Phân tích mô hình và tính bảo thủ trong cấu trúc gen ftsz ở chi bacillus bằng tin sinh học

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN TÍCH MƠ HÌNH VÀ TÍNH BẢO THỦ TRONG
CẤU TRÚC GEN ftsZ Ở CHI BACILLUS
BẰNG TIN SINH HỌC

Hà Nội-2023


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN TÍCH MƠ HÌNH VÀ TÍNH BẢO THỦ TRONG
CẤU TRÚC GEN ftsZ Ở CHI BACILLUS
BẰNG TIN SINH HỌC

Ngƣời thực hiện

: Lê Thị Vân

Khoá

: K64CNSHB

Mã sinh viên

: 646374

Ngành

: Công nghệ sinh học

Ngƣời hƣớng dẫn

: TS. Chu Đức Hà
ThS. Trần Thị Hồng Hạnh

Hà Nội-2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong khóa luận
này. Mọi kết quả thu đƣợc nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các
nghiên cứu khác. Các số liệu, kết quả của khóa luận này chƣa từng đƣợc cơng bố.
Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!
Hà nội, ngày

tháng

năm

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Vân

i


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp em luôn nhận đƣợc sự
quan tâm, hƣớng dẫn giúp đỡ tận tình của các thầy, cơ giáo trong khoa Công
nghệ Sinh học cùng với sự giúp đỡ, động viên từ bạn bè.
Lời đầu tiên, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Ban giám hiệu
Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học đã
tận tình giúp đỡ cho em suốt thời gian em theo học tại trƣờng.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lịng biết ơn vơ cùng sâu sắc đến Cơ ThS Trần
Thị Hồng Hạnh - Bộ môn Công nghệ vi sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Học
viện Nông Nghiệp Việt Nam và Thầy TS. Chu Đức Hà - Khoa Công nghệ
Nông nghiệp, Đại học Công nghệ, Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà
Nội đã giúp đỡ em trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận này.
Bên cạnh đó, em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu, nhiệt
tình của tập thể cán bộ Khoa Công nghệ Nông nghiệp, Đại học Công nghệ, Đại
học Quốc Gia Hà Nội là nơi tôi đã tiến hành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Cuối cùng, em xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô trong khoa Công
nghệ Sinh học - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày 13 tháng 02 năm 2023
Sinh viên thực hiện

Lê Thị Vân

ii

MỤC LỤC
Lời cam đoan ...................................................................................................... i
Lời cảm ơn......................................................................................................... ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh mục ký hiệu, chữ cái viết tắt ................................................................... vi
Danh mục bảng................................................................................................ vii
Danh mục hình ............................................................................................... viii
PHẦN I: MỞ ĐẦU ........................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................... 1

1.2.

Mục đích và yêu cầu của đề tài ............................................................ 1

1.2.1. Mục đích của đề tài ............................................................................... 1
1.2.2. Yêu cầu của đề tài ................................................................................. 2
1.3.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................. 2

1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................. 2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................... 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
2.1.

Nguồn gốc, xuất xứ của chi Bacillus .................................................... 3

2.2.

Đặc điểm hình thái, cấu trúc của chi Bacillus....................................... 3

2.3.

Đặc điểm di truyền của chi Bacillus ..................................................... 4

2.4.

Vai trò của chi Bacillus ......................................................................... 5

2.4.1. Ứng dụng của Bacillus trong cơng nghiệp hóa chất ............................. 5
2.4.2. Ứng dụng của Bacillus trong sản xuất enzyme..................................... 5
2.4.3. Ứng dụng của Bacillus trong nông nghiệp, vật liệu sinh học và y học ...... 6
2.4.4. Kháng bệnh do hệ thống gây ra ............................................................ 8
2.4.5. Cơ chế thúc đẩy tăng trƣởng thực vật ................................................... 9
2.5.

Giới thiệu về FtsZ ............................................................................... 10

2.5.1. Vai trò của FtsZ................................................................................... 10
2.5.2. Cấu trúc đặc trƣng của FtsZ ................................................................ 10
iii


2.6.

Tình hình nghiên cứu trong nƣớc........................................................ 12

2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới...................................................... 14
PHẦN III. PHẠM VI, NỘI DUNG, ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .................................................................................... 17
3.1.

Phạm vi nghiên cứu............................................................................. 17

3.1.1. Thời gian nghiên cứu .......................................................................... 17
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 17
3.2.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................... 17

3.3.

Dữ liệu nghiên cứu .............................................................................. 17

3.4.

Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 17

3.4.1. Phƣơng pháp xác định và chú giải họ gene mã hóa FtsZ ở chi
Bacillus ................................................................................................ 17
3.4.2. Phƣơng pháp phân tích đặc tính của protein FtsZ ở chi Bacillus
Expaxy Protparam. .............................................................................. 19
3.4.3. Phƣơng pháp phân tích vị trí cƣ trú nội bào ....................................... 21
3.4.4.

Phƣơng pháp xây dựng mơ hình cấu trúc khơng gian của FtsZ ở chi

Bacillus................................................................................................ 22

3.4.5. Phƣơng pháp xây dựng cây phát sinh ................................................. 23
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 26
4.1.

Kết quả xác định và chú giải họ gen mã hóa FtsZ ở chi Bacillus...... 26

4.2.

Phƣơng pháp phân tích đặc tính của protein FtsZ ở chi Bacillus
bằng Expaxy Protparam. ..................................................................... 27

4.3.

Kết quả phân tích vị trí cƣ trú nội bào của protein FtsZ ở chi
Bacillus................................................................................................ 32

4.4.

Cấu trúc đặc trƣng cho FtsZ ở chi Bacillus ........................................ 34

4.5.

Kết quả xây dựng mơ hình cấu trúc khơng gian của FtsZ ở chi
Bacillus................................................................................................ 39

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................ 41
iv

5.1.

Kết luận ............................................................................................... 41

5.2.

