Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định vi khuẩn bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------***--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS LATEROSPORUS
TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC”

HÀ NỘI - 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------***--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS LATEROSPORUS
TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC”

Sinh viên thực hiện

: ĐỖ THỦY NGUYÊN

Lớp

: K64CNSHA

MSV

: 642333

Giảng viên hƣớng dẫn

: TS. NINH THỊ THẢO

Bộ mơn

: CƠNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

HÀ NỘI - 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của tôi thực hiện
trong thời gian từ 07/2022 – 12/2022 dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Ninh Thị Thảo,
giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học Thực Vật – Khoa Công nghệ Sinh học –
Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và
chƣa đƣợc cơng bố ở bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào ở trong và ngồi nƣớc. Các
tài liệu đã trích dẫn đã đƣợc chỉ rõ nguồn và đƣợc nêu ở mục tài liệu tham khảo.
Hà Nội, ngày tháng 02 năm 2023
Sinh viên

Đỗ Thủy Nguyên

i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam,
đội ngũ giảng viên, cán bộ đang giảng dạy và công tác tại Học viện Nông nghiệp
Việt Nam. Tôi vô cùng biết ơn các thầy, cô khoa Công nghệ sinh học, đặc biệt là
Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật đã giảng dạy, hƣớng dẫn và tạo điều kiện để
tơi hồn thành chƣơng trình học, thực tập nghề nghiệp và khố luận tốt nghiệp.
Tơi xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Ninh Thị Thảo đã định
hƣớng nghiên cứu, tận tình chỉ dạy, giúp đỡ, hỗ trợ tơi trong suốt q trình thực
hiện khóa luận tốt nghiệp của mình.
Thứ hai, tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy TS. Đinh Trƣờng Sơn, cô ThS.
Phạm Thị Thu Hằng và các thầy cô khác đang công tác tại bộ môn Công nghệ sinh
học Thực vật đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khố luận.
Cuối cùng tơi muốn gửi lời cảm ơn đến Bố, Mẹ, gia đình và bạn bè đang
thực hiện khố luận tại bộ mơn Cơng nghệ sinh học Thực vật đã khuyến khích,
động viên, hỗ trợ, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt q trình học tập và
hồn thành khố luận tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng 02 năm 2023
Sinh viên

Đỗ Thủy Nguyên

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... I
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... II

DANH MỤC BẢNG............................................................................................... VI
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... VII
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... VIII
TÓM TẮT ............................................................................................................... IX
PHẦN 1. MỞ ĐẦU.................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
1.2. Mục đích và yêu cầu ..................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ................................................................................................. 2
1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................... 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4
2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus laterosporus .................................... 4
2.2. Lịch sử phát hiện .......................................................................................... 6
2.3. Thể ký sinh (parasporal body) ...................................................................... 7
2.4. Đặc tính đối kháng ........................................................................................ 8
2.5. Các đặc tính và cơng dụng khác ................................................................. 12
2.6. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus laterosporus ............................... 12
2.7. Các phƣơng pháp nghiên cứu xác định Bacillus laterosporus ................... 14
2.8. Giới thiệu về chế phẩm sinh học “Kaito Nano Hữu Cơ” ........................... 16
PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 18
3.1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 18
3.1.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu.............................................................. 18
3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................. 18
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu .............................................................. 19
iii


3.1.4. Hóa chất .................................................................................................. 20
3.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................... 21
3.2.1. Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus từ chế phẩm sinh
học

.............................................................................................................. 21

3.2.2. Phƣơng pháp làm thuần, giữ giống ...................................................... 23
3.2.3. Nội dung 2: Đánh giá các đặc điểm hình thái và đặc điểm hóa sinh của
các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập giả định.............................. 24
3.2.4. Nội dung 3 : Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus tuyển chọn
bằng phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 16S rRNA và PCR với mồi đặc
hiệu

.............................................................................................................. 28

3.2.5. Phần mềm xử lý số liệu ........................................................................ 31
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 34
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn ............................................................................ 34
4.1.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ pha loãng mẫu ban đầu đến kết quả phân lập vi
khuẩn .............................................................................................................. 34
4.1.2. Ảnh hƣởng của nồng độ pha loãng mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn 36
4.1.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ xử lý mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn....... 37
4.1.4. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn ..... 39
4.2. Khảo sát đặc điểm sinh học và phản ứng hóa sinh của các chủng vi khuẩn
tuyển chọn ............................................................................................................ 41
4.2.1. Đánh giá đặc điểm hình thái các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả
định

.............................................................................................................. 41

4.2.2. Phân tích đặc tính hóa sinh các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả
định

.............................................................................................................. 46

4.3. Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập bằng phƣơng pháp
xác định trình tự nucleotide 16S rRNA và phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc
hiệu .................................................................................................................... 57
iv


4.3.1. Kết quả tách chiết DNA ......................................................................... 57
4.3.3. Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập bằng phƣơng
pháp phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu ................................................ 61
4.5. Tính toán tổng số vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học 62
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 64
5.1. Kết luận ......................................................................................................... 64
5.2. Kiến nghị....................................................................................................... 64
TAI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 65

