Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định vi khuẩn bacillus laterosporus trong phân bón hữu cơ

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------***--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS LATEROSPORUS
TRONG PHÂN BÓN HỮU CƠ”

HÀ NỘI – 2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------***--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS LATEROSPORUS
TRONG PHÂN BÓN HỮU CƠ”

Sinh viên thực hiện

: VŨ THỊ NHƢ QUỲNH

Lớp

: K64CNSHA

MSV

: 642422

Giảng viên hƣớng dẫn : TS. NINH THỊ THẢO
Bộ mơn

: CƠNG NGHỆ THỰC VẬT

Hà Nội -2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu xây dựng
phương pháp xác định vi khuẩn bacillus laterosporus trong phân bón hữu cơ” do
tơi thực hiện từ 6/2022 đến tháng 12/2022 dưới sự hướng dẫn của TS. Ninh Thị
Thảo – Giảng viên Bộ môn Công nghệ thực vật – Khoa Công nghệ Sinh học –
Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Số liệu và kết quả nghiên cứu trong đề tài này là hoàn toàn trung thực, chưa
từng được cơng bố trong bất kì cơng trình nghiên cứu khoa học nào ở trong
nước và quốc tế.
Các tài liệu tham khảo đã được trích dẫn rõ ràng. Mọi sự giúp đỡ đã được
cảm ơn.
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
Sinh viên thực hiện

Vũ Thị Nhƣ Quỳnh

i


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian thực tập tại Bộ môn Công nghệ Thực vật – Khoa Công nghệ
Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, được sự quan tâm, giúp đỡ của các
thầy cô, các anh chị, bạn bè tại phịng thí nghiệm bộ mơn, cùng sự nỗ lực, cố
gắng của bản thân, tơi đã hồn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Ninh
Thị Thảo, Giảng viên Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật đã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo, động viên tinh thần, cũng như cung cấp các tài liệu, thông tin khoa
học cần thiết, liên quan đến đề tài này cho tôi.
Thứ hai, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy TS. Đinh Trường Sơn, cô
ThS. Phạm Thị Thu Hằng và các thầy cô trong bộ môn CNSH Thực vật đã giúp
đỡ tôi và cung cấp những kiến thức khoa học hữu ích trong thời gian thực hiện
khóa luận.
Tơi cũng muốn cảm ơn những người bạn đồng hành trong phòng thí
nghiệm của tơi vì sự hỗ trợ đáng kể của họ.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn vô hạn tới công sinh
thành, dưỡng dục của bố mẹ. Cảm ơn gia đình và những người bạn thân đã luôn
ở bên, tiếp thêm động lực, là nguồn cổ vũ lớn lao cho tôi trong suốt thời gian
qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
Sinh viên thực hiện

Vũ Thị Nhƣ Quỳnh

ii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................. vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT........................................................................... viii
TÓM TẮT ........................................................................................................... ix
PHẦN 1: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu ....................................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu....................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................................ 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
2.1. Bacillus laterosporus...................................................................................... 3
2.1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus laterosporus................................... 3
2.1.2. Lịch sử phát hiện ......................................................................................... 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 4
2.2. Thể ký sinh (parasporal body)........................................................................ 5
2.1.5. Khả năng kháng khuẩn ................................................................................ 6
2.1.6. Khả năng gây bệnh cho động vật không xương sống ................................. 7
2.1.7. Các công dụng khác .................................................................................... 7
2.2. Phương pháp nghiên cứu để định danh vi khuẩn ........................................... 8
2.2.1. Phương pháp truyền thống .......................................................................... 8
2.2.2. Phương pháp hiện đại .................................................................................. 8
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................... 10
3.1. Vật liệu ......................................................................................................... 10
3.2. Thời gian và địa điểm nguyên cứu ............................................................... 10

iii


3.3. Vật liệu thí nghiệm ....................................................................................... 10
3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm...................................................................... 10
3.3.2. Hóa chất..................................................................................................... 11
3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ......................................................... 12
3.4.1. Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus từ phân bón hữu cơ
............................................................................................................................. 12
3.4.2. Phương pháp làm thuần, giữ giống ........................................................... 14
3.4.3. Nội dung 2: Đánh giá các đặc điểm hình thái và sinh hóa của các mẫu vi
khuẩn Bacillus laterosporus được phân lập từ phân bón hữu cơ........................ 15
3.4.4. Nội dung 3: Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus bằng phương pháp
xác định trình tự 16S rRNA và phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu ......... 18
PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 21
4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus từ phân bón hữu cơ ..................... 21
4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ pha loãng mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn .. 21
4.1.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến kết quả phân lập vi khuẩn ..... 23
4.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn ......... 26
4.1.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn ........ 30
4.2. Đánh giá hình thái và sinh hóa của các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus
giả định được phân lập từ phân bón hữu cơ ........................................................ 31
4.2.1. Lựa chọn các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định ..................... 31
4.2.2. Đánh giá đặc điểm hình thái các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả
định ...................................................................................................................... 32
4.2.3. Phân tích đặc tính hóa sinh các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả
định ...................................................................................................................... 34
4.2.4 Tổng hợp kết quả khảo sát đặc điểm hóa sinh ........................................... 40
4.3. Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập bằng phương pháp giải
trình tự đoạn gen 16S rRNA và phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu ........ 42

