Nghiên cứu nhân nhanh và ra rễ in vitro của cây hà thủ ô đỏ (polygonum multiflorum thumb)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------- -------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH VÀ RA RỄ IN VITRO CỦA
CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonum multiflorum Thunb.)”

HÀ NỘI – 2022


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------- -------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH VÀ RA RỄ IN VITRO CỦA
CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonum multiflorum Thunb.)”

Người thực hiện

: Nguyễn Trung Hiếu

Mã sinh viên

: 637026

Khóa

: K63

Khoa

: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn

: TS. Nông Thị Huệ

HÀ NỘI – 2022


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan kết quả và số liệu của đề tài “Nghiên cứu nhân nhanh
và ra rễ in vitro của cây Hà thủ ô đỏ” là công trình nghiên cứu độc lập qua việc
tự nghiên cứu, tìm tài liệu cùng với sự hướng dẫn của TS. Nông Thị Huệ và khơng
có bất kì sự sao chép của nguồn nào khác, chưa có cơng bố trong bất kì một cơng
trình nghiên cứu nào. Trong bài báo cáo có sử dụng một số nguồn tài liệu tham
khảo đã được trích dẫn nguồn và chú thích rõ ràng.
Em hồn tồn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ sinh học, bộ môn
Công nghệ Sinh học Thực vật và nhà trường về sự cam đoan này.
Hà Nội, ngày 9 tháng 9 năm 2022
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trung Hiếu

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin cảm ơn sâu sắc tới cơ TS. Nơng Thị Huệ đã tận tình
hướng dẫn, phân tích và tận tâm giúp đỡ trong suốt q trình làm khóa luận.
Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô trong khoa Công
nghệ sinh học nói chung và thầy cơ tại Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học Thực vật nói
riêng đã trực tiếp giảng dạy truyền đạt những kiến thức hữu ích trong thời gian
học tập tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Em cũng bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt
Nam đã tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài này.
Cuối cùng, em gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người thân đã luôn ở
bên giúp đỡ, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc để tơi hồn thành bài
khóa luận này.
Hà Nội, ngày 9 tháng 9 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Trung Hiếu

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................. vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... vii

TÓM TẮT.................................................................................................................... viii
PHẦN 1: MỞ ĐẦU .........................................................................................................1
1.1

Tính cấp thiết của đề tài .....................................................................................1

1.2

Mục đích .............................................................................................................2

1.3

Yêu cầu ...............................................................................................................2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................3
2.1

Giới thiệu chung về cây hà thủ ô đỏ ...................................................................3

2.1.1

Nguồn gốc ..........................................................................................................3

2.1.2

Phân loại .............................................................................................................3

2.1.3

Công dụng của cây Hà thủ ô đỏ .........................................................................4

2.1.4

Đặc điểm, hình thái ............................................................................................5

2.1.5

Phân bố, sinh thái, thu hoạch ..............................................................................6

2.1.6

Tổng quan các phương pháp nhân giống cây Hà thủ ô đỏ .................................7

2.1.7

Tổng quan các chất hóa học được dùng .............................................................7

2.1.8.

Tình hình nhân giống in vitro trong nước và thế giới ........................................8

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................11
3.1

Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................11

3.1.1

Vật liệu .............................................................................................................11

3.1.2

Hóa chất và dụng cụ .........................................................................................11

3.1.3

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................................11

3.2

Nội dung và phương pháp nghiên cứu .............................................................12

3.3

Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................14

3.3.1

Phương pháp chuẩn bị vật liệu .........................................................................14

iii


3.3.2

Phương pháp chuẩn bị mẫu nhân nhanh...........................................................14

3.3.3

Chuẩn bị môi trường MS ..................................................................................14

3.3.4

Phương pháp nhân nhanh và quy trình thực hiện .............................................14

3.3.5

Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu ...............................................15

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................16
4.1

Nghiên cứu nhân nhanh in vitro chồi cây Hà thủ ô đỏ .....................................16

4.1.1

Ảnh hưởng của BA-αNAA đến nhân nhanh chồi in vitro cây Hà thủ ô đỏ .....16

4.1.2

Ảnh hưởng của Kinetin và α-NAA đến nhân nhanh chồi in vitro cây
Hà thủ ô đỏ .......................................................................................................19

4.2

Nghiên cứu ra rễ in vitro cây Hà thủ ô đỏ ........................................................22

4.2.1

Ảnh hưởng của α-NAA đến ra rễ in vitro cây Hà thủ ô đỏ ..............................22

4.2.2

Ảnh hưởng của THT đến ra rễ in vitro cây Hà thủ ô đỏ ..................................25

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................28
5.1

Kết luận ............................................................................................................28

5.2

Kiến nghị ..........................................................................................................28

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................29
PHỤ LỤC ......................................................................................................................31

