Đặc điểm hiển vi, thành phần hóa học và thăm dò tác dụng kháng vi sinh vật, tác dụng ức chế sản sinh nitric oxid in vitro in silico của tinh dầu loài conamomum rubidum (lamxay n s lý) škorničk a d poulsen, họ gừn

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THU HÀ

ĐẶC ĐIỂM HIỂN VI, THÀNH PHẦN
HĨA HỌC VÀ THĂM DỊ TÁC DỤNG
KHÁNG VI SINH VẬT, TÁC DỤNG ỨC
CHẾ SẢN SINH NITRIC OXID
IN VITRO & IN SILICO CỦA TINH DẦU
LOÀI Conamomum rubidum (Lamxay &
N.S.Lý) Škorničk. & A.D.Poulsen,
HỌ GỪNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2023


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THU HÀ
MÃ SINH VIÊN: 1801159

ĐẶC ĐIỂM HIỂN VI, THÀNH PHẦN
HÓA HỌC VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG
KHÁNG VI SINH VẬT, TÁC DỤNG ỨC
CHẾ SẢN SINH NITRIC OXID
IN VITRO & IN SILICO CỦA TINH DẦU
LỒI Conamomum rubidum (Lamxay &
N.S.Lý) Škorničk. & A.D.Poulsen,

HỌ GỪNG

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Thanh Tùng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI – 2023


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, bạn bè đã hỗ trợ tôi trong
q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ. Đầu tiên là người thầy đáng kính
mà tơi đã theo học suốt hơn 2 năm – TS. Nguyễn Thanh Tùng – giảng viên Bộ môn
Dược liệu. Thầy là người đã chỉ dẫn tận tình cho tơi từ những kiến thức, kĩ năng cơ
bản nhất của việc nghiên cứu. Và hơn thế nữa, thầy cịn cho tơi nhiều cơ hội để được
phát triển trên con đường nghiên cứu khoa học như tham gia báo cáo tại các Hội nghị
khoa học trong nước. Cảm ơn thầy đã truyền cho tôi động lực để bước trên con đường
đầy chông gai này.
Xin cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Quốc Bình, TS. Nguyễn Khắc Tiệp và
nhóm nghiên cứu đã tạo điều kiện, giúp đỡ tơi trong q trình nghiên cứu và thực
hiện. Tơi cũng xin cảm ơn các bạn, các em, các anh chị nghiên cứu sinh cùng nghiên
cứu tại Bộ môn Dược liệu đã giúp đỡ cũng như động viên tinh thần cho tơi trong suốt
q trình thực hiện đề tài.
Trong q trình thực hiện, tôi đã được bạn Lê Quang Bảo và bạn Đặng Thái
Hồng M1K73 hỗ trợ rất nhiều, ln động viên và giúp đỡ tơi để tơi hồn thành đề
tài.
Ngồi ra, tơi cũng muốn bày tỏ lịng biết ơn đến Nhà trường cũng như tồn thể
các thầy cơ đã giảng dạy, cung cấp kiến thức cho tơi để có thể thực hiện được khóa

luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn
ở bên, đồng hành, giúp đỡ, ủng hộ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong học tập.
Cảm ơn bố mẹ và em trai đã động viên tinh thần và vật chất để tơi hồn thành chặng
đường học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Dược Hà Nội.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2023
Sinh viên

Đỗ Thu Hà


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
C.:

Conamomum

DĐVN:

Dược điển Việt Nam

FID:

Flame ionization detector (Detector ion hóa ngọn lửa)

GC:

Gas Chromatography (Sắc ký khí)

MS:

Mass spectrometry (Khối phổ)

NP/PEG:

Natural products/Polyethylenglycol (Thuốc thử các hợp chất tự nhiên)

NXB:

Nhà xuất bản

MMFF:

Merck Molecular Force Field (Trường lực phân tử của Merck)

Rf :

Retention factor (Chỉ số lưu giữ)

RI:

Retention indices

RT:

Retention time (Thời gian lưu)

RIcal. :

Chỉ số lưu giữ tinh toán theo giá trị C8-C20 trong cùng điều kiện sắc ký
phân tích trên cột HP-5MS

RIlit :

Chỉ số lưu giữ của các hợp chất tra cứu trên thư viện và tài liệu

SKLM:

Sắc ký lớp mỏng

STT:

Số thứ tự

TPHH:

Thành phần hóa học

TT:

Thuốc thử

UV:

Ultra Violet (Tử ngoại)


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1. Đặc điểm thực vật chi Conamomum Ridl..........................................................2
1.1.1. Lịch sử phân loại chi Conamomum Ridl. .....................................................2
1.1.2. Các loài thuộc chi Conamomum và (phân bố của chúng) ..........................2
1.1.3. Thành phần hóa học chi Conamomum........................................................6
1.2 Tổng quan về phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxid in
vitro ............................................................................................................................14
1.3. Tổng quan về phương pháp đánh giá kháng khuẩn in vitro .........................15
1.3.1. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch............................................................16
1.3.2. Phương pháp pha loãng thạch ....................................................................16
1.3.3. Phương pháp vi pha loãng nồng độ ............................................................17
1.4. Tổng quan về phương pháp mô phỏng phân tử Docking ..............................17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................17
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ....................................................................................20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................20
2.1.2. Thiết bị và hóa chất......................................................................................20
2.2. Nội dung nghiên cứu .........................................................................................21
2.2.1. Nghiên cứu về đặc điểm hiển vi..................................................................21
2.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học ...........................................................21
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học của tinh dầu ..............................................21
2.2.4. Nghiên cứu tác dụng in silico bằng phương pháp docking phân tử ........22
2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................22
2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm hiển vi ......................................................................22
2.3.2. Định tính bằng phản ứng hóa học .............................................................22
2.3.3. Định tính thành phần hóa học bằng sắc ký lớp mỏng ..............................26
2.3.4. Nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu .............................................27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................................32
3.1. Kết quả thực nghiệm ........................................................................................32
3.1.1. Đặc điểm hiển vi của loài Conamomum rubidum .....................................32
3.1.2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học lồi Conamomum rubidum ....35

3.1.3. Kết quả ức chế sản sinh nitric oxid của tinh dầu ......................................41


3.1.4. Kết quả kháng vi sinh vật ............................................................................42
3.1.5. Kết quả docking mô phỏng phân tử ............................................................42
3.2. Bàn luận .............................................................................................................45
3.2.1. Đặc đểm hiển vi lồi Conamomum rubidum ..............................................45
3.2.2. Định tính thành phần hóa học ngồi tinh dầu ..........................................45
3.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu .................................................45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................48


