Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của cây nho rừng (vitis heyneana roem schult )

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỒNG KHÁNH LINH

Ầ

NGHIÊN CỨ
C Ố

Y

ỌC
CỦ C Y

ƯỚ
C DỤ
RỪNG

(Vitis heyneana Roem. & Schult.)

LUẬ VĂ

ẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ C Í MI

.

, ĂM 2022


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỒNG KHÁNH LINH

NGHIÊN CỨ
Ầ
A ỌC ƯỚ
C
DỤ
C Ố
Y
CỦ C Y
ỪNG
(Vitis heyneana Roem. & Schult.)

LUẬ VĂ

ẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, ĂM 2022

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HỒNG KHÁNH LINH

NGHIÊN CỨ
Ầ
ỌC ƯỚ
C
DỤ
C Ố
Y
CỦ C Y
ỪNG
(Vitis heyneana Roem. & Schult.)

NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 8720206

LUẬ VĂ

ƯỜI

ẠC SĨ DƯỢC HỌC

ƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. VÕ VĂN LẸO

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, ĂM 2022

.


.

LỜI C M Đ
Tôi xin cam đoan luận văn này là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu và
kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc cơng bố trong bất kỳ cơng trình
nghiên cứu khoa học nào.
Tác giả luận văn

Nguyễn Hoàng Khánh Linh

.


.

LUẬ VĂ

TÓM TẮT
ẠC SĨ DƯỢC HỌC KHÓA 2019 – 2021

Chuyên ngành: Dƣợc học cổ truyền, mã số: 8720206
ên đề tài: Nghiên cứu t n p ần o ọ
ớn t
ụn
n o
o
(Vitis heyneana Roem. & Schult.)
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Võ Văn Lẹo
Học viên thực hiện: Nguyễn Hoàng Khánh Linh

ủ

Nho rừng

Mở đầu Cây Nho rừng (hay cịn gọi là Nho lơng, Nho năm góc, Nho ngũ giác, Nho tía), tên khoa
học là Vitis heyneana Roem. & Schult., họ Nho Vitaceae. Trong dân gian, rễ Nho rừng dùng trị
viêm phế quản; làm thuốc lợi tiểu và phối hợp với rễ dứa hãm hoặc sắc uống trị bệnh lậu. Tuy
nhiên hiện nay vẫn cịn ít nghiên cứu về phần trên mặt đất của loài cây này tại Việt Nam. Đề tài
tiến hành phân lập các thành phần hóa học có trong thân và lá Vitis heyneana Roem. & Schult.
hƣớng tác dụng chống oxy hóa nhằm cung cấp thêm thơng tin để có thể ứng dụng loài cây này làm
thuốc.
Đ i t ợng nghiên cứu: Thân và lá cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.) thu hái tại
Vĩnh Phúc (12/2019).
n p p n iên ứu:
Định danh, lựa chọn nguyên liệu, khảo sát đặc điểm thực vật, kiểm tra độ tinh khiết;
Khảo sát hóa học hƣớng tác dụng chống oxy hóa (mơ hình DPPH)
Phân lập, tinh chế, định danh và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chất tinh khiết.

Kết quả
Xác định nguyên liệu: Định danh nguyên liệu chính xác là cây Nho rừng.
Đánh giá tác dụng sinh học: Từ 7kg thân cây Nho rừng, chiết ngấm kiệt thu đƣợc 903,5 g cao
cồn, tiến hành chiết phân
bố lỏng – lỏng thu đƣợc 48,6g phân đoạn PE, 25,7g phân đoạn CHCl3, 78,7g phân đoạn
EtOAc. Qua thử nghiệm, phân đoạn EtOAc có IC50 thấp nên (40,42 µg/ mL) nên hoạt tính dập tắt
gốc tự do DPPH cao. Từ đó, phân đoạn EtOAc đƣợc lựa chọn để làm đối tƣợng phân lập các hợp
chất tiếp theo.
Từ 3kg lá Nho rừng, chiết ngấm kiệt thu đƣợc 154 g cao cồn, tiến hành chiết phân
bố lỏng – lỏng thu đƣợc 42 g phân đoạn PE, 15 g phân đoạn CHCl3, 12 g phân đoạn EtOAc. Qua
thử nghiệm, phân đoạn EtOAc có IC50 thấp nên (37,02 µg/ mL) nên hoạt tính dập tắt gốc tự do
DPPH cao. Từ đó, phân đoạn EtOAc đƣợc lựa chọn để làm đối tƣợng phân lập các hợp chất tiếp
theo.
Phân lập và xác định cấu trúc: Từ 15g phân đoạn EtOAc của thân qua sắc ký cột nhanh kết hợp
kết tinh phân đoạn thu đƣợc 3 kết tinh. Thông qua các kỹ thuật phổ đã định danh đƣợc 3 chất: VH3
(201 mg) – trans-resveratrol, VH4 (95mg) - hopeaphenol và VH5 (55 mg) - spinasterol.
Từ 9g phân đoạn EtOAc của lá qua sắc ký cột nhanh kết hợp kết tinh phân đoạn thu đƣợc 2 kết
tinh. Thông qua các kỹ thuật phổ đã định danh đƣợc 2 chất: VH6 (28 mg) - Daucosterol và VH7
(10 mg) - Apigenin.
Thử tác dụng sinh học: Trans-resveratrol là 18,792 (µg/ mL), hopeaphenol là 395,37 (µg/ mL) so
với trolox là 8,862 (µg/ mL). Đối với spinasterol, tác dụng rất kém nên không xác định IC50.
Bàn luận: cần tiếp tục các thử nghiệm về tác dụng sinh học trên các chất tinh khiết và phân lập
chất từ các phân đoạn giàu tiềm năng.