4.3.1. Kết quả tách chiết DNA ........................................................................... 42
4.3.2. Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập bằng phương
pháp xác định trình tự nucleotide 16S rRNA ...................................................... 43
iv


4.3.3. Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus bằng phương pháp PCR sử
dụng mồi đặc hiệu ............................................................................................... 45
4.4. Tính tốn tổng số vi khuẩn Bacillus laterosporus phân bón hữu cơ ........... 47
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................... 49
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 49
5.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 50

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 11
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ pha loãng mẫu đến sự phát triển của vi khuẩn
sau 20h nuôi cấy .................................................................................................. 21
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ lấy mẫu đến sự phát triển của vi khuẩn ............ 23
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý mẫu đến sự phát triển của vi khuẩn sau
20h nuôi cấy ........................................................................................................ 27
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của thời gian xử lý mẫu đến sự phát triển của................. 30
Bảng 4.5: Danh sách 20 mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập giả định
sử dụng để đánh giá đặc điểm hình thái và hóa sinh........................................... 32
Bảng 4.6: Đặc điểm hình thái và tế bào của 20 mẫu vi khuẩn Bacillus
laterosporus phân lập giả định ............................................................................ 33
Bảng 4.7:Đặc điểm hóa sinh của 20 khuẩn lạc tuyển chọn ................................ 41

Bảng 4.8: Mật độ khuẩn lạc có hình thái đặc trưng của phân bón hữu cơ ......... 48

vi


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1: (A): Ảnh nhuộm Gram, (B): Hình thái vi khuẩn Bacillus laterosporus,
(C): Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus laterosporus ............................... 4
Hình 2.2: Túi bào tử. SW của vi khuẩn Bacillus laterosporus, túi bào tử; sp:- bào
tử; SC:- áo bào tử; CSPB:- cơ thể parasporal hình xuồng. ................................... 5
Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc của các mẫu vi khuẩn phân lập trên môi trường
LB ........................................................................................................................ 33
Hình 4.2: Kết quả nhuộm Gram của khuẩn lạc Q2 ............................................. 34
Hình 4.3: Kết quả thử nghiệm phản ứng MR...................................................... 35
Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm phản ứng VP ....................................................... 36
Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate .............................. 37
Hình 4.6: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh enzyme protease.......................... 38
Hình 4.7: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh enzyme amylase .......................... 40
Hình 4.8: DNA tổng số của 3 mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus ................... 43
Hình 4.9: Kết quả sản phẩm PCR của mồi 16S .................................................. 44
Hình 4.10: Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của mẫu vi khuẩn Q11 bằng công
cụ BLAST trên NCBI .......................................................................................... 45
Hình 4.11: PCR mồi đặc hiệu ............................................................................. 46

vii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

STT

Từ viết tắt

Diễn giải chữ viết tắt

1

CSPB

Canoe-Shaped Parasporal Body

2

CT

Công thức

3

DNA

Deoxyribonucleic acid

4

ĐC

Đối chứng

5

LB

Luria Bertani Broth

6

MR

Methyl red

7

RNA

Ribonucleic acid

8

PCR

Polymerase chain reaction

9

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

10

VP

Voges – Proskauer

viii


TĨM TẮT
Trong đề tài này, chúng tơi nghiên cứu phương pháp xác định vi khuẩn
Bacillus laterosporus – loài vi khuẩn có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn gây
bệnh và thúc đẩy sự phát triển của thực vật - từ phân bón hữu cơ. Chúng tơi tiến
hành đánh giá các đặc điểm hình thái, đặc điểm hóa sinh và sự hiện diện của gen
đặc hiệu ở các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập giả định. Kết quả
cho thấy, 3 mẫu vi khuẩn bao gồm Q2, Q6, Q11 trong số 20 mẫu vi khuẩn phân
lập giả định có các đặc điểm hình thái và hóa sinh bao gồm khuẩn lạc trịn, màu
be hoặc trắng, viền ria, nhẵn, phẳng, tế bào Gram dương, trực khuẩn, kết quả âm
tính với phản ứng MR-VP, khơng có khả năng biến dưỡng citrate và có khả
năng sinh enzyme ngoại bào protease và amylase. Nghiên cứu cũng kiểm tra
trình tự 16S rRNA của mẫu vi khuẩn Q11 và ghi nhận mức độ tương đồng với
các chủng vi khuẩn trong chi Bacillus là khá cao. Phương pháp PCR sử dụng
cặp mồi đặc hiệu đã kiểm chứng được sự có mặt của gen cpbB mã hóa cho
protein của phức hợp SC-CSPB trên vi khuẩn Bacillus laterosporus ở 3 mẫu vi
khuẩn Bacillus laterosporus Q2, Q6, Q11 cho thấy vạch băng đặc hiệu chỉ xuất
hiện ở 3 mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus mà không ghi nhận ở vi khuẩn
Bacillus thuringiensis. Điều này chứng tỏ có thể sử dụng gen cpbB làm dấu hiệu
nhận diện vi khuẩn Bacillus laterosporus ở mức độ phân tử. Do đó, chúng tơi
kết luận rằng có thể sử dụng các phương pháp phân tích về mặt hình thái, đặc
điểm hóa sinh và phân tử kết hợp để phân lập và xác định vi khuẩn Bacillus
laterosporus trong phân bón hữu cơ.

