Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano paclitaxel định hướng làm hỗn dịch tiêm truyền khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG ĐỨC THUẬN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN
NANO PACLITAXEL ĐỊNH HƯỚNG LÀM
HỖN DỊCH TIÊM TRUYỀN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2023


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG ĐỨC THUẬN
Mã sinh viên: 1801670

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN
NANO PACLITAXEL ĐỊNH HƯỚNG LÀM
HỖN DỊCH TIÊM TRUYỀN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Võ Quốc Ánh
2. TS. Đào Văn Nam
Nơi thực hiện:
Bộ mơn Hóa lý
Khoa Bào chế - Cơng nghệ dược phẩm

HÀ NỘI - 2023

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Võ
Quốc Ánh và TS. Đào Văn Nam – những người thầy đã tận tình truyền đạt những kiến
thức chuyên mơn, những kỹ năng và kinh nghiệm trong q trình thực nghiệm. Cảm ơn
các thầy đã dạy em những thái độ và suy nghĩ phù hợp khi đứng trước khó khăn trong
thực hiện khóa luận cũng như trong cuộc sống.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên, các bạn sinh viên
thuộc bộ mơn Hóa lý, Viện Cơng nghệ Dược phẩm Quốc gia, Bộ mơn Cơng nghệ sinh
học Dược, Bộ mơn Hóa sinh đã tạo điều kiện về thiết bị, máy móc và hóa chất trong q
trình thực nghiệm để hồn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Phịng Đào tạo, Khoa Bào chế và
Cơng nghệ dược phẩm, Khoa Cơng nghệ Sinh học, Khoa Cơng nghệ Hóa dược, Khoa
Khoa học cơ bản và các khoa phòng ban khác, các thầy cô và cán bộ nhân viên Trường
Đại học Dược Hà Nội đã dạy bảo, tạo điều kiện và giúp đỡ tơi hồn thành khóa học tại
trường cũng như thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã ln động viên và quan
tâm tôi trong thời gian vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2023

Hoàng Đức Thuận


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1.
1.1.

TỔNG QUAN .....................................................................................2

Vài nét về paclitaxel ............................................................................................ 2

1.1.1.

Cơng thức hóa học và tính chất lý hóa ............................................................... 2

1.1.2.

Dược động học ...................................................................................................2

1.1.3.

Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng ................................................................ 3

1.1.4.

Độc tính và tác dụng khơng mong muốn ...........................................................3

1.2.

Vài nét về đặc điểm hệ thống mạch máu của khối u và hiệu ứng tăng thấm

và lưu giữ (EPR) ............................................................................................................4
1.3.

Vài nét về các dạng bào chế của PTX ................................................................ 4

1.3.1.

PTX hòa tan trong Cremophor EL và ethanol ...................................................4

1.3.2.

Vài nét về nano PTX và một số nghiên cứu bào chế nano PTX........................5

1.4.

Vài nét về albumin và hệ tiểu phân nano albumin ...........................................8

1.4.1.

Albumin .............................................................................................................8

1.4.2.

Hệ tiểu phân nano albumin ................................................................................9

1.4.3.

Một số nghiên cứu về nano albumin khác .......................................................11

CHƯƠNG 2.
2.1.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................14

Nguyên vật liệu và thiết bị ................................................................................14

2.1.1.

Nguyên vật liệu ................................................................................................ 14

2.1.2.

Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 14

2.2.

Nội dung nghiên cứu .........................................................................................15

2.2.1.

Đánh giá các tính chất lý hóa của dược chất....................................................15

2.2.2.

Nghiên cứu bào chế HD nano albumin chứa PTX ..........................................15

2.2.3.

Đánh giá các đặc tính của HD nano .................................................................15

2.3.

Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................15

2.3.1.

Phương pháp bào chế .......................................................................................15

2.3.2.

Các phương pháp đánh giá...............................................................................17

2.3.3.

Phương pháp xử lý kết quả và biểu diễn số liệu ..............................................22

CHƯƠNG 3.

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................. 23


3.1.

Thẩm định phương pháp định lượng PTX .....................................................23

3.1.1.

Độ đặc hiệu ......................................................................................................23

3.1.2.

Độ thích hợp của hệ thống ...............................................................................23

3.1.3.

Độ tuyến tính ....................................................................................................23

3.1.4.

Độ tìm lại PTX .................................................................................................24

3.2.

Kết quả đánh giá một số đặc tính lý hóa của dược chất ................................ 25

3.2.1.

Đặc điểm của nguyên liệu PTX .......................................................................25

3.2.2.

Độ tan của PTX trong một số môi trường .......................................................25

3.3.

Kết quả nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano albumin chứa PTX ............26

3.3.1.

Khảo sát lựa chọn thành phần công thức. ........................................................26

3.3.1.
thuật

Lựa chọn khoảng biến thiên của các thành phần trong công thức và thông số kỹ
… ......................................................................................................................28

3.3.2.

Khảo sát ảnh hưởng của kỹ thuật bốc hơi dung môi đến đặc tính tiểu phân ...30

3.3.3.

Đánh giá độ ổn định của HD............................................................................31

3.3.4. Đánh giá ảnh hưởng của một số tỷ lệ thành phần và thông số kỹ thuật đến đặc
điểm phân bố KTTP của HD .........................................................................................31
3.3.5.
3.4.

Lựa chọn công thức để thực hiện các đánh giá các đặc tính của HD nano .....38
Đánh giá các đặc tính của HD nano.................................................................38

3.4.1.

Kết quả xác định tỷ lệ dược chất được nano hóa trong HD. ............................ 38

3.4.2.

Đánh giá khả năng hòa tan - khuếch tán của PTX từ HD ................................ 40

3.4.3.

Kết quả phổ hồng ngoại FT-IR ........................................................................42

3.4.4.