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của BA-αNAA đến nhân nhanh chồi in vitro cây Hà thủ
ô đỏ (sau 4 tuần nuôi cấy) ................................................................. 16
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của Kinetin và α-NAA đến nhân nhanh chồi in vitro cây
Hà thủ ô đỏ (sau 4 tuần nuôi cấy) ..................................................... 19
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ cây Hà thủ ô đỏ (sau 4
tuần nuôi cấy) .................................................................................... 22
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của THT đến ra rễ in vitro cây Hà thủ ô đỏ (sau 4 tuần
nuôi cấy) ............................................................................................ 25

v


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1: Cây hà thủ ơ đỏ ................................................................................... 5
Hình 2.2: Các bộ phận cây Hà thủ ơ đỏ .............................................................. 6
Hình 3.1: Cây Hà thủ ơ đỏ in vitro.................................................................... 11
Hình 4.1: Chồi Hà thủ ơ đỏ trên mơi trường có bổ sung BA và BA-αNAA
sau 4 tuần .......................................................................................... 18
Hình 4.2: Chồi Hà thủ ơ đỏ trên mơi trường có bổ sung Kinetin và αNAA
sau 4 tuần .......................................................................................... 21
Hình 4.3: Hình ảnh rễ của cây Hà thủ ơ đỏ trên mơi trường bổ sung α-NAA
sau 4 tuần .......................................................................................... 24
Hình 4.4: Hình ảnh rễ của cây Hà thủ ơ đỏ trên môi trường bổ sung THT sau
4 tuần ................................................................................................. 27

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
αNAA

Alpha Naphathaleneasetic Acid

Ki

Kinetin

BA

6- benzyladenine

MS

Môi trường nuôi cấy cơ bản theo
Murashige và Skoog (1962)

THT

Than hoạt tính

GOT

Glutamat Oxaloacetat
Transaminase

GPT

Glutamat Pyruvat Transaminase

Lux

Đơn vị đo độ sáng cơ bản

BAP

6-benzylaminopurine

TDZ

Thidiazuron

2,4D

2,4-dichloropheneacetic acid

vii


TĨM TẮT
Cây Hà thủ ơ đỏ là lồi cây dược liệu quý có tên trong sách đỏ Việt Nam và
cần được bảo vệ.
Nghiên cứu này tập trung vào việc nghiên cứu các cơng thức khác nhau nhằm tìm
ra mơi trường nhân nhanh và ra rễ tốt nhất cho cây Hà thủ ô đỏ cho hệ số nhân
giống cao, chồi sinh trưởng khỏe mạnh, cây có bộ rễ tốt khỏe nhằm tăng cường
khả năng sống sót khi đưa cây ra vườn ươm. Dựa trên các kết quả đã thu được
thông qua các thí nghiệm nhân ni in vitro trên cây Hà thủ ô đỏ, chúng tôi rút ra
các điều kiện tối ưu nhất bao gồm:
1. Môi trường nhân nhanh chồi tốt nhất: MS + 1mg/L BA + 0,4mg/L αNAA với
hệ số nhân chồi đạt 17,2 chồi/mẫu và chiều cao trung bình là 4,25cm, lá xanh,
thân mập.
2. Môi trường ra rễ tốt nhất MS + 0,25mg/L αNAA cho tỷ lệ ra rễ đạt 100%, chiều
dài rễ trung bình là 11,75cm và số rễ trên mẫu trung bình là 7,55 rễ\mẫu, rễ dài,
màu trắng.

viii


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora Thunb.) thuộc họ rau răm
(polygonacease) là cây dược liệu quý có tên trong Sách đỏ Việt Nam cần được
bảo vệ. Trên thế giới nhiều nước như Trung Quốc hay Nhật Bản cũng sở hữu
giống cây thuốc quý này. Ở Việt Nam, thì giống cây này phổ biến ở vùng Lai
Châu, Hịa Bình, Sơn La, Lào Cai,...
Ngồi các cơng dụng thơng thường qua các bài thuốc cổ truyền như bổ
máu, chữa suy thận, chữa bạc và rụng tóc sớm, mẩn ngứa, khí hư, đau lưng mỏi
gối,..Ngày nay với rất nhiều hợp chất hóa học được tách chiết từ củ hà thủ ô đỏ
như quinon, flavonid, stibenes,...Trong y học hiện đại chúng được dùng trong điều
chế thuốc chống ung thư, chống lão hóa, chống viêm, điều hịa miễn dịch của cơ
thể. Hà thủ ơ đỏ được đánh giá là thuốc quý có giá trị rất cao cả về mặt công dụng
đối với sức khỏe con người cũng như giá trị kinh tế.
Thực trạng ngày nay hà thủ ơ đỏ ngồi tự nhiên đang suy giảm nghiêm
trọng cả về số lượng lẫn chất lượng do quá trình khai thác cũng như bảo tồn chưa
tốt dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng và ảnh hưởng đến nguồn cung dược liệu q của
con người.
Chính vì vậy, mà một số tỉnh đã đưa ra các dự án trồng Hà thủ ô đỏ để cung
cấp nguồn dược liệu mà thị trường cần, xong việc trồng Hà thủ ô đỏ này vẫn áp
dụng phương pháp truyền thống như giâm cành hoặc trồng bằng hạt. Phương pháp
này cho hệ số nhân thấp, cây phát triển kém, phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết. Khác
với các phương pháp trên, đó là phương pháp nhân giống Hà thủ ơ đỏ in vitro sẽ
cho cây giống có chất lượng cao với tỉ lệ các chất emodin, physcion cao hơn so
với cây tự nhiên (Chang Lin et al., 2003). Đến nay cũng có một số cơng trình cơng
bố về nhân gống cây Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp in vitro (Trần Thị Kim Thu,
2008; Trương Thị Bích Phượng và cộng sự, 2008; Hoàng Thị Kim Hồng); tuy
1