Kiến nghị ............................................................................................. 41

DANH MỤC CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................... 42
Danh mục cơng trình đã cơng bố liên quan đến khóa luận ............................. 48

v


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Chữ
viết tắt

Thuật ngữ Tiếng Anh

Hiếu khí mang bào tử

ASB
B

Thuật ngữ Tiếng Việt

Bacillus

Bacillus

CTL

C-terminal linker

CTT

C-terminal tail

CTV

C-terminal variable

II

Instability index

Độ bất ổn định

L

Length

Chiều dài (aa)

LB

Lipopeptide

mW

Molecular weight

Trọng lƣợng phân tử (kDa)

MK- 7 Menaquinone-7
National Center for
NCBI

Biotechnology
Information

NTP
pI

gia

N-terminal peptide
Theoretical pI
Systemic

SAR

Trung tâm thơng tin Cơng nghệ Sinh học Quốc

resistance

acquired

Điểm đẳng điện
Tính kháng tập nhiễm hệ thống

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Những tham số ClustalW ................................................................... 24
Bảng 3.2: Những phân tích ƣu tiên ..................................................................... 24
Bảng 4.1. Thơng tin của họ gene FtsZ ở chi Bacillus ......................................... 26
Bảng 4.2. Đặc tính cơ bản của FtsZ ở chi Bacillus ............................................. 28
Bảng 4.3: Phân tích vị trí cƣ trú nội bào của nhóm FtsZ ở Bacillus ................... 33

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Mặt cắt ngang của bào tử Bacillus (Peter CB Turnbull Bacillus
1996) ..................................................................................................... 4
Hình 2.2. Cấu trúc tinh thể và các vùng chức năng của FtsZ ............................. 12
Hình 3.1. Phần mềm NCBI ................................................................................. 18
Hình 3.2: Phần mềm Blast protein ...................................................................... 18
Hình 3.3: Thơng tin các họ gen ........................................................................... 19
Hình 3.4: Phƣơng pháp xác định và chú giải họ gene mã hóa FtsZ ở chi
Bacillus................................................................................................ 19
Hình 3.5. Cơ sở dữ liệu Expasy - Protparam ...................................................... 20
Hình 3.6. Phƣơng pháp phân tích đặc tính lý hố của nhóm ftsZ ở chi
Bacillus................................................................................................ 21
Hình 3.7. Sơ đồ các bƣớc tiến hành phân tích vùng promoter của ftsZ ở lồi
Bacillus................................................................................................ 23

Hình 3.8. Phƣơng pháp phân nhóm FtsZ bằng cơ sở dữ liệu trên MEGA 11. .. 25
Hình 4.1. Biểu đồ kích thƣớc và trọng lƣợng phân tử của họ gene ftsZ ở chi
Bacillus................................................................................................ 29
Hình 4.2. Biểu đồ điểm đẳng điện của họ gene ftsZ ở chi Bacillus.................... 30
Hình 4.3. Biểu đồ độ bất ổn định của họ gene ftsZ ở chi Bacillus ..................... 30
Hình 4.4. Biểu đồ chỉ số béo và độ ƣa nƣớc của họ gene ftsZ ở chi Bacillus .... 31
Hình 4.5. Vùng chức năng NTP .......................................................................... 36
Hình 4.6. Vùng chức năng CTV ......................................................................... 36
Hình 4.7. Vùng chức năng CTT .......................................................................... 37
Hình 4.8. Vùng chức năng GTP .......................................................................... 38
Hình 4.9. Vùng chức năng CTL .......................................................................... 38
Hình 4.10. Mơ hình cấu trúc của 19 FtsZ chƣa biết chức năng ở chi Bacillus .. 39
Hình 4.11. Tỷ lệ của các tiểu đơn vị alpha và beta trong các protein FtsZ ở
Bacillus................................................................................................ 40
viii


TĨM TẮT
Các protein FtsZ đã đƣợc đặc trƣng hóa để đóng vai trị quan trọng trong
q trình phân chia tế bào. Ở đây, em đã báo cáo một phân tích tồn diện về các
protein FtsZ trong nhóm chi Bacillus bằng các phƣơng pháp tin sinh học. Kết
quả là, em đã xác định và mô tả các protein FtsZ trong 19 lồi Bacillus. Kích
thƣớc và trọng lƣợng của các protein FtsZ trong nhóm chi Bacillus lần lƣợt nằm
trong khoảng từ 376 đến 410 aa và từ 39,53 đến 44,15 kDa. Tất cả các protein
FtsZ trong lồi Bacillus đều có tính axit và hình cầu và đƣợc định vị trong tế bào
chất. Tiếp theo, mơ hình cấu trúc 3D và nhiều căn chỉnh đã đƣợc thực hiện. Em
nhận ra rằng các protein FtsZ trong loài Bacillus thể hiện năm vùng chức năng
cụ thể. Kết hợp lại với nhau, nghiên cứu của em có thể cung cấp một nền tảng
vững chắc để mơ tả thêm đặc tính chức năng của các protein FtsZ liên quan đến
quá trình phân chia tế bào.