ix


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong sản xuất nông nghiệp, phân bón đóng vai trị quan trọng quyết định
cả về chất lượng và sản lượng thu hoạch. Hiện nay có rất nhiều dạng phân bón
khác nhau đã được sản xuất sử dụng trong nơng nghiệp như: phân hố học đa
lượng hoặc vi lượng: phân hữu cơ, phân sinh học, phân vi sinh. Trên thế giới
cũng như ở nước ta đã có nhiều cơng trình nghiên cứu giúp cho nơng dân biết
chọn lựa những loại phân có ích nhất và cách sử dụng phân như: bón phân vào
thời điểm nào và liều lượng bao nhiêu là có hiệu quả cao nhất. Tuy nhiên, ngành
nông nghiệp nước ta hiện nay chủ yếu sử dụng phân bón hóa học trong canh tác
và sản xuất. Do sử dụng không đúng cách, lạm dụng các loại phân bón và thuốc
trừ sâu hóa học làm tăng dư lượng các chất hóa học gây ơ nhiễm môi trường đất,
môi trường nước và ảnh hưởng đến sinh vật cũng như con người đồng thời làm
đất canh tác bị bạc màu nhanh chóng.
Dưới tác động của việc đẩy mạnh cơng nghiệp hóa hiện đại hóa đất nước
góp phần làm diện tích đất nơng nghiệp ngày một giảm đi. Chính vì vậy để tăng
năng suất, sản lượng cây trồng đồng thời phải đảm bảo môi trường phát triển
bền vững là một vấn đề cấp thiết hiện nay. Do đó, việc tìm ra giải pháp thay thế
thân thiện sinh học là yêu cầu cấp thiết. Phát triển phân bón sinh học có hiệu
quả, phân hủy sinh học và thân thiện với môi trường là một hướng đi phù hợp.
Xu hướng sử dụng thuốc trừ sâu sinh học để thay thế dần thuốc trừ sâu hóa học
đang ngày càng được mở rộng. Lợi ích của việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học
trong các chương trình nơng nghiệp và sức khỏe cộng đồng là rất lớn, đặc biệt
không để lại dư lượng trên các nông sản, vấn đề gây lo ngại cho người tiêu dùng
đặc biệt là đối với các sản phẩm rau quả.
Bacillus laterosporus là một trong những loài vi khuẩn được các nhà khoa

học nghiên cứu kỹ lưỡng để cho ra những chế phẩm sinh học đặc hiệu tốt cho
mơi trường. Đã có khá nhiều sản phẩm phân bón hữu cơ có chứa vi khuẩn
Bacillus laterosporus được thương mại trên thị trường Việt Nam như phân bón
hữu cơ “Nấm đối kháng Trichoderma”, Kaito Nano Hữu Cơ, Bio Sun... Tuy
1


nhiên, các tiêu chuẩn cơ sở đã được thiết lập ở nước ta khơng thể định tính hoặc
định lượng Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học. Việc nghiên cứu thiết
lập phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn trong mẫu chế phẩm vi sinh ở
điều kiện Việt Nam là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và ứng dụng. Xuất phát từ
thực tiễn đó, từ xu hướng nghiên cứu hiện nay trên thế giới và trong nước, đề tài
nghiên cứu nhằm phát triển phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn
Bacillus laterosporus trong phân bón hữu cơ.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
Xây dựng phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn Bacillus
laterosporus trong phân bón hữu cơ.
1.2.2. Yêu cầu
- Phân lập được vi khuẩn Bacillus laterosporus có trong phân bón hữu cơ.
- Đánh giá được đặc điểm hình thái và sinh hóa của các mẫu vi khuẩn
Bacillus laterosporus giả định phân lập từ phân bón hữu cơ.
- Định danh được vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định bằng phương
pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Bacillus laterosporus