nhiên các báo cáo cho thấy hiệu quả nhân giống phụ thuộc vào nguồn gốc vật liệu
nuôi cấy, thành phần, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng sử dụng. Trong nuôi

cấy mô tế bào, các giống khác nhau nuôi trên cùng một mơi trường dinh dưỡng
thì khả năng tái sinh có thể khác nhau do sự khác biệt về kiểu gen.
Kế thừa các kết quả nghiên cứu về nhân nhanh in vitro trước đây trên cây
Hà thủ ô đỏ và với mục đích nâng cao hệ số nhân giống cũng như tạo cây hồn
chỉnh cho mục đích sản suất chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh
và ra rễ in vitro của cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora Thunb.)”
1.2 Mục đích
Nghiên cứu nhân nhanh để nâng cao hệ số nhân chồi cũng như tạo cây
hoàn chỉnh cho cây Hà thủ ô đỏ nhằm phục vụ cho công nghiệp dược liệu cũng
như bảo tồn giống thuốc tại Việt Nam.
1.3 Yêu cầu
- Xác định được ảnh hưởng của BA, Kinetin kết hợp với α-NAA trong nhân
nhanh chồi cây Hà thủ ô đỏ.
- Xác định được ảnh hưởng của α-NAA, than hoạt tính đối với ra rễ cho
chồi cây Hà thủ ô đỏ.

2


PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu chung về cây hà thủ ô đỏ
2.1.1 Nguồn gốc
Cây Hà Thủ ô đỏ có nguồn gốc từ Châu Á như: Nhật Bản, Trung Quốc (Tứ
Xuyên, Giang Tô, Quảng Tây, Phúc Kiến, Hồ Bắc). Tại Việt Nam, cây Hà Thủ ô
đỏ mọc nhiều nhất ở các tỉnh Tây Bắc như: Lào Cai, Lai Châu tiếp đến các tỉnh
Vĩnh Phúc, Cao Bằng, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đắk Lắk, Đắk Nông, Gia
Lai, Đà Lạt….
2.1.2 Phân loại
Cây Hà thủ ơ đỏ có tên khoa học là Fallopia multiflora Thunb. là một lồi
hà thủ ơ cây thân mềm, thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), bộ Cẩm chướng

(Caryophyllales), có tên gọi khác là Dạ giao đằng, Dạ hợp, Địa Tinh, Mằn năng
ón (Tày), Khua lìn (Thái), Xạ ú sí (Dao),… Cây Hà thủ ơ đỏ là một lồi dây leo
có vịng đời khá dài, sống lâu năm. Đặc điểm dễ nhận thấy của Hà thủ ô là thân
dây quấn, mọc xoắn vào nhau. Mặt ngoài thân cây hà thủ ơ đỏ có màu xanh tía,
nhẵn, có vân và có rễ phình thành củ. Lá cây Hà thủ ô đỏ mọc so le; mỏng và có
màu nâu nhạt; có cuống lá dài; phiến hình trái tim hẹp, đầu lá nhọn, mép lá nguyên
hoặc hơi lượn sóng. Hoa Hà thủ ô đỏ nhỏ, màu trắng, mọc thành chùm và có nhiều
nhánh. Hà thủ ơ đỏ có thể thu hoạch quanh năm nhưng tốt nhất là vào tháng 11 –
12. Cây được đào lên lấy rễ là chủ yếu.
Phân loại cây Hà thủ ô đỏ:
- Ngành (Division): Magnoliophyta
- Lớp (Class): Eudicots
- Bộ (Ordo): Caryophyllales
- Họ (Familia): Polygonaceae
- Chi (Genus): Fallopia
- Loài (Species): Fallopia multiflora (Đỗ Tất Lợi, 2013)
3