.


.

SUMMARY

THESIS OF MASTER PHARMACY – Course 2019 - 2021
Major: Traditional Pharmacy, code: 8720206
STUDY OF ANTIOXIDANTS OF CHEMICAL COMPOSITION OF
Vitis heyneana Roem. & Schult.
Instructor: Vo Van Leo, Dr
Student: Nguyễn Hoàng Khánh Linh
Introduction:
Vitis heyneana Roem. & Schult., Vitaceae is known as Wild grape in Vietnam. Following the folk,
the root can use for asthma, use as a diuretic drug, or boil and extract with pineapple root to cure
gonorrhea. However, there is still a lack of research about the on-earth part of this plant in Vietnam
nowadays. The study of antioxidants of chemical composition of Vitis heyneana Roem. & Schult.
provide additional information to be able to use this herbal as medicine.
Materials:
Stem and leaves of Vitis heyneana Roem. & Schult. was collected in Vinh Phuc (12/2019)
Methods:
Extraction, separation, isolation, and purification were done; Structure elucidation was based on
NMR and MS spectrometric methods.
In vitro screening of fractions, isolated compounds for antioxidant effects (DPPH).
Isolation, purification, identification and evaluation of antioxidant activity of pure substances.
Results:
Bio-assay screening:
7kg of Vitis heyneana Roem. & Schult stem powder was extracted with 96% to produce 903,5g
ethanol extract which was successively portioned with solvent to obtain 49,6g PE, 25,7g CHCl3,
78,7g EtOAc. EtOAc has a low IC50 (40,42 µg/ mL) which can highly quench DDPH free radicals.
Therefrom, EtOAc is chosen to be isolated.
From 3kg of Vitis heyneana Roem. & Schult. leaves powder was extracted with 96% to produce
154g ethanol extract which was successively portioned with solvent to obtain 42 g PE, 15 g CHCl3,
and 12 g EtOAc. EtOAc has a low IC50 (40,42 µg/ mL) which can highly quench DDPH free
radicals. Therefrom, EtOAc is chosen to be isolated.
Chemical composition:

From 15g EtOAc of stem extract was separated by flash-column and fractional crystallization to
obtain 3 crystallines. By the spectrometric method, VH3 (201 mg) – trans-resveratrol, VH4 (95mg)
– hopeaphenol, and VH5 (55 mg) – Spinasterol was isolated
From 9g EtOAc of leaves extract was separated by flash-column and fractional crystallization to
obtain 2 crystallines. By the spectrometric method, VH6 (28 mg) - Daucosterol and VH7 (10 mg) Apigenin.
Bio-assay testing:
Trans-resveratrol has IC50 = 18,792 (µg/ml), hopeaphenol is 395,37 (µg/ml) and trolox is 8,862
(µg/ml). Spinasterol has very little effect so IC50 is not necessary.
Conclusion: Further studies about the effect of constituents from Vitis heyneana Roem. & Schult.
has to be conducted.

.


.

i

MỤC LỤC
MỤC LỤC .............................................................................................................................. i
DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. ii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................ iii
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................................. iv
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 2
1.1. THỰC VẬT HỌC ........................................................................................................... 2
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC ........................................................................................... 4
1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC .............................................................................................. 14
1.4. MỘT SỐ CÔNG DỤNG CỦA NHO RỪNG ............................................................... 25
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP SÀNG LỌC KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA ................... 26

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 30

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 30
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ......................................................................... 35
3.1. KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC VÀ VI HỌC .............................................................. 35
3.2. KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC .................................................................... 39
3.3. BÀN LUẬN .................................................................................................................. 79
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 81
KẾT LUẬN.......................................................................................................................... 81
ĐỀ NGHỊ ............................................................................................................................. 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 83
PHỤ LỤC ............................................................................................................................ 89
PHỤ LỤC ............................................................................................................................ 92

.


.

ii

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
C ữ
viết tắt

Từ nguyên

AO

3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D
glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O-D-glucopyranosyl ester

BT

Bài thuốc hỗ trợ điều trị thoái hóa cột sống
của Lƣơng y Nguyễn Thiện Chung

BVTV

Bảo vệ thực vật

BuOH

n-Butanol

CK

Cao khô phun sấy

CL

Cao lỏng

DAD

Diode Array Detector

DĐVN

Dƣợc điển Việt Nam

ĐL

Đinh lăng

EtOAc

Ethyl acetat

E.A

Phân đoạn ethyl acetat

EtOH

Ethanol

HPLC

High performance liquid chromatography

MD

Mía dị

MeOH

Methanol

N

Nhàu

PĐ

Phân đoạn

RM

Râu mèo

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SPE

Solid-phase extraction

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

TLTK

Tài liệu tham khảo

TT

Thuốc thử

YHCT

Y học cổ truyền

WHO

World Health Organization

.

n

tiếng Việt

Đầu dò dãy diod quang

Sắc ký lỏng hiệu năng
cao

Chiết pha rắn

Tổ chức Y tế thế giới


.