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến sự phát triển của vi khuẩn sau
20h nuôi cấy ............................................................................................ 34
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của độ pha loãng mẫu đến sự phát triển của vi khuẩn sau 20h
nuôi cấy ................................................................................................... 36
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của độ nhiệt độ xử lý mẫu đến sự phát triển của vi khuẩn sau
20h nuôi cấy ............................................................................................ 38
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của độ thời gian xử lý mẫu đến sự phát triển của vi khuẩn sau
20h nuôi cấy ............................................................................................ 40
Bảng 4.5. Đặc điểm hình thái và tế bào của 20 mẫu phân lập ................................ 43

Bảng 4.6. Đặc điểm hóa sinh của 20 mẫu vi khuẩn phân lập ................................. 55
Bảng 4.7. Mật độ khuẩn lạc Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học ........ 63

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Ảnh nhuộm Gram của tế bào Bacillus laterosporus dƣới kính hiển vi
( ....................................................................................... 5
Hình 2.2. Hình thái khuẩn lạc Bacillus laterosporus ( .................. 6
Hình 2.3. Túi bào tử của vi khuẩn Bacillus laterosporus. SW: thành túi bào tử; Sp:
bào tử; SC: vách bào tử; CSPB: thể ký sinh hình xuồng (Ruiu và cs.,
2013). .......................................................................................................... 7
Hình 3.1. Sản phẩm Kaito Nano Hữu Cơ .............................................................. 18
Hình 4.2. Kết quả nhuộm Gram tế bào mẫu vi khuẩn phân lập “ T10” đƣợc quan sát
dƣới kính hiển vi ....................................................................................... 42
Hình 4.3. Hình thái khuẩn lạc của các mẫu vi khuẩn phân lập .............................. 43
Hình 4.4. Kết quả thử nghiệm phản ứng MR......................................................... 47
Hình 4.5. Kết quả thứ nghiệm phản ứng VP .......................................................... 48
Hình 4.6. Kết quả khả năng biến dƣỡng citrate của 20 mẫu phân lập ................... 50
Hình 4.7. Hoạt tính sinh enzyme protease của các mẫu vi khuẩn tuyển chọn....... 52
Hình 4.8. Kết quả xác định hoạt tính enzyme amylase .......................................... 54
Hình 4.9. DNA tổng số của 5 chủng tuyển chọn ................................................... 57
Hình 4.10. Sản phẩm PCR với mồi 27F và 1492R ................................................ 58
Hình 4.12. Kết quả so sánh trình tự bằng cơng cụ BLAST trên NCBI ................. 60
Hình 4.13. Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen cpbB .................................. 61

vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
CSPB
CT
DNA

Diễn giải chữ viết tắt
Canoe-Shaped Parasporal Body
Cơng thức
Deoxyribonucleic acid

ĐC

Đối chứng

LB

Luria Bertani Broth

ml

Milliliter

mg

Milligram

MR

Methyl Red

RNA

Ribonucleic acid

TCVN
VP
PCR
µg
µl

Tiêu chuẩn Việt Nam
Voges-Proskauer
Polymerase chain reaction
Microgram
Microliter

viii


TĨM TẮT
Trong đề tài này, chúng tơi nghiên cứu phƣơng pháp xác định vi khuẩn
Bacillus laterosporus – loài vi khuẩn có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh
và thúc đẩy sự phát triển của thực vật - từ chế phẩm sinh học. Đặc điểm hình thái,
hóa sinh, trình tự gen 16S rRNA và sự hiện diện của gen đặc hiệu ở các mẫu vi
khuẩn Bacillus laterosporus phân lập đã đƣợc đánh giá. Kết quả cho thấy, 5 mẫu vi
khuẩn bao gồm T7, T10, T12, T16, T19 trong số 20 mẫu vi khuẩn phân lập giả định
mang các đặc điểm nhƣ có khuẩn lạc trịn, màu be hoặc trắng, viền ria, nhẵn,
phẳng, tế bào Gram dƣơng, dạng hình que, kết quả âm tính với phản ứng MR-VP,
khơng có khả năng biến dƣỡng citrate và có khả năng sinh enzyme ngoại bào

protease và amylase. Nghiên cứu cũng kiểm tra trình tự 16S rRNA của mẫu vi
khuẩn T10 và ghi nhận mức độ tƣơng đồng với các chủng vi khuẩn trong chi
Bacillus là khá cao. Sự có mặt của gen cpbB mã hóa cho protein của phức hợp SCCSPB ở vi khuẩn Bacillus laterosporus đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR sử
dụng cặp mồi đặc hiệu ở 4 mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus T10, T12, T16, T19
cho thấy vạch băng đặc hiệu chỉ xuất hiện ở 4 mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus
mà không ghi nhận ở vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Điều này chứng tỏ có thể sử
dụng gen cpbB làm dấu hiệu nhận diện vi khuẩn Bacillus laterosporus ở mức độ
phân tử. Do đó, chúng tơi kết luận rằng có thể sử dụng các phƣơng pháp phân tích
về mặt hình thái, đặc điểm hóa sinh và phân tử kết hợp để phân lập và xác định vi
khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học.