2.1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus laterosporus
Bacillus laterosporus trước đây được gọi là Brevibacillus laterosporus, là
một loại vi khuẩn hình thành bào tử hiếu khí được đặc trưng bởi khả năng tạo ra
một bao thể bào tử dạng lamellar hình chiếc xuồng tiếp giáp với bào tử. Một số
chủng tạo ra các thể vùi tinh thể có hình dạng và kích cỡ khác nhau, chúng được
giải phóng riêng biệt khỏi bào tử trong quá trình phân giải túi bào tử. Bacillus
laterosporus có tiềm năng được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học,
so với các chủng Bacillus thuringiensis và Bacillus sphaericus thì Bacillus
laterosporus thể hiện hoạt động sinh học rất rộng (Miljkovic & cs., 2019).
2.1.2. Lịch sử phát hiện
Mối quan hệ của Bacillus laterosporus và côn trùng được ghi nhận đầu tiên
vào đầu thế kỉ 20 bởi White (1912), khi ông tiến hành nghiên cứu về vi khuẩn của
ong mật bị ảnh hưởng bởi loài ong mật ở châu Âu. Trong số vi khuẩn gây bệnh
phân lập được, White đã tìm ra được lồi vi khuẩn mới được đặt tên là Bacillus
orpheus White. Tuy nhiên, các mô tả chi tiết về vi khuẩn này được đưa ra vào
năm 1917 bởi McCray, người đã phân lập các vi khuẩn sinh bào tử khác nhau từ
ong (Roy & cs., 1921). Tuy nhiên trên thực tế, vi khuẩn Bacillus laterosporus
được đặt tên và mô tả bởi Laubach, người đã phân lập vi khuẩn này từ nước ngọt
(Laubach, 1916). Do sự tương đồng của hai chủng phân lập nên tên thứ hai được
ưu tiên sử dụng hơn và dùng để chỉ cho loài vi khuẩn này (Smith, 1952). Vào năm
1980 sau khi Donnell đến thăm Iceland ông đã phát hiện ra vi khuẩn này tồn tại ở
trong đất nhờ sự phát triển mạnh mẽ của cây trồng mà khơng cần phân bón.
Bacillus laterosporus còn được phân lập được từ nhiều loại nguồn khác nhau như
đất (Oliveira & cs., 2004), đá quý (Khan, 2001), nước ngọt (Laubach, 1916),
nước biển (Suslova & cs., 2012), côn trùng (White, 1912), bề mặt lá (Roy & cs.,
2006), phân hữu cơ (Adegunloye & cs., 2007), sữa (Varadaraj & cs., 1993), phô
mai (Román-Blanco & cs., 1999), mật ong (Iurlina, 2005), thực phẩm giàu tinh
bột (Fangio, 2010), nước thải nhà máy gelatin (Sharma & cs., 1996).
3

2.1.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus laterosporus là một loại vi khuẩn hình que, hình thành nội bào tử,
có đặc điểm hình thái là tạo ra một cơ thể ký sinh hình xuồng (CSPB) điển hình
gắn chặt vào bên trong túi bào tử. Bacillus laterosporus hình thành khuẩn lạc
phẳng, nhẵn (trơn), màu trắng hoặc màu be với rìa hình thoi (Ghazanchyan &
cs., 2018).
Bacillus laterosporus là vi khuẩn Gram dương, nội bào tử hình bầu dục làm
phồng tế bào, xếp ở hai bên, kích thước ơ [µm]: 0,6-0,9 x 1,2 - 4,0. Tính cơ động
của vi khuẩn di chuyển bằng Flagella, là vi khuẩn hiếu khí có chế độ dinh dưỡng
là hóa dưỡng. Bằng cách kiểm tra đồng thời độ phì nhiêu của đất và độ hoàn hảo
của thảm thực vật địa phương, các chuyên gia đưa ra kết luận rằng một chủng
nhất định của các loài Laterosporus hoặc Bacillus laterosporus là hợp lý với
điều kiện tối ưu cho hệ thực vật địa phương phát triển mạnh. Vi khuẩn này có
thể tiết ra rất nhiều chitinase, ức chế các nấm gây bệnh. Đồng thời, Bacillus
laterosporus có thể ức chế các vi khuẩn có hại như Escherichiacoli, Baculovirus,
v.v...(Ruiu & cs., 2007)

Hình 2.1: (A): Ảnh nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus laterosporus (B):
Hình thái vi khuẩn Bacillus laterosporus, (C): Hình thái khuẩn lạc của vi
khuẩn Bacillus laterosporus
4


Nguồn: ( Ruiu & cs. (2007);
/>2.2. Thể ký sinh (parasporal body)
Đặc điểm hình thái chính đặc trưng cho Bacillus laterosporus là một khía
cạnh đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu khác nhau. Vào giữa thế kỷ
20, Hannay đã tiến hành quan sát các tế bào bào tử cố định bằng kính hiển vi
quang điện tử, đi đến kết luận rằng “thể ký sinh hình xuồng - Canoe-Shaped

Parasporal Body” được hình thành trước khi hồn thành q trình tạo bào tử và
vẫn tồn tại cùng bào tử bởi vì nó là “một phần của bào tử” (Hannay & cs.,
1957).