Cây Hà thủ ơ trắng ( Streptocaulo juventas Merr) cịn có tên gọi khác để
phân biệt với cây hà thủ ô đỏ như: dây mốc, cây đa lông, xạ ú pẹ (Dao), hà thủ ơ
nam, dây sữa bị, mã liên an, củ vú bị, cây sừng bị, chừa ma sìn (Thái), khau cần
cà (Tày). Đây là loại cây dây leo, thông thường người ta lấy rễ củ; một số nơi
dùng cả thân và lá cây. Hà thủ ô trắng là vị dược liệu có mùi thơm nhẹ, mang vị
đắng chát; thân lá có nhựa trắng.
2.1.3 Cơng dụng của cây Hà thủ ô đỏ
Theo y học cổ truyền, hà thủ ô đỏ có tác dụng nhuận tràng, bổ huyết, bổ
can thận, tiêu độc, mạnh gân xương, chủ trị các triệu chứng như râu tóc bạc sớm,
mất ngủ, táo bón, suy nhược thần kinh, tiêu hóa kém, cao huyết áp, tinh trùng yếu,
ho gà..

Theo nhiều nghiên cứu của y học hiện đại, hà thủ ơ đỏ có đa dạng cơng dụng, cụ
thể:
•

Nhuận tràng: Anthraglucozit và anthraquinon có trong hà thủ ơ đỏ có

cơng hiệu chính trong việc nhuận tràng. Hai hoạt chất này có khả năng kích
thích co bóp ruột, kích thích hệ tiêu hóa, tăng cường nhu động ruột giúp chống
táo bón và đi ngồi ra máu.
•

Giúp “xanh tóc”: Cơng dụng nổi tiếng của hà thủ ô đỏ là chữa rụng tóc,

tóc bạc sớm. Theo kinh nghiệm dân gian, trong vịng 1 - 2 tháng sau khi sử
dụng hà thủ ô đỏ tóc sẽ giảm rụng đến 80%; đối với tình trạng tóc bạc sớm, sau
3 - 4 tháng sử dụng sẽ giảm 20 - 30% tỉ lệ tóc bạc.
•

Bổ huyết chống suy nhược: khoa học đã chứng minh khả năng tăng hồng

cầu, cải thiện lưu thông máu lên não, giảm mất ngủ, mệt mỏi của hà thủ ơ đỏ.
•

Bảo vệ gan: Stiblen trong hà thủ ô đỏ giúp giải độc gan, chống oxy hóa,

tăng cường chức năng gan, ức chế enzyme GOT và GPT.

4

•

Kháng khuẩn, giảm mỡ máu: Resveratrol giúp kháng nấm, khuẩn và giảm

cholesterol trong máu; Trilycerde giúp chống xơ vữa động mạch, ngừa tai biến.
•

Tăng hoạt động estrogen: giúp phụ nữ cải thiện thiếu máu, khí hư bạch đới,

kinh nguyệt khơng đều, tăng sữa ở phụ nữ sau sinh.

Hình 2.1: Cây hà thủ ơ đỏ
2.1.4 Đặc điểm, hình thái
Cây Hà thủ ơ đỏ có đặc điểm hình thái sinh học được miêu tả như sau:
• Cây thuộc loại dây leo bằng thân quấn, sống lâu năm. Thân mềm, nhẵn,
mọc xoắn vào nhau.
• Lá có hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng hình mũi tên, gốc hình tim, đầu
thn nhọn, cuống lá dài khoảng 2cm, phủ lơng tơ, bẹ chìa ngắn, mỏng, có lơng
dài.
• Cụm hoa mọc thành chuỳ phân nhánh, mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành, dài hơn
lá; lá bắc ngắn; hoa nhỏ nhiều, màu trắng; nhị hình số 8, thường dính vào gốc của
bao hoa.

5


• Quả nhẵn bóng, hình 3 cạnh, nằm trong bao hoa phát triển thành những
cánh rộng.
• Rễ phình thành củ, giống củ khoai lang, màu nâu đỏ. Củ của cây Hà thủ ơ
đỏ có ruột màu hơi đỏ lát cắt ngang có hình giống những đám mây. Đây cũng

chính là phần có nhiều dược chất nhất và được dùng nhiều cho khám chữa bệnh.

Hình 2.2: Các bộ phận cây Hà thủ ô đỏ
(a) Lá Hà thủ ô.

(b) Củ Hà thủ ô.

(c) thân rễ Hà thủ ô.

