sung vào mơi
trường ni cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn cacbon
thơng dụng nhất hiện nay là saccarose, ngồi ra có thể sử dụng glucose, maltose
hay fructose thay thế (Trần Thị Lệ, 2008).
- Muối khoáng đa lượng, vi lượng
Các nguyên tố khoáng đa lượng là một trong những thành phần thiết yếu
cần cho việc cung cấp nguyên liệu để tế bào, mô thực vật xây dựng nên thành
phần cấu trúc. Đặc biệt, nó có vai trị quan trọng tham gia vào thành phần axit
nucleic, axit amin, tham gia cấu tạo màng tế bào,… Bên cạnh đó khống đa
lượng, khống vi lượng có vai trị kích thích sự hoạt động của nhiều enzyme và
xúc tác cho các phản ứng sinh hóa xảy ra trong tế bào.
9


Trong thành phần muối khoáng đa lượng, các nguyên tố cần phải cung
cấp chủ yếu là nito, phospho, kali và sắt. Các loại muối khoáng vi lượng: là
những nguyên tố thường được sử dụng với hàm lượng thấp hơn 30mg/l dung
dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vi lượng được chứng minh là không thể thiếu
đối với sự phát triển của mô: Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co. Các ngun tố này
đóng vai trị quan trọng trong hoạt động của các enzyme.
- Vitamin
Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng khơng
đủ về lượng nên cần được bổ sung vào môi trường, nhất là các vitamin nhóm B
(Vũ Văn Vụ, 2009).
+ Vitamin B1 (Thiamine HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi
trường ni cấy, có vai trị trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino
acid.
+ Vitamin B6 (Pyridocine HCl): Là coenzyme quan trọng trong nhiều
phản ứng trao đổi chất.
+ Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp.

+ Myo-inositol: Có vai trị trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào,
tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khống, trao đổi hydratcacbon.
- Chất điều hịa sinh trưởng
Các chất điều hịa sinh trưởng là thành phần khơng thể thiếu trong mơi
trường ni cấy, có vai trị quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái và tái
sinh các bộ phận của mẫu cấy để thành cây hoàn chỉnh. Hiệu quả của chất điều
hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: nồng độ, hoạt tính của chất điều hịa sinh trưởng
và yếu tố nội sinh của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ, 2009).
Dựa vào hoạt tính sinh lý, chất điều hịa sinh trưởng được chia thành 2
nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm chất ức chế sinh trưởng.
Trong ni cấy mơ, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm
thường được sử dụng.

10


+ Nhóm Auxin: chủ yếu kích thích sự giãn của tế bào làm tăng phân bào,
sự hình thành mơ sẹo và xuất hiện rễ bất định. Các loại auxin sử dụng trong nuôi
cấy mô là 3-Indole acetic acid (IAA); α-Napthalene acetic acid (α-NAA); 2,4Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D); 3 - Indole butyric acid (IBA). Trong đó
IAA là auxin tự nhiên, ít được sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, dễ bị
phân hủy trong quá trình hấp khử trùng do đó khơng ổn định trong mơi trường
ni cấy; NAA, IBA và 2,4-D là các auxin nhân tạo thường có hoạt tính mạnh
hơn, do cấu trúc phân tử khá bền vững nên các auxin nhân tạo khó bị oxy hóa
bởi các enzyme. 2,4-D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân
chia tế bào và hình thành callus (Vũ Văn Vụ, 2009).
+ Nhóm Cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên
quan chủ yếu đến kích thích sự phân chia tế bào, tạo và nhân mô sẹo, sự thay đổi
ưu thể ngọn và phân hóa chồi từ mơ sẹo hoặc từ các cơ quan, kích thích phát
sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh, tăng cường phát
sinh chồi phụ.

Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-Benzylaminopurine
(BAP) hoặc 6-Benzyladenin (BA), 6 - γ - γ -dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2furfurylamino)-1 H-purine-6- amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans2-butanylamino) purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên nhưng
chúng không được sử dụng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và khơng ổn
định, cịn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo được sử dụng thông dụng hơn.
Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong nuôi
cấy mô và tế bào thực vật. Trong cây cần có sự cân bằng giữa chất điều hịa sinh
trưởng nội sinh (có sẵn trong cây, do cây tự tổng hợp) và ngoại sinh (bổ sung từ
bên ngoài). Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin = 1 sẽ kích thích hình
thành mơ sẹo, tỷ lệ auxin/cytokinin < 1 sẽ kích thích hình thành chồi và tỷ lệ
auxin/cytokinin > 1 sẽ kích thích hình thành rễ (Hồng Minh Tấn và cs., 2006).

11


- Các thành phần khác
+ Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm có một số chất
hữu cơ như acid hữu cơ, acid béo; cùng 1 số ngun tố vơ cơ như Cu, Fe, Zn…
Ngồi tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp 1 số chất dinh dưỡng
cho tế bào, mô nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 2009).
+ pH của môi trường: Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng
tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi
trường được điều chỉnh trong khoảng từ 5,8 - 6,0. Trong q trình ni cấy, pH
của mơi trường có thể giảm do mẫu ni cấy sản sinh ra các acid hữu cơ.
2.3. Ưu nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở
ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp.
- Ưu điểm:
+ Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng,
phát triển và cho năng suất cao.
+ Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được tính trạng đã

chọn lọc.
+ Tạo được dịng thuần các cây tạp giao. Điều này có ý nghĩa rất lớn với
cây thuốc nói chung, đặc biệt là với những loại cây trồng để lấy hoạt chất.
+ Tạo được cây có genotip mới (đa hội, đơn bội).
+ Bảo quản và lưu trữ tập đồn gen.
+ Có khả năng ứng dụng dễ sản xuất quanh năm.
+ Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh
thái nhất định hoặc hạt nẩy mầm kém.
+ Hệ số nhân giống cực kỳ cao (thường đạt được ở các loại cây khác nhau
trong phạm vi từ 36-1012/năm, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản
xuất đại trà.
+ Phục tráng giống thông qua kỹ thuật cấy đỉnh sinh trưởng và cải tạo
giống bằng kỹ thuật gen.
12


+ Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất
lượng và số lượng. Bằng phương pháp nuôi cấy đinh sinh trưởng (meristem)
người ta đã tạo ra những cây hoàn toàn sạch virus.
- Nhược điểm:
+ Đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối
với những cây có giá trị cao hoặc khó giống bằng phương pháp khác.
+ Cây con có kích thước nhỏ, địi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở
giai đoạn sau in vitro.
+ Cây có những đặc tính khơng mong muốn hoặc tạo đột biến tăng hoặc
khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào
nhiều lần.
+ Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt.
2.4. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro về cây la hán quả trong và ngoài
nước

2.4.1. Trong nước
Ở Việt Nam cho tới nay chưa có cơng trình nghiên cứu nào về nhân giống
cây la hán bằng phương pháp ni cấy mơ.
2.4.2. Ngồi nước
Năm 2006, Lan Taoju và cs đã sử dụng lá, cuống lá và hom thân (khơng
có chồi) của S. grosvenorri làm mẫu cấy, để nghiên cứu khả năng khác biệt của
chúng trong quá trình tái sinh cây con in vitro. Kết quả cho thấy : Trên môi
trường MS + 1,0 mg/l BA + 0,1 mg/l IAA và MS + 2,0 mg/l BA + 0,1 mg/l
IAA, cây con có thể tái sinh trực tiếp từ các đoạn của lá. Các đoạn gốc của lá
cho thấy khả năng tái sinh mạnh nhất, sau đó là các đoạn trung bình và cuối
cùng là các đoạn ngọn. Mơi trường MS + 3 mg/l BA + 0,1 mg/l IAA là môi
trường tạo mơ sẹo từ lá, sau đó mơ sẹo tái sinh hình thành cây con, nhưng hầu
hết các cây con đều bị biến dị. Cuống lá và hom thân (không có chồi) dễ dàng
hình thành một số lượng lớn mơ sẹo trên cả ba mơi trường, nhưng khó tái sinh
hình thành cây con (Lan Taoju et al., 2006).
13