ix


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Phân chia tế bào đã đƣợc biết đến nhƣ một quá trình quan trọng đối với
tồn bộ sinh vật sống. Về cơ bản, sự phân chia tế bào ở các loài vi khuẩn đƣợc
sắp xếp bởi một bộ phận phân chia. Trong bƣớc này, FtsZ, một guanosine-5′triphosphatease (GTPase) hình thành polyme, thúc đẩy q trình phân chia tế
bào vi khuẩn (Lưwe & Amos, 1998). Đặc biệt, các protein fztsZ đóng vai trị
nhƣ một cơng cụ điều hịa q trình hình thành q trình phân chia và tế bào
học, khi nó tập hợp thành các sợi nguyên sinh để tạo nên một khuôn mẫu giống
nhƣ chiếc nhẫn (Mcquillen & Xiao, 2020). Các protein ftsZ ở các loài vi khuẩn
đƣợc báo cáo là chia sẻ cách thức tƣơng tự với các tubulin trong các tế bào nhân
chuẩn (Nogales et al., 1998).
Chi Bacillus biểu thị một loại vi khuẩn gram dƣơng, hình thành bào tử, hình
que và hiếu khí. Chi này có thể đƣợc phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ đất
(hầu hết), khơng khí, nƣớc, ruột, động vật, rau và thực phẩm (Elshaghabee et al.,
2017). Ở quy trình mơ phân tử, q trình phân chia tế bào, đặc biệt là các protein
ftsZ của các nhóm chi này chƣa đƣợc mơ tả đầy đủ.
Xuất phát từ thực tiễn đó, tơi thực hiện đề tài: “Phân tích mơ hình và tính
bảo thủ trong cấu trúc gen ftsZ ở chi Bacillus bằng tin sinh học”. Nghiên cứu
này đƣợc thực hiện nhằm mơ tả tồn diện các protein ftsZ đƣợc tìm thấy trong
nhóm chi Bacillus.
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục đích của đề tài
Nghiên cứu này đƣợc thực hiện nhằm tìm hiểu mức độ biểu hiện gene mã
hóa ftsZ ở chi Bacillus từ đó góp phần bổ sung dữ liệu về nhân tố phiên mã ftsZ
liên quan đến vi sinh vật trong tiến hóa.

1


1.2.2. Yêu cầu của đề tài
- Xác định và chú giải họ gene mã hoá ftsZ ở chi Bacillus.
- Phân tích đặc tính của protein ftsZ ở chi Bacillus.
- Phân tích vị trí cƣ trú nội bào của protein ftsZ ở chi Bacillus.
- Xây dựng mơ hình cấu trúc khơng gian của ftsZ ở chi Bacillus.
1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của nghiên cứu này có thể cung cấp những dẫn liệu khoa học
quan trọng cho việc tìm hiểu gene mã hóa FtsZ liên quan đến q trình tiến hoá
của chi Bacillus.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Là cơ sở cho thấy chức năng gen FtsZ của chi Bacillus nhằm phục vụ đời
sống.

2


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Nguồn gốc, xuất xứ của chi Bacillus
Chi Bacillus thuộc họ Bacillaceae. Họ Bacillaceae bao gồm các vi khuẩn
hình que hình thành nội bào tử, có hai phân bộ chính: vi khuẩn hình thành bào tử
kỵ khí thuộc chi Clostridium và vi khuẩn hình thành bào tử kỵ khí hoặc hiếu khí
thuộc chi Bacillus thƣờng đƣợc gọi là ASB (hiếu khí mang bào tử). Chi Bacillus
đƣợc Cohn thành lập năm 1872 và bao gồm hơn 200 lồi và phân lồi đƣợc mơ
tả thuộc ngành Firmicutes.
2.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của chi Bacillus

Dựa trên các đặc điểm hình thái, vi khuẩn thuộc chi này đƣợc mơ tả là
hình que, gram dƣơng, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý và dƣơng tính với catalase. Do
khả năng sinh lý rộng và khả năng hình thành nội bào tử, Bacillus spp. có khả
năng chống lại các điều kiện môi trƣờng bất lợi từ cát sa mạc và suối nƣớc nóng
đến đất Bắc Cực từ nƣớc ngọt đến trầm tích biển. Hầu hết các lồi Bacillus là
lồi hoại sinh. Chi này bao gồm các đại diện ƣa nhiệt, ƣa lạnh, ƣa axit, ƣa kiềm,
ƣa mặn và ƣa mặn có khả năng phát triển ở nhiệt độ, giá trị pH và nồng độ muối
mà ở đó ít sinh vật khác có thể tồn tại.
Hình 2.1 cho thấy cấu trúc của một nội bào tử Bacillus tổng quát (chi tiết
về cấu trúc khác nhau giữa các loài). Một bào tử đƣợc sản xuất trên mỗi tế bào
sinh dƣỡng. Nguyên sinh chất trung tâm hay còn gọi là tế bào mầm, mang các
thành phần cấu tạo của tế bào sinh dƣỡng trong tƣơng lai, kèm theo axit
dipicolinic, chất cần thiết cho khả năng chịu nhiệt của bào tử. Bao quanh nguyên
sinh chất là một vỏ não bao gồm phần lớn peptidoglycan (murein), chất này
cũng rất quan trọng trong việc kháng nhiệt và bức xạ của bào tử. Lớp bên trong,
màng vỏ hoặc thành nguyên sinh chất, trở thành thành tế bào của tế bào sinh
dƣỡng mới khi bào tử nảy mầm. Các lớp áo bào tử, chiếm tới 50% thể tích của
bào tử, bảo vệ nó khỏi hóa chất, enzym,...

3


Hình 2.1: Mặt cắt ngang của bào tử Bacillus
(Peter CB Turnbull Bacillus 1996)
2.3. Đặc điểm di truyền của chi Bacillus
Một số vi khuẩn, chẳng hạn nhƣ Bacilli và Clostridia , đƣợc biết là phát
triển bào tử. Đây là những dạng sống không hoạt động, không hoạt động và
không hoạt động về mặt chuyển hóa, có khả năng tồn tại trong điều kiện khắc
nghiệt ( Hilbert và Piggot 2004 ).
Bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dƣỡng đầy đủ chức năng khi gặp