(d) Thân dây Hà thủ ô

2.1.5 Phân bố, sinh thái, thu hoạch
Cây hà thủ ô mọc hoang ở rừng núi, nhiều nhất ở các tỉnh Tây Bắc sau đến
các tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, lào Cai, Lai Châu, Tây Nguyên. Một số
nước Châu Á cũng có cây hà thủ ơ sinh sống như Nhật Bản, Trung Quốc (Giang
Tô, Quảng Tây, Tứ Xuyên, Hồ Bắc, Phúc Kiến).
Cây Hà thủ ô đỏ ra hoa và quả nhiều hàng năm. Sau khi quả già, phần thân
leo trên mặt đất tàn lụi, hạt giống phát tán ra xung quanh và sẽ nảy mầm vào mùa
xuân và mùa hè năm sau. Cây có khả năng tái sinh vơ tính khỏe, từ một đoạn dây

6


đem vùi xuống đất hoặc các củ con, và các đoạn rễ cịn sót lại trong khi khai thác
thì đều có khả năng mọc lại cây mới.
Thu hái và chế biến: Bộ phận dùng làm thuốc của cây Hà thủ ô đỏ là rễ củ.
Thu hoạch quanh năm, tốt nhất là vào mùa thu đông, khi cây khô héo. Đào lấy rễ
củ, rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, đem phơi hay sấy nhẹ cho khơ (có thể đồ chín
trước khi làm khơ).
2.1.6 Tổng quan các phương pháp nhân giống cây Hà thủ ơ đỏ

• Giâm cành: việc cắt một đoạn cành (hoặc rễ) của cây Hà thủ ô đỏ rồi chuyển
sang một môi trường khác. Trong môi trường mới này có đủ dinh dưỡng,
cành đem giâm sẽ mọc rễ trước để tự ni thân rồi sau đó mới ra lá.
• Trồng bằng hạt: ta chỉ việc gieo hạt Hà thủ ơ đỏ vào đất sau đó đảm bảo
đầy đủ dinh dưỡng, hạt sẽ nảy mần và phát triển thành cây con.
• Nhân nhanh in vitro: sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực
vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của Hà thủ ơ đỏ có kích thước
nhỏ, sinh trưởng trong điều kiện vơ trùng trong các ống nghiệm hoặc trong
bình ni cấy khác.
2.1.7 Tổng quan các chất hóa học được dùng
MS1, MS2, MS3, MS4: các hợp chất cơ bản để pha môi trường MS.
Agar : Agar là một polysaccharide bao gồm galactose một loại đường đơn
giản. Khi được hòa tan trong nước ở nhiệt độ cao và sau đó được làm lạnh, nó sẽ
thu được độ sệt của gelatin. Đây là chất làm đơng Ms.
BA: 6-Benzyladenine, cịn được gọi là 6-benzylaminopurine, là một
cytokinin tổng hợp kích thích sự phân chia tế bào ở thực vật. Đây là chất kích
thích nảy chồi.
Ki: Kinetin là một chất chống oxy hóa ổn định, thuộc về một loại hormone
thực vật cụ thể được gọi là Cytokinin, đây là một lớp nhân tố điều hòa sinh trưởng,
thúc đẩy sự phân chia tế bào ở thực vật. Đây là chất kích thích nảy chồi.

7


αNAA: Là chất điều tiết sinh trưởng thực vật có tác dụng rộng, thúc đẩy sự
phân bào và phân hóa tổ chức, dùng để kích thích quả to, thân, rễ củ lớn to. Dẫn
đến hình thành rễ nhánh, rễ lá, dùng để tăng nhanh tốc độ ra rễ của hạt giống và
các cành ươm.
THT: Than hoạt tính (tên Tiếng Anh là Activeted Carbon): là một dạng của
Carbon được xử lý ở mơi trường yếm khí, để tăng diện tích bề mặt hấp thụ hoặc

các phản ứng hóa học. Than hoạt tính có bề mặt rất lớn từ 500 đến 2500m2/g.
2.1.8. Tình hình nhân giống in vitro trong nước và thế giới
• Thế giới
Việc nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ đã được tiến hành tuy nhiên còn
rất hạn chế. Các nghiên cứu trên đối tượng này tập trung chủ yếu vào việc tách
chiết thu nhận hoạt chất mục tiêu, phân tích thành phần hóa học (Bounda và
Feng, 2015).
Năm 2003, Li-Chang Lin đã tiến hành thí nghiệm về tạo chồi từ đoạn thân
mang mắt ngủ và thu được kết quả: Mẫu cấy đoạn thân mang mắt ngủ được nuôi
cấy in vitro trên mơi trường cơ bản của MS có chứa các nồng độ khác nhau của
αNAAvà BA. Các mẫu cấy đoạn thân mang mắt ngủ (97%) tạo ra nhiều chồi (4,7
chồi mỗi mẫu) trên môi trường cơ bản MS được bổ sung 0,2 mg/L NAA và 2,0
mg/L BA sau 6 tuần nuôi cấy. 88% đến 100% chồi (chiều dài 1,0 cm) kéo dài
(khoảng 3,02-4,28 cm) và ra rễ trên mơi trường cơ bản MS có bổ sung αNAA
hoặc axit indole-3-butyric (IBA). Tất cả các chồi rễ được chuyển sang chậu có
chứa đất đã được khử trùng, vermiculite, và rêu than bùn (1: 1: 1). Các cây con đã
được trồng và chăm sóc trong điều kiện nhà kính với độ ẩm cao trước khi chuyển
ra ruộng. Hàm lượng anthraquinon được xác định bằng cách sử dụng HPLC. Phân
tích cho thấy hàm lượng của các hợp chất dược liệu chính-emodin và sức sống
của chồi nuôi cấy trong ống nghiệm 6 tuần tuổi và cây in vitro 3 tháng tuổi được
trồng trong nhà kính cao hơn so với hàm lượng thuốc thơ được bán trên thị trường
(Li-Chang lin, 2003).
8