iii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Vitis ở Việt Nam..................................................... 2
Bảng 1.2. Một số hợp chất stilbenoid phân lập từ các loài thuộc chi Vitis ........................... 6
Bảng 1.3. Một số hợp chất flavonoid từ loài V. labrusca và V.vinifera .............................. 10
Bảng 1.4. Các acid béo và hàm lƣợng của chúng trong dầu hạt nho .................................. 11
Bảng 1.5. So sánh thành phần hóa học trong rễ-thân-lá của cây nho rừng ......................... 13
Bảng 1.6. Tác dụng kháng vi rút của polyphenol có nguồn gốc từ V. amurensis ............... 22
Bảng 1.7. Một số tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Vitis ........................................ 25
Bảng 2.8. Cách pha mẫu đo của phƣơng pháp DPPH ......................................................... 34
Bảng 3.9. Kết quả sơ bộ thành phần hóa học của lá Nho rừng ........................................... 39
Bảng 3.10. Kết quả sơ bộ thành phần hóa học của thân Nho rừng ..................................... 40
Bảng 3.11. Kết quả sắc ký cột pha thuận phân đoạn ethyl acetat của cao Nho rừng .......... 43
Bảng 3.12. Giá trị IC50 của các cao phân đoạn.................................................................... 42
Bảng 3.13. Kết quả sắc ký cột nhanh phân đoạn ethyl acetat của cao lá Nho rừng ............ 48
Bảng 3.14. Chƣơng trình sắc ký HPLC xác định độ tinh khiết hợp chất VH3 ................... 51
Bảng 3.15. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH3 ............................................................... 53
Bảng 3.16. So sánh phổ NMR của hợp chất VH3 và trans-resveratrol theo tài liệu tham
khảo ...................................................................................................................................... 54
Bảng 3.17. Chƣơng trình sắc ký HPLC xác định độ tinh khiết hợp chất VH4 ................... 55
Bảng 3.18. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH4 ............................................................... 58
Bảng 3.19. So sánh phổ NMR của hợp chất VH4 và hopeaphenol theo tài liệu tham khảo59
Bảng 3.20. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH5 ............................................................... 61
Bảng 3.21. Bảng so sánh dữ liệu phổ của VH5 và Spinasterol ........................................... 63
Bảng 3.22. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất VH6 ............................................................... 66
Bảng 3.23. So sánh phổ NMR của hợp chất VH6 và theo tài liệu tham khảo .................... 68
Bảng 3.24. Dữ liệu phổ MNR của hợp chất VH7 ............................................................... 69
Bảng 3.25. Bảng so sánh dữ liệu phổ của VH7 và Apigenin .............................................. 70
Bảng 3.26. Thông số hoạt tính chống oxy hóa chất đối chiếu trolox .................................. 71
Bảng 3.27. Thơng số hoạt tính chống oxy hóa cao petroleum ether ................................... 72
Bảng 3.28. Thơng số hoạt tính chống oxy hóa cao cloroform ............................................ 72

Bảng 3.29. Thơng số hoạt tính chống oxy hóa cao ethyl acetat .......................................... 73
Bảng 3.30. Thơng số hoạt tính chống oxy hóa hợp chất trans-resveratrol ......................... 74
Bảng 3.31. Thơng số hoạt tính chống oxy hóa hợp chất hopeaphenol ................................ 75
Bảng 3.32. Thơng số hoạt tính chống oxy hóa cao petroleum ether ................................... 75
Bảng 3.33. Thơng số hoạt tính chống oxy hóa cao cloroform ............................................ 76
Bảng 3.34. Thơng số hoạt tính chống oxy hóa cao ethyl acetat .......................................... 77

.


.

iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem.& Schult.) ........... 4
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số oligostilbenoid phân lập từ V. heyneana ..................... 12
Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất nhóm triterpenoid ....................................................... 13
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của các polyphenol V. amurensis đƣợc nghiên cứu ............... 23
Hình 2.5. Sơ đồ chuẩn bị mẫu nghiên cứu .......................................................................... 33
Hình 3.6. Vi phẫu lá Nho rừng ............................................................................................ 35
Hình 3.7. Các thành phần trong vi phẫu lá Nho rừng ......................................................... 36
Hình 3.8. Vi phẩu thân Nho rừng ........................................................................................ 36
Hình 3.9. Các thành phần trong bột lá Nho rừng ................................................................ 37
Hình 3.10. Cấu tử bột thân Nho rừng .................................................................................. 38
Hình 3.11. SKLM kiểm tra các phân đoạn chiết phân bố cao Nho rừng ............................ 42
Hình 3.12. SKLM các phân đoạn từ sắc ký cột pha thuận .................................................. 43
Hình 3.13. SKLM các phân đoạn rửa giải từ phân đoạn 4 .................................................. 44
Hình 3.14. SKLM 3 chất VH1 - VH2 - VH3 ...................................................................... 45
Hình 3.18. Quy trình chiết xuất lá dƣợc liệu Nho rừng ...................................................... 47

Hình 3.15. SKLM các phân đoạn từ sắc ký cột nhanh ........................................................ 48
Hình 3.16. SKLM khảo sát độ tinh khiết hợp chất VH3 ..................................................... 50
Hình 3.17. Sắc ký đồ HPLC hợp chất VH3 ........................................................................ 51
Hình 3.18. Phổ MS của hợp chất VH3 ................................................................................ 52