điều kiện thuận lợi. Ở Bacillus subtilis , đƣợc cho là sinh vật mơ hình bào tử có
đặc điểm tốt nhất, sự phát triển của bào tử kéo dài trong vài giờ và đòi hỏi sự
phối hợp không gian và thời gian để biểu hiện hàng trăm gen ( Hilbert và Piggot
2004). Các gen tạo bào tử rất đa dạng về cấu trúc và chức năng (hệ thống truyền
tín hiệu, các yếu tố sigma và các chất điều hịa phiên mã, các enzym chuyển hóa
và các protein cấu trúc của lớp phủ bào tử), bởi vì sự phát triển của bào tử địi
hỏi phải cấu hình lại hồn tồn vỏ tế bào và q trình trao đổi chất. Hiểu biết
về B. subtilis sporulation khá rộng rãi, nhƣng chƣa đầy đủ và các gen tạo bào tử
mới vẫn đang đƣợc xác định ( Traag et al. 2013 ; Meeske et al. 2016 ).
Mặc dù có sự đa dạng về cấu trúc và chức năng, các gen tạo bào tử đều
đóng góp vào một chƣơng trình phát triển chung. Theo nghĩa đó, bào tử tƣơng tự
nhƣ q trình phát triển ở các sinh vật đa bào, nơi mà sự biểu hiện của hàng
nghìn gen đa dạng về chức năng cần đƣợc điều chỉnh theo thời gian và không
gian ( Hilbert và Piggot 2004 ; Yanai 2018 ). Trƣớc đây, ngƣời ta đã chỉ ra rằng
lịch sử tiến hóa của một gen có liên quan chặt chẽ với các hạn chế về biểu hiện
4


và chức năng sinh học, do nó ảnh hƣởng đến mức độ tích hợp gen vào mơi
trƣờng tế bào ( Domazet-Lošo và Tautz 2010 ; Capra et al. 2013). Những tiến
bộ gần đây trong sinh học máy tính giúp chúng ta có thể khám phá các mối
liên hệ tiềm năng giữa tiến hóa gen và tiến hóa chức năng. Với phƣơng pháp
phân tích thực vật bộ gen, tuổi gen có thể đƣợc suy ra bằng cách xem xét một
nhóm gen chính thống để đại diện cho các dịng con của nút xác định sâu
nhất, hoặc là kết quả của sự khác biệt giữa hai nhóm tƣơng đồng xa nhất
( Domazet-Loso et al. 2007). Do đó, phân tích phylostratigraphy của bất kỳ
bộ gen nhất định nào sẽ phân loại các gen của nó thành phylostrata (PS), mỗi
gen chứa các gen có họ protein xuất hiện tại một nút cụ thể (thời điểm) trong
cây sự sống. Sau đó, tuổi của một gen đƣợc xác định là tổ tiên chung gần đây
nhất của lồi đƣợc tìm thấy trong phylostratum đó. Dựa trên các phân tích

phylostratigraphy nhƣ vậy, một số tác giả quy định rằng nếu một chức năng
sinh học mới xuất hiện tại một thời điểm nhất định trong q trình tiến hóa,
thì các gen liên quan đến chức năng đó sẽ đƣợc làm giàu trong phylostratum
tƣơng ứng. Phát hiện này đã đƣợc xác nhận trong các trƣờng hợp chẳng hạn
nhƣ phát triển ung thƣ ở Metazoa ( Trigos et al. 2017 ) và phát triển hệ thống
giác quan ở động vật có xƣơng sống ( Sestak et al. 2013 ).
2.4. Vai trò của chi Bacillus
2.4.1. Ứng dụng của Bacillus trong công nghiệp hóa chất
Ứng dụng của B. subtilis trong cơng nghiệp đã phát triển nhanh chóng
trong những thập kỷ qua và nó đã trở thành nhà máy sản xuất tế bào vi sinh vật
chính cho nhiều sản phẩm cơng nghiệp (Schallmey M et al. 2004), bao gồm
enzyme , kháng sinh, vitamin, axit amin. Các chất hóa học do B. subtilis sản
xuất cũng đóng vai trị quan trọng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ thực
phẩm, thức ăn chăn ni, mỹ phẩm, hóa chất và dƣợc phẩm.
2.4.2. Ứng dụng của Bacillus trong sản xuất enzyme
Do B. subtilis phát triển nhanh chóng trên chất nền rẻ tiền, mạnh mẽ, khả
năng tiết protein, không gây bệnh và q trình xử lý xi dịng thuận lợi, B.
5


subtilis đã trở thành một máy chủ biểu hiện lý tƣởng để sản xuất các loại
enzyme công nghiệp khác nhau. Theo thống kê chƣa đầy đủ, enzyme đƣợc sản
xuất bằng B. subtilis chiếm 50% tổng thị trƣờng enzyme (Schallmey M et al.
2004). Nhiều enzym đã đƣợc thể hiện thành công trong B. subtilis, bao gồm cả
amylase, xylanase, lichenase, β-galactosidase (Watzlawick H et al. 2019),
cellulase, protease serine kiềm, và nhiều loại khác. Enzyme đóng vai trị quan
trọng trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, chất tẩy rửa, công nghiệp dệt may, da,
giấy và dƣợc phẩm.
Do trạng thái GRAS của nó, protease từ B. subtilis có thể đƣợc sử
dụng trong các ứng dụng thực phẩm khác nhau, chẳng hạn nhƣ chuẩn bị

thủy phân đậu nành, làm mềm thịt, thủy phân casein, đông tụ sữa và xử lý
chất thải thực phẩm.
2.4.3. Ứng dụng của Bacillus trong nông nghiệp, vật liệu sinh học và y học
Vì là một loại lợi khuẩn khơng gây bệnh nên B. subtilis thƣờng đƣợc sử
dụng làm phụ gia vi sinh để cải thiện chức năng đƣờng ruột ở động vật. Nó đã
đƣợc tìm thấy giúp thúc đẩy tăng trƣởng động vật và ngăn ngừa bệnh tật (Lee
NK et al. 2019). Nó có thể đƣợc sản xuất ở dạng nội bào tử, sau đó đi vào đƣờng
ruột của động vật và nhanh chóng kích hoạt lại để tiết ra các protease có hoạt
tính cao nhƣ lipase và amylase trong đƣờng ruột trên, rất hữu ích để phân hủy
carbohydrate phức tạp trong thức ăn thực vật. Hơn nữa, B. subtilis có thể tạo
ra polypeptide có tác dụng đối kháng với mầm bệnh đƣờng ruột, cải thiện
hiệu quả khả năng tiêu hóa thức ăn. Ngồi ra, nó có thể đƣợc sử dụng trong
xử lý sinh học nƣớc và ngăn ngừa bệnh tật ở các sinh vật nuôi trồng thủy sản
nhƣ tôm và cá. Do B. subtilis là vi khuẩn hiếu khí, góp phần tạo nên mơi
trƣờng kỵ khí bằng cách tiêu thụ oxy trong ruột, từ đó thúc đẩy sự sinh sản
của vi khuẩn ƣu thế trong ruột, duy trì cân bằng sinh thái của đƣờng ruột.
B. subtilis có thể tiết ra nhiều loại peptide và bacteriocin kháng khuẩn
trọng lƣợng phân tử thấp, chẳng hạn nhƣ surfactin, bacilysin và subtilin, có giá
trị tiềm năng trong kỹ thuật y sinh, thực phẩm và nông nghiệp. Các peptide
6