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng thành phần hóa học từ tinh dầu lá và rễ loài Conamomum
rubidum. ..........................................................................................................................8
Bảng 1.2. Bảng thành phần hóa học từ tinh dầu Conamomum xanthophlebium và
Conanmomum cylindrostachys ....................................................................................11
Bảng 1.3. Bảng thành phần hóa học từ tinh dầu thân rễ và lá loài Conamomum
vietnamense ...................................................................................................................12
Bảng 3.1. Kết quả phân tích tinh dầu lồi Conamomum rubidum bằng GC-MS .....39
Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc hoa ̣t tính ức chế sản sinh nitric oxid (NO) trên tế bào
RAW 264.7 của các mẫu ..............................................................................................41
Bảng 3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng nấm của tinh dầu từ thân rễ và bộ
phận trên mặt đất của Conamomum rubidum ............................................................42
Bảng 3.4. Năng lượng liên kết và tương tác giữa các chất với các đích....................43


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Nguyên lý của phương pháp protein docking.............................................18
Hình 2.1. Bộ phận hứng tinh dầu nhẹ hơn nước theo quy định của Dược điển Mỹ

(USP 38 – NF33) ..........................................................................................................27
Hình 3.1. Đặc điêm vi phẫu thân rể loài Conamomum rubidum...............................32
Hình 3.2. Đặc điểm vi phẫu lá loài Conamomum rubidum .......................................33
Hình 3.3. Hình ảnh bột thân rễ Conamomum rubidum.............................................34
Hình 3.4. Hình ảnh bột bộ phận trên mặt đất lồi Conamomum rubidum ...............35
Hình 3.5. Sắc ký đồ dịch chiết methanol của 2 mẫu bộ phận trên mặt đất, bộ phận
trên mặt đất của lồi Conamomum rubidum hệ dung mơi (I) trước và sau khi phun
thuốc thử NP/PEG, quan sát ở bước sóng 366 nm .....................................................37
Hình 3.6. Sắc ký đồ 2 mẫu tinh dầu thân rễ, bộ phận trên mặt đất lồi
Conamomum rubidum triển khai với hệ dung mơi (II) quan sát dưới ánh sáng tử
ngoại bước sóng 254 nm, 366 nm và ánh sáng trắng, ánh sáng tử ngoại bước sóng
366 nm sau khi phun thuốc thử hiện màu. .................................................................38
Hình 3.7. Cấu trúc hóa học một số thành phần chính trong tinh dầu loài C.
rubidum .........................................................................................................................43
Hình 3.8. Tương tác 2D giữa phối tử và protein.........................................................44


ĐẶT VẤN ĐỀ
Họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.) là một họ lớn, là một nguồn phong phú đa dạng
các thành phần có hoạt tính sinh học. Họ này bao gồm khoảng 52 chi và hơn 1300 lồi
thực vật lâu năm có hoa thơm với thân rễ bò ngang hoặc củ đặc trưng; phân bố rộng rãi
chủ yếu ở ba châu lục: Châu Mỹ, Châu Phi và Châu Á. Các loài đặc trưng nhất của họ
này bao gồm: Gừng (Zingiber officinale Roscoe), Nghệ (Curcuma longa L.), Gừng
Java (Curcuma zanthorrhiza Roxb)…[1]
Đã có nhiều nghiên cứu thực nghiệm chỉ ra rằng các thành phần hóa học có
trong tinh dầu của các lồi thuộc họ này có nhiều tác dụng sinh học quan trọng trong
việc chống lại bệnh tật như: tác dụng chống oxy hóa, tác dụng chống viêm, trị đái tháo
đường, bảo vệ gan, bảo vệ thần kinh, kháng khuẩn, chống ung thư…[1]
Trong đó, chi Conamomum là chi được tái thành lập gần đây, bao gồm một số
loài trước đây được xếp ở các chi khác và một số loài mới. Conamomum rubidum

(Lamxay & NSLý) Skornick. & AD Poulsen (tên đồng nghĩa là Amomum rubidum
Lamxay & NSLý) có tác dụng chữa các bệnh do vi khuẩn gây ra, có tính kháng khuẩn,
chữa sốt và lở lt [8]. Tinh dầu từ lồi Conamomum rubidum có tác dụng kháng vi
sinh vật và diệt bọ gậy. Các nghiên cứu trước đây chỉ dừng lại ở nghiên cứu về thành
phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật mà chưa làm rõ được đặc điểm
hiển vi, tác dụng ức chế sản sinh Nitric oxid và chưa làm rõ được khả năng ức chế vi
sinh vật của các thành phần trong tinh dầu. Bởi vậy, các dữ liệu về lồi này cịn tương
đối hạn chế. Bên cạnh đó, chúng tơi cũng mong muốn đánh giá một số tác dụng khác
của tinh dầu từ loài này như tác dụng ức chế sản sinh nitric oxid cũng như xác định các
hợp chất có hoạt tính trong tinh dầu dựa trên phương pháp sàng lọc ảo.
Do đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Đặc điểm hiển vi, thành phần hóa học và
thăm dò tác dụng kháng vi sinh vật, tác dụng ức chế sản sinh nitric oxid in vitro &
in silico của tinh dầu loài Conamomum rubidum (Lamxay & N.S.Lý) Škorničk. &
A.D.Poulsen, họ Gừng”
Đề tài tiến hành với các mục tiêu sau:
- Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột phần trên mặt đất và thân rễ.
- Định tính thành phần hóa học và phân tích thành phần tinh dầu phần trên mặt
đất và thân rễ
- Đánh giá tác dụng kháng khuẩn, ức chế sản sinh nitric oxid in vitro của tinh
dầu phần trên mặt đất và thân rễ; tiến hành nghiên cứu mô phỏng docking phân tử
khảo sát cơ chế kháng khuẩn, kháng nấm của một số thành phần chính trong tinh dầu.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật chi Conamomum Ridl.
1.1.1. Lịch sử phân loại chi Conamomum Ridl.
Chi Conamomum Ridl. là một chi nhỏ trong Họ Zingiberaceae Martiov, chỉ có 12
lồi được cơng nhận trên tồn thế giới, chủ yếu phân bố ở đất thấp thường xanh và