Hình 3.19. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của hợp chất VH3 phân lập ................... 52
Hình 3.20. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của hợp chất VH3 phân lập .................. 52
Hình 3.21. Một số tín hiệu tƣơng quan trong phổ NMR của hợp chất VH3....................... 54
Hình 3.22. Cơng thức cấu tạo VH3 (trans-resveratrol) ...................................................... 54
Hình 3.23. SKLM khảo sát độ tinh khiết hợp chất VH4 ..................................................... 55
Hình 3.24. Sắc ký đồ HPLC hợp chất VH4 ........................................................................ 56
Hình 3.25. Phổ MS của hợp chất VH3 ................................................................................ 56

Hình 3.26. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của hợp chất VH4 phân lập ................... 57
Hình 3.27. Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của hợp chất VH4 phân lập .................. 57
Hình 3.28. Một số tín hiệu tƣơng tác trong phổ NMR của hợp chất VH4 .......................... 59

.


.

v

Hình 3.29. Cơng thức cấu tạo VH4 (hopeaphenol) ............................................................. 60
Hình 3.30. SKLM khảo sát độ tinh khiết hợp chất VH5 ..................................................... 60
Hình 3.31. Nhận định sơ bộ cấu trúc của VH5 ................................................................... 62
Hình 3.32. Cấu trúc của VH5 .............................................................................................. 62
Hình 3.33. Một số tín hiệu tƣơng quan trong phổ HMBC của hợp chất VH5 .................... 63
Hình 3.34. SKLM khảo sát độ tinh khiết hợp chất VH6 ..................................................... 64

Hình 3.35. SKLM khảo sát độ tinh khiết hợp chất VH7 ..................................................... 69
Hình 3.36. Cấu trúc của VH7 .............................................................................................. 70
Hình 3.37. Một số tín hiệu tƣơng quan trên phổ HMBC của VH7 ..................................... 70
Hình 3.38. Hoạt tính chống oxy hóa của trolox .................................................................. 71
Hình 3.39. Hoạt tính chống oxy hóa của cao petroleum ether ............................................ 72
Hình 3.40. Hoạt tính chống oxy hóa của cao cloroform ..................................................... 73
Hình 3.41. Hoạt tính chống oxy hóa của cao ethyl acetat ................................................... 73

Hình 3.42. Hoạt tính chống oxy hóa của trans-resveratrol ................................................. 74
Hình 3.43. Hoạt tính chống oxy hóa của hopeaphenol ....................................................... 75
Hình 3.44. Hoạt tính chống oxy hóa của cao petroleum ether ............................................ 76
Hình 3.45. Hoạt tính chống oxy hóa của cao cloroform ..................................................... 76
Hình 3.46. Hoạt tính chống oxy hóa của cao ethyl acetat ................................................... 77
Hình 3.47. HTCO của chất chiết từ thân và lá Nho rừng .................................................... 78

.


.

1

ĐẶT VẤ ĐỀ
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm, gió mùa, có nguồn tài nguyên thực
vật phong phú và đa dạng, trong đó có rất nhiều lồi đƣợc sử dụng làm thuốc. Việc sử
dụng thuốc và các thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ thực vật chủ yếu vẫn
còn dựa trên kinh nghiệm dân gian, chƣa có đầy đủ bằng chứng khoa học để chứng
minh tác dụng, cơ chế tác dụng, tác dụng không mong muốn...của những cây cỏ làm
thuốc này. Trong đó, cây Nho rừng gần đây đƣợc nhiều ngƣời quan tâm.

Ở Việt Nam, ngoài loài nho cho khai thác quả Vitis vinifera cịn có nhiều lồi nho
mọc hoang dại khác phân bố phổ biến ở khu vực miền núi phía bắc nhƣ Vitis
labrusca L (Nho chồn), Vitis balansana Planch. (nho đất, nho dại nhỏ quả), Vitis
flexnosa Thunb. (Nho dại, nho cong queo), Vitis heyneana Roem. & Schult (Vitis
pentagona Diels et Gilg) (Nho rừng, Nho lơng, Nho năm góc), Vitis retordii Rom.
Caill. Ex Planch. (Nho lông hoe), V. retordii, V. balansaeana (nho đất)... Chúng đƣợc
sử dụng nhiều trong y học cổ truyền với tác dụng chống viêm nhƣ thuốc cầm máu,
tiêu sƣng, chống viêm, trị phong thấp, khớp xƣơng đau nhức, viêm gan vàng da, mụn
nhọt, viêm vú, viêm khớp, tác dụng chống oxy hóa [1].
Cây Nho rừng (hay cịn gọi là nho lơng, nho năm góc, nho ngũ giác, nho tía), tên
khoa học là Vitis heyneana Roem. & Schult., họ Nho Vitaceae [1, 2].Trong dân gian,
rễ Nho rừng dùng trị viêm phế quản; làm thuốc lợi tiểu và phối hợp với rễ dứa hãm
hoặc sắc uống trị bệnh lậu. Vỏ rễ đƣợc dùng trị kinh nguyệt khơng đều và bạch đới,
dùng ngồi điều trị chứng sƣng , đau do chấn thƣơng, gân cốt tê đau; toàn cây dùng
trị bệnh sởi; lá dùng trị bệnh lỵ, mụn nhọt sƣng lở; và một số tác dụng khác [1]. Hiện
nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của lồi Vitis heyneana Roem. & Schult.
tại Việt Nam cịn rất ít. Trong dân gian hay sử dụng phần dƣới mặt đất để làm thuốc
nên trong đề tài muốn nghiên cứu riêng về phần trên mặt đất để góp phần phong
phú hơn về lồi nho này. Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học
hƣớng tác dụng chống oxy hóa của phần trên mặt đất cây Nho rừng” đƣợc thực hiện
với các mục tiêu chính nhƣ sau:
- Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro bằng phƣơng pháp đánh bắt gốc tự do
DPPH của các cao phân đoạn chiết từ phần trên mặt đất cây Nho rừng.
- Phân lập và xác định cấu trúc của các hoạt chất chính từ cao có tác dụng chống
oxy hóa mạnh thơng qua sàng lọc trên mơ hình DPPH.
- Thử hoạt tính chống oxy hóa của chất tinh khiết thu đƣợc sau khi phân lập, để
phục vụ cho các mục đích kiểm nghiệm và thử nghiệm sinh học sau này.