• Việt Nam
Năm 2011, Hoàng Thị Kim Hồng nghiên cứu khả năng tái sinh chồi và
cụm chồi trong cấy in vitro cây Hà thủ ô đỏ (Polynum multiflorum Thumb.). Kết
quả: mơi trường MS có bổ sung BAP 4 mg/L và αNAA 0,1 mg/L kích thích đoạn
thân của chồi in vitro cây Hà thủ ô đỏ tái sinh cụm chồi tốt nhất, với trung bình

8,54 chồi trên một mẫu. Các đoạn thân in vitro này có khả năng tạo cụm chồi tốt
trên mơi trường có BAP 4 mg/L và αNAA 0,2 mg/L hoặc BAP 5 mg/L và αNAA
0,3 mg/L nhưng một số mẫu cịn có khả năng phân hóa thành callus. Chồi đơn
tách từ cụm chồi in vitro tạo rễ, sinh trưởng và phát triển tốt trên mơi trường MS
có bổ sung αNAA 0,5 mg/L (Hoàng Thị Kim Hồng, 2011).
Năm 2012, Phạm Minh Tâm và cộng sự đã nghiên cứu khả năng nhân
giống in vitro từ lá cây Hà thủ ô đỏ. Lá cây Hà thủ ô đỏ được cấy vào môi trường
MS bổ sung αNAA, BA, TDZ, 2,4D. 93% mẫu cho cảm ứng trong môi trường
chứa 0,75 mg/L TDZ, 2 mg/L BA và 0,5 mg/L 2,4D tạo mô sẹo nặng trung bình
0,419g. Sau đó mơ sẹo được cấy chuyển sang môi trường MS chứa 4 mg/L BA
và 1,5 mg/L kinetin để tạo chồi với trung bình 3,933 chồi tái sinh trên mẫu. Chồi
sẽ được nhân cụm chồi trong môi trường MS bổ sung 4 mg/L BAP, 0,25 mg/L
αNAA với trung bình 7,44 chồi trên cụm chồi và tạo rễ trong môi trường MS bổ
sung 0,5 mg/L αNAA. Cuối cùng, cây hoàn chỉnh được trồng ngoài vườn ươm
trên giá thể chứa 50% xơ dừa và 50% tro trấu cho tỉ lệ sống 57%, chiều cao cây
trung bình đạt 5,27 cm và số lá trung bình 4,41 lá trên mỗi cây (Phạm Minh Tâm,
2012).
Năm 2017, Bùi Văn Thắng và cộng sự đã tiến hành nhân giống in vitro cây
Hà thủ ô đỏ và đạt kết quả tốt với hệ số nhân giống cao. Các chồi Hà thủ ô đỏ
được sát khuẩn bề mặt bằng cồn 70% trong 1 phút, khử trùng bằng dung dịch
HgCl2 0,1% trong 6 phút và nuôi mẫu trên mi trường MS có bổ sung 0,2 mg/L
BAP và 30 g/L sucrose, kết quả cho tỉ lệ mẫu sạch nảy chồi đạt 48,53%, chồi cao,