rừng trên núi ở các nước Đông Nam Á, như Việt Nam, Campuchia, Thái Lan,
Malaysia, Singapore, Sumatra và Borneo [23]. Chi này được đặc trưng bởi mào bao
phấn hình sừng có ba thùy với các thùy bên hẹp và hướng xuống dưới. Conamomum
được Ridley xác lập đầu tiên vào năm 1899 với một loài là C. utriculosum Ridl., được
phát hiện tại vườn chè ở bang Perak Malaysia [22]. Holttum (1950) đã chuyển loài này
sang Amomum Roxb., và tên gọi này đã được các nhà thực vật học chấp nhận trong
hơn 50 năm [22]. Tuy nhiên, dựa trên sự kết hợp của phân tử (nrITSvà matK) và bằng
chứng hình thái học, nhà thực vật học De Boer đề xuất Conamomum là một chi riêng
biệt bởi vậy năm 2018, chi Conamomum Ridl. được chính thức cơng nhận [22].
1.1.2. Các lồi thuộc chi Conamomum và (phân bố của chúng)
Chi Conamomum bao gồm 12 lồi được cơng nhận là: Conamomum citrinum
Ridl., Conamomum utriculosum (Ridl.) Škorničk. & A.D.Poulsen, Conamomum
cylindraceum Ridl. Škorničk. & A.D.Poulsen, Conamomum spiceum Ridl. Škorničk. &
A.D.Poulsen, Conamomum xanthophlebium (Baker) Škorničk. & A.D.Poulsen,
Conamomum odorum Luu, H.Đ.Trần & G.Tran, Conamomum squarrosum (Ridl.)
Škorničk. & A.D.Poulsen, Conamomum vietnamense N.S.Lý & T.S. Hoang,
Conamomum pierreanum (Gagnep) Škorničk. & A.D.Poulsen, Conamomum
cyclindrastachys (K.Schum.) Škorničk. & A.D.Poulsen, Conamomum flavidum (Ridl.)
Škorničk. & A.D.Poulsen, Conamomum rubidum (Lamxay & N.S.Lý) Škorničk. &
A.D.Poulsen [37].
Trong đó có 3 lồi đã được công bố ở Việt Nam là Conamomum rubidum
(Lamxay & N.S.Lý) Škorničk. & A.D.Poulsen, Conamomum odorum Luu, H.Đ.Trần
& G.Tran và Conamomum vietnamense N.S.Lý & T.S. Hoang [37].
1.1.2.1. Conamomum citrinum Ridl.
Tên đồng nghĩa: Amomum citrinum, Amomum cylindrostachys
Phân bố: Loài này đã được tìm thấy ở Bán đảo Malaysia và vùng Tây Bắc của
Sumatera
Đặc điểm thực vật

2

Có cùng họ với A. squarrosum Ridl., khác biệt như sau: Lá khá rộng (rộng đến 8
cm), nhẵn ở mặt dưới; cuống lá không quá 5 mm. dài. Cuống dài 25-40 cm; bẹ ngắn.
Tổng bao cứng hơn, rộng hơn một chút, khơng có bẹ, màu xanh lục hồn tồn, nhẵn.
Đỉnh bao phấn có đốm đỏ, các thùy bên màu đỏ.
1.1.2.2. Conamomum utriculosum (Ridl.) Škorničk. & A.D.Poulsen
Phân bố: Loài này đã được tìm thấy ở Bán đảo Malaysia tới phía Bắc và Trung
của Sumatera.
Đặc điểm thực vật
Thân rễ rất to nhô cao hẳn so với mặt đất trên rễ mập, dày. Thân cây cao khoảng
2m hình chùy ở gốc. Lá hình mũi mác hoặc hình mác thn dài, hình mũi mác thn
nhọn ở gốc. Lá bắc hình bầu dục, bao quanh một hoa đơn, sáu thùy, xẻ gần đến gốc ở
mặt trong, có các thùy nhọn. Đài hình bầu dục dài hơn ống tràng và ngắn hơn lá bắc
trong, 3 thùy trịn tù và dày, các thùy dưới thn dài, tù, mỏng có các chấm, một thùy
trịn rộng hơn nhiều ở đỉnh.
Thân rễ bám trên rễ cọc, mập mạp. Chồi lá cao 2-2,5 m. Lá to 70 x 13 cm, nhẵn,
đỉnh hơi nhọn, gốc hình nêm hẹp; cuống lá 1-2 cm, nhẵn. Cuống 12-20 cm, nhẵn. Đài
hoa ngắn hơn lá bắc, có bầu nhụy tới 2 cm, nhẵn, rộng, đỉnh chia thùy rộng. Tràng hoa
hầu như không dài bằng đài hoa; thùy 1-7 cm. Cánh mơi màu vàng có gân đỏ.
1.1.2.3. Conamomum cylindraceum Ridl. Škorničk. & A.D.Poulsen
Phân bố: Loài này đã được tìm thấy ở Bán đảo Malaysia tới phía Bắc và Trung
của Sumatera.
Đặc điểm thực vật
Chồi lá tới 2 m hoặc cao hơn. Lá to 50 x 8 cm, nhẵn, khi khơ có màu xanh xám
khá nhạt, đỉnh hơi nhọn, gốc thu hẹp dần, hình nêm; cuống lá khơng có; dây chằng
lớn, đến 2 cm dài, rộng, nhẵn. Cuống hoa dường như trên mặt đất, đến 17 cm dài, mập
mạp, mang các bẹ dai chắc xen kẽ dài tới 4 cm trục dài, có nhiều lơng ngắn. Cụm hoa
dài dần đến 17 cm dài, hình trụ, khoảng 4 cm rộng. Lá bắc ngắn hơn nhiều so với đài
hoa, đài hoa dài 1,5 cm, hình ống, đỉnh gần như cụt, có lông. Tràng hoa - ống khoảng

8 mm. Đỉnh bao phấn màu cam, thn dài, có một điểm ở mỗi bên. Quả khơng cuống,
hình cầu, đường kính gần 1,5cm, bao bởi các lá bắc dai, có gân dọc nhẹ, phủ lơng ngắn
[25].
1.1.2.4. Conamomum spiceum Ridl. Škorničk. & A.D.Poulsen
Phân bố: Loài này được phát hiện ở Bán đảo Malaysia
3


Đặc điểm thực vật
Cành lá mọc sát nhau, khoảng 2 m. cao. Lá dài khoảng 60 cm, rộng khoảng 25cm, thu hẹp dần về đỉnh (không đuôi) và gốc, nhẵn; cuống lá to khoảng 2 cm. Cuống
to khoảng 5 cm, có lơng ngắn. Cụm hoa dài khoảng 20 cm, mảnh, đường kính khoảng
5 cm. Lá bắc có hình dạng như ở A.xanthophlebium, 4 cm, mép có lơng. Đài hoa 2,5
cm, nhiều lông. Tràng hoa dài bằng đài hoa; thùy màu đỏ xỉn, khoảng 2,5 cm, có mũ ở
đỉnh, chếch một góc nhỏ so với mơi, các thùy bên hẹp hơn. Mơi dài hơn tràng hoa một
chút, thùy hình trứng, hầu như khơng có thùy, hai bên về phía gốc cong lên và chạm
vào thùy tràng hoa ở lưng, đỉnh hơi lõm, màu vàng, có các vết nhỏ màu đỏ ở hai bên
gần gốc ở giữa.
1.1.2.5. Conamomum xanthophlebium (Baker) Škorničk. & A.D.Poulsen
Phân bố: Lồi này được tìm thấy trong rừng chỗ đất thấp ở tất cả các vùng của
Malaya về phía bắc đến Perak và ở độ cao hơn 1000m
Đặc điểm thực vật
Thân rễ ở hoặc ngay dưới mặt đất. Cành lá dài tới 5 m. cao, bẹ màu xanh hoặc
vàng nâu ở gốc thân. Lá màu xanh đậm, nhẵn, to khoảng 80 x 12 cm, đỉnh ngắn nhọn,
gốc hình nêm, không bằng nhau; cuống lá 1-2-5 cm. Cuống thường 10-15 cm, cá biệt
tới 40 cm, phủ nhiều bẹ chồng lên nhau. Cụm hoa dài khoảng 12-24, đường kính
khoảng 8-9 cm. Lá bắc biến đổi, dài 5-7 cm, rộng 2-4 cm, đỏ đậm, mỏng, có gân dọc
hẹp hơi nhơ lên, mặt ngồi nhẵn hoặc ít nhiều có lơng dai, các lơng mềm. Lá bắc dài
3,5-5,5 cm, khơng hình ống, 3 thùy, các thùy to 2 cm, nhọ. Đài hoa 2-3-5 cm (kể cả
bầu nhụy), có lơng, chia thùy dài khoảng 1/3 chiều dài, tràng hoa dài bằng đài hoa;
thùy đỏ thẫm; thuỳ lưng dài 2,5 cm và rộng 2 cm. Nhị hoa màu trắng. Bao phấn màu