ix


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Nền nông nghiệp Việt Nam đang có xu hƣớng phát triển theo canh tác hữu

cơ để góp phần đảm bảo sức khỏe cho ngƣời tiêu dùng và đảm bảo phát triển nông
nghiệp bền vững, đồng thời giảm sự tích tụ nitrate, tồn dƣ các chất hóa học và kim
loại nặng ở một số vùng, gây ô nhiễm nguồn nƣớc, môi trƣờng đất và sức khỏe con
ngƣời (Anitha và cs., 2014). Cùng với sự phát triển nhanh chóng của cơng nghệ
sinh học và nhu cầu đảm bảo các điều kiện sinh thái của đời sống và công nghiệp,
ngƣời ta ngày càng quan tâm hơn đến vi khuẩn sinh bào tử. Phân bón và chế phẩm
vi sinh có chứa các nhóm vi sinh vật cố định đạm, phân giải chất hữu cơ, phân giải
phosphate khó tan, kích thích sinh trƣởng thực vật, ngăn ngừa và phịng trừ bệnh
hại tác động từ môi trƣờng hoặc các vi sinh vật gây bất lợi cho cây trồng là một
thành phần quan trọng trong nền nông nghiệp bền vững này (Danielsson và cs.,

2007). Nhiều nghiên cứu trƣớc đây đã xác định đƣợc các nhóm vi sinh vật nhƣ nấm
Aspergillus, Penicillium, vi khuẩn Bacillus, Pseudomonas… có khả năng tiết các
enzyme để phân giải lân và kali thành dạng dễ tan, hữu dụng cho cây trồng. Một số
vi khuẩn cịn có khả năng sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trƣởng giúp cây
phát triển nhanh. Trong nông nghiệp, các vi khuẩn thuộc chi Bacillus tham gia vào
q trình hịa tan các chất từ khó tan sang dạng dễ tan (Gupta và cs., 2002), giúp cải
tạo đất, tăng năng suất cây trồng hoặc đối kháng với một số nấm gây bệnh và vi
khuẩn ở vùng rễ cây trồng (Fan và cs., 2012), làm phong phú thêm hệ vi sinh vật
đất và trả lại độ phì nhiêu cho đất.
Bacillus laterosporus, cịn đƣợc biết đến dƣới tên Brevibacillus laterosporus,
là nhóm vi khuẩn thuộc chi Bacillus đƣợc nghiên cứu và ứng dụng hết sức rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Bacillus laterosporus tiết một lƣợng lớn chitinase
nên có khả năng ức chế mạnh mẽ các loại nấm bệnh và các vi khuẩn có hại nhƣ
1


Escherichia coli, Baculovirus. Mặt khác, Bacillus laterosporus còn thúc đẩy sự
phát triển của thực vật thơng qua việc kích thích sự phát triển của bộ rễ, tăng cƣờng
khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng và khả năng quang hợp (Song và cs., 2011).
Chính nhờ đặc tính này mà vi khuẩn Bacillus laterosporus đã và đang đƣợc ứng
dụng rộng rãi trong việc sản xuất phân bón và chế phẩm vi sinh. Các chế phẩm sinh
học nhƣ Kaito Nano Hữu Cơ, Bio Sun, phân bón hữu cơ nấm đối kháng
Trichoderma Bacillus HLC,... có chứa thành phần là Bacillus laterosporus. Hiện
nay, các tiêu chuẩn đã ban hành ở nƣớc ta không thể áp dụng để đánh giá định tính
và định lƣợng vi khuẩn Bacillus laterosporus trong phân bón vi sinh và chế phẩm
sinh học. Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn quốc gia cho các chỉ tiêu vi sinh vật hữu
ích, trong đó có phân bón vi sinh có chứa vi khuẩn Bacillus laterosporus là cần
thiết để phục vụ cho công tác kiểm tra, quản lý chất lƣợng sản phẩm phân bón vi
sinh nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp và bảo vệ quyền lợi của ngƣời
tiêu dùng. Việc nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định tính và định lƣợng vi

khuẩn Bacillus laterosporus trong mẫu chế phẩm vi sinh ở điều kiện Việt Nam là
cần thiết, có ý nghĩa khoa học và ứng dụng. Xuất phát từ thực tiễn đó, từ xu hƣớng
nghiên cứu hiện nay trên thế giới và trong nƣớc, đề tài nghiên cứu nhằm phát triển
phƣơng pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học.
1.2.

Mục đích và yêu cầu

1.2.1. Mục đích
Xây dựng phƣơng pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus trong chế
phẩm sinh học.
1.2.2. Yêu cầu
- Xác định phƣơng pháp chuẩn bị mẫu thích hợp cho quá trình phân lập vi
khuẩn Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học.
2


- Đánh giá đƣợc các đặc điểm hình thái và sinh hoá của các mẫu vi khuẩn
Bacillus laterosporus giả định trong chế phẩm sinh học.
- Định danh đƣợc vi khuẩn Bacillus laterosporus bằng phƣơng pháp giải
trình tự 16S rRNA và phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu.