.

.

2

C ƯƠ

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. THỰC VẬT HỌC
1.1.1. Vị trí phân loại
Vị trí của chi Vitis trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (2009) [3]:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Hạt kín (Angiospermae)
Lớp Hai lá mầm (Dicotyledones)
Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae)
Bộ Nho (Vitales)
Họ Nho (Vitaceae)
Chi Nho (Vitis)
Phân bố: Trên thế giới chi Vitis có khoảng trên 66 lồi, chủ yếu ở vùng ôn đới, mở
rộng đến vùng cận nhiệt đới [4, 5, 6].
Ở nƣớc ta chi này có 6 loài [1, 2, 4]. Danh sách các loài thuộc chi Vitis ở Việt Nam
đƣợc trình bày tại Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Danh sách các loài thuộc chi Vitis ở Việt Nam

STT

Tên lồi

ên t ơn t

ờng

Phân b

1

Vitis vinifera L.

Nho

Phú n, Khánh Hịa, Ninh
Thuận, Bình Thuận, Lâm
Đồng, TP. Hồ Chí Minh

2

Vitis labrusca L.

Nho chồn

Việt Nam

3

Vitis balansana
Planch.

Nho đất, nho
dại nhỏ quả

Thái Nguyên, Hà Nội, Hải
Dƣơng,Hải Phịng, Ninh
Bình, Quảng Trị,Huế, Đà
Nẵng, Nha Trang, Khánh
Hịa

4

Vitis flexuosa
Thunb.

Nho dại, nho cong
queo

Sơn La, Tây Ninh

5

Vitis heyneana
Roem. & Schult

Nho rừng, nho lơng,
nho năm góc, nho tía,
nho ngũ giác

Lạng Sơn, Ninh Bình,
Ninh Thuận

6

Vitis retordii
Roman du Caill. Ex

Nho lơng hoe

Hà Nam, Nam Định, Ninh
Bình

.


.

3

Planch.
1.1.2. Đặ điểm hình thái thực vật của chi Vitis
Dây leo, thân gỗ, thƣờng đơn tính khác gốc, hiếm khi lƣỡng tính. Có tua quấn,
thƣờng chia làm đơi. Lá đơn, chia thùy, đôi khi lá xẻ chân vịt, lá kèm tiêu giảm.
Cụm hoa mọc chùm tụ tán, hoa 5 cánh có đài hình đĩa, lá đài ngun bản. Cánh hoa
liền ở phía đỉnh và tỏa ra nhƣ cái phễu. Nhị hoa mọc đối diện với cánh hoa, không
phát triển và rụng sớm đối với hoa cái. Hoa một nhụy, mảnh, đầu nhụy mở rộng.
Quả mọng hình cầu, có từ 2-4 hạt. Hạt hình trứng hay elip hoặc hình quả lê, nội nhũ
hình chữ M theo mặt cắt ngang [4].
1.1.3. Đặ điểm thực vật loài Nho rừng
Cây nhỡ leo; cành cây màu đỏ, phủ lông nhện tựa bông, lông màu xám hoặc nâu,
tua chia làm đôi đối diện với lá [4, 7]. Cành cây hình trụ với đƣờng cong chạy dọc,
có lông màu xám hoặc nâu, tua chia làm đôi [7]. Lá đơn; lá kèm màu nâu hình trứng
hay hình mác dài 3-5mm, rộng 2-3mm, đỉnh nhọn hiếm khi tù; cuống lá dài 2,5-6

cm với lớp lông tơ dày đặc; phiến lá thỉnh thoảng chia 3 thùy dài 4-12 cm, rộng 3-8
cm, lớp lông tơ xám hoặc nâu thƣa dần, lông gân lá xa trục đơi khi có lơng, gần trục
với lớp lơng tơ thƣa thớt khi cịn non sau đó thì khơng có lơng, gân xa trục thì nhẵn
đơi khi có vài lơng tơ, gân chính có từ 3-5, gân bên có 4-6 cặp, hình tim đến gần
hình tim, khe tù hiếm khi sắc nhọn, mép từ 9-19 răng cƣa mỗi bên, sắc nhọn. Cụm
lá đối dài 4-14 cm, phân nhánh phát triển; cuống dài 1-2 cm với lông màu xám hoặc
nâu. Cuống nhỏ 1-3 mm, nhẵn. Nụ hình trứng hoặc elip, 1,5-2 cm, đỉnh tròn [7]. Đài
hoa 0,1mm. Chỉ nhị hình sợi, 1-1,2 mm, bao phấn màu vàng hình elip; nhụy hoa
bầu dục, ngắn. Quả mọng, màu tím đen khi chín, hình cầu đƣờng kính 1-1,3 cm [7].
Hạt 2-4 [4], hình trứng, đỉnh trịn, rốn ở giữa có lỗ hƣớng lên [7].
Sinh thái: trong rừng, cây bụi, sƣờn đồi, thung lũng [7], ra hoa tháng 5-6, có quả
tháng 10-11 [4]. Phân bố: Lạng Sơn, Ninh Bình vào Bình Thuận; cịn có ở Trung
Quốc, Lào, Campuchia [4].