Hình 2.2: Túi bào tử. SW của vi khuẩn Bacillus laterosporus, túi bào tử; sp:bào tử; SC:- áo bào tử; CSPB:- cơ thể parasporal hình xuồng (Ruiu & cs.,
2013).
Các giả thuyết khác nhau đã được đưa ra vai trò và chức năng của các cơ
thể này có thể đóng vai trò là đơn vị lưu trữ nếu bào tử nảy mầm trong mơi
trường thiếu hụt, có thể hỗ trợ sự nảy mầm của bào tử hoặc có thể là vách phụ
hoặc chỉ là biến dạng của vách bào tử. Tuy nhiên, chức năng cụ thể vẫn chưa
được xác nhận cho đến nay. James và Young (1958) đã phân tích thành phần
hóa học của cấu trúc áo bào tử, sau khi phát triển một phương pháp tách nó ra
khỏi nguyên sinh bào tử. Theo nghiên cứu của họ, các thành phần chính của
CSPB là phosphate và nitrogen. Ngồi lượng phosphate dồi dào, vật liệu protein
5


được thu hồi thông qua chiết xuất kiềm với sự có mặt của chất khử (alkalithioglicollate) phá vỡ liên kết S-S. Kết quả phân tích hình thái và hóa học kết
hợp cho thấy rằng thành phần photpho là một phần của cấu trúc của thể ký sinh
hình xuồng (Ruiu & cs., 2013).
Các cơ thể bào tử khác (PB), khác biệt với CSPB, đã được ghi nhận bên
trong túi bào tử bởi Montaldi và Roth (1990), người đã xác định được loại thứ
hai, hình cầu, hình góc và loại thứ ba, có vân với các dải song song xen kẽ. Chức
năng của các cấu trúc này chưa được làm rõ, nhưng có giả thiết cho rằng cấu
trúc này có vai trị trong hoạt động diệt côn trùng (Ruiu & cs., 2013).
Bacillus laterosporus là một loại vi khuẩn được đặc trưng bởi „thể ký sinh
hình xuồng SC – CSPB” bao xung quanh lõi bào tử. Vì vậy, Bacillus
laterosporus đã được xác định và mơ tả bởi các protein chính của phức hợp SCCSPB. Các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp sàng lọc protein để tìm ra
được 4 protein quan trọng trong Bacillus laterosporus bao gồm với ExsC (42
kDa), CHRD (42 kDa), CpbA (54 kDa) và CpbB (42 kDa) (Ruiu & cs., 2013).

Các gen mã hóa protein ExsC, CHRD, CpbA và CpbB của Bacillus laterosporus
đã được khuếch đại thành công với các đoạn mồi được thiết kế dựa trên các trình
tự tương đồng và đã được công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI. Trình tự DNA của
các gen này hiện nay đã được công bố trên cơ sở dữ liệu GenBank theo các mã
số sau: KY124461 (CpbA), KY124462 (CpbB), KY124463 (CHRD) và
KY124464 (ExsC) (Marche & cs., 2017).
2.1.5. Khả năng kháng khuẩn
Một số chủng Bacillus laterosporus thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tương
đối rộng đối với các loại vi khuẩn và nấm khác nhau. Đặc tính sinh học này có
liên quan đến việc sản xuất nhiều loại enzyme và kháng sinh bởi Bacillus
laterosporus.
Chủng vi khuẩn Bacillus laterosporus BPM3, phân lập từ bùn ở Ấn Độ,
được xác định là có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh thực
vật như Fusarium oxysporum, Aspergillus sp, Alternaria, Colletotrichum
gloeosporioides và sự phát triển của vi khuẩn cầu khuẩn Gram
6


dương Staphylococcus aureus. Các hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm từ
chủng vi khuẩn này đã được tinh sạch và mơ tả. Thơng tin sơ bộ về thành phần
hóa học của phần hoạt động mạnh nhất thu được bằng phân tích quang phổ cho
thấy sự hiện diện của -CH, nhóm carbonyl, nhóm dimethyl, -CH và nhóm
2

methyl.
Do có tính đối kháng chống lại nhiều vi sinh vật có hại khác nhau Bacillus
laterosporus được sử dụng như một chất phụ gia thức ăn (Hong & cs.,
2005). Gia cầm uống bào tử Bacillus laterosporus có thể cải thiện chuyển hóa
thức ăn và tăng trọng lượng (Porubcan, 2003).
2.1.6. Khả năng gây bệnh cho động vật không xƣơng sống