3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus laterosporus
Bacillus laterosporus là một vi khuẩn Gram dƣơng, hình que, hình thành nội

bào tử, thuộc họ Paenibacillaceae. Bacillus laterosporus là một loài phổ biến đã
đƣợc phân lập từ nhiều loại vật liệu nhƣ đất, đá quý, dung nham, nƣớc ngọt, nƣớc
biển, côn trùng, bề mặt lá, phân hữu cơ, sữa, pho mát, mật ong, thực phẩm giàu tinh
bột, gelatin - nƣớc thải nhà máy, da thú và len, chim cút (Ruiu, 2013). Bacillus
laterosporus đã đƣợc báo cáo là có tiềm năng đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm
soát sinh học với phổ hoạt động sinh học rất rộng - bao gồm ốc sên, tuyến trùng và
côn trùng. Chúng có khả năng tạo ra một thể ký sinh phiến mỏng hình chiếc xuồng
gắn chặt vào một bên của bào tử (Hong và cs., 2005). Ở ngƣời, Bacillus
laterosporus tồn tại trong điều kiện axit dạ dày. Sau khi vào ruột, các bào tử bắt
đầu nảy mầm và nhân lên sau mỗi 32 phút. Tuy nhiên, đây là vi khuẩn sống trong
đất và cũng giống nhƣ các vi khuẩn sống trong đất khác, chúng sẽ không phát triển
thành các khuẩn lạc lớn, sống lâu dài trong ruột. Các khuẩn lạc chỉ tạm thời phát
triển và sẽ bắt đầu chết trong vòng 3 ngày hoặc lâu hơn. Các nghiên cứu đã cho
thấy rằng Bacillus laterosporus hoàn toàn an toàn với ngƣời (Nivetha và Halka,
2017).

4


Hình 2.1. Ảnh nhuộm Gram của tế bào Bacillus laterosporus dƣới kính hiển vi
( />Tiềm năng kiểm sốt sinh học đối với côn trùng gây bệnh của Bacillus
laterosporus đã đƣợc báo cáo chống lại côn trùng theo các bộ khác nhau bao gồm
Coleoptera, Lepidoptera, Diptera và chống lại tuyến trùng và động vật thân mềm
(Ruiu, 2013).
Ngoài khả năng gây bệnh đối với động vật không xƣơng sống, các chủng
Bacillus laterosporus khác nhau cịn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, đặc
biệt là đối với vi khuẩn và nấm. Nhiều loại phân tử, bao gồm protein và kháng sinh,
có liên quan đến khả năng gây bệnh và phƣơng thức hoạt động đã đƣợc nghiên cứu.
Tồn bộ trình tự bộ gen gần đây của Bacillus laterosporus cho thấy tiềm năng sản

xuất polyketide, nonribosomal peptide và độc tố của chủng vi khuẩn này (Djukic và
cs., 2011; Sharma và cs., 2012). Bacillus laterosporus cũng đƣợc liệt kê trong số
các chế phẩm sinh học cho động vật có vú và chim (Hong và cs., 2005; Porubcan,
2003), các loại kháng sinh cụ thể có nguồn gốc từ Bacillus laterosporus đã và đang
đƣợc sử dụng trong y học (Umezawa và Takeuchi, 1987).

5


Hình 2.2. Hình thái khuẩn lạc Bacillus laterosporus ( />2.2.

Lịch sử phát hiện
Nghiên cứu về tầm quan trọng của mối quan hệ giữa Bacillus laterosporus

với côn trùng đã đƣợc ghi nhận sau khi chủng vi khuẩn này đƣợc phân lập lần đầu
tiên vào đầu thế kỷ 20 bởi White (1912). Khi đó, ơng đang tiến hành nghiên cứu về
vi khuẩn ở ong mật châu Âu. Trong số những vi khuẩn gây bệnh, ơng đã phân lập
đƣợc một lồi mới mà ơng đặt tên là Bacillus orpheus White (White, 1912). Một
mô tả chi tiết về vi khuẩn này đã đƣợc đƣa ra vào năm 1917 bởi McCray, ngƣời đã
phân lập các vi khuẩn sinh bào tử khác nhau của một nhà nuôi ong. Tuy nhiên, một
năm trƣớc đó, Bacillus laterosporus đã đƣợc đặt tên và mô tả bởi Laubach, ngƣời
đã phân lập đƣợc một chủng khác từ nƣớc ngọt. Sau đó, do sự tƣơng đồng giữa hai
chủng phân lập, tên thứ hai đƣợc ƣu tiên hơn và đƣợc chọn để chỉ loài vi khuẩn
này. Năm 1946, Steinhaus đã liệt kê chúng trong số các lồi vi khuẩn hình thành
bào tử. Theo kết quả của các nghiên cứu phân loại gần đây dựa trên phân tích trình
6


tự 16S rRNA, loài này đã đƣợc chuyển vào chi Brevibacillus mới trong cụm
Brevibacillus brevis (Ruiu, 2013).