kháng khuẩn từ B. subtilis là công cụ điều trị đầy hứa hẹn, vì hoạt tính rộng và
hoạt tính tiêu diệt nhanh chống lại nhiều loại mầm bệnh của chúng. Với các vấn
đề ngày càng gia tăng về tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật do việc sử dụng
kháng sinh thông thƣờng không hợp lý, các peptide kháng khuẩn sẽ đóng một
vai trị quan trọng hơn trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn. Peptide
kháng khuẩn cũng có ƣu điểm là an tồn và thân thiện với môi trƣờng. Chúng
đƣợc sử dụng rộng rãi làm phụ gia thức ăn chăn nuôi trong nông nghiệp và chăn
nuôi để tăng cƣờng tiêu hóa chất xơ động vật và sức khỏe đƣờng ruột. B.

subtilis có thể cải thiện sự cân bằng của hệ vi khuẩn đƣờng ruột và có khả năng
cải thiện sức khỏe đƣờng ruột, hiệu quả hấp thu thức ăn. Các nghiên cứu đã chỉ
ra rằng việc bổ sung bào tử B. subtilis vào thức ăn cho bò sữa có thể cải thiện
sản xuất sữa và protein (Souza VL et al.). Hơn nữa, bổ sung B. subtilis vào khẩu
phần ăn của gà đẻ có thể cải thiện năng suất cũng nhƣ chất lƣợng vỏ trứng của
gà đẻ.
Màng sinh học có cấu trúc gồm các tế bào liên kết chặt chẽ tạo thành
trạng thái phát triển chủ yếu của vi khuẩn trong môi trƣờng tự nhiên và nhân tạo
(Pisithkul T et al. 2019). Màng sinh học có thể đƣợc sử dụng để sản xuất các vật
liệu sống có chức năng tự phục hồi, đây là điều mong muốn đối với nhiều sản
phẩm (Huang J et al. 2019). B. subtilis có thể hình thành các màng sinh học
phức tạp và chắc chắn và là một chủng mẫu tốt để nghiên cứu sự hình thành
màng sinh học. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng màng sinh học dựa trên
cơ chế protein amyloid TasA ở B. subtilis thể hiện hành vi đàn hồi của
hydrogel. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng màng sinh học có thể đƣợc chế tạo
chính xác thành các vi cấu trúc ba chiều (3D) khác nhau thông qua công nghệ in
3D và vi nang. So với vật liệu hóa học, vật liệu sống nhân tạo này có hoạt động
trao đổi chất, khả năng tự đổi mới và khả năng lập trình. Ngồi ra, khả năng hình
thành màng sinh học của B. subtilis thúc đẩy quá trình tổng hợp pentapeptide
cảm ứng số tối thiểu và oxit nitric (NO), có thể trì hỗn sự lão hóa của vật chủ
(Kovacs AT et al. 2019). Sự hình thành màng sinh học cải thiện khả năng
7


chuyển hóa chất dinh dƣỡng và sản xuất hóa chất của vi sinh vật, và có thể đƣợc
sử dụng để cải thiện tính ổn định của q trình lên men. Các nghiên cứu gần đây
cho thấy rằng một lò phản ứng màng sinh học có thể thúc đẩy q trình bài tiết
MK-7 ngoại bào (Mahdinia E et al. 2019).
2.4.4. Kháng bệnh do hệ thống gây ra
Các cơ chế bảo vệ thực vật, chẳng hạn nhƣ tính kháng hệ thống cảm ứng

(ISR) có thể bắt đầu bởi các tác nhân bên ngồi trƣớc khi nhiễm bệnh hoặc đƣợc
kích hoạt bởi nhiễm trùng cục bộ, dẫn đến tính kháng hệ thống (SAR). Cả hai
yếu tố sinh học và phi sinh học đã đƣợc sử dụng để tạo ra ISR ở thực vật chống
lại các mầm bệnh khác nhau. ISR đƣợc thúc đẩy bởi vi khuẩn rhizobacteria
không gây bệnh và chủ yếu phụ thuộc vào dẫn tín hiệu jasmonate hoặc ethylen,
trong khi SAR đƣợc trung gian thơng qua q trình phụ thuộc vào axit salicylic.
SAR cũng kích hoạt các bộ gen liên quan đến phòng thủ cụ thể liên quan đến
việc sản xuất các protein liên quan đến sinh bệnh học, trong khi ISR khơng đi
kèm với việc kích hoạt các gen này. Khả năng phòng thủ do ISR làm trung gian
yếu hơn đáng kể so với khả năng phòng thủ mà SAR có đƣợc. Tuy nhiên, ISR
và SAR cùng nhau cung cấp sự bảo vệ tốt hơn, cho thấy rằng chúng có thể hoạt
động phụ gia trong việc gây ra khả năng kháng mầm bệnh.
Bacillus spp. có thể gợi ra ISR bằng cách gây ra sự tổng hợp các enzyme
bảo vệ chống oxy hóa. Các enzyme chủ do B. subtilis gây ra bao gồm peroxidase,
polyphenol oxidase, phenylalanine ammonia-lyase và superoxide dismutase. Tăng
tổng hợp các enzyme bảo vệ chống oxy hóa dẫn đến ISR chống lại bệnh sƣơng mai
sớm và muộn ở cây giống cà chua. Tƣơng tự, Rais et al. đã chỉ ra rằng Bacillus spp.
đã tăng cƣờng các hoạt động SOD, POX, PPO và PAL trong gạo bị nhiễm bệnh, do
đó, giảm bớt thiệt hại oxy hóa do Pyricularia oryzae gây ra và ngăn chặn tỷ lệ mắc
bệnh vụ nổ. Bacillus sp. ức chế bệnh thán thƣ của ớt bằng cách kích hoạt các
enzyme liên quan đến phịng thủ và sự tích tụ các hợp chất phenolic. Tƣơng
tự, Bacillus sp. tăng cƣờng thúc đẩy tăng trƣởng và bảo vệ chống lại Rhizoctonia
solani và Fusarium oxysporum bằng cách gợi ra các enzyme liên quan đến phòng
8