Kết quả phân tích nhiệt lượng quét vi sai ........................................................44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .........................................................................................46


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

AcOH

Acid acetic

CCM

Curcumin

CrEL

Cremophor EL

BSA

Albumin huyết thanh bị

D/N

Dầu/nước

DOXO

Doxorubicin

EE

Tỷ lệ dược chất được nano hóa (encapsulation efficiency)

EPR

Tăng tính thấm và lưu giữ

FDA

Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm

HD

Hỗn dịch

HPLC

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSA

Albumin huyết thanh người

KTTP

Kích thước tiểu phân

LC

Tỷ lệ dược chất trong hệ nano (loading efficiency)

PB KTTP

Phân bố kích thước tiểu phân

PTX

Paclitaxel

SLS

Natri lauryl sulfat

SPARC

Protein bài tiết chứa nhiều cystein (secreted protein and rich in cystein)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các ưu điểm của ABI-007 so với Taxol [16]..................................................7
Bảng 1.2. Một số đặc tính của Abraxane và mẫu bào chế [18] .....................................12
Bảng 2.1. Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ............................... 14
Bảng 2.2. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm................................ 14
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống .................................................23

Bảng 3.2. Diện tích píc ở các mẫu chuẩn có nồng độ từ 0,05 – 5,98 µg/mL ................23
Bảng 3.3. Thành phần mẫu thử và mẫu đối chứng ........................................................24
Bảng 3.4. Khả năng tạo NT của một số dung môi hữu cơ ............................................26
Bảng 3.5. Công thức khảo sát sự ảnh hưởng của DCM trong pha nước đến hệ tiểu phân
được tạo thành ...............................................................................................................27
Bảng 3.6. Phân bố kích thước tiểu phân của NT CT1, CT2 và CT3 ............................. 29
Bảng 3.7. Phân bố kích thước tiểu phân của mẫu CT1, CT4 và CT5 ........................... 29
Bảng 3.8. Phân bố kích thước tiểu phân của mẫu CT1, CT6 và CT7 ........................... 29
Bảng 3.9. Phân bố kích thước tiểu phân của mẫu CT6, CT8, CT9 và CT10 ................30
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp bay hơi dung môi đến PB
KTTP CT 11 ..................................................................................................................30
Bảng 3.11. PB KTTP của NT CT11 tại một số thời điểm sau khi bào chế ...................31
Bảng 3.12. Đặc điểm PB KTTP của HD CT11 sau các khoảng thời gian ....................31
Bảng 3.13. Các biến độc lập và khoảng biến thiên .......................................................32
Bảng 3.14. Các công thức trong thiết kế thí nghiệm .....................................................32
Bảng 3.15. Kết quả giá trị thực nghiệm của các biến đầu ra .........................................33
Bảng 3.16. Tham số thống kê của mơ hình, hệ số tương quan và giá trị p của các biến
đầu vào trong mô hình ...................................................................................................34
Bảng 3.17. Tham số thống kê, hệ số tương quan và giá trị p của các biến đầu vào sau
khi đã loại bỏ các biến đầu vào ảnh hưởng khơng có ý nghĩa thống kê ........................35
Bảng 3.18. Phân bố KTTP và kết quả định lượng PTX trong các khoảng KTTP của mẫu
N1 và N2 (n=3) ..............................................................................................................39
Bảng PL.4. Kết quả tỷ lệ PTX tự do, PTX trong phức hợp phân tử PTX-BSA tự do và
tiểu phân nano PTX và PTX trong tiểu phân lớn hoặc kết tinh


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 - Cơng thức hóa học của paclitaxel (PTX) .......................................................2
Hình 1.2. Cấu trúc không gian ba chiều của HSA và BSA .............................................9
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của PTX trong

khoảng 0,05 – 2,99 µg/mL. ........................................................................................... 24
Hình 3.2. Ngun liệu paclitaxel khi quan sát dưới kính hiển vi quang học vật kính 40,
thang đo 2 µm (A và B). ................................................................................................ 25
Hình 3.3. Ảnh hưởng của số chu kỳ đồng nhất hóa và tỷ lệ pha dầu đến KTTB TB, PDI,
KTTP TB píc chính và độ rộng của píc chính. .............................................................. 36
Hình 3.4. Đồ thị PB KTTP của HD N1 trước khi ly tâm theo cường độ tín hiệu (A), số
lượng (B) và thể tích (C). PB KTTP của HD N1 sau khi ly tâm theo cường độ tín hiệu
(D), số lượng (E) và thể tích (F). PB KTTP của BSA theo cường độ tín hiệu (G), số
lượng (H) và thể tích (I).................................................................................................37
Hình 3.5. Đồ thị phân bố kích thước tiểu phân của HD N2 khoảng KTTP (II) theo cường
độ tín hiệu (A), số lượng tiểu phân (B), thể tích (C). ....................................................39
Hình 3.6. Tỷ lệ PTX tự do, trong phức hợp PTX-BSA tự do, trong các tiểu phân nano
và PTX trong tiểu phân lớn hoặc kết tinh của N1 và N2 ..............................................40
Hình 3.7. Đồ thị hòa tan – khuếch tán PTX từ N1 và N2 trong môi trường đệm phosphat
đẳng trương pH 7,4 chứa SLS 1 % (n=3) ......................................................................41
Hình 3.8. Phổ hồng ngoại của nguyên liệu PTX, nguyên liệu BSA, dịch ly tâm N1 (sN1),
dịch ly tâm N2 (sN2) và N2. .........................................................................................43
Hình 3.9. Đồ thị DSC các mẫu nguyên liệu PTX, nguyên liệu BSA, cắn ly tâm N2 (pN2),
N2 ..................................................................................................................................44
Hình PL.1. Sắc ký đồ của dung dịch paclitaxel chuẩn (A), dung dịch thử trong mẫu thử
đánh giá phương pháp xử lý mẫu hỗn dịch (B), dung dịch sau xử lý mẫu hỗn dịch (C),
dung dịch thử khuếch tán (D) và phổ hấp thụ của píc chính trong dung dịch chuẩn (E) ..
Hình PL.2. Sắc ký đồ của dung mơi tìm lại PTX (A), mẫu placebo (B) và mơi trường
khuếch tán (C)
Hình PL.3. Hình ảnh dưới kính hiển vi quang học vật kính 40 của NT thô (A), NT nano
(B) và HD (C) trong thiết kế thí nghiệm


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư là bệnh khó chữa, có tỷ lệ tử vong cao nhất và số lượng ca bệnh mắc mới