9


thân và lá xanh đậm. Cảm ứng tái sinh tạo cụm chồi trên môi trường MS thêm 1
mg/L BAP, 0,3 mg/L Kinetin, 0,2 mg/L αNAA và 30 g/L sucrose, cho hệ số nhân
chồi và tỉ lệ chồi hữu hiệu đạt cao nhất (9,1 chồi/mẫu và 94,4% chồi hữu hiệu)
sau 4 tuần nuôi cấy. Chồi ra rễ 100%, số rễ trung bình 5,58 rễ/cây và chiều dài rễ

trung bình 4,68 cm khi nuôi trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/L IBA, 0,1 mg/L
αNAA và 20 g/L sucrose sau 4 tuần ni cấy. Cây con hồn chỉnh trồng trên giá
thể 30% trấu tồn tính, 20% bột xơ dừa và 50% đất, cho tỉ lệ sống 100% ( Bùi
Văn Thắng, 2017).
Năm 2017, Phạm Thanh Huyền nghiêm cứu nhân giống từ hom thân cây Hà
Thủ ô đỏ [Fallopia multiflora (Thumb.) Haraldson]. Nghiên cứu được tiến hành
tại xã Sơn Đông, thị xã Sơn Tây, thành phố Hà Nội. Kết quả đánh giá ảnh hưởng
của tuổi hom, thời vụ giâm hom, chất điều hòa sinh trưởng và giá thể giâm hom
đến khả năng nhân giống của hom thân Hà thủ ô đỏ cho thấy thời vụ giâm hom
từ tháng 12 năm trước đến tháng 1 năm sau, sử dụng hom thân bánh tẻ và xử lý
hom bằng chất điều sinh trưởng IBA 1% hoặc αNAA 0,5% cho tỷ lệ sống cao
nhất. Giá thể giâm hom là cát cho thời gian bắt đầu ra chồi sớm hơn và tỷ lệ
sống cao hơn của hom thân so với giá thể giâm hom là đất ( Phạm Thanh Huyền,
2017).
Năm 2019, Vũ Quốc Luận và cộng sự đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của
nguồn mẫu, chất điều hòa sinh trưởng và hệ thống nuôi cấy lên khả năng nhân
nhanh rễ bất định của cây Hà Thủ Ơ đỏ ni cấy in vitro. Các kết quả thu được
cho thấy, rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ tái sinh tốt nhất ở nguồn mẫu lá trên mơi trường
SH có bổ sung 30 g/L sucrose, 8,5 g/L agar, 1,5 mg/L IBA và điều chỉnh về pH =
5,8. Khả năng nhân nhanh rễ bất định trong các phương thức nuôi cấy khác nhau
cho thấy bioreactor Hàn Quốc cho kết quả tốt nhất về khối tượng tươi (17,04 g),
khối lượng khô (1,56 g) và tỷ lệ tăng sinh (3,40 lần) (Vũ Quốc Luận và các cs,
2019).

10


PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Vật liệu

Cây Hà Thủ Ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.) in vitro được cung
cấp bởi Bộ môn CNSH Thực Vật, khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nơng
nghiệp Việt Nam.

Hình 3.1: Cây Hà thủ ơ đỏ in vitro
3.1.2 Hóa chất và dụng cụ
• Hóa chất
Mơi trường sử dụng trong q trình ni cấy thực vật là mơi trường MS cơ
bản. Thành phần hóa chất có trong mơi trường được thể hiện ở mục 2.1.7.
• Dụng cụ
Nồi hấp khử trùng, box cấy chuyên dụng, cân phân tích, máy đo pH, tủ 4oC,
pipet,... và các dụng cụ, máy móc khác tại Bộ mơn Thực vật, khoa Cơng nghệ
Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật –
Khoa Công nghệ sinh học – Học Viện Nông Nghiệp việt Nam
Thời gian nghiên cứu: 04/2022 – 09/2021

11


3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và αNAA đến nhân nhanh chồi
in vitro cây Hà thủ ô đỏ
Nồng độ BA(mg/L)

Nồng độ αNAA(mg/L)

CT1-ĐC

0

0

CT2

0,5

0,2

CT3

1

0,2

CT4

0,5

0,4

CT5

1

0,4

Công thức

Cắt các đoạn chồi dài khoảng 1,5 cm chứa mắt ngủ, sau đó cấy vào các bình
nhân nhanh với số lượng 5 chồi/bình. Theo dõi kết quả sau 4 tuần.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin và αNAA đến nhân nhanh
chồi in vitro cây Hà thủ ô đỏ.
Công thức

Nồng độ Ki(mg/L)

Nồng độ αNAA(mg/L)

CT1-ĐC

0

0

CT2

0,5

0,2

CT3

1

0,2

CT4

0,5

0,4

CT5

1

0,4

Cắt các đoạn chồi dài khoảng 1,5 cm chứa mắt ngủ, sau đó cấy vào các bình
nhân nhanh với số lượng 5 chồi/bình. Theo dõi kết quả sau 4 tuần..

12


Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng αNAA đến khả năng ra rễ của cây Hà
thủ ô đỏ
Nồng độ αNAA(mg/L)

Công thức
CT1-ĐC

0

CT2

0,25

CT3

0,5

CT4

0,75

CT5

1

Các chồi thu được sau quá trình nhân nhanh, chiều dài 3,5-4 cm, có 4-5 lá được
sử dụng cho các thí nghiệm ra rễ.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của THT đến khả năng ra rễ của cây
Hà thủ ô đỏ
Nồng độ αNAA(mg/L)

Công thức
CT1-ĐC

0

CT2

0,25

CT3

0,5

CT4

0,75

CT5

1

Các chồi thu được sau quá trình nhân nhanh, chiều dài 3,5-4 cm, có 4-5 lá được
sử dụng cho các thí nghiệm ra rễ.