thủ (PAL, POX, PPO) trong đậu nành, trong khi B. subtilis có khả năng làm giảm
tỷ lệ mắc bệnh, thúc đẩy sự phát triển của cây con và tăng hoạt động của các
enzyme chống oxy hóa (POD, PPO, PAL) trong cây dƣa chuột. Sự cảm ứng
kháng Plasmopara halstedii của Bacillus sp. chủng đi kèm với sự tích tụ các

enzyme liên quan đến phòng thủ (PAL, POX, PPO) trong hƣớng dƣơng.
2.4.5. Cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật
Bacillus spp. tạo ra nhiều chất chuyển hóa có thể làm tăng khả năng cung
cấp chất dinh dƣỡng cho cây trồng, và do đó, trực tiếp thúc đẩy tăng trƣởng và
năng suất của cây. Hầu hết các chất dinh dƣỡng thiết yếu của cây trồng đƣợc
cung cấp thơng qua bón phân khống, một thực tế gây ra thiệt hại kinh tế lớn,
cũng nhƣ đặt ra những vấn đề đáng kể cho môi trƣờng. Việc sử dụng phân bón
sinh học có chứa N2- sửa chữa hoặc P-solubilizing Bacillus spp. là một cách tiếp
cận hợp lý để giảm các tác động tiêu cực của phân bón tổng hợp mà khơng ảnh
hƣởng đến an tồn thực phẩm. N2-cố định và P-solubilizing Bacillus spp. có liên
quan trực tiếp đến sự hấp thu chất dinh dƣỡng và thúc đẩy tăng trƣởng tiếp theo
ở các nhà máy khác nhau. Saeid et al. đã chỉ ra rằng dịch tiết hòa tan đƣợc tạo ra
bởi Bacillus (B. subtilis, B. megaterium, B. cereus) bao gồm các axit gluconic,
lactic, axetic và succinic, xác nhận mối tƣơng quan chặt chẽ giữa tổng nồng độ
axit hữu cơ và lƣợng phốt pho đƣợc giải phóng. Các phân lập của
B. megaterium, B. subtilis và B. simplex, thể hiện khả năng hòa tan P bằng cách
tạo ra axit axetic, propionic, isobutyric, isocaproic, caproic và heptanoic, và có
tác động tích cực đến sự nảy mầm của hạt và các thơng số tăng trƣởng sinh
dƣỡng của cà tím, hạt tiêu và cà chua (Tao et al) cho rằng P-solubilization và Pmineralization có thể cùng tồn tại trong cùng một chủng Bacillus. Tƣơng tự,
tiêm chủng với B. subtilis làm tăng sự phát triển của cây và tổng sự tích tụ P và
P hấp thu của cây dƣa chuột. Bacillus spp. có thể trực tiếp làm tăng năng suất
thực vật thông qua các cơ chế truyền đạt việc sản xuất phytohormone hoặc chất
điều hòa sinh trƣởng thực vật (PGRs), chẳng hạn nhƣ auxin, cytokinin,
gibberellins, ethylene và axit abscisic. Hormone thực vật là các chất hữu cơ ảnh
hƣởng đến sinh lý và sự phát triển của thực vật ở nồng độ rất thấp. Sinh tổng
9


hợp hormone thực vật bằng Bacillus spp. có liên quan trực tiếp đến việc thúc
đẩy tăng trƣởng tiếp theo ở các loại cây khác nhau.