Khả năng gây bệnh của các chủng Bacillus laterosporus đối với các động
vật không xương sống khác nhau như côn trùng, tuyến trùng và động vật thân
mềm đã được đánh giá. Mức độ gây độc của Bacillus laterosporus với động vật
khơng xương sống hồn tồn phụ thuộc vào sinh vật chủ cũng như giai đoạn
phát triển của vi khuẩn. Một số độc tố protein và phương thức gây độc đã được
xác định. Tuy nhiên, nhiều khía cạnh vẫn cần được làm rõ và cần nghiên cứu
thêm (Ruiu & cs., 2013).
2.1.7. Các công dụng khác
Do tạo nhiều chất chuyển hóa khác nhau, nên hoạt tính sinh học của
Bacillus laterosporus không chỉ giới hạn đối với động vật không xương sống, vi
khuẩn và nấm. Vi khuẩn này cịn có tác dụng diệt tảo lam có hại thuộc các chi
khác nhau bao gồm Oscillatoria, Anabaena, Microcystis và Nostoc.
Một lĩnh vực khác đang được quan tâm là việc sử dụng vi khuẩn Bacillus
laterosporus để xử lý sinh học, đó là xử lý sinh học của một địa điểm bị ô nhiễm
để phân hủy và loại bỏ các chất gây ô nhiễm hoặc các hợp chất gây ơ
nhiễm. Các ví dụ điển hình là quá trình phân hủy sinh học rượu polyvinyl thành
axetat, quá trình khử màu của các loại thuốc nhuộm azo dệt may khác nhau
thông qua việc sản xuất các loại enzyme khác nhau bao gồm lignin peroxidase,
laccase, aminopyrine N -demethylase, NADH-DCIP reductase và malachite
green reductase, sự phân hủy sinh học của tanin thực vật trong nước thải thuộc
7


da, sự phân hủy sinh học của toluen và phenol, hấp thụ sinh học các kim loại độc
hại từ dung dịch nước và giải độc kim loại trong hệ thống nước thải (Ruiu & cs.,
2013).
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu để định danh vi khuẩn
2.2.1. Phƣơng pháp truyền thống
Phương pháp thông thường để xác định vi khuẩn bao gồm xác định đặc
điểm, hình dáng, kích thước, màu sắc và mùi của khuẩn lạc (các đặc điểm có thể

quan sát bằng mắt thường). Có thể xác định các hình thái trên mơi thạch ni.
Các vi khuẩn thường hình thành các khuẩn lạc riêng biệt, màu sắc khác nhau,
kích cỡ, hình dáng khác nhau khi nuôi trên cùng môi trường (Houpikian, 2002).
Xác định vi khuẩn có thể dùng các đặc điểm sinh hóa bao gồm nhuộm
Gram, nhuộm bào tử hay các xét nghiệm sinh hóa đơn giản. Nhuộm Gram là
phương pháp để phân biệt 2 loại vi khuẩn nhanh hơn là vi khuẩn Gram âm, vi
khuẩn Gram dương dựa trên cấu tạo vách tế bào. Một số vi khuẩn có thể biến
đổi Gram do đó khơng thể nhuộm Gram (Houpikian, 2002). Có thể sử dụng
phương pháp nhuộm bào tử để xác định vi khuẩn, để phân biệt vi khuẩn hình
thành bào tử và khơng hình thành bào tử. Các phản ứng hóa sinh đơn giản như
phản ứng catalase, phản ứng MR – VP, phản ứng IAA, khả năng sinh enzyme
ngoại bào,... cũng có thể xác định vi khuẩn dựa trên khả năng âm tính hay dương
tính.
2.2.2. Phƣơng pháp hiện đại
Mặc dù vẫn được sử dụng phổ biến nhưng các phương pháp truyền thống
có mức độ sai sót rất cao. Phương pháp truyền thống có hai nhược điểm lớn đó
là chỉ áp dụng cho các vi sinh vật có thể ni trong ống nghiệm và mức độ giống
nhau của chủng là rất cao. Vậy nên, phương pháp xác định vi sinh vật hiện đại
hơn đã ra đời để xác định chính xác sự khác nhau giữa các vi sinh vật.
Xác định vi sinh vật bằng phương pháp PCR đó là kĩ thuật phân tử được sử
dụng khá phổ biến hiện nay để xác định vi khuẩn. Sử dụng PCR người ta có thể
nhanh chóng phát hiện và xác định các loài vi sinh vật trực tiếp từ các mẫu lâm
sàng, do đó đẩy nhanh các quy trình xác định vi sinh vật (Järvinen AK & cs.,
8