vàng. Quả hình trứng, dài 2cm, rộng 1,5 cm, nhẵn, được bao phủ bởi những sợi lông
mềm mượt. Các cụm hoa lớn và các lá bắc lớn màu đỏ sẫm có gân mịn là đặc trưng.
Có rất nhiều biến thể về hình dạng của các lá bắc, thực vật vùng núi thường có chúng
rộng hơn vùng đồng bằng.
1.1.2.6. Conamomum odorum Luu, H.Đ.Trần & G.Tran
Phân bố: là 1 lồi mới ở tỉnh Khánh Hịa, miền Trung Việt Nam [30].
Đặc điểm thực vật
Nó được đặc trưng bởi mùi ngọt ngào, lá có vân và hình elip hẹp với cuống lá
ngắn và dây chằng, cụm hoa hình trứng tụ lại, đài hoa có lơng mu, thùy tràng hoa màu
kem, nhãn màu vàng, hình trứng với các dải màu đỏ ở giữa ở gốc và bầu nhụy có lơng.
C.odorum được minh họa bằng các bức ảnh chi tiết về các đặc điểm chính và so sánh
về mặt hình thái với các đồng loại gần nhất của nó là C. piereanum và C. rubidum[30]
4


Cây thảo mọc thành bụi, cao tới 1,2 m với 10–24 lá trên thân giả; thân rễ phân
nhánh, đường kính 4–6 mm, bên ngoài màu xanh kem, bên trong màu kem khoảng
cách giữa các thân giả là 4–8 cm, vảy rộng hình tam giác, dài 10–24 mm rộng 14–20
mm, nâu, mỏng như giấy, đỉnh nhọn. Thân giả phình ở gốc (đường kính khoảng 2,5
cm), lúc non màu hồng sau chuyển sang màu xanh; dây chằng dài 1–2 mm, màu lục
nhạt, nhẵn; cuống lá dài 2–4 mm, màu lục nhạt; phiến lá hình elip hẹp, 25–30 × 3–3,5
cm, nhẵn, mặt trên xanh đậm, có vân, mặt dưới màu sáng hơn, đơi khi sáng tím, gốc
đậm, đỉnh nhọn đến đi, dài 1 cm, mép nguyên. Cụm hoa hình trứng, mọc thẳng từ rễ
leo [30].
1.1.2.7. Conamomum squarrosum (Ridl.) Škorničk. & A.D.Poulsen
Phân bố: Loài hoa nhỏ này đã được tìm thấy ở vùng đất thấp Perak, Trengganu
và Malacca.
Đặc điểm thực vật
Thân lá mọc sát nhau, tới 3 hay 4 m dài, 2/5 gốc trụi lá, bẹ hơi vàng, hơi đỏ ở gốc
thân. Lá to 55 x 6 cm, mặt trên hẹp hơn nhiều, mặt dưới có lơng ngắn khắp mặt, đỉnh

nhọn, gốc hình nêm hẹp; cuống lá 0-2 cm, thon, có lơng ngắn mặt dưới hoặc sáng
bóng; dây chằng ngun vẹn, thường có lơng ngắn, to khoảng 1 cm dài. Cuống 10-15
cm dài, bẹ dài khoảng 3,5 cm dài và 3 cm tách rời, rộng, chắc, đỉnh tròn với một điểm
dưới đỉnh ngắn. Cụm hoa dài khoảng 10 cm, gốc được bao bọc bởi hai bẹ lớn giống
như ở cuống. Nhị có thùy nhỏ hình tam giác ở gốc mơi, mép gốc 3 mm, mép xa 2 mm.
Bao phấn khoảng 8 mm. Đầu nhụy hình chén, lỗ hẹp hình elip ngang, nhẵn. Quả được
bao bọc bởi những lá bắc, trịn, nhẵn hoặc hơi có gờ dọc về phía đỉnh, khoảng 1-3 cm
vách mỏng, đỉnh có đài hoa bền.
1.1.2.8. Conamomum vietnamense N.S.Lý & T.S. Hoang
Phân bố: Được tìm thấy ở Tây Nguyên, Việt Nam [22]
Đặc điểm thực vật
Nó giống nhất với C.odorum và C.rubidum, nhưng khác ở chỗ có rễ cọc phát
triển tốt, phiến lá hình elip, lá bắc hình trứng hẹp, lá bắc có lông tơ ở trục, đài hoa dài
hơn với 2 thùy cụt, hình trứng rộng đến hình cầu, nhụy dài và lộng lẫy [22].
Cây thảo mảnh, mọc thành bụi, cao 1,2–2 m. Thân rễ ngang. cách mặt đất 20–50
cm bởi nhiều rễ cọc, dài 10–42,5 cm, đường kính 0,5–1 cm, hơi thơm; rễ cọc mập,
màu nâu sẫm đến xanh nâu, 20–70 × 0,5–0,7 cm, nhẵn; khoảng cách giữa các thân giả
2,8–5 cm, được bao phủ bởi khoảng. 8 vảy tinh; vảy có lơng, hình tam giác rộng,
khoảng 1 × 1,5 cm, có vảy cứng, có vân, mặt ngồi có lơng tơ, đỉnh rộng và nhọn đến
nhọn với một đầu có chất nhầy ngắn. Cành lá 3–10 mỗi khóm; thân giả cao 1–1,5 m,
5


mỗi giả có 9–16 lá, phình to ở gốc, đường kính 1,6–1,8 cm, nhỏ dần về đỉnh, màu xanh
lục, có vân, nhẵn, mặt ngoài dạng lưới mịn. Quả trưởng thành hình cầu con, 13–15 ×
10–12 mm, màu đỏ, nhẵn, có lơng, đài hoa bền, chứa 10–15 hạt; hạt hình cầu con
khơng đều, 3–3,5 ×2– 2,5 mm, màng hạt màu trắng [22].
1.1.2.9. Conamomum pierreanum (Gagnep) Škorničk. & A.D.Poulsen
Phân bố: Thái Lan, Campuchia [15].
Đặc điểm thực vật