ngày càng gia tăng. Ước tính trong năm 2020, thế giới ghi nhận khoảng 19,3 triệu ca
mắc mới và gần 10 triệu ca tử vong vì ung thư [15]. Trên lâm sàng, ung thư phổi và ung
thư vú là hai bệnh lý ung thư hay gặp nhất và có tỷ lệ tử vong hàng đầu [22], [52]. 85 %
trường hợp ung thư phổi là ung thư phổi không tế bào nhỏ. Phần lớn trường hợp ung thư
vú tiến triển thành ung thư vú di căn và gây tử vong cho bệnh nhân [52]. Có rất nhiều
thuốc hóa trị liệu điều trị ung thư đã được phát triển, trong đó có paclitaxel, là một trong
số ít các hóa trị liệu ung thư có nguồn gốc tự nhiên.
Paclitaxel là một alkaloid có hoạt tính chống ung thư được tìm thấy trong vỏ cây
một số lồi thơng đỏ (Taxus brevifolia, T. baccata,…) [1], [7]. Dạng bào chế của
paclitaxel hòa tan trong hỗn hợp Cremophor EL và ethanol khan đã đánh dấu một bước
ngoặt lớn trong điều trị ung thư vú di căn [19] và ung thư phổi không tế bào nhỏ [50].
Tuy nhiên, dạng bào chế này cũng đã bộc lộ những nhược điểm về độc tính của tá dược
Cremophor EL và đặc tính dược động học phi tuyến tính [30], [39], [40], [57]. Điều này
đặt ra yêu cầu phát triển những dạng bào chế paclitaxel an toàn và hiệu quả hơn. Một
trong những hướng nghiên cứu là phát triển các hệ nano chứa paclitaxel.
Các hệ nano chứa paclitaxel là các hệ đưa thuốc tiềm năng, giúp tăng tích lũy thuốc
vào khối u và giảm độc tính tại các mơ khỏe mạnh. Trong các chế phẩm nano chứa
paclitaxel trên thị trường, Abraxane®, hỗn dịch chứa phức hợp albumin-paclitaxel, là
chế phẩm được phê duyệt bởi FDA Hoa Kỳ và nhiều quốc gia khác trong điều trị nhiều
bệnh lý ung thư. So với Taxol®, Abraxane® cho thấy tính hiệu quả và tính an tồn vượt
trội trong điều trị ung thư vú di căn và ung thư phổi không tế bào nhỏ nhờ vào đặc điểm
dược động học tuyến tính, có khả năng phân bố ưu tiên thuốc vào khối u và giảm phơi
nhiễm thuốc tồn thân [8], [13], [19]. Những ưu điểm của Abraxane® được cho là nhờ
vào khả năng hướng đích của các tiểu phân nano và tính an tồn của albumin trong vai
trị là chất mang [13], [14], [33].
Với mục đích bước đầu phát triển chế phẩm hỗn dịch nano paclitaxel tiêm truyền
tĩnh mạch tại Việt Nam, đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano paclitaxel định
hướng làm hỗn dịch tiêm truyền” đã được thực hiện với các mục tiêu sau:
 Bước đầu bào chế và đánh giá được ảnh hưởng của một số yếu tố đến phân bố
kích thước tiểu phân của hỗn dịch nano paclitaxel.

 Đánh giá được một số đặc tính lý hóa của hỗn dịch nano paclitaxel.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về paclitaxel
1.1.1. Công thức hóa học và tính chất lý hóa
Cơng thức hóa học và tên khoa học

Hình 1.1 - Cơng thức hóa học của paclitaxel (PTX)
Công thức phân tử: C47H51NO14 [10], [11].
Khối lượng phân tử: 853,91 g/mol [11].
Tên khoa học: 4,10β-Bis(acetyloxy)-13α-[[(2R,3S)-3-benzamido-2-hydroxy-3phenylpropanoyl]oxy]-I,7β-dihydroxy-9-oxo-5β,20-epoxytax-1l-en-2α-yl benzoat [10].
Tính chất lý hóa
Cảm quan: Bột màu trắng hoặc gần như trắng, dạng tinh thể [10].
Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol (MeOH), ethanol,
dicloromethan và dễ tan trong methyl clorid [10], acetonitril [45].
Độ bền: PTX bị phân hủy nhanh chóng trong các dung dịch MeOH chứa kiềm yếu
và trong các dung dịch MeOH có tính acid mạnh. PTX bền trong dung dịch MeOH chứa
0,1 % acid acetic (AcOH) trong bảy ngày ở nhiệt độ phòng hoặc ba tháng ở 4 °C. AcOH
có thể đã trung hịa các vết kiềm có trong MeOH, giúp PTX khơng bị phân hủy [45].
LogP: 3,2 [53].
Góc quay cực: Dung dịch 10 mg/mL trong MeOH có góc quay cực ở 20 °C từ 49,0° đến -55,0° ở dạng khan [10], [11].
1.1.2. Dược động học
Dạng bào chế thông thường của PTX là dạng dung dịch đậm đặc trong Cremophor
EL và ethanol tuyệt đối để pha dịch truyền tĩnh mạch. Sau khi tiêm vào tĩnh mạch, thuốc
phân bố rộng vào các mô và dịch cơ thể, có thể bị ảnh hưởng bởi liều và thời gian truyền.
Tỷ lệ gắn với protein là 89 % đến 98 % và không bị thay đổi khi dùng cùng với cimetidin,
ranitidin, dexamethason hoặc diphenhydramin. Ở giai đoạn ổn định, thể tích phân bố là

5-6 lít/kg cân nặng, thể tích phân bố của người tiêm truyền từ 1 đến 6 giờ là 67,1 lít/m2
và của người tiêm truyền 24 giờ là 227 đến 688 lít/m2 cho thấy thuốc khuếch tán nhiều
2


ra ngoài mạch và/hoặc gắn nhiều với các thành phần của mô. Thời gian bán thải trong
huyết thanh là 6-13 giờ, nếu thời gian tiêm truyền từ 1 đến 6 giờ, thời gian bán thải là
6,4 giờ; nếu thời gian tiêm truyền từ 24 giờ trở lên, thời gian bán thải là 15,7 đến 52 giờ.
Sau khi truyền tĩnh mạch, có khoảng 2-13 % lượng thuốc được thải qua nước tiểu dưới
dạng ban đầu; ngồi thận cịn có những đường đào thải khác (đào thải qua phân ≈ 70 %,
trong đó 5 % là dạng chưa chuyển hóa). PTX được chuyển hóa tại gan thơng qua
cytochrom P450; isoenzym CYN28 và CYP3A4, và tạo ra chất chuyển hóa chủ yếu là
6α-hydroxypaclitaxel. Độ thanh thải dao động từ 0,3 đến 0,8 lít/giờ/kg (hay 6,0-15,6
lít/giờ/m2). Độ thanh thải khi thời gian truyền từ 1 đến 6 giờ là 5,8 đến 16,3 lít/giờ/m2
và trong trường hợp tiêm truyền trong 24 giờ là 14,2 đến 17,2 lít/giờ/m2.
Ngồi dạng bào chế thơng thường, PTX cịn được bào chế dưới dạng tiểu phân
nano albumin chứa PTX. Với chế phẩm nano albumin chứa PTX, thể tích phân bố và độ
thanh thải tăng lên đáng kể (45-55 %) so với dạng thơng thường. Bên cạnh đó, tỷ lệ PTX
tự do trong máu cũng cao hơn so với dạng thông thường [1].
PTX còn là cơ chất của P-glycoprotein (P-gp), là hệ vận chuyển chủ động đào thải
PTX khỏi tế bào và gây ra hiện tượng kháng thuốc. Để khắc phục vấn đề này, một số
chất ức chế P-gp (ví dụ: verapamil) có thể được kết hợp, tuy nhiên các chất đó cũng có
độc tính và/hoặc thay đổi đặc tính dược động học và phân bố sinh học của thuốc [39].
1.1.3. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng
PTX, hoạt chất có trong vỏ cây thơng đỏ Taxus brevifolia, là một thuốc chống ung
thư [1]. PTX được chỉ định điều trị nhiều loại u rắn, bao gồm ung thư buồng trứng, ung
thư vú di căn, ung thư phổi không tế bào nhỏ và ung thư phổi tế bào nhỏ, ung thư đầu
và cổ, ung thư thực quản, ung thư tuyến tiền liệt và bàng quang, cũng như ung thư Kaposi
liên quan đến AIDS [7].
PTX kích thích trùng hợp các dime tubulin tạo ra các vi ống mới và ức chế giải