2.5. Giới thiệu về FtsZ
2.5.1. Vai trị của FtsZ
Trong q trình phân chia tế bào, FtsZ tƣơng tác với các protein liên quan
đến màng khác nhƣ FtsW, FtsK, FtsQ và FtsI và giúp neo FtsZ vào màng tế bào
chất của vi khuẩn. FtsZ đƣợc báo cáo là một protein đƣợc bảo tồn cao với khối
lƣợng phân tử tƣơng đối là 40.000 và là ulƣỡng mặt trong eubacteria. Nó cũng
đƣợc tìm thấy trong các thành viên của Euryarchaea, lục lạp của thực vật và một
số ty thể. Thực vật bậc cao cũng đã đƣợc tìm thấy chứa hai họ tƣơng đồng FtsZ
riêng biệt dƣờng nhƣ đã phân kỳ sớm trong q trình tiến hóa của thực vật. Vi
khuẩn đột biến thiếu protein FtsZ không thể phân chia mà kéo dài thành dạng
sợi. FtsZ là một protein phân chia tế bào quan trọng ở sinh vật nhân sơ và đang
cho thấy ngày càng nhiều hứa hẹn nhƣ một mục tiêu để khám phá thuốc kháng
khuẩn. Protein FtsZ đã đƣợc dự đoán là một mục tiêu mạnh mẽ và đã đƣợc
nghiên cứu rộng rãi để phát hiện ra các tác nhân kháng khuẩn thế hệ tiếp theo có
thể đƣợc sử dụng để chống lại tình trạng kháng thuốc đối với các loại thuốc
thƣờng đƣợc sử dụng cho Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA),
bệnh lao và các bệnh nhiễm trùng qua trung gian vi sinh vật khác. Gen ftsZ đƣợc
coi là một gen phân chia tế bào thiết yếu ở nhiều vi khuẩn bao gồm cả E. coli và
ngƣời ta đã phát hiện ra rằng miền đầu cuối C cho FtsZ rất khác nhau cả về kích
thƣớc và sự liên kết giữa các loài vi khuẩn khác nhau. Cấu trúc bậc cao hơn của
protein FtsZ trong ống nghiệm bao gồm ruy băng, tấm và bó.
2.5.2. Cấu trúc đặc trưng của FtsZ
Đột biến nhạy cảm với nhiệt độ tạo sợi Z (FtsZ) lần đầu tiên đƣợc mô tả cho
Escherichia coli vào năm 1980, dựa trên phát hiện rằng nhiều thể đột biến khác
nhau của E. coli không thể phân chia mà phát triển thành sợi dài ở nhiệt độ không
cho phép là 42°C. Một thập kỷ sau, trong một nghiên cứu mang tính đột phá, Bi và
Lutkenhaus có thể chỉ ra rằng FtsZ tự lắp ráp thành cấu trúc dạng vòng tại vị trí
phân chia trong tƣơng lai, cấu trúc này phụ thuộc vào sự liên kết và quá trình thủy
10

phân sau đó của nucleotide guanosine-5′- triphotphat (GTP). Khả năng hiện diện
của các yếu tố khung tế bào trong tế bào vi khuẩn, có thể tƣơng tự về mặt chức
năng với vai trị của actin hoặc tubulin trong q trình phân bào ở tế bào nhân
chuẩn, đã thách thức quan điểm về vi khuẩn vào thời điểm đó và ủng hộ nhận thức
mới nổi rằng vi khuẩn không chỉ là một túi chứa đầy enzym, do đó kích hoạt vơ số
cuộc điều tra sâu hơn về FtsZ.
Năm 1998, Löwe và Amos đã báo cáo cấu trúc tinh thể đầu tiên của FtsZ,
cấu trúc này sau đó đƣợc tinh chế ở độ phân giải 1,7 Å (PDB: 1FSZ và 2VAP,
tƣơng ứng; ngân hàng dữ liệu protein, ). Phân giải dƣ lƣợng
axit amin 23-356 của FtsZ từ methanogen siêu ƣa nhiệt Methanocaldococcus
jannaschii (MjFtsZ, trƣớc đây là Methanococcus jannaschii; tổng chiều dài protein:
364 axit amin), cấu trúc tinh thể đầu tiên tiết lộ hai miền protein chính, cụ thể là
GTP đầu tận cùng N miền liên kết và miền đầu cuối C, và nó đã chứng minh cấu
trúc tƣơng đồng với tubulin protein tế bào nhân chuẩn (Hình 1A & B). Trong cả βtubulin và FtsZ, miền đầu cuối N bao gồm sáu tờ β đƣợc sắp xếp song song và
đƣợc bao quanh bởi các chuỗi xoắn ốc H1-H6. Miền đầu cuối C bao gồm bốn tờ β
đƣợc sắp xếp song song (S7–S10), đƣợc bao quanh bởi các chuỗi xoắn ốc H8-H10
và nó đƣợc kết nối với miền đầu cuối N thông qua chuỗi xoắn ốc trung tâm H7.
MjFtsZ mang thêm một chuỗi xoắn ốc H0 ở đầu N, khơng có trong tubulin và FtsZ
từ các sinh vật đƣợc mô tả khác. Hơn nữa, tubulin mang thêm hai xoắn ốc dài ở đầu
C (H11 + H12), trong khi MjFtsZ đƣợc đặc trƣng bởi vùng β-kẹp tóc nhỏ (S11 +
S12) ở vị trí này. Đáng chú ý, MjFtsZ cịn có một đi N dài hơn 30 axit amin nhơ
ra khỏi protein lõi hình cầu, ngắn hơn đáng kể ở các vi khuẩn khác bao gồm E. coli,
Pseudomonas

aeruginosa,

Bacillus

subtilis,

Streptococcus

Staphylococcus aureus và Mycobacterium tuberculosis.

11

pneumoniae,


Hình 2.2. Cấu trúc tinh thể và các vùng chức năng của FtsZ
(N Silber và cộng sự 2020)
2.6. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Trong nƣớc trƣớc đây, Võ Hồng Thi và cộng sự (2012) đã tiến hành
nghiên cứu hoạt tính protease của một số chủng Bacillus phân lập từ nƣớc
thải chế biến thịt và thủy hải sản. Từ nƣớc thải sản xuất giàu đạm của một vài
nhà máy chế biến thịt và thủy hải sản, đã lựa chọn đƣợc 10 chủng Bacillus có
khả năng phân giải protein tốt từ 30 chủng phân lập, bao gồm 7 chủng có
nguồn gốc từ nƣớc thải chế biến thủy sản và 3 chủng có nguồn gốc từ nƣớc
thải chế biến thịt. Kết quả khảo sát hoạt tính phân giải protein của 10 chủng
này cho thấy hoạt tính protease đạt cực đại sau 72 giờ nuôi cấy ở pH 7 và
500C. Những kết quả ban đầu này có thể đƣợc coi là cơ sở để triển khai
nghiên cứu ứng dụng khả năng xử lý nƣớc thải chế biến thịt và thủy hải sản
trong thực tế với các mức độ nƣớc thải ô nhiễm khác nhau của các tổ hợp
Bacillus tuyển chọn.
Cũng vào năm 2012, Nguyễn Quang Huy và cộng sự đã tiến hành phân
lập các chủng Bacillus có hoạt tính tạo màng sinh vật (Biofilm) và tác dụng
12