Tương tự như C.rubidum và C.odorum, tuy nhiên C.pierreanum có rễ cọc, cuống
lá ngắn hơn, phiến lá lớn hơn, thn dài, kích thước 30-50 x 5-8 cm. Cụm hoa hình
cầu hoặc hình trứng, mọc gần gốc thân rễ. Mặt ngồi của lá bắc có lơng tơ [15].
1.1.2.10. Conamomum cyclindrastachys (K.Schum.) Škorničk. & A.D.Poulsen
Phân bố: Loài này được phát hiện ở Borneo (Sarawak)
Đặc điểm thực vật
Thân cây khoảng gần 2m. Lá hình mũi mác nhọn có đi nhẵn, thuôn dần về gốc,
bẹ nhẵn. Các cuống được bao phủ bởi các bẹ thn. Lá bắc hình bầu dục hình mũi mác
dài nửa inch, có màu xanh lục. Đài hoa màu nhạt với ba thùy ngắn. Tràng hoa dài,
thùy hẹp hình mũi mác màu trắng. Mơi 3 thùy, thùy giữa thuôn dài màu vàng đậm hơn
ở tâm với 2 vết đỏ ở gốc. Đỉnh bao phấn, ba lỗ màu đỏ sẫm, thùy trung tâm rất ngắn,
các bên hẹp cong hình vịng cung.
1.1.2.11. Conamomum flavidum (Ridl.) Škorničk. & A.D.Poulsen
Phân bố: Loài này được phát hiện ở Borneo (Sarawak)
Đặc điểm thực vật
Thân cây khơng mập lắm. Lá hình mũi mác nhọn thu hẹp ở gốc thành cuống lá
ngắn. Cành dày đặc, nhiều hoa hình trụ trên một cuống, bẹ lá nhẵn, trục lá có lơng tơ.
Đài hoa rất nhọn và nhẵn, hình chng ngắn có 3 thùy, thùy ngắn. Cánh hoa thn dài
màu vàng đỏ. Bao phấn có 2 cánh bên, khơng có mào đầu. Quả nang.
1.1.3. Thành phần hóa học chi Conamomum
Trong số các loài thuộc chi Conamomum, Lê Thị Hương cùng các cộng sự đã
chỉ ra có 36 hợp chất chiểm 95,4% tổng hàm lượng tinh dầu thân rễ từ loài C. rubidum
(syn. Amomum rubidum) thu ở vườn quốc gia Bidoup, Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng được
xác định bằng GC/MS ( Bảng 1.1). Trong đó Monoterpen là hợp chất chiếm ưu thế với

6


83,3%. Thành phần chính của tinh dầu là β-Phellandren (16,1%), limonen (14,4 %), δ3-caren (13,9%) …[8]
Bảng 1.1. Bảng thành phần hóa học từ tinh dầu thân rễ lồi Conamomum rubidum.

STT RT (min)

Thành phần

RIcal

RIlit.

Hàm lượng
(SD)

1

9.87

-Thujen

930

921

0,2 ± 0,01

2

10.14

-Pinen

939

932

7,7 ± 0,21

3

10.55

-Fenchen

953

946

0,3 ± 0,00

4

10.64

Camphen

955

950

1,5 ± 0,00

5

11.52

-Pinen

985

978

6,9± 0,10

6

11.75

Myrcen

992

990

2,6 ± 0,01

7

12.35

-Phellandren

1011

1004

6,9 ± 0,50

8

12.56

-3-Caren

1017

1014

13,9 ± 0,75

9

12.75

-Terpinen

1022

1022

1,8 ± 0,00

10

13.03

p-Cymen

1030

1026

3,1 ± 0,00

11

13.19

Limonen

1035

1030

14,4 ± 0,12

12

13.26

-Phellandren

1037

1034

16,1 ± 0,56

13

13.30

1,8-Cineole

1038

1036

1,8 ± 0,00

14

14.68

(E)--Ocimen

1059

1044

1,3 ± 0,01

15

14.17

-Terpinen

1064

1062

3,5± 0,00

16

15.22

Terpinolen

1095

1090

2,8 ± 0,01

17

18.93

-Terpineol

1200

1198

0,2 ± 0,00

18

19.87

Fenchyl acetat

1228

1228

1,3 ± 0,00

19

20.29

Thymol methyl ether

1240

1244

1,3 ± 0,00

20

22.17

Bornyl acetat

1294

1294

3,1 ± 0,00

21

25.32

-Copaen

1385

1385

0,4 ± 0,00

22

26.67

-Santalen

1432

1432

0,2 ± 0,00

23

26.84

-Caryophyllen

1437

1435

0,4 ± 0,00

24

27.93

-Humulen

1472

1467

1,1 ± 0,01

25

28.87

Aristolochen

1502

1498

0,4 ± 0,00

26

29.13

-Amorphen

1510

1512

0,2 ± 0,00

27

29.20

trans-Muurola-4,5-dien

1513

1512

0,3 ± 0,01

7


28

29.24

-Muurolen

1514

1515

0,1 ± 0,00

29

29.93

-Cadinen

1537

1535

0,2 ± 0,00

30

29.99

cis-Calamenen

1539

1540

0,1 ± 0,00

31

30.27

trans-Cadina-1,4-dien

1549

1545

0,2 ± 0,00

32

30.94

(E)-Nerolidol

1571

1568

0,5 ± 0,01

33

32.73

Humulene epoxide II

1632

1634

0,2 ± 0,00

34 33.58
Cadinol)

epi--Cadinol (=-

1662

1668

0,2 ± 0,00

35

34.02

ar-Turmeron

1678

1676

0,3 ± 0,00

36

34.18

Intermedeol

1682

1688

0,6 ± 0,00

Tổng

95,4

Monoterpen (1-12, 14-16)

83,3

Monoterpenoid (13, 17- 20)

6,7

Sesquiterpen (21-31)

3,6

Sesquiterpenenoid (32-36)

1,8

Và theo nghiên cứ khác đầy đủ hơn của Lê Thị Hương cùng các cộng sự đã chỉ ra
58 thành phần hóa học có trong lá và thân lồi Conamomum rubidum [10]. Trong đó,
mẫu lá có 30 hợp chất chiếm 99,1% tổng hàm lượng tinh dầu, mẫu thân có 49 thành
phần, chiếm 97,4% tổng hàm lượng tinh dầu. Ngoài ra, các thành phần chiếm tỉ lệ lớn
nhất là 1,8-cineol (1,9-37,7%), δ-3-caren (19,5-21,9%) và limonen (16,3-17,8%). Chi
tiết các thành phần được thể hiện trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Bảng thành phần hóa học từ tinh dầu lá và thân loài Conamomum rubidum.
Hàm lượng
STT

RT
(min)

RI

Thành phần

cal.

lit.