trùng hợp các vi ống sẵn có. Điều này dẫn đến sự bất thường của mạng lưới vi ống ở kỳ
trung gian trong quá trình phân bào. Vì mạng lưới vi ống di chuyển các nhiễm sắc thể
đã phân chia, nên sự bất thường của mạng lưới vi ống dẫn đến sự ức chế quá trình phân
bào, làm ức chế tăng sinh tế bào ung thư [1], [62].
1.1.4. Độc tính và tác dụng không mong muốn
Hầu hết các người bệnh dùng PTX đều bị rụng tóc. Gần 90 % bệnh nhân bị suy
tủy. Nguy cơ suy tủy tăng lên khi tăng liều dùng, tăng tần suất và thời gian tiêm truyền.
Bệnh nhân phục hồi nhanh chóng sau khi dừng thuốc. Các tác dụng không mong muốn
thường gặp khác của PTX gồm các phản ứng quá mẫn (ở mức độ nghiêm trọng > 2 %),
bệnh thần kinh ngoại vi, suy tủy, giảm mạnh bạch cầu trung tính, tới dưới 500mm3 (1475 %), giảm tiểu cầu (17-52 %), thiếu máu với hemoglobin < 80 g/lít (16-22 %) trong
đó 6 % có thể chuyển thành thiếu máu nặng; hạ huyết áp không biểu hiện triệu chứng,
3


nhịp tim chậm không biểu hiện triệu chứng, rối loạn điện tâm đồ; buồn nôn, nôn, ỉa
chảy, viêm niêm mạc, táo bón, tắc ruột; rụng tóc, kích ứng tại nơi truyền thuốc; đau cơ,
đau khớp, trong đó có đến 12 % trường hợp rất nặng,… [1]
1.2. Vài nét về đặc điểm hệ thống mạch máu của khối u và hiệu ứng tăng thấm và
lưu giữ (EPR)
Năm 1986, Hiroshi Maeda và cộng sự đã đặt ra thuật ngữ “hiệu ứng tăng thấm và
lưu giữ” để mô tả một hiện tượng sinh lý bệnh của khối u. Các khối u thể hiện tính thấm
cao đối với các hợp chất cao phân tử. Khi thâm nhập vào khối u, các hợp chất cao phân
tử bị giữ lại trong một thời gian dài [63].
Hiệu ứng EPR được giải thích dựa trên một số đặc điểm sinh lý bệnh cơ bản của
khối u [42], [44]. Hệ thống mạch máu của khối u có đặc điểm khác với của các mơ bình
thường. Trong các mơ bình thường, hệ thống mao mạch được sắp xếp một cách trật tự
và hợp lý, giúp phân bố đủ oxy và dinh dưỡng đến các tế bào [54]. Trong các khối u, do
sự phát triển mạnh mẽ của các tế bào, các yếu tố tiền tạo mạch được biểu hiện quá mức.
Điều này dẫn đến sự phát triển chưa đầy đủ của mạch máu, đặc trưng bởi hình thái gấp
khúc, đường kính khơng đồng đều và tính thấm cao. Các mạch máu của khối u được sắp

xếp lộn xộn, không phân biệt rõ động mạch, tĩnh mạch, mao mạch, và có những điểm
cụt trên mạch máu. Cấu trúc hệ thống mạch màu trên giúp các hợp chất cao phân tử dễ
dàng thốt khỏi lịng mạch để vào khoảng gian bào của khối u. Hệ thống mạch bạch
huyết trong khối u bị giãn, rị rỉ và khơng liên tục. Hiện tượng này làm dịch bị ứ lại trong
khối u, dẫn đến sự tăng thời gian lưu của các hợp chất cao phân tử [54], [63].
Hiệu quả của hiệu ứng EPR thay đổi tùy thuộc vào loại và vị trí của khối u, tình
trạng tưới máu trong khối u và đặc tính hóa lý của các tác nhân chống ung thư [63].
1.3. Vài nét về các dạng bào chế của PTX
1.3.1. PTX hòa tan trong Cremophor EL và ethanol
Chế phẩm PTX tiêm truyền đầu tiên được bào chế dưới dạng dung dịch, trong đó
dược chất được hịa tan trong hỗn hợp Cremophor EL và ethanol khan (CrEL-PTX) với
tên thương mại Taxol®. Mặc dù đã chứng minh được có hiệu quả trong điều trị, công
thức CrEL-PTX cho thấy những nhược điểm gây ra bởi tá dược Cremophor EL:
 Có tác dụng khơng mong muốn nghiêm trọng, bao gồm quá mẫn [39] và bệnh
thần kinh ngoại biên [40].
 Có đặc tính dược động học phi tuyến tính: độ thanh thải phụ thuộc liều và nồng
độ thuốc ở trạng thái ổn định trong máu không tỷ lệ với liều dùng và/hoặc thời gian
truyền [39], [57]. Điều này dẫn đến nồng độ dược chất trong máu không tỷ lệ thuận
với thời gian truyền thuốc, gây ra khó khăn trong việc hiệu chỉnh liều và so sánh tác
dụng của các thuốc hóa trị liệu [30].
4