2009). Sử dụng gen 16S rRNA là gen phổ biến cho vi khuẩn, do chức năng 16S
rRNA rất cần thiết cho tế bào vi khuẩn trong quá trình dịch mã, nên hầu như tất
cả các bộ gen của vi khuẩn đều được cấu tạo từ gen 16S rRNA. Cho đến nay,
hơn 8168 loài vi khuẩn đã được xác định với việc sử dụng trình tự gen 16S

rRNA (Janda & cs., 2007). Tuy nhiên, gen 16S rRNA có mặt trong một số
lượng lớn vi khuẩn với mức độ tương đồng cao nên muốn phát hiện vi khuẩn
dựa vào gen này cho hiệu quả thấp. Vì vậy để xác định Bacillus laterosporus
(Ruiu & cs., 2016) đã đề xuất sử dụng các cặp mồi cho các gen đặc hiệu của loài
này. Các gen đặc hiệu mã hóa cho các protein chiết xuất từ bề mặt của bào tử
chứa huyền phù thu nhận từ q trình ni cấy trong mơi trường rắn hoặc mơi
trường lỏng. Bề mặt của các bào tử được bao phủ bởi một lớp vỏ bào tử và cơ
thể ký sinh hình xuồng (SC-CSPB) là một đặc điểm đặc trưng của vi khuẩn
Bacillus laterosporus. Ngoài ra, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra hai gen điển
hình Bacillus laterosporus mà khơng tìm thấy được ở các lồi vi khuẩn khác.
Gen cpbA là trình tự nucleotide mã hóa cho protein liên quan đến phức hợp SCCSPB và có trọng lượng phân tử khoảng 28 KDa của các chủng Bacillus
laterosporus. Trong khi đó gen cpbB là trình tự nucleotide mã hóa cho protein
liên kết với phức hợp SC-CSPB và có trọng lượng phân tử khoảng 14 KDa
(Ruiu & cs., 2016). Do đó các cặp mồi được thiết kế với trình tự nucleotide
tương tự như gen cpbA, gen cpbB có thể được sử dụng để phát hiện các chủng vi
khuẩn Bacillus laterosporus.

9


PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Vật liệu
Phân bón hữu cơ “Nấm đối kháng Trichoderma”, sản phẩm của công ty
TNHH Tân Nơng Phát.

Trong phân bón hữu cơ “Nấm đối kháng Trichoderma” có các nguyên liệu
sử dụng là Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma
ovalisporum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Bacillus Laterosporus,
Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium,...
3.2. Thời gian và địa điểm nguyên cứu

- Địa điểm: Khoa Công nghệ sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian: 6/2022 – 12/2022
3.3. Vật liệu thí nghiệm
3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
- Các dụng cụ thí nghiệm bao gồm: đĩa petri, ống nghiệm, micropipette
(100 µl, 1000 µl), ống falcon (15 ml, 50 ml), ống effendorft (1,5 ml, 2,0 ml),
bình định mức (100 ml, 200 ml), buret chính xác (10 ml, 20 ml), que cấy, đèn
cồn, ống đong,…
- Các trang thiết bị phịng thí nghiệm: box cấy, máy lắc nuôi cấy, bể ổn
nhiệt, tủ nuôi cấy điều chỉnh nhiệt độ, máy đo mật độ quang máy ly tâm, cân kỹ

10


thuật, cân phân tích, máy đo pH, nồi hấp vơ trùng, tủ sấy, tủ lạnh (-4ºC, -20ºC),
lị vi sóng, tủ hút hóa chất lỏng.
3.3.2. Hóa chất
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Nhóm thí nghiệm
Phân lập vi khuẩn
Bacillus laterosporus

Nhuộm
Gram

Khảo sát
các đặc
điểm hóa
sinh

Khả năng
sinh
enzyme
ngoại bào

Mơi trƣờng

Thành phần mơi
trƣờng
1l mơi trường gồm:
10g Tryptone
5g Yeast Extract
LB
10g NaCl
20g Agar
pH = 7,0 ± 0,2
Tím gentian 1g
10 ml cồn ethanol 96º
Tím Gentian
1 ml acid phenic
100 ml nước cất
Lắc đều, lọc qua giấy lọc
2g KI
1g I2
Lugol
Lên thể tích bằng nước
cất đến vạch 200ml, lắc
đều
1g Fuchsin kiềm
10 ml cồn ethanol 96º

Fuchsin
5 ml acid phenic
100 ml nước cất
Lắc đều, lọc qua giấy lọc
6,31g KH2PO4
Đệm phosphate 0,1M, 9,34g K HPO
2
4
pH 7
1000 ml nước cất
pH = 7,0
2% agar + 1% tinh bột
Đĩa thạch thử hoạt tính
pha trong đệm phosphate
Amylase
0,1M, pH 7
2% agar + 1% gelatin
Đĩa thạch thử hoạt tính
pha trong đệm phosphate
Protease
0,1M, pH 7
0,1g Aminobalac 10B
30ml Methanol
Thuốc nhuộm aminoden
10ml Acid acetic
100 ml Nước cất, lắc đều
20 ml Methanol
11

Khả năng
sinh
enzyme
ngoại bào

Tẩy aminoden

Lugol

Khảo sát
các đặc
điểm hóa
sinh

Phản ứng
MR

MR – VP Broth

7g Peptone
5g Glucose

Thuốc thử Methyl red
Phản ứng
VP

50 ml Nước cất
7,5 ml Acid acetic
100 ml Nước cất, lắc đều
2g KI

1g I2
Lên thể tích bằng nước
cất đến vạch 200 ml, lắc
đều
1l mơi trường gồm:

Thuốc thử VP

Simmon‟s citrate agar
(SCA) (g/l)

Tách chiết DNA từ vi
khuẩn
CTAB

5g NaCl
0,1g Methyl red
300ml Ethanol 95%
Alpha Naphtol 5%
NaOH 40%
1.0g Ammonium
dihydrogen phosphate
1,0g Dipotassium
hydrogen phosphate
5,0g NaCl
2,0g Sodium citrate
0,2g MgSO4
0,08g Bromothymol blue
20,0g Agar
pH = 7,0

0,5g CTAB 364.45
1g EDTA 372.24
2,5g Tris base 121.14
5g NaCl
100 ml nước cất, hòa tan
ở nhiệt độ phòng

3.4. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus từ phân bón hữu
cơ
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ pha loãng mẫu đến kết quả
phân lập vi khuẩn
Mẫu phân bón được hịa tan trong NaCl 0,85% theo tỉ lệ 1:9 (w/v) và xử lý
trong 80°C trong 5 phút. Sau đó, mẫu được pha lỗng bằng NaCl 0,85% ở các
12


độ pha loãng khác nhau từ 10-2 đến 10-8. Hút 100 µl dung dịch vi khuẩn từ nồng
độ 10-2 đến 10-8 được nuôi cấy trên môi trường thạch LB. Mỗi công thức nuôi
cấy 3 đĩa. Ủ các đĩa ở nhiệt độ 30°C trong 24h.
Cơng thức

Nồng độ mẫu pha lỗng

CT1

10-2

CT2

10-3

CT3

10-4

CT4

10-5

CT5

10-6

CT6

10-7

CT7

10-8

Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến kết quả phân
lập vi khuẩn
Hòa tan mẫu theo tỷ lệ từ 1:9 đến 1:49 (w/v) vào NaCl 0,85% đem đi
vorter. Sau đó, xử lý mẫu ở 80°C trong 5 phút để tiêu diệt tất cả các tế bào sinh
dưỡng và loại bỏ vi khuẩn khơng cịn bảo tử. Ni cấy 100µl dung dịch vi khuẩn
ở độ pha lỗng 10-7, 10-8 trên môi trường thạch LB. Mỗi công thức nuôi cấy 3
đĩa. Ủ các đĩa ở nhiệt độ 30°C trong 24h.
Cơng thức

Tỉ lệ mẫu: NaCl 0,85% (w/v)

CT1

1:9

CT2

1:19

CT3

1:29

CT4

1:39

CT5

1:49

Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nhiệt độ xử lý mẫu đến kết quả phân lập
vi khuẩn
Mẫu được hòa tan trong NaCl 0,85% theo tỉ lệ 1:9 (w/v) và sẽ được xử lý ở
trong nhiệt độ khác nhau từ nhiệt độ phòng, 60°C, 80°C, 90°C, 100°C trong 5
phút. Sau đó, pha lỗng mẫu đến nồng độ 10-7, 10-8 và hút 100µl dung dịch vi
13

khuẩn nuôi cấy trên môi trường thạch LB. Mỗi công thức nuôi cấy 3 đĩa. Ủ các
đĩa ở nhiệt độ 30°C trong 24h.
Cơng thức

Nhiệt độ xử lý mẫu

CT1

Nhiệt độ phịng

CT2

60°C

CT3

80°C

CT4

90°C

CT5

100°C

Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của thời gian xử lý mẫu đến kết quả phân
lập vi khuẩn
Mẫu được hòa tan trong NaCl 0,85% theo tỉ lệ 1:9 (w/v) và sẽ được xử lý ở

trong nhiệt độ 80°C với thời gian khác nhau trong 3 phút, 5 phút, 7 phút, 10
phút. Sau đó, pha lỗng mẫu đến nồng độ 10-7, 10-8 và hút 100µl dung dịch vi
khuẩn ni cấy trên mơi trường thạch LB. Mỗi công thức nuôi cấy 3 đĩa. Ủ các
đĩa ở nhiệt độ 30°C trong 24h.
Công thức

Thời gian xử lý mẫu (phút)

CT1

3

CT2

5

CT3

7

CT4

10

3.4.2. Phƣơng pháp làm thuần, giữ giống
 Phương pháp làm thuần
Các mẫu vi khuẩn đã được sàng lọc, nuôi cấy trong môi trường thạch Luria
Bertani (LB).
Lựa chọn các khuẩn lạc có hình thái khác nhau để cấy riêng ra các đĩa môi
trường mới, cấy chuyển đến khi xuất hiện các khuẩn lạc đơn riêng rẽ, đồng nhất

với nhau về hình thái thì vi khuẩn đã được làm thuần.
 Phương pháp giữ giống

14