RI

Lá

Thân

1

8.97

2-Heptanol

900

890

0,1

-

2

10.14

α -Pinen

939

932

3,0

5,8

3

10.56

α -Fenchen

953

946

0,4

0,4

4

10.64

Camphen

955

950

0,6

0,6

5

11.51

β -Pinen

984

978

0,2

1,2

6

11.75

Myrcen

992

988

2,7

3,4

8


7

12.35

α -Phellandren

1011

1004

2,4

4,7

8

12.56

δ -3-Caren

1017

1014

19,5

21,9

9

12.75

α -Terpinen

1022

1022

0,9

1,1

10

12.91

δ -Cymen

1027

1024

-

0,3

11

13.03

o-Cymen

1030

1026

2,5

3,8

12

13.19

Limonen

1035

1030

16,3

17,8

13

13.25

β-Phellandren

1037

1032

-

14,6

14

13.32

1,8-Cineol

1039

1036

37,7

1,9

15

13.68

(E)-β-Ocimen

1049

1043

0,2

0,7

16

14.16

γ-Terpinen

1064

1060

1,4

1,0

17

15.17

2-Nonanon

1093

1092

0,3

-

18

15.22

Terpinolen

1095

1094

2,0

2,8

19

15.31

Fenchon

1097

1096

0,2

-

20

15.47

2-Nonanol

1102

1100

1,7

0,2

21

15.53

Linalool

1103

1102

0,6

-

22

16.12

p-Ethylanisol

1120

1122

0,2

-

23

16.24

endo-Fenchol

1124

1124

0,3

-

24

17.55

Camphene
hydrat

1161

1165

0,2

-

25

17.84

p-Mentha-1,5-

1169

1170

-

0,1

dien-8-ol
26

18.13

Borneol

1178

1178

0,7

-

27

18.48

Terpinen-4-ol

1187

1180

0,8

-

28

18.80

Cryptone

1197

1192

-

0,3

29

18.94

α -Terpineol

1201

1200

2,5

0,2

30

21.17

(2E)-Decenal

1265

1264

-

0,3

31

22.40

Dihydroedulan

1301

1302

0,2

0,3

32

22.59

Terpinen-4-ol

1307

1310

-

0,2

acetat
33

24.25

α -Terpinyl acetat

1357

1356

-

0,1

34

25.32

α -Copaen

1389

1387

0,2

1,2

35

26.66

α -Santalen

1431

1431

0,2

0,3

36

26.84

β-Caryophyllen

1437

1435

0,2

1,0

37

27.93

α -Humulen

1472

1475

0,4

2,9

9


38

28.53

γ -Muurolen

1491

1490

-

0,3

39

28.76

Germacrene D

1498

1498

-

0,2

40

28.87

Aristolochen

1502

1500

-

0,3

41

28.97

β-Selinen

1505

1502

-

0,3

42

29.15

trans-Muurola4(14),5-dien

1511

1512

-

0,5

43

29.20

(E,E)-α-Farnesen

1513

1513

0,5

0,3

44

29.24

α -Muurolen

1514

1515

-

0,2

45

29.36

β-Bisabolen

1518

1520

-

0,3

46

29.74

γ -Cadinen

1531

1531

-

0,1

47

29.93

δ -Cadinen

1537

1535

-

0,4

48

30.00

cis-Calamenen

1539

1540

-

1,7

49

30.27

trans-Cadina-1,4dien

1549

1545

-

0,3

50

30.94

(E)-Nerolidol

1571

1569

-

0,4

51

31.77

Spathulenol

1599

1600

-

0,1

52

31.96

Caryophyllene

1605

1602

-

0,6

1632

1634

-

1,1

oxid
53

32.73

Humulene
Epoxide II

54

33.16

1-epi-Cubenol

1648

1650

-

0,2

55

33.58

epi- α -Cadinol

1662

1662

-

0,3

56

33.93

α -Cadinol

1675

1670

-

0,2

57

34.02

ar-Turmeron

1678

1678

-

0,5

58

35.07

Curlon

1716

1714

-

0,2

Tổng

99,1

97,4

Monoterpen (2-13, 15, 16, 18)

52,1

80,1

Monoterpenoid (14, 19, 21, 23-29, 31-33)

43,2

3,1

Sesquiterpen (34-49)

1,5

10,3

-

3,5

2,3

0,5

Sesquiterpenoid (50-58)
Thành phần khác (1, 17, 20, 22, 30)

Bên cạnh đó, Salasiah M. và cộng sự (2022) đã nghiên cứu thành phần tinh dầu
của một số loài thuộc họ Zingiberaceae ở Sarawak, Malaysia; trong đó có 2 lồi là
Conamomum xanthophlebium và Conanmomum cylindrostachys có hàm lượng tinh
10


dầu khoảng trên 0.05%. Cụ thể, monoterpen là nhóm chiếm hàm lượng nhiều nhất,
khoảng 35,71-42,19% với sabinen là thành phần chính (16,4-17,74%). Tiếp theo đó là
nhóm monoterpen chứa oxy và sesquiterpen với hàm lượng trên 20%, trong đó C.
xanthophlebium có terpinen-4-ol nhiều hơn C. cylindrostachys, còn C. cylindrostachys
lại trội hơn về thành phần α-terpineol. Ngoài ra, báo cáo cũng cho thấy có các thành
phần khác thuộc nhóm sesquiterpen chứa oxy, diterpen… với hàm lượng được trình
bày ở Bảng 1.3 [26]
Bảng 1.3. Bảng thành phần hóa học từ tinh dầu Conamomum xanthophlebium và
Conanmomum cylindrostachys
Hàm lượng (%)
STT