Những nhược điểm của công thức CrEL-PTX cho thấy sự cần thiết của việc phát
triển các dạng bào chế an toàn hơn của PTX. Một trong những giải pháp tiềm năng là
phát triển các hệ phân phối thuốc không chứa nồng độ cao Cremophor EL và các chất
diện hoạt khác.
1.3.2. Vài nét về nano PTX và một số nghiên cứu bào chế nano PTX
Hệ nano chứa PTX
Các hệ mang thuốc nano được định nghĩa là các phức hợp có kích thước nano, có

thể đơn giản như các tiểu phân nano, nhũ tương nano, phức hợp polyme, hoặc phức tạp
hơn như các hệ đa thành phần kích thước nano có chứa thuốc, protein hoặc gen, các hệ
đưa thuốc hướng đích và hệ có gắn phối tử phát tín hiệu theo dõi được trên thử nghiệm
in vitro hoặc in vivo [2].
Các hệ nano chứa PTX là những hệ đưa thuốc tiềm năng nhờ vào một số ưu điểm
so với CrEL-PTX:
 Cải thiện độ tan của PTX: độ tan trong nước của PTX được tăng lên đáng kể khi
liên hợp với các polyme tan trong nước hoặc được chứa trong nano lipid [39].
 Giảm nguy cơ gây phản ứng quá mẫn so với dạng CrEL-PTX do không sử dụng
tá dược Cremophor EL [9].
 Cải thiện đặc tính dược động học PTX: tăng thời gian bán thải do tăng thời gian
lưu trong hệ tuần hồn. Các tiểu phân nano có kích thước nhỏ (đường kính vài nm
đến vài trăm nm), cho phép phân bố ưu tiên PTX vào vị trí khối u do hiệu ứng EPR
[39].
 Tránh được sự bắt giữ của hệ thống lưới nội mơ (RES), làm giảm độc tính và tăng
liều dung nạp tối đa của thuốc. RES là một hệ thống gồm các tế bào thực bào có khả
năng bắt giữ các tiểu phân có kích thước lớn và đặc điểm bề mặt không phù hợp [44].
Điều này dẫn đến giảm tác dụng in vivo của thuốc và tăng tích lũy thuốc ở các cơ
quan chứa nhiều tế bào thực bào (gan, lách và phổi) [59]. Các tiểu phân nano có kích
thước nhỏ sẽ tránh được sự nhận diện của RES. Bên cạnh đó, bề mặt của các tiểu
phân nano thường được gắn polyethylen glycol (PEG) để tránh bị RES loại bỏ [39].
 Bề mặt tiểu phân nano có thể được gắn thêm các phối tử đặc hiệu giúp tiểu phân
nano tác dụng tại đích chọn lọc và hiệu quả hơn, nhờ đó cải thiện sự hấp thu khối u
và giảm tác dụng phụ của thuốc [39].
Từ những nhược điểm của công thức CrEL-PTX và những ưu điểm của các hệ
nano được trình bày ở trên, PTX đã và đang được nghiên cứu bào chế trong các hệ nano
có cấu trúc khác nhau [39], bao gồm nano lipid, liposom, vi nhũ tương, nano nhũ tương;
nano vô cơ: nano vàng, nano từ tính; nano polyme: PLGA, PCL, PLA, chitosan,

5

albumin; ngồi ra có thể có cấu trúc khác như liên hợp với polyme, ống nano carbon,
tinh thể nano, cyclodextrin, nanogel,…
Một số nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano chứa PTX
Tác giả Trịnh Thị Hằng đã thực hiện nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano polyme
chứa PTX và dihydroartemisinin (DHA) bằng phương pháp kết tủa thay đổi dung môi
với chất mang poly (acid lactic-co-glycolic) và lecithin. Hệ tiểu phân thu được từ cơng
thức bào chế tối ưu có kích thước tiểu phân (KTTP) là 135,1 ± 4,65 (nm), chỉ số đa phân
tán PDI là 0,305 ± 0,010 và thế zeta đo được là +17,77 ± 3,65 (mV); tỷ lệ dược chất
được nano hóa EE(%) của PTX là 98,03 ± 1,48 % và của DHA là 66,04 ± 0,68 %. Sau
48 giờ, phần trăm giải phóng dược chất từ hệ tiểu phân nano tại pH 7,4 đối với DHA và
PTX lần lượt là 80,14 % và 71,82 %; tại pH 5,0 đối với DHA và PTX lần lượt là 59,10
% và 50,78 % [3].
Tác giả Nguyễn Tuấn Linh đã thực hiện nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano
polyme – lipid chứa PTX và phức hợp dihydroartemisinin-glucosamin (DHA-GLU)
bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung mơi với chất mang poly (acid lactic-coglycolic) và lecithin. Hệ tiểu phân thu được từ cơng thức bào chế lựa chọn có KTTP là
113,50 ± 1,71 (nm), chỉ số đa phân tán PDI là 0,248 ± 0,003 và thế zeta đo được là 33,60 ± 3,39 mV; tỷ lệ dược chất được nano hóa EE(%) của PTX và của DHA lần lượt
là 98,73 ± 0,89 % và 66,41 ± 0,53 %. Kết quả thử giải phóng hệ tiểu phân cho thấy khả
năng giải phóng dược chất sau 24 giờ ở môi trường đệm pH 5,0 đối với DHA là 81,81
%, PTX là 54,34 %; tại pH 7,4 đối với DHA là 74,60 %, PTX là 39,12 %. Độ ổn định
của hệ tiểu phân trong điều kiện 2-8 oC là 6 tuần. Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử
quét cho thấy các tiểu phân có hình cầu và kích thước nhỏ hơn 200 nm [4].
Một số chế phẩm nano chứa PTX trên thị trường
Abraxane® (nab-PTX, ABI-007) là hóa trị liệu đầu tiên được phát triển dựa trên
công nghệ Nanoparticle Albumin Bound và được FDA Hoa Kỳ phê duyệt vào năm 2005.
Abraxane® được phê duyệt điều trị ung thư vú di căn, điều trị ung thư phổi không tế
bào nhỏ di căn hoặc tiến triển cục, ung thư tuyến tụy di căn [34], điều trị ung thư vú bộ
ba âm tính dành cho người dương tính với PD-L1 [29]. Bề mặt tiểu phân nab-PTX gồm
các phân tử albumin liên kết với nhau, tạo thành lớp vỏ albumin. Lớp vỏ albumin này

bao quanh phần lõi được cấu tạo từ PTX vơ định hình [13].
Nab-PTX được bào chế dựa trên phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương
(NT). NT có pha dầu là dung dịch PTX trong cloroform và pha nước là dung dịch HSA
bão hòa cloroform. Để bào chế NT, phối hợp từng giọt pha dầu vào pha nước, đồng nhất
hỗn hợp để tạo thành NT thơ, sau đó đồng nhất hóa NT thơ ở áp suất cao để tạo NT
nano. NT nano được loại dung mơi hữu cơ bằng phương pháp thích hợp để thu được
hỗn dịch (HD) có đặc điểm trong mờ, gồm các tiểu phân nano PTX với đường kính chủ
6