.


.

4

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem.& Schult.) [8]
Chú thích: a. Cành mang lá, cụm quả; b. Thân già; c. Thân non; d. Tua cuốn; e. Lá;
f. Gốc lá; g. Ngọn lá; h. Cụm quả; i. Quả; j. Quả cắt ngang; k. Hạt (mặt bụng); l.
Hạt (mặt lƣng); m. Hạt cắt ngang; n. Hạt cắt dọc.

1.2. THÀNH PHẦN HĨA HỌC
1.2.1. Thành phần hóa học của chi Vitis
Hiện nay, trên thế giới đã có khá nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học các lồi
thuộc chi Vitis. Các kết quả nghiên cứu chủ yếu tập trung trên V. vinifera, V.

amurensis và V. balansana cho thấy chúng có chứa các hợp chất thuộc nhóm
stilbenoid, flavonoid, tanin, polysaccharid, acid amin và steroid.
1.2.1.1. Nhóm chất stilbenoid
Stilbenoid là nhóm hợp chất đặc trƣng của chi Vitis nói riêng và trong họ Vitaceae
nói chung. Đã có khoảng 100 stilbenoid dạng monomer, dimer hoặc oligomer
đƣợc tìm thấy từ các lồi Vitis [9].
Từ cao chiết ethanol của lá và thân V. amurensis đã phân lập và xác định đƣợc 6
oligostilbenoid (r-2-viniferin (1), trans-amurensin B (2), trans-ε-viniferin (3),
gnetin H (4), amurensin G (5), (+)-ampelopsin A (6)) và 4 stilbenoid (transresveratrol (7), (+)-ampelopsin F (8), piceatannol (9), trans-piceid (10)) [10].

.


.

5

Năm 1998, tác giả Piere Waffo Teguo và cộng sự đã phân lập từ phân đoạn ethyl
acetat loài V. vinifera 9 hợp chất stilbenoid gồm (E)-astringin (11), (E)resvertrolosid (12), (E)-piceid (13), piceatannol (9), (E)-resveratrol (14), (Z)astringin (15), (Z)-resvertrolosid (16), (Z)-piceid (17), (Z)-resveratrol (18) [11].
Năm 2011, từ cao chiết ethanol phần trên mặt đất của V. thunbergii đã phân lập
đƣợc 6 stilbenoid gồm trans-resveratrol (7), (+)-ε-viniferin (19), ampelopsin C
(20), ampelopsin A (6), (-)-vitisin B (21), (+)-vitisin A (22).
Năm 2013, Sylvain Schnee và cộng sự đã phân lập đƣợc 5 oligostilbenoid trong cao
chiết methanol V. vinifera, chúng gồm ampelopsin A (6), hopeaphenol (23),
ampelopsin H (24), ε-viniferin (25), E-vitisin B) (26) [12].

.


.

6

Bảng 1.2. Một số hợp chất stilbenoid phân lập từ các loài thuộc chi Vitis
STT

Tên chất

CTCT

Loài/Bộ phận dùng

TLTK
[11, 14, 15, 16]

1

(E)-Piceid (13)

V. vinifera (lá, thân, quả)
V. amurensis (lá, thân)
V. larbusca (quả)
[11, 15]

2

(Z)-Piceid (17)

V. vinifera (lá, thân, quả)
V. larbusca (quả)

V. heyneana (thân)

[10, 11, 17]
3

4

Piceatannol (9)

V. vinifera (lá, thân, quả)
V. amurensis (lá, thân)

trans- Resveratrol (7)

V. vinifera (lá, thân, quả)
V. amurensis (lá, thân)
V. thunbergii (lá, thân)
V. larbusca (lá, thân, quả)
V. heyneana (thân)

.

[10, 11, 14, 15,
16, 17, 18]


.

7

[11, 14, 15]
5

(Z)-Resveratrol (18)

V. vinifera (lá, thân, quả)
V. larbusca (quả)

[17, 18, 19, 20,
21]

6

(+)-Ampelopsin A (6)

V. thunbergii (rễ, thân)
V. amurensis (lá, thân, rễ)
V. vinifera (thân)
V. heyneana (thân)

[10, 21]

7

(+)-Ampelopsin F (8)

.

V. amurensis (lá, thân)
V. thunbergii (lá, thân)

.

8

[18, 22]
8

Amurensin H (27)

V. amurensis (rễ)
V. vinifera (thân)

[18]

9

(+)-(E)-ε-Viniferin (28)

V. vinifera (lá, thân)
V. heyneana (thân)

[12, 16, 24]

10

Hopeaphenol (23)

.