Thành phần

Phân loại

C.
xanthophlebium

C.
cylindrostachys

1

(Z)-β-ocimen

Monoterpen

0,05

0,13

2

4-caren

Monoterpen

1,94

-

3

Camphen

Monoterpen

-

0,26

4

Limonen

Monoterpen

1,09

-

5

p-cymen

Monoterpen

1,37

3,6

6

p-mentha-1,5,8trien

Monoterpen

0,05

-

7

sabinen

Monoterpen

16,4

17,74

8

α-terpinen

Monoterpen

5,07

4,55

9

α-thujen

Monoterpen

0,94

2,02

10

α-pinen

Monoterpen

2,25

4,14

11

β-pinen

Monoterpen

-

4,16

12

δ-terpinen

Monoterpen

6,55

5,59

35,71

42,19

Tổng
13

bornyl acetat

Monoterpenoid

0,17

0,21

14

cis-piperitol

Monoterpenoid

-

0,94

15

eugenol

Monoterpenoid

-

1,42

16

geranial

Monoterpenoid

0,35

0,67

11


17

geranyl acetat

Monoterpenoid

0,23

0,11

18

linalool

Monoterpenoid

3,15

0,08

19

neral

Monoterpenoid

0,12

0,27

20

nerol

Monoterpenoid

0,15

0,14

21

p-cymen-7-ol

Monoterpenoid

-

0,5

22

sabinene hydrat

Monoterpenoid

2,02

3,11

23

terpinen-4-ol

Monoterpenoid

13,7

-

24

terpinen-4-ol acetat

Monoterpenoid

0,08

0,28

25

trans-p-menth-2en-1-ol

Monoterpenoid

0,99

2,33

26

α-terpineol

Monoterpenoid

2,26

13,11

27

α-terpinyl acetat

Monoterpenoid

1,55

1,96

28

carvacrol

Monoterpenoid

0,07

-

24,84

25,13

Tổng

Ngoài ra, khi nghiên cứu về loài Conamomum vietnamense Nguyễn Danh Đức
và cộng sự đã chỉ ra thành phần hóa học của tinh dầu được phân tích và trình bày trong
Bảng 1.4 theo đó có tổng cộng 52 hợp chất trong thân rễ và 28 hợp chất trong lá có thể
xác định được, chiếm 99,35% và 99,83% hàm lượng chất dễ bay hơi. Như có thể thấy
từ Bảng 1.4, các thành phần chính của cả hai mẫu tinh dầu hầu như tương tự nhau. Cụ
thể, đáng chú ý là eucalyptol là thành phần chiếm ưu thế trong các mẫu dầu thân rễ và
lá với 40,47% và 49,49% tổng hàm lượng tương ứng. Tiếp theo đó, Limonen được xác
định là loại dầu có thành phần cao thứ hai với hàm lượng lần lượt là 18,74% và

26,20%. Hai monoterpen, α-pinene và α-phellandrene, cũng có mặt trong cả hai loại
tinh dầu với tỷ lệ phần trăm tương tự nhau (3,30–4,91%) [23] .
Bảng 1.4. Bảng thành phần hóa học từ tinh dầu thân rễ và lá loài Conamomum
vietnamense
STT

Thành phần

RIcal.

RT

RIlit.

Hàm lượng (%)
Thân rễ

Lá

1

α-Pinen

5.548

939

937

3,60

4,91

2

Camphen

5.908

955

952

1,42

0,66

12


3

β-Pinen

6.612

981

979

0,42

1,27

4

β-Myrcen

6.938

993

991

1,25

2,36

5

α-Phellandren

7.333

1007

1005

3,30

3,77

6

3-Caren

7.499

1013

1011

0,34

0,09

7

α-Terpinen

7.676

1020

1017

1,70

1,47

8

p-Cymen

7.905

1029

1025

1,33

1,29

9

Limonen

8.048

1034

1030

18,74

26,20

10

Eucalyptol

8.134

1037

1032

40,47

49,49

11

cis-β-Ocimen

8.271

1042

1038

0,11

0,07

12

trans-β-Ocimen

8.58

1052

1049

1,50

0,34

13

γ-Terpinen

8.924

1063

1060

0,64

1,37

14

Terpinolen

9.845

1091

1088

0,74

0,71

15

2-Nonanon

9.937

1094

1092

0,05

0,16

16

Linalool

10.177

1100

1099

3,23

0,87

17

exo-Fenchol

10.635

1116

1115

0,40

0,18

18

Camphor

11.659

1149

1145

0,10

-

19

Camphene hydrat

11.779

1153

1148

0,07

-

20

endo-Borneol

12.334

1170

1167

2,19

0,49

21

Terpinen-4-ol

12.723

1181

1177

0,58

0,46

22

α-Terpineol

13.158

1193

1189

2,43

1,84

23

Fenchyl acetat

14.142

1224

1123

0,17

-

24

Bornyl acetat

16.317

1289

1285

0,74

-

25

Dihydroedulan

16.408

1291

1293

-

0,06

26

2-Undecanon

16.545

1295

1294

-

0,15

27

α-Copaen

19.229

1382

1376

0,87

-

28

Methyl cinnamat

19.418

1385

1380

-

0,08

29

Caryophyllen

20.608

1423

1419

0,57

0,21

30

Humulen

21.661

1458

1454

0,14

-

31

Alloaromadendren

21.884

1465

1461

0,12

-

13


32

Cadina-1(6),4-dien

22.268

1478

1481

0,33

-

33

γ-Muurolen

22.348

1480

1477

0,3

-

34

Aristolochen

22.599

1488

1487

0,21

0,1

35

β-Eudesmen

22.657

1490

1486

0,16

-

36

α-Selinen

22.914

1498

1494

0,35

-

37

Epizonaren

23.023

1501

1051

0,71

-

38

β-Bisabolen

23.292

1511

1509

0,10

-

39

γ-Cadinen

23.481

1518

1513

0,20

0,08

40

Cadina-3,9-dien

23.755

1527

1518

1,47

-

41

Cadina-1(10),4dien

23.824

1530

1524

1,04

0,05

42

Cubenen

24.018

1537

1532

0,98

-

43

α-Calacoren

24.333

1547

1542

0,09

-

44

(±)-transNerolidol

24.911

1567

1564

1,21

1,1

45

Palustrol

25.06

1572

1567

0,07

-

46

Caryophyllenyl
alcohol

25.129

1574

1570

0,11

-

47

(-)-Globulol

25.529

1588

1580

0,19

-

48

Guaiol

25.924

1600

1596

0,11

-

49

Epicubenol

26.788

1633

1627

0,43

-

50

γ-Eudesmol

26.880

1636

1631

0,63

-

51

α-epi-Cadinol

27.183

1647

1640

0,77

-

52

δ-Cadinol

27.286

1651

1645

0,29

-

53

β-Eudesmol

27.400

1655

1649

0,68

-

54

α-Eudesmol

27.486

1658

1653

1,52

-

55

(+)-Intermedeol

27.646

1664

1667

0,18

-

99.35

99.83

Tổng

1.2 Tổng quan về phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxid in
vitro
14


Gốc tự do nitric oxid (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau. Dạng
•NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan
thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện các đáp ứng viêm [21].

Một phương pháp được sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu các thành
phần sản phẩm của nó (nitrat và nitrit). Phản ứng này đòi hỏi rằng nitrate (NO3) đầu
tiên được giảm thành nitrite (NO2), do tác động của nitrate reductase.