2.3.

Thể ký sinh (parasporal body)
Vào giữa thế kỷ 20, Hannay đã tiến hành quan sát các tế bào sinh bào tử và

bào tử dƣới kính hiển vi quang điện tử và Hannay đƣa ra kết luận rằng “thể ký sinh
hình xuồng - Canoe-Shaped Parasporal Body” đƣợc hình thành trƣớc khi hồn
thành q trình tạo bào tử và vẫn tồn tại cùng bào tử bởi vì nó là “một phần của bào
tử” (Hannay, 1957).

Hình 2.3. Túi bào tử của vi khuẩn Bacillus laterosporus. SW: thành túi bào tử; Sp:
bào tử; SC: vách bào tử; CSPB: thể ký sinh hình xuồng (Ruiu và cs., 2013).
Các giả thuyết khác nhau đã đƣợc đƣa ra về vai trò và chức năng có thể có
của các thể ký sinh có thể đóng vai trị là đơn vị lƣu trữ nếu bào tử nảy mầm trong
mơi trƣờng thiếu hụt, có thể hỗ trợ sự nảy mầm của bào tử hoặc có thể là vách phụ
hoặc chỉ là biến dạng của vách bào tử. Tuy nhiên, chức năng cụ thể vẫn chƣa đƣợc
7


xác nhận cho đến nay. Fitz James và Young (1958) đã phân tích thành phần hóa
học của cấu trúc vách bào tử, sau khi phát triển một phƣơng pháp tách nó ra khỏi
nguyên sinh bào tử. Theo nghiên cứu của họ, các thành phần chính của CSPB là
photpho và cs nitrogen. Ngồi ra cịn có protein đƣợc thu hồi thơng qua chiết xuất
kiềm với sự có mặt của chất khử (alkali -thioglycollate) phá vỡ liên kết S-S. Kết
quả phân tích kết hợp giữa hình thái và hóa học cho thấy thành phần photpho là
một phần của cấu trúc thể ký sinh hình xuồng, cịn lại các protein chiết xuất là chất
nền của CSPB (Fitz James và Young, 1958).
Các thể ký sinh khác (PB), khác biệt với CSPB, đƣợc tìm thấy bên trong túi
bào tử bởi Montaldi và Roth (1990). Đây là các thể ký sinh, hình cầu với dạng góc
cạnh hoặc vân với các dải song song xen kẽ. Chức năng của các cấu trúc này chƣa

đƣợc làm rõ nhƣng có ý kiến cho rằng chúng có liên quan đến hoạt động diệt côn
trùng chống lại Diptera của vi khuẩn Bacillus laterosporus (Ruiu và cs., 2013).
2.4.

Đặc tính đối kháng
Một số chủng vi khuẩn Bacillus laterosporus thể hiện hoạt tính kháng khuẩn

đối với các loại vi khuẩn và nấm khác nhau. Đặc tính sinh học này cũng đƣợc thấy
ở các lồi khác của chi Brevibacillus và có liên quan đến việc sản xuất nhiều loại
enzyme và kháng sinh (Chandel và cs., 2010). Một chủng Bacillus laterosporus
đƣợc phân lập từ bùn ở Ấn Độ, đƣợc gọi là BPM3, đƣợc báo cáo rằng có khả năng
ức chế sự phát triển của nấm thực vật Fusarium oxysporum f. sp. ciceri (Padwick)
Matuo & K. Sato, F. semitectum Berk. & Ravenel, Magnaporthe grisea (Hebert)
Barr và Rhizoctonia oryzae Ryker & Gooch, và của cầu khuẩn Gram dƣơng
Staphylococcus aureus Rosenbach (Saikia và cs., 2011).
Bằng chứng về sự ức chế nấm cũng đƣợc ghi nhận ở chủng vi khuẩn Bacillus
laterosporus ZQ2 đƣợc phân lập từ rễ cây táo ở Trung Quốc. Chủng vi khuẩn ZQ2
có khả năng ức chế nấm gây bệnh trên cây táo bao gồm Rhizoctonia solani Kuhn,
8


Fusarium oxysporum Schlecht, F. solani (Mart.), Aspergillus fumigatus Fres,
Alternaria

alternata

(Fr.)