kháng khuẩn của chúng. Kết quả cho thấy đã phân lập hai chủng vi khuẩn ký
hiệu U1.3 và U3.7 có khả năng tạo biofilm. Cả hai chủng vi khuẩn đều có khả
năng tạo biofilm trong mơi trƣờng khống đƣợc bổ sung các nguồn nitơ và
cacbon khác nhau. Dựa vào đặc điểm hình thái và kết quả phân tích trình tự gen
16S rARN cho thấy cả hai chủng U1.3 và U3.7 đều thuộc chi Bacillus trong đó
U1.3 gần với lồi Bacillus subtilis cịn chủng U3.7 gần với lồi Bacillus
velezensis. Hai chủng vi khuẩn phân lập có khả năng ức chế sự phát triển một số
vi khuẩn có hại nhƣ E. coli, Samonella sp., Phytophthora sp. và Rastonia sp.
Năm 2017, Nguyễn Hoàng Anh và cộng sự đã tiến hành phân lập, tuyển
chọn vi khuẩn Bacillus spp từ dạ cỏ bị có khả năng sinh enzyme β- glucanase và
bƣớc đầu xác định đặc tính của enzyme. Kết quả cho thấy, đa số các chủng
Bacillus spp phân lập đƣợc đều có khả năng sinh enzyme β- glucanase ngoại
bào, trong đó chủng PX.07 có hoạt độ enzyme cao nhất đạt 6,8 U/l. Enzyme βglucanase từ dịch nuôi cấy của chủng này đƣợc tinh sạch bằng (NH4)2SO4 50%
nồng độ bão hịa để xác định đặc tính. Nhiệt độ và pH tối ƣu của enzyme tƣơng
ứng là 600C và pH 6. Enzyme bền trong khoảng nhiệt độ 30 - 600C và pH từ 3 6.
Năm 2019, Huỳnh Thị Cẩm Tiên và cộng sự đã phân lập và định danh
một số chủng Bacillus spp có hoạt tính cao trong tầng đất mặt đƣợc thu thập từ
tỉnh Bình Thuận. Kết quả phân lập đƣợc 3 chủng vi khuẩn thuộc các loài
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis và Bacillus subtilis. Đánh giá
hoạt tính cho thấy các chủng vi khuẩn thu đƣợc có khả năng phân giải cenllulose
và protein tƣơng đối cao, trong khi độ phân giải phosphate ở mức độ trung bình.
Thử nghiệm kết hợp còn cho thấy 3 chủng vi khuẩn thu đƣợc khơng có tính đối
kháng nhau.
Năm 2020, Trần Thùy Trang và cộng sự đã tiến hành phân lập và tuyển
chọn chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis có khả năng đối kháng tốt
với nấm Colletotrichum scovillei gây bệnh thán thƣ trên ớt ở Thành phố Hồ
Chí Minh. Sau khi thu thập đƣợc 5 mẫu đất, nghiên cứu này đã phân lập đƣợc
13

22 chủng nghi ngờ thuộc nhóm Bacillus subtilis. Trong đó, chủng vi khuẩn
BHCM8.3 có khả năng đối kháng mạnh nhất với nấm Colletotrichum scovillei
trên đĩa Petri (hiệu quả đối kháng là 81,58% sau 15 ngày khảo sát). Kết quả
định danh sinh học phân tử dựa trên vùng 16 ribosomal DNA (rDNA) cho
thấy trình tự chủng BHCM8.3 có độ tƣơng đồng gần với vi khuẩn B. subtilis
(100%).
Năm 2021, Nguyễn Thị Lâm Đồn và cộng sự đã nghiên cứu một số đặc
tính của vi khuẩn Bacillus phân lập từ nƣớc thải làng nghề bún Phú Đô. Từ mẫu
nƣớc thải làng nghề sản xuất bún Phú Đơ, nhóm nghiên cứu đã thu đƣợc 66
chủng Bacillus nhằm từng bƣớc xây dựng bộ sƣu tập các chủng thuộc chi quan
trọng này. Trong số 66 chủng có 26 chủng sinh cả ba enzyme ngoại bào
amylase, protease, celullase với đƣờng kính vịng phân giải cơ chất lớn lần lƣợt
là 18,3, 20,8 và 20,9mm. Bằng phƣơng pháp nhuộm tím tinh thể đã xác định
đƣợc 4 chủng (NTB2.1, NTB2.3, NTB2.11, NTB5.7) có khả năng tạo màng sinh
vật (biofilm) tốt với OD570nm ≥ 3,17. Các chủng này ngoài khả năng sinh
enzyme và tạo biofilm tốt cịn có khả năng kháng một số chủng vi khuẩn gây
bệnh E. coli và Salmonella typhimurium và chúng khơng đối kháng nhau.
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 2008, Ramanujam Srinivasan và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu
“Protein phân chia tế bào vi khuẩn FtsZ tập hợp thành các vòng tế bào chất
trong nấm men phân hạch. Trong quá trình phân bào, hầu hết các vi khuẩn lắp
ráp một cấu trúc giống nhƣ vòng bao gồm FtsZ tƣơng đồng tubulin. Các cơ chế
điều chỉnh việc lắp ráp và tổ chức các phân tử FtsZ thành các vòng vẫn chƣa
đƣợc hiểu đầy đủ. Tiến hành biểu hiện FtsZ của vi khuẩn trong nấm men phân
hạch Schizosaccharomyces pombe và thấy rằng các sợi FtsZ tập hợp thành các
vòng tế bào chất. Điều tra về Escherichia coli FtsZ cho thấy rằng sự lắp ráp
vòng xảy ra bởi một q trình đóng và/hoặc cuộn các bó tuyến tính. Kết quả cho
thấy rằng các vịng FtsZ có thể lắp ráp trong trƣờng hợp khơng có tất cả các

14