yếu từ 140-160 nm. HD sau đó được lọc qua màng lọc vô khuẩn để loại tạp và đông khô
để đảm bảo độ ổn định cho chế phẩm. Trong quá trình đơng khơ, albumin cũng đóng
vai trị là một chất bảo vệ đơng lạnh (cryoprotectant). Do đó, chế phẩm nab-PTX không
cần các chất bảo vệ đông lạnh thông thường như mannitol, glycerin,… [16].
Các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng đã chứng minh nab-PTX có đặc tính
dược động học và đặc tính phân bố sinh học riêng biệt, giúp tăng hiệu quả ức chế khối
u so với CrEL-PTX. Sau khi vào máu, nab-PTX phân tách chủ yếu thành các phức hợp
albumin-PTX và một phần PTX tự do. Các phức hợp albumin-PTX sẽ được phân bố ưu
tiên đến khối u theo một số cơ chế bao gồm hiệu ứng EPR, và quan trọng nhất là sự vận
chuyển tích cực thơng qua thụ thể gp60 (albondin) và caveola. Sự phân bố thuốc vào
khối u của nab-PTX chủ yếu thông qua các kênh vận chuyển, trái ngược với CrEL-PTX
chủ yếu thông qua vận chuyển thụ động. Do đó, nab-PTX giúp giảm phơi nhiễm thuốc
tồn thân, từ đó làm giảm nguy cơ giảm bạch cầu trung tính (một độc tính giới hạn liều)
so với CrEL-PTX [13]. So với Taxol®, thời gian tiêm truyền Abraxane® ngắn hơn (30
phút) và khơng cần điều trị trước bằng các thuốc chống quá mẫn (Bảng 1.1) [39]. Tuy
nhiên, nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng Abraxane® có thể gây ra hiện tượng kháng thuốc
do điều hòa lên P-gp [68].
Bảng 1.1. Các ưu điểm của ABI-007 so với Taxol [16]
Đặc điểm
Công thức

ABI-007

Taxol

3-4 % albumin Cremophor EL (50 %) và ethanol (50 %)

Dùng thuốc chống quá mẫn
trước khi điều trị bằng PTX

Không

Glucocorticoid, kháng histamin

Thời gian truyền

30 phút

3 giờ đến 24 giờ

Liều khuyến cáo

260mg/m2 da

175mg/m2 da

Đặc tính dược động học

Tuyến tính

Khơng tuyến tính

Ngồi Abraxane®, tại một số quốc gia cũng được lưu hành một số chế phẩm nano
paclitaxel khác như Genexol®-PM, Lipusu,… [55]
Genexol®-PM (CynviloqTM, IG-001, Nant-008) là chế phẩm nano chứa PTX với
KTTP 25 nm được phát triển đầu tiên bởi Tập đoàn Dược Sinh học Samyang – Hàn
Quốc (Samyang Biopharmaceuticals Corporation). Chế phẩm Genexol được phê duyệt
tại Hàn Quốc, Hungary, Bulgaria và một số quốc gia khác trong điều trị ung thư vú, ung
thư phổi và ung thư buồng trứng [61]. Cấu trúc của Genexol được xác định là micel
polyme vỏ-lõi, trong đó, phần lõi là PTX và phần vỏ là copolyme mPEG-b-poly(D,Llactid) gồm một đầu kỵ nước (PLA) và một đầu thân nước (mPEG) [31], [55]. Chế phẩm
được bào chế bằng cách sử dụng acetonitril hòa tan mPEG-PLA và PTX, sau đó bay hơi
loại dung mơi để thu được hỗn hợp gel trước khi được hòa tan trong nước để tạo thành
hệ micel chứa PTX [61]. So với Taxol, Genexol có liều dung nạp tối đa cao hơn, tăng
7


tích lũy thuốc trong khối u, ức chế P-gp hiệu quả và có đặc điểm dược động học tuyến
tính [61].
Lipusu là chế phẩm liposom chứa PTX với KTTP 400 nm được phát triển đầu tiên
bởi Công ty Dược phẩm Luye – Trung Quốc (Luye Pharma Group Ltd.) và được phê
duyệt là thuốc được chỉ định đầu tay cho bệnh nhân ung thư buồng trứng và ung thư
phổi không tế bào nhỏ không phù hợp để xạ trị hoặc phẫu thuật, bệnh nhân ung thư vú
tái phát sau điều trị bằng doxorubicin hoặc kết hợp với cisplatin [55]. Chế phẩm được
bào chế bằng phương pháp phân tán màng mỏng, trong đó PTX, lecithin và cholesterol
được hịa tan trong ethanol, sau đó dung dịch tạo thành được cất quay để loại dung mơi.
Lớp màng mỏng tạo ra được hịa tan trong dung dịch lysin chứa 5 % mannitol, sau đó
được lọc qua màng 0,2 µm và đơng khơ [64].
1.4. Vài nét về albumin và hệ tiểu phân nano albumin
1.4.1. Albumin
Albumin là protein chính trong huyết thanh và có khối lượng phân tử thay đổi tùy

thuộc vào loại albumin. Cấu trúc albumin có nhiều amino acid tích điện như lysin,
arginin, acid glutamic và acid aspartic [6], [14].
HSA (albumin huyết thanh người, khối lượng phân tử 66500 Da) là một protein
hình cầu được cấu tạo từ ba vùng có cấu trúc tương tự nhau (I, II và III), mỗi vùng gồm
hai vùng nhỏ (A và B) và được ổn định bởi 17 cầu nối disulfid [6], [14]. Phân tử HSA
có hai vị trí liên kết thuốc quan trọng: Vị trí Sudlow I chủ yếu liên kết với các acid
dicarboxylic và các phân tử dị vịng cồng kềnh, và vị trí Sudlow II có ái lực với các acid
carboxylic thơm [24].
BSA (albumin huyết thanh bò, khối lượng phân tử 69323 Da) là một trong những
loại albumin được nghiên cứu nhiều nhất do có cấu trúc tương đồng với HSA. Phân tử
BSA cũng được cấu tạo từ ba vùng tương đồng (I, II, III), mỗi vùng gồm hai vùng nhỏ
(A và B) và được chia thành chín vịng (L1–L9) bởi 17 liên kết disulfid. HSA và BSA
giống nhau về điểm đẳng điện và 80 % trình tự, chỉ khác nhau về khối lượng phân tử
dưới 1 % [14], [56].
Tuy có sự tương đồng về mặt cấu tạo, phân tử HSA chỉ có một tiểu phần tryptophan
Trp-214, trong khi phân tử BSA chứa hai tiểu phần tryptophan Trp-212 và Trp-134
(Hình 1.2) [6], [33]. Mặt khác, so với HSA, BSA có thể gây ra một số phản ứng miễn
dịch không mong muốn khi được sử dụng trên người [21]. Ngoài BSA và HSA, albumin
trứng, albumin huyết thanh người tái tổ hợp từ nấm men cũng được sử dụng trong y học
[14].
Một số ưu điểm của albumin trong vai trò chất mang thuốc [14], [33], [56]:

8


 Rất dễ tan trong nước, ổn định trong khoảng pH từ 4–9, tan được trong ethanol
40 %, và có thể được đun nóng ở 60 °C trong tối đa 10 giờ mà khơng tạo ra độc tính.
 Dễ tinh chế và có khả năng phân hủy sinh học. Tuy nhiên, BSA có nhược điểm
là có thể gây phản ứng miễn dịch ở người và ở chuột.
 Được hấp thu nhiều hơn vào khối u và mơ bị viêm.