Keissler,

Valsa

sordida

Nits,

Colletotrichum

gloeosporioides (Penz.) Penz. and Sacc., Botrytis cinerea Pers. và Physalospora
piricola Nose. Hoạt tính kháng nấm của dịch lọc ni cấy, đạt mức ức chế khoảng
80%, đƣợc duy trì sau khi xử lý nhiệt lên đến 120°C trong 30 phút, chiếu tia cực
tím hoặc thay đổi pH từ 1 đến 11 (Song và cs., 2011).
Bacillus laterosporus phân lập từ các mẫu đất vùng rễ đã đƣợc ghi nhận có
hoạt tính kháng nấm (Idris và cs., 2008) và các hoạt tính thúc đẩy tăng trƣởng thực
vật của vùng rễ (PGPR) (Zhang và cs., 2001). Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, chế phẩm
Bacillus laterosporus đã thúc đẩy sự phát triển của cây rau diếp (Yobo và cs.,
2004).
Những đặc tính này có liên quan đến việc sản xuất các peptide kháng khuẩn
và thử nghiệm khuếch tán trên đĩa thạch để định lƣợng hoạt tính sinh học của
Bacillus laterosporus đã đƣợc phát triển (Li và cs., 2011). Gần đây hơn, một
peptide kháng khuẩn mới có khối lƣợng phân tử khoảng 1.600 Da từ chủng
Bacillus laterosporus A60 đã đƣợc phân lập và xác định. Trình tự peptide này đƣợc
xác định là BL-A60, đƣợc phân lập từ môi trƣờng ni cấy và hoạt tính ức chế của
nó đƣợc xác định đối với các mầm bệnh thực vật khác nhau bao gồm vi khuẩn
Gram âm, Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith và Xanthomonas campestris
pv. vesicatoria (Doidge) Dye, vi khuẩn Gram dƣơng, Bacillus subtilis (Ehrenberg)
Cohn, và các loại nấm Phytophthora capsici Leonian, B. cinerea, Verticillium
dahliae Kleb, F. oxysporum. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm, đƣợc duy trì ở
100°C trong 15 phút sau khi xử lý và không bị ảnh hƣởng bởi sự thay đổi pH từ 3
đến 11 hoặc sau khi xử lý bằng protease K, trypsin và pepsin (Zhao và cs., 2012).

Hoạt động của các peptide kháng khuẩn từ vi khuẩn Bacillus laterosporus
đƣợc cho là có liên quan đến sự tƣơng tác với màng tế bào nơi hình thành các kênh
9


ion và lỗ xuyên màng dẫn đến vỡ và ly giải tế bào. Cuối cùng, các peptide có thể
xâm nhập vào tế bào và chuyển vị trí trong tế bào chất, nơi chúng có thể làm rối
loạn q trình tổng hợp protein bằng cách tƣơng tác với DNA và RNA (Brogden,
2005). BL-A60 có thể hoạt động theo cách tƣơng tự, nhƣng những khía cạnh này
vẫn chƣa đƣợc làm rõ cho đến nay.
Một số chủng Bacillus laterosporus cũng tạo ra chitinase có thể đóng vai trị
chính trong sự phân hủy thành tế bào của nấm. Một chủng vi khuẩn Bacillus
laterosporus mới đƣợc phân lập từ đất đầm lầy ngập mặn ở Ấn Độ, đƣợc xác định
là Lak1210, khi đƣợc nuôi cấy trên mơi trƣờng có chứa chitin dạng keo, sẽ tạo ra
các chitinase đƣợc giải phóng trong dịch ni cấy nổi phía trên. Hoạt tính của các
protein kháng nấm này đã đƣợc thử nghiệm chống lại nấm gây bệnh thực vật
Fusarium equiseti (Corda) Sacc. Những protein này cho thấy tính tƣơng đồng cao
với 89,4 kDa 4 domain chitodextrinase với 69,4 kDa 2 domain chitinase (ChiA1)
đƣợc mã hóa bởi B. laterosporus LMG15441 (Prasanna và cs., 2013). Một peptide
kháng khuẩn phổ biến khác đƣợc phát hiện gần đây đƣợc tạo ra bởi chủng GI-9 là
laterosporulin, là một peptide ổn định nhiệt với khối lƣợng phân tử 5,6 kDa (Singh
và cs., 2012).
Bên cạnh vi khuẩn và nấm gây bệnh thực vật, các đặc tính kháng khuẩn của
B. laterosporus cũng đã đƣợc chứng minh trong in vitro đối với vi khuẩn
Paenibacillus larvae (White), tác nhân gây bệnh cho đàn ong mật châu Mỹ (Alippi
và cs., 2006).
Các đặc tính kháng nấm và kháng khuẩn của một số chủng Bacillus
laterosporus đã đƣợc y học quan tâm đến để sản xuất kháng sinh có tác dụng điều
trị. Một ví dụ đƣợc đại diện bởi thuốc kháng sinh laterosporamine cho thấy tác
dụng ức chế in vitro và in vivo chống lại đa số vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm

bao gồm Bacillus subtilis, Bacillus anthracis Cohn, Staphylococcus aureus
10


Rosenbach, Streptococcus pneumoniae (Klein) Chester, Streptococcus pyogenes
Rosenbach, Escherichia coli (Migula) Castellani và Chalmers, Klebsiella
pneumoniae (Schroeter) Trevisan, Salmonella typhimurium (Loeffler) Castellani và
Chalmers, Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) Migula (Shoji và cs., 1976).
Chủng vi khuẩn Bacillus laterosporus đƣợc phân lập từ nƣớc biển nhiệt đới
tại bờ biển Papua New Guinea đã đƣợc phát hiện là sinh acyldipeptides
tupuseleiamides và polyketides basiliskamides, trong môi trƣờng nuôi cấy, ức chế
đáng kể vi khuẩn E. coli và nấm Candida albicans (Robin) Berkhout (Barsby và
cs., 2002). Một chủng khác cũng đƣợc phân lập từ biển (PBG-276) đã đƣợc báo cáo
là sản xuất nhiều loại kháng sinh khác nhau bao gồm loloatins, bogorols và
lipopeptide tauramamide (Desjardine và cs., 2007).
Trong số các loại kháng sinh khác đƣợc sản sinh ra trong môi trƣờng nuôi
cấy bởi Bacillus laterosporus là cyclodecapeptide laterocidin (Qin và cs., 2010),
chất ức chế thrombin bacithrocin A, B và C (Kamiyama và cs., 1994), chất ức chế
aminopeptidase M leuhistin (Aoyagi và cs., 1991) và kháng sinh chống ung thƣ
spergualin (Umezawa và cs., 1987). Các chủng khác sản xuất enzyme
cephalosporin acylase quan trọng trong cơng nghiệp, hữu ích trong quy trình sản
xuất dẫn xuất cephalosporin.
Do tính đối kháng chống lại các vi sinh vật có hại khác nhau, Bacillus
laterosporus đƣợc báo cáo là tạo ra các tác dụng có lợi ngay cả bên trong ruột
của động vật có vú sau khi đƣợc sử dụng nhƣ một chất phụ gia thức ăn (Hong và
cs., 2005). Do những tác dụng của Bacillus laterosporus, việc cho gia cầm uống
bào tử Bacillus laterosporus có thể cải thiện chuyển hóa thức ăn và tăng trọng
(Porubcan, 2003).

11

2.5.

Các đặc tính và cơng dụng khác
Hoạt tính sinh học của Bacillus laterosporus không chỉ giới hạn ở động vật

không xƣơng sống, vi khuẩn và nấm. Chúng cịn có tác dụng diệt tảo chống lại tảo
lam có hại thuộc các chi khác nhau bao gồm Oscillatoria, Anabaena, Microcystis
và Nostoc, đã đƣợc chứng minh (Kuznetsova và cs., 2008; Wen và cs., 2013).
Một lĩnh vực khác đang đƣợc quan tâm là việc sử dụng các vi sinh vật để xử
lý sinh học, đó là xử lý sinh học của một địa điểm bị ô nhiễm để phân hủy và loại
bỏ các chất gây ô nhiễm hoặc các hợp chất gây ô nhiễm. Danh sách các chất có thể
bị phân hủy bởi các chủng Bacillus laterosporus liên tục đƣợc phát triển. Các ví dụ
điển hình là quá trình phân hủy sinh học ethanol polyvinyl thành axetat (Lim,
2001), quá trình khử màu của các loại thuốc nhuộm azo dệt khác nhau thông qua
việc sản xuất các loại enzyme khác nhau bao gồm lignin peroxidase, laccase,
aminopyrine N-demethylase, chất khử NADH-DCIP và chất khử malachite green
(Gomare và Govindwar, 2009), sự phân hủy sinh học của tanin thực vật trong nƣớc
thải của xƣởng thuộc da (Jeyaseelan và cs., 2008) sự phân hủy sinh học của toluen
và phenol (Reda và Ashraf, 2010), sự hấp thụ sinh học các kim loại độc hại từ dung
dịch nƣớc (Zouboulis và cs., 2004) và giải độc kim loại trong hệ thống nƣớc thải
(Holail và cs., 2011; Kamila và Momba, 2011).
2.6.

Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus laterosporus
Năm 2004, các nhà nghiên cứu tại Brazil đã phân lập đƣợc 33 chủng vi

khuẩn Bacillus laterosporus, bao gồm ba chủng mới đƣợc phân lập từ các mẫu đất
của Brazil, và đánh giá đa dạng di truyền của các chủng này sử dụng chỉ thị phân

tử. Các chỉ thị phân tử có thể đặc trƣng cho các chủng vi khuẩn liên quan đến khả
năng gây bệnh của chúng đã đƣợc báo cáo trong nghiên cứu này. Ngồi ra, nghiên
cứu cũng đã thử nghiệm độc tính của Bacillus laterosporus thông qua đánh giá khả
năng kháng côn trùng thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera), Bộ Cánh cứng
12