Năm 2008, Qin Xinmin và cộng sự đã nghiên cứu về mối tương quan giữa
lá mầm với tuổi cây con 3 – 9 ngày và sự phân hóa chồi bất định. Kết quả cho
thấy tỷ lệ phân hóa chồi bất định trong lá mầm tăng lên cùng với sự gia tăng của
tuổi cây con trong vòng 3 – 6 ngày. Hiệu quả nảy mầm của lá mầm với cây con
6 ngày tuổi là tốt nhất đạt 83,3% và sau đó tỷ lệ phân hóa chồi bất định giảm
dần, tỷ lệ phân hóa chồi bất định trên mẫu lá mầm trên môi trường MS + 1mg/l
BA + 0,5 mg/l IBA + 3% sucrose + 0,65% agar đạt 85,7%. Tỷ lệ ra rễ của cây
con trên mơi trường lỏng ½ MS + 1 mg/l IBA đạt 91,7%. Việc bổ sung kháng
sinh 10 – 20 mg/l hygromycin vào mơi trường có thể ức chế sự phân hóa của
chồi và rễ bất định. Việc sử dụng kết hợp BA và IBA có tác dụng thúc đẩy rõ
ràng đến tỷ lệ phân hóa chồi bất định ở S.grosvenorii (Qin Xinmin et al., 2008).
Năm 2010, Yang và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của các hormones thực

vật khác nhau đến việc nhân nhanh Momordica grosvenori Swingle, mơi trường
MS + 1mg/l BA thích hợp để nhân nhanh với hệ số nhân đạt 5,75 chồi/mẫu. Môi
trường MS + 0,5 mg/l IBA thích hợp cho sự tạo rễ (Yang et al., 2010).
Hệ thống tái sinh hiệu quả thông qua lá mầm của Siraitia grosvenirii đã
được nhóm tác giả Liang Zu-zhen thiết lập vào năm 2010. Kết quả cho thấy mơi
trường ¼ MS với 0,5 – 0,6 % agar là tối ưu cho sự nảy mầm của hạt với tỷ lệ
nảy mầm đạt 89,2%. Môi trường tạo rễ tốt nhất là ½ MS + 0,5 mg/l IBA + 1,5 %
sucrose. Mơi trường ½ MS + 1 mg/l BA + 0,1 mg/l IBA thích hợp nhất để tạo
chồi bất định. Bổ sung 0,2% AC vào mơi trường có lợi cho sự ra rễ, nhưng
khơng có lợi cho các chồi bất định của lá mầm với tỷ lệ đạt 95,8%, trung bình 10
chồi/lá mầm. Thời gian nảy mầm của hạt ảnh hưởng đến sự phân hóa của chồi.
Thời gian ủ 2 - 4 ngày thích hợp cho sự phân hóa chồi nhanh chóng, tỷ lệ sống
được cải thiện lên đến 91,7% (Liang Zu-zhen et al., 2010).
Năm 2013, Chen đã nghiên cứu nhân nhanh cây tam bội không hạt Siraitia
grosvenirii, thân non được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu. Sau khi khử trùng,
các đoạn thân mang mắt ngủ được nuôi cấy trên môi trường MS + 0,5 mg/l BA
+ 0,05 mg/l NAA để thu được chồi vô trùng. Môi trường nhân tốt nhất là MS +
14


0,5 mg/l BA + 0,2 mg/l IBA + 0,03 mg/l GA3, hệ số nhân 16,4 sau 30 ngày, môi
trường tối ưu kéo dài chồi là MS + 0,05 mg/l BA + 0,1 mg/l IBA + 0,1 mg/l
GA3, môi trường tối ưu để tạo rễ là ½ MS + 0,5 mg/l IBA, tỷ lệ sống đạt 98,1%
sau 30 ngày trên giá thể khoáng chất : đá trân châu : đất xốp (vermiculite :
perlite : mellow soil) (1:1:2) (Chen, 2013).

15