Hình 1.2. Cấu trúc không gian ba chiều của HSA và BSA
Một trong những điểm độc đáo của albumin là khả năng khiến liên kết với thụ thể
được khối u biểu hiện quá mức. Albumin được tích tụ bên trong khối u nhờ vào một cơ
chế vận chuyển tích cực albumin theo cơ chế xuyên bào nội mạc mạch máu. Cơ chế này
đóng vai trị vận chuyển các thành phần trong huyết tương có gắn/khơng gắn với
albumin. Albumin bắt đầu xun bào bằng cách liên kết với thụ thể gp60 (albondin) của
nội mạc mạch máu, thụ thể này kích thích caveolin-1 (một protein nội bào), khiến màng
nội mạc hình thành cấu trúc túi (caveola) chứa các thành phần của huyết tương. Cấu trúc
túi sau đó tách khỏi bề mặt trong lịng mạch để vận chuyển albumin và các phối tử đến
bề mặt ngồi lịng mạch [20], [33]. Mặt khác, các khối u bài tiết ra một protein đặc biệt
khơng có trong các mơ bình thường (SPARC) đóng một vai trị trong việc thu hút và
tích tụ albumin bên trong khối u. Hai cơ chế trên đóng vai trị chính dẫn đến sự tích tụ
của albumin vào khối u [56].
1.4.2. Hệ tiểu phân nano albumin
Khái niệm, ưu và nhược điểm của hệ tiểu phân nano albumin
Hệ tiểu phân nano albumin là hệ nano polyme sử dụng albumin làm chất mang
dược chất. Nhờ cấu trúc albumin gồm nhiều amino acid có nhóm chức, hệ tiểu phân
nano albumin có khả năng mang được các loại thuốc có đặc tính khác nhau (tích điện
dương/âm, ưa/kỵ nước,…) và có thể gắn thêm các phối tử bề mặt một cách dễ dàng [24].
Hệ tiểu phân nano HSA có ưu điểm là độ ổn định cao, không độc, không sinh phản
ứng miễn dịch và có khả năng phân hủy sinh học. Nhược điểm của hệ tiểu phân nano
HSA là có giá thành cao [23].

9


Một số phương pháp bào chế nano albumin
Hệ tiểu phân nano albumin được bào chế bằng nhiều phương pháp, trong đó có 5
phương pháp tiêu biểu: Kết tủa do thay đổi dung môi, tạo NT, tạo gel bằng nhiệt, phun

sấy nano và công nghệ Nanoparticle Albumin Bound (nab):
a. Kết tủa do thay đổi dung môi:
Hệ tiểu phân nano albumin được bào chế bằng cách thêm dung dịch dược chất
trong dung mơi hữu cơ (ví dụ ethanol hoặc aceton) vào dung dịch albumin trong nước.
Các dung môi hữu cơ làm giảm độ phân cực của dung dịch nước, dẫn đến sự kết tủa của
các phân tử albumin tạo thành các tiểu phân có kích thước nano. Sau đó, các chất làm
bền (ví dụ glutaraldehyd) được thêm vào nhằm tăng độ ổn định cho hệ tiểu phân. Nhóm
chức aldehyd trong các phân tử glutaradehyd sẽ phản ứng ngưng tụ với nhóm chức amin
trong các phân tử albumin, tạo thành cầu nối liên phân tử giúp tăng độ bền cho các tiểu
phân. Các tiểu phân nano albumin sau đó được tinh chế và phun sấy hoặc đơng khơ để
duy trì độ ổn định trong thời gian dài [14], [65], [67].
b. Tạo nhũ tương
Để bào chế hệ tiểu phân nano albumin, trước tiên, nhũ tương nước/dầu được bào
chế bằng phương pháp thích hợp. Dung dịch albumin trong nước được phối hợp với
dung dịch dược chất trong dầu thực vật (ví dụ dầu hạt bơng). Pha dầu và pha nước được
đồng nhất hóa bằng cách khuấy ở tốc độ cao. Sau đó, nhũ tương được xử lý bằng phương
pháp hóa học hoặc nhiệt độ. Trong phương pháp hóa học, albumin bị biến tính bằng
cách phân tán nhũ tương trong ether có chứa 2,3-butadien hoặc formaldehyd, giúp tăng
độ ổn định cho tiểu phân nano. Trong phương pháp xử lý bằng nhiệt, nhũ tương được
phân tán vào dầu nóng (>120 oC) hoặc được đun nóng ở 175-180 oC trong 10 phút. Nhiệt
độ cao sẽ làm bốc hơi pha nước và biến tính albumin, giúp tăng độ ổn định cho tiểu phân
nano [14], [28], [51].
c. Tạo gel nhiệt
Trong phương pháp tạo gel nhiệt, dung dịch albumin trong nước được đun nóng ở
khoảng 80 oC. Ở nhiệt độ cao, các phân tử albumin mở xoắn và chuyển sang dạng gel
nhờ tương tác với nhau qua các liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, tương tác kỵ nước,...
để tạo thành hệ tiểu phân nano albumin. Hệ tiểu phân nano albumin sau đó được khuấy
với dung dịch dược chất. Trong quá trình khuấy, dược chất sẽ tương tác tĩnh điện và
tương tác kỵ nước với tiểu phân nano albumin, dẫn đến sự phối hợp dược chất vào hệ
tiểu phân [14], [49].

d. Phun sấy nano
Để bào chế hệ tiểu phân nano albumin theo phương pháp phun sấy nano, trước
tiên, dung dịch nước chứa chất diện hoạt, dược chất, albumin và các thành phần khác sẽ
10