Nitrit được phát hiện và phân tích bằng cách hình thành một màu hồng đỏ khi
mẫu thử có chứa NO2- với thuốc thử Griess. [32]

Khi thêm acid sulphanilic, nitrit tạo thành muối diazonium, sau đó các thuốc
nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamin) được thêm vào để tạo thành màu hồng.
Phương

pháp

MTT

(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl

tetrazolium

bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng sống
sót của tế bào. Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase hoạt động mạnh, những
enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan khơng hồ tan, màu tím
đậm. Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT.
Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và
đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm
được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào [20].

1.3. Tổng quan về phương pháp đánh giá kháng vi sinh vật in vitro

15

Để đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của các mẫu . Tuy nhiên có 3 phương
pháp được sử dụng phổ biến là: phương pháp khuếch tán đĩa thạch, phương pháp pha
loãng thạch, phương pháp pha loãng nồng độ.
1.3.1. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch
Khuếch tán đĩa thạch là phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn được sử
dụng phổ biến trong phịng thí nghiệm. Ở phương pháp này, vi khuẩn được nuôi cấy
đến nồng độ nhất định rồi cấy lên toàn bộ bề mặt của thạch với tăm bông tiệt trùng để
chúng phát triển đồng đều trên đĩa thạch. Sau đó, các khoanh giấy tẩm mẫu thử được
đưa vào đĩa thạch hoặc mẫu thử được nhỏ vào các giếng thạch đục trên đĩa (khoanh
giấy hoặc lỗ thạch có đường kính 6 mm). Sau đó, các đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ và
thời gian thích hợp. Khi được ủ, dịch chiết tinh dầu dần dần khuếch tán qua môi
trường thạch và ức chế sự phát triển của các loài vi khuẩn được thử nghiệm. Cuối
cùng, vùng ức chế có thể được quan sát và đường kính của vùng được lấy làm phép
đo. Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá thơng qua chỉ tiêu đường kính vịng vơ
khuẩn. Đường kính vịng vơ khuẩn càng lớn, vi sinh vật càng nhạy cảm hơn với mẫu
thử [12]
Ưu điểm của phương pháp này là khá dễ thực hiện và tiết kiệm chi phí. Bên cạnh
đó, nó cho phép kiểm tra đồng thời một số lượng lớn các mẫu dễ dàng và linh hoạt,
phù hợp với các mẫu thử chưa tinh khiết.
Nhược điểm của phương pháp này là không đo được giá trị MIC (tức là không
định lượng được) và đối với những vi khuẩn khó ni cấy và phát triển chậm thì nó
khó kiểm tra tính nhạy cảm [34], [3]. Bên cạnh đó, tính phân cực của các hợp chất tự
nhiên có thể ảnh hưởng đến sự khuếch tán của các hợp chất lên mơi trường ni cấy.
Do đó, phương pháp này không phải lúc nào cũng đáng tin cậy để xác định hoạt tính
kháng khuẩn của chất có hoạt tính kháng khuẩn tự nhiên [13].
1.3.2. Phương pháp pha loãng thạch
Pha loãng thạch là một phương pháp giúp xác định nồng độ ức chế vi sinh vật tối
thiểu (MIC) của mẫu kiểm tra. Trong phương pháp này, mẫu thử được pha loãng 1/2

nối tiếp thành một dãy mẫu có nồng độ giảm dần theo cấp số nhân rồi thêm vào môi
trường thạch nóng chảy ở 45-50°C, trộn đều rồi đổ vào đĩa petri, bảo quản ở 2-8°C. Vi
sinh vật được nuôi cấy và pha lỗng đến nồng độ thích hợp rồi cấy lên đĩa thạch rồi ủ
ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Xác định đĩa có nồng độ tối thiểu ức chế được hoàn
toàn sự phát triển của vi sinh vật [24].

16


Ưu điểm của phương pháp pha loãng thạch là khả năng kiểm tra đồng thời tính
nhạy cảm của nhiều vi khuẩn trên cùng một đĩa và có thể kiểm tra tính nhạy cảm của
vi sinh vật khó ni cấy vì thạch có thể bổ sung thành phần hỗ trợ vi khuẩn phát triển.
Hơn nữa, phương pháp này có thể bán định lượng được giá trị MIC. Tuy nhiên, việc
pha loãng thạch không được sử dụng phổ biến trong hầu hết các phịng thí nghiệm vi
sinh do tốn nhiều thời gian, cơng sức và nó cũng khơng thích hợp với những mẫu thử
không bền với nhiệt [12].
1.3.3. Phương pháp vi pha loãng nồng độ
Trong phương pháp này, đĩa 96 giếng được sử dụng với mỗi giếng là một nồng
độ khác nhau của mẫu thử. Vi khuẩn được nuôi cấy và pha đến nồng độ thích hợp rồi
cấy vào các giếng. Sau đó, đĩa được ủ trong thời gian và nhiệt độ thích hợp. Giá trị
MIC là nồng độ thấp nhất mà khơng thấy có sự phát triển của vi sinh vật [24].
Đây là một phương pháp được ưu tiên nhiều hơn khi nghiên cứu về hoạt tính
kháng khuẩn của các dịch chiết từ thực vật, cho phép sử dụng một lượng nhỏ các hợp
chất hoặc chiết xuất thực vật cũng như mơi trường ni cấy và có thể đồng thời thử
nghiệm nhiều mẫu một cách dễ dàng [12].
1.4. Tổng quan về phương pháp mô phỏng phân tử Docking
Phương pháp protein docking ra đời từ những năm 1980 đã trở thành một trong
những phương pháp phổ biến trong việc thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, nhờ khả năng
dự đốn sự hình thành liên kết giữa cấu tử và receptor trong túi liên kết với độ chính
xác khá cao. Kỹ thuật này ứng dụng dữ liệu về cấu trúc protein được tạo ra bởi phương

pháp tinh thể học tia X, phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phương pháp
kính hiển vi điện tử lạnh để khảo sát tương tác giữa các phân tử nhỏ với protein. Mặc
dù không thể áp dụng phương pháp này cho mọi protein, nó vẫn cung cấp thông tin giá
trị về kiểu liên kết và tương tác ở nhiều protein. Docking đánh giá những liên kết có ý
nghĩa và độ bền cao, và thậm chí cịn có thể định lượng khả năng liên kết bởi các hàm
tính điểm, qua đó phân hạng khả năng liên kết mạnh yếu của các cấu tử. Nhờ ưu điểm
thực hiện trên máy tính với tốc độ càng ngày càng nhanh, chính xác và chi phí khơng
q lớn, protein docking dần được coi là bước khởi đầu cho nghiên cứu thiết kế thuốc
hiện đại [33]
Nguyên lý của Docking (Hình 1.1) thực chất một bài tốn tối ưu, tìm vị trí và
cấu hình phù hợp và đánh giá tương tác của một cơ chất gắn kết vào túi liên kết của
protein. Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu chính của docking là tìm ra cấu dạng mà
năng lượng tự do của tồn hệ là thấp nhất. Để tìm cấu dạng phù hợp nhất, các phần
17