V. vinifera (thân)
V. amurensis (rễ)


.

9

[21]

11

(+)-Viniferol A (29)

V. vinifera (thân)

[10]

13

r-2-Viniferin (1)

V. amurensis (lá, thân)

[12]

14

(E)-Vitisin B (26)

.

V. vinifera
(thân)


.

10

1.2.1.2. Nhóm chất flavonoid và phenol khác
Năm 1999, Yinrong Lu và cộng sự đã phân lập và xác định đƣợc 16 hợp chất từ
bã nho và đã xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc dựa theo
các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR), phổ MS ….Chúng gồm
6 hợp chất thuộc nhóm acid phenolic (acid gallic (30), acid 4-O-glucosid gallic
(31), acid 3-O-glucosid gallic (32), trans-acid caftaric (33), trans- acid coutaric
(34), cis-acid coutaric (35)), một hợp chất là dẫn xuất của hydroxy phenol (2hydroxy-5-(2-hydroxy-ethyl) phenylglucosid (36)) và 9 hợp chất thuộc nhóm
flavonoid (catechin (37), epicatechin (38), procyanidin B1 (39), quercetin 3-Oglycosid (40), quercetin 3-O-glucuronid (41), kaempferol 3-O-glycosid (42),
kaempferol 3-O-galactosid (43), astilbin (44), engeletin (45) [25].
Một nghiên cứu khác của Ismael Ivan Rockenbach và cộng sự trên bột của hạt và
vỏ loài V. vinifera và V. labrusca cho thấy hàm lƣợng phenol trong hạt cao hơn
trong vỏ (2128-16518mg catechin/100g hạt và 660-1839mg catechin /100g vỏ).
Nghiên cứu cịn cho thấy cao chiết từ hạt nho có tổng hàm lƣợng polyphenol cao
hơn trong vỏ, đặc biệt là các oligome và polyme flavanol [26].
Năm 2008, Zhenchang Liang và cộng sự đã tiến hành phân tích 110 mẫu vỏ nho
bằng phƣơng pháp LC-MS. Kết quả phát hiện 29/33 pic là các hợp chất
anthocyanin. Tất cả các anthocyanin là dẫn xuất monoglucosid hoặc diglucosid của
5 anthocyanin (delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin và malvidin) nhƣ
delphinidin-3-O-glucosid (46), cyanidin-3-O-glucosid (47), peonidin-3-O-glucosid

(48), malvidin-3-O-glucosid (49 …[28].
Bảng 1.3. Một số hợp chất flavonoid từ loài V. labrusca và V.vinifera
STT

Tên chất

1

Catechin (37)

.

CTCT

Loài

TLTK

V. labrusca, V. vinifera

[28]


.

11

2

Quercetin

(50)

V. labrusca, V. vinifera

[28]

3

Rutin (51)

V. labrusca, V. vinifera

[28]

4

Kaempferol
(52)

V. labrusca, V. vinifera

[28]

1.2.1.3. Sterol
Các nhà nghiên cứu đã chọn các giống nho đỏ ở nhiều vùng, và sau đó tách lấy hạt
nho điều chế ra dầu hạt nho. Nghiên cứu đã xác định đƣợc hàm lƣợng cũng nhƣ là
các loại acid béo và sterol trong hạt nho (xem Bảng 1.4) [29].
Bảng 1.4. Các acid béo và hàm lƣợng của chúng trong dầu hạt nho

m l ợn (%)

Acid béo

Acid béo

m l ợn (%)

Myristic

≤ 0,1 %

Linoleic

58-77 %

Palmitic

5-10 %

Linolenic

≤1%

Stearic

3-5 %

Arachidic

≤ 0,1 %

Oleic

12-26 %

Các sterol bao gồm 15 chất: cholesterol (53), brassicasterol (54), 24-methylen
cholesterol (55), campesterol (56), campestanol (57),

stigmasterol (58),∆7-

campesterol (59), ∆5,23-stigmastadienol (60), clerosterol (61), β-sitosterol (62),
sitostanol (63), ∆5-avenasterol (64), ∆5,24-stigmastadienol (65), ∆7-stigmasterol (66)
và ∆7-avenasterol (67) [29].

.


.

12

Các thành phần khác
Nghiên cứu của Sónia O. Prozil và cộng sự đã xác định đƣợc các polysaccharid
trong thân cây V. vinifera chủ yếu là cellulose, heteroxylan và glucan, trong đó
cellulose chiếm 30,3%, heteroxylan chiếm 12% và glucan chiếm khoảng 15%. Các
loại đƣờng có trong quả nho là các monosaccharid (rhamnose, arabinose, xylose,
mannose, galactose, glucose) [30].
Nhóm nghiên cứu cũng đã xác định đƣợc hàm lƣợng protein trong bã nho chiếm
khoảng 6,1-13% [30].
1.2.2. Thành phần hóa học lồi Nho rừng

Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về loài V. heyneana Roem. &
Schult. Một số hợp chất đƣợc phân lập từ lồi này chủ yếu thuộc nhóm stilbenoid,
acid phenol và terpenoid [16, 31].
1.2.2.1. Nhóm chất stilbenoid
Năm 1996, Li W. W. và cộng sự đã phân lập đƣợc 4 oligomer từ thân cây V.
heyneana là heyneanol A (68), ampelopsin C (20), amelopsin A (6) và (+)-εviniferin (19) [31].
Năm 2013, từ rễ cây V. heyneana, Yue L. và cộng sự đã phân lập đƣợc 3 monomer
(vitisinol A (69), (E)-piceid (13) và hopeaphenol (23).