(Coleoptera) và động vật thân mềm Biomphalaria glabrata. Trong số các mục tiêu
đƣợc thí nghiệm, Biomphalaria glabrata thể hiện mức độ nhạy cảm cao nhất đối
với Bacillus laterosporus, với một số chủng gây ra tỷ lệ chết từ 90 đến 100% ở độ
tuổi 3 và 12 ngày. Anticarsia gemmatalis là một loại dịch hại nơng nghiệp có thể
đƣợc kiểm sốt bằng cách sử dụng thuốc trừ sâu sinh học dựa trên các tác nhân vi
khuẩn, nấm hoặc virus. Nghiên cứu cho thấy, ấu trùng của Anthonomus grandis
cũng dễ mắc bệnh, có tỷ lệ tử vong từ 33 đến 63%. Độc tính cũng đƣợc ghi nhận
đối với Anticarsia gemmatalis (một loại cơn trùng có liên quan đến việc làm hỏng
ngũ cốc trong bảo quản). Việc áp dụng phƣơng pháp PCR kết hợp với BOX-PCR
đã tạo ra 15 và 17 kiểu gen khác nhau tƣơng ứng. Một đoạn khuếch đại 1078bp đã
đƣợc phát hiện cho tất cả các chủng Bacillus laterosporus khi sử dụng mồi để
khuếch đại vùng BOXA1R. Tƣơng tự, một đoạn trình tự 900 bp đƣợc nhân bản từ
tất cả các chủng phân lập bằng cách sử dụng đoạn mồi RAPD OPA-11. Các đoạn
khuếch đại này không đƣợc phát hiện đối với các loài vi khuẩn Brevibacillus khác,
cho thấy rằng chúng đại diện cho các dấu hiệu đặc trƣng cho vi khuẩn Bacillus
laterosporus, có thể hữu ích cho việc phân lập và xác định các chủng mới của loài
này (Oliveira và cs., 2004).
Năm 2011, Song và cs. đã công bố nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn
Bacillus laterosporus ZQ2 từ rễ táo ở Đông Sơn, Trung Quốc. Chủng vi khuẩn
ZQ2 có khả năng ức chế nấm gây bệnh trên cây táo bao gồm Rhizoctonia solani,
Fusarium oxysporum, Fusarium solani và Physalospora piricola. Tỷ lệ ức chế đối
với các loại nấm khác nhau dao động từ 55,26 đến 88,17%. Chủng ZQ2 đƣợc xác
định là Bacillus laterosporus dựa trên đặc điểm hình thái, xét nghiệm sinh hóa và

phân tích trình tự 16S rDNA. Các chất chuyển hóa kháng nấm do ZQ2 tạo ra ổn
định nhiệt ngay cả sau khi đƣợc xử lý ở 121°C trong 30 phút. Trong khi đó, hoạt
tính chống lại sự phát triển của Rhizoctonia solani hầu nhƣ không thay đổi khi dịch
lọc nuôi cấy đƣợc chiếu xạ dƣới tia cực tím (UV) hoặc ở pH từ 1 đến 11, và chỉ bị
13


giảm ở điều kiện pH từ 12 đến 14. Khi thí nghiệm ở điều kiện pH từ 12 đến 14,
quan sát bằng kính hiển vi quang học, sợi nấm của Rhizoctonia solani bị ức chế bởi
các chất chuyển hóa kháng nấm khiến nó phát triển bất thƣờng. Hoạt tính kháng
nấm mạnh và hoạt chất tƣơng đối ổn định của Bacillus laterosporus ZQ2 cho thấy
tiềm năng lớn trong việc kiểm soát bệnh nấm trên táo (Song và cs., 2011).
Trong năm 2012, Sharma và cs. đã báo cáo trình tự bộ gen 5,18 Mb
của chủng Bacillus laterosporus GI-9, đƣợc phân lập từ một mẫu đất dƣới lớp bề
mặt thu đƣợc từ một vùng đất nơng nghiệp ở Chandigarh, nằm ở phía bắc Ấn Độ.
Chủng GI-9 đã đƣợc xác định trong quá trình sàng lọc vi khuẩn có hoạt tính kháng
vi sinh vật. Sự hiện diện của nội bào tử, các đặc tính kiểu hình và phân tích BLAST
trình tự gen 16S rRNA (GenBank gia nhập số FR686596) đã chỉ định chủng GI-9
cho chi Brevibacillus. Nó có độ tƣơng đồng cao (99%) với Bacillus laterosporus
DSM25. Tuy nhiên, chủng DSM25 cho thấy sự khác biệt về đặc tính kiểu hình, bao
gồm sự tăng trƣởng ở 50°C, phản ứng dƣơng tính trong thử nghiệm VogesProskauer và quá trình thủy phân urê, so với Bacillus laterosporus (Sharma và cs.,
2012).
2.7.

Các phƣơng pháp nghiên cứu xác định Bacillus laterosporus

2.7.1. Phƣơng pháp truyền thống
Phƣơng pháp thông thƣờng để xác định vi khuẩn bao gồm xác định đặc
điểm, hình dáng, kích thƣớc, màu sắc và mùi của khuẩn lạc (các đặc điểm có thể
quan sát bằng mắt thƣờng). Có thể xác định các hình thái trên mơi thạch ni. Các

vi khuẩn thƣờng hình thành các khuẩn lạc riêng biệt, màu sắc khác nhau, kích cỡ,
hình dáng khác nhau khi ni trên cùng môi trƣờng (Houpikian và Raoult, 2002).
Xác định vi khuẩn có thể dùng các đặc điểm sinh hóa bao gồm nhuộm Gram,
nhuộm bào tử hay các xét nghiệm sinh hóa đơn giản. Nhuộm Gram là phƣơng pháp
14