13


3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp chuẩn bị vật liệu
Đoạn chồi của Hà thủ ơ đỏ có kích thước khoảng 1,5 cm cắt từ cây in vitro
4-6 tuần tuổi được chuyển sang môi trường nhân nhanh là môi trường dinh dưỡng
khoáng MS bổ sung BA-αNAA, KI- αNAA, αNAA, THT. Các chồi được cấy
chuyển sang môi trường mới 4 tuần 1 lần.
3.3.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu nhân nhanh
Mẫu vật liệu là chồi được tách ra từ cây hà thủ ô đỏ in vitro khoảng 4-6
tuần tuổi, được cắt với kích thước khoảng 1,5 cm và sạch bệnh.
3.3.3 Chuẩn bị môi trường MS
MS1: 50ml/L

MS2 : 5ml/L

MS3 : 5ml/L

MS4 : 5ml/L

30g /L đường

6,5g /L agar

Bổ sung BA-αNAA, bổ sung KI- αNAA,bổ sung αNAA, bổ sung THT
vào MS theo các tỉ lệ dự tính.
PH : 5,7-5,8
Bổ sung agar, đun nóng cho đến khi agar tan hồn tồn, sau đó rót ra
bình, để nguội, bọc kín, hấp khử trùng
Sau khi hồn thành các bước trên lấy bình ra xếp ngay ngắn để nguội để
môi trường được ổn định và sẵn sàng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.4 Phương pháp nhân nhanh và quy trình thực hiện
Phương pháp
Sử dụng phương pháp ni cấy trên môi trường Ms cơ bản với 6,5g/L agar,
30g/L đường.
Tất cả các thí nghiệm ni cấy được đựng trong bình trụ 250 ml, sử dụng
mơi trường ni cấy có độ điều chỉnh ở mức PH 5,7-5,8 trước khi hấp khử trùng
ở 121 độ c, 1 atm. Mẫu được nuôi cấy trong môi trường ánh sáng huỳnh quang
trắng lạnh ngưỡng 2000 lux và nhiệt độ ở 25-27 độ c.
14


Quy trình
Chuẩn bị giấy cấy đã hấp khử trùng.
Đốt banh, dao, kéo, khay bằng cồn để khử trùng.
Khử trùng box cấy bằng cồn.
Sau đó khử trùng bằng tia cực tím trong 20 phút cả box và các dụng cụ cấy
như trên.

Khử trùng tay và các bình Ms để bắt đầu nhân nhanh.
• LƯU Ý:
+ Ln bật đèn cồn trong suốt thời gian cấy.
+ Khơng đưa tay qua miệng bình cũng như giấy cấy tránh nhiễm.
+ Khử khuẩn tay mỗi khi có thao tác nào ra vào box cấy.
3.3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên.
Mỗi thí nghiệm có 5 cơng thức, mỗi cơng thức có 5-6 bình, mỗi bình 5 mẫu.
Thống kê và xử lý số liệu trên nền Excel và phần mềm IRRISTAT.
3.3.6 Chỉ tiêu theo dõi

-

Chiều cao chồi trung bình (cm)
Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu)
Số lượng rễ trung bình (rễ)
Chiều dài rễ trung bình (cm)
Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)

=
=
=
=
=

15

𝐓ổ𝐧𝐠 𝐜𝐡𝐢ề𝐮 𝐜𝐚𝐨 𝐜𝐡ồ𝐢
𝐓ổ𝐧𝐠 𝐬ố 𝐜𝐡ồ𝐢
𝐓ổ𝐧𝐠 𝐬ố 𝐜𝐡ồ𝐢

𝐓ổ𝐧𝐠 𝐬ố 𝐦ẫ𝐮 𝐜ấ𝐲
𝐓ổ𝐧𝐠 𝐬ố 𝐫ễ
𝐓ổ𝐧𝐠 𝐬ố 𝐦ẫ𝐮 𝐜ấ𝐲
𝐓ổ𝐧𝐠 𝐜𝐡𝐢ề𝐮 𝐝à𝐢 𝐭ấ𝐭 𝐜ả 𝐫ễ
𝐓ổ𝐧𝐠 𝐬ố 𝐫ễ
𝐒ố 𝐦ẫ𝐮 𝐭ạ𝐨 𝐫ễ
𝐓ổ𝐧𝐠 𝐬ố 𝐦ẫ𝐮 𝐜ấ𝐲

x 100