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số oligostilbenoid phân lập từ V. heyneana

.


.

13

1.2.2.2. Nhóm chất megastigman glycosid
Năm 2012, từ cao chiết aceton 70% của lá cây V. heyneana, Hai-Jian Cong và cộng
sự đã phân lập đƣợc 5 megastigman glucosid trong đó có một megastigman
glucosid mới là (3S,5R,6R,9R)-megastigman-3, 5, 6, 9-tetrol 9-O- β-ᴅglucopyranosid (70) và 4 megastigman glucosid là actinidioionsid (71), (6S,9R)roseosid (72), icarisid B5 (73) và icarisid B1 (74) [32].
1.2.2.3. Một số thành phần khác
Năm 2013, Yue Li và cộng sự đã phân lập đƣợc 5 hợp chất từ rễ cây V. heyneana,
bao gồm β-sitosterol (62), aviculin (86), acid betulinic (87), benzyl O-β-Dapiofuranosyl-(1→2-β-D-glucopyranosid (88) và methyl rosmarinat (89) [16].
Từ cao chiết lá cây V. heyneana, Hai-Jian Cong và cộng sự đã phân lập và xác định
đƣợc 1 cycloartan nortriterpenoid là 25,26,27-trinor-3β, 24-dihydroxycycloartan
(90) và 1 cycloartan triterpenoid là cycloart-23-en-3β, 25-diol (91) [32].

25,26,27-trinor-3β, 24dihydroxycycloartan

cycloart-23-en-3β, 25-diol

Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất nhóm triterpenoid
Bảng 1.5. So sánh thành phần hóa học trong rễ-thân-lá của cây nho rừng
BỘ
Ậ
IÊ CỨ

THÀNH
Ầ
ỌC

Ễ
5 ợp ất β-sitosterol (62), aviculin (86), acid
betulinic (87), benzyl O-βD-apiofuranosyl-(1→2 -βD glucopyranosid (88) và
methyl rosmarinat (89)
Stilbenoid

.

THÂN

LÁ

Stilbenoid:
- Triterpenoid
Heyneanol A (68), - Stilbenoid
ampelopsin C (20),
- 5 ợp ất

amelopsin A (6) và
Megastigman
(+)-ε- viniferin (19)
glucosid
Polysaccharid


.

14

1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC
Hiện nay các nghiên cứu về dƣợc lý chủ yếu trên loài V. vinifera, một số ít nghiên
cứu tiến hành trên các loài V. amurensis và V. thunbergii.
1.3.1. Tác dụng ch ng viêm
Kết quả nghiên cứu của Min-Ji Bak và cộng sự cho thấy procyanidin từ hạt lồi V.
amurensis có tác dụng chống viêm mạnh thơng qua sự ức chế iNOS và COX-2 bằng
cách điều khiển con đƣờng truyền tín hiệu NFκB và p38 MAPK [33].
Năm 2005, Greenspan P. và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm cho chuột ăn khẩu
phần ăn chứa 5% vỏ nho V. rotundifolia trong 14 ngày, sau đó tiêm carrageenan vào
chân chuột và đo thể tích bàn chân chuột sau 3h. Kết quả cho thấy chuột có chế độ
ăn vỏ nho hàng ngày bị phù nề ít hơn khoảng 50% so với chuột khơng ăn, điều này
chứng tỏ vỏ nho có tác dụng kháng viêm in vivo. Nghiên cứu năm 2011 của KunTeng Wang và cộng sự đã chỉ ra rằng tác dụng ức chế giải phóng IL-1β và PGE2
gây bởi LPS của cao chiết methanol từ thân loài V. thunbergii có tác dụng ức chế tốt
hơn các bộ phận khác (cành, lá và rễ) lần lƣợt là 71,29 ± 7,08% và 22,50 ± 6,20%
và không gây độc. Tác dụng ức chế PGE2 của resveratrol và ampelopsin C phân lập
từ phần thân loài V. thunbergii cho kết quả ức chế cao nhất với giá trị IC50 lần lƣợt
là 73,32 ± 1,74 và 15,52 ± 2,69 µM. Mặt khác resveratrol cũng ức chế hoạt động
của COX-2 khá đáng kể với IC50 = 27,01 ± 1,11µM [34].
Nghiên cứu của Bakhta Aouey và cộng sự năm 2016 cho thấy cao chiết thủy phân lá

V. vinifera với liều 100, 200 và 400 mg/kg làm giảm đáng kể thể tích phù bàn chân
chuột lần lƣợt là 34,48% (p <0,05), 36,20% (p<0,05) và 41,37% (p <0,05) 5 giờ sau
khi tiêm carrageenan [35].
Theo nghiên cứu năm 2017 của nhóm tác giả Vion E., trans-ε-viniferin có tác dụng
làm phân rã β-amyloid peptid và chống viêm trên chuột bị Alzheimer mạnh hơn tác
dụng của resveratrol [36].
Cao lá V. vinifera ở liều cao cho thấy hoạt tính chống viêm mạnh mẽ, đã đƣợc nhóm
nghiên cứu chứng minh có tác dụng giảm phù nề ở liều 400 mg / kg (50,02%) trong

.