được phun để tạo thành các hạt aerosol. Các giọt aerosol được sấy bằng khơng khí nóng
để thu được các tiểu phân nano albumin. Quá trình thu gom các tiểu phân này sử dụng
một trống có hình trụ, trong đó thành trống đóng vai trị một anod tích điện dương và
một ống trụ trong trong lịng trống đóng vai trị cathod tích điện âm. Do đó, trong trống
tồn tại một điện trường có hướng từ lịng trống ra thành trống. Vì đa số các tiểu phân
nano albumin được tích điện âm, nên các tiểu phân này được gia tốc trong điện trường
và được giữ lại bởi thành trống [36].
e. Công nghệ nab
Trong công nghệ nab, các tiểu phân nano albumin được bào chế bằng cách sử dụng
áp suất cao làm nhỏ các tiểu phân của hệ phân tán. Hệ phân tán thường là một nhũ tương
dầu/nước (D/N), trong đó pha nước là dung dịch albumin và pha dầu là dung dịch dược
chất trong dung mơi hữu cơ thích hợp. Để bào chế hệ nano albumin, pha dầu được phối
hợp vào pha nước, sau đó hai pha được đồng nhất để tạo thành nhũ tương thô. Nhũ tương
thô tiếp tục được đồng nhất hóa dưới áp suất cao để tạo thành nhũ tương nano, sau đó
được bốc hơi dung mơi hữu cơ để thu được hệ nano albumin chứa dược chất [14], [16],
[32], [38], [43].
1.4.3. Một số nghiên cứu về nano albumin khác
Một số nghiên cứu bào chế nano albumin chứa PTX khác
Dongmei Zhao và cộng sự nghiên cứu bào chế nano BSA có gắn phối tử folat chứa
PTX (PTX-FA-BSANPs) bằng phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi. Đầu tiên,
BSA được hòa tan trong nước. Dung dịch PTX trong ethanol được thêm từ từ vào dung
dịch BSA bằng bơm nhu động với tốc độ 1 mL/phút. Sau đó, dung dịch glutaraldehyd
0,25 % được thêm vào và khuấy trong 16 giờ để tăng độ bền cho hệ tiểu phân. Hệ nano
được cất quay ở 40 oC để loại bỏ ethanol, sau đó phân tán lại trong nước dưới tác dụng

của siêu âm, ly tâm, rửa bằng ethanol và nước, thu được HD PTX-BSANPs. HD trên
được khuấy với dẫn chất ester N-hydroxysuccinimide của folat (NHS-folat) trong 12
giờ để thu được PTX-FA-BSANPs. Đánh giá cho thấy PTX-FA-BSANPs có kích thước
trung bình 217,0 ± 3,6 nm và PDI bằng 0,034 ± 0,004, thế zeta −30,91 ± 1,97 mV, tỷ lệ
dược chất được nano hóa EE(%) là 95,3 % và tỷ lệ dược chất trong hệ nano LE(%) là
27,2 %. Thử nghiệm in vivo trên tế bào ung thư PC3 cho thấy các tiểu phân nano có gắn
folat được hấp thu nhiều hơn vào tế bào khối u so với tiểu phân nano không gắn folat
[67].
Yue Gao và cộng sự nghiên cứu bào chế nab-PTX theo phương pháp mới, trong
đó PTX và PEG được hịa tan trong ethanol, sau đó bốc hơi ethanol trong chân không
để thu hỗn hợp lỏng của PTX và PEG. Hỗn hợp lỏng sau đó được thêm từng giọt vào
bột HSA đồng thời khuấy đều. Hỗn hợp tiếp tục được siêu âm trong đệm phosphat salin
để tạo thành HD trước khi được thẩm tách để loại bỏ PEG và ethanol dư và đông khô.
11


So với Abraxane®, mẫu bào chế có nhiều đặc điểm giống nhau: hình thái KTTP và hình
thái bề mặt, PB KTTP, khả năng giải phóng in vitro, đặc điểm dược động học và phân
bố trên chuột, và khả năng ức chế khối u. Mặc dù tỷ lệ dược chất được nano hóa EE(%)
đều ≈100 %, tỷ lệ dược chất trong hệ nano LE(%) của mẫu bào chế cao hơn 50 % so với
Abraxane® [18]. Bảng 1.2 so sánh một số chỉ tiêu của sản phẩm so với Abraxane.
Bảng 1.2. Một số đặc tính của Abraxane và mẫu bào chế [18]
Đặc tính

Abraxane®

Mẫu bào chế

Bán kính tiểu phân 146,2 ± 1,1 nm 141,4 ± 1,6 nm
Thế zeta

-26,4 ± 1,2mV

-32,9 ± 0,9mV

EE %

99,83 ± 0,03 % 99,86 ± 0,02 %

LE %

9,72 ± 0,09 %

15,29 ± 0,10 %

Một số nghiên cứu bào chế nano albumin chứa dược chất khác
Kim Tae Hyung và cộng sự nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano HSA chứa
curcumin (CCM) bằng công nghệ nab. Pha nước là dung dịch HSA 2 % (w/v) nước bão
hòa cloroform. Pha dầu là dung dịch CCM trong cloroform bão hòa nước. Phối hợpvà
đồng nhất hóa hai pha ở áp suất 20000 psi trong 9 chu kỳ. Cất quay hệ thu được ở 25 oC
dưới áp suất giảm trong 15 phút để loại cloroform, sau đó lọc qua màng lọc 0,25 μm và
đơng khơ để thu được hệ tiểu phân nano CCM. Kết quả cho thấy: Với nồng độ CCM từ
25 – 75 mg/mL trong pha dầu và tỷ lệ hai pha từ 1:74 đến 1:9 (v/v), hệ nano CCM có
KTTP TB nằm trong khoảng từ 119,4 ± 1,7 (nm) đến 149,2 ± 1,2 (nm), với tỷ lệ CCM
nằm trong khoảng từ 3,1 ± 0,4 (%) đến 14,1 ± 1,7 (%). Để thu được hệ nano có KTTP
nhỏ hơn 150 nm và tỷ lệ dược chất trong hệ nano, nhóm tác giả đã lựa chọn công thức
phù hợp. Hệ tiểu phân nano CCM bào chế theo cơng thức được lựa chọn có KTTP TB
là 139,5 ± 2,9 (nm) và tỷ lệ CCM là 7,2 ± 2,5 (%). Kết quả thử nghiệm trên in vivo trên
chuột cho thấy: hệ tiểu phân nano HSA chứa CCM khơng cho thấy độc tính tồn thân;
so với CCM tự do, hệ tiểu phân nano HSA chứa CCM vượt trội hơn cả về tỷ lệ dược

chất được phân bố vào khối u cũng như hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào.
Qi Jianing và cộng sự nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano BSA – dextran –
chitosan chứa doxorubicin (DOXO) bằng phương pháp tạo gel nhiệt. Đầu tiên, phức hợp
BSA – dextran được bào chế bằng cách cho BSA và dextran phản ứng với tỷ lệ và điều
kiện phù hợp. Sau đó, dung dịch phức hợp BSA – dextran được phối hợp với dung dịch
chitosan sao cho tỷ lệ chitosan/BSA = 10 % (w/w) và nồng độ BSA từ 0,5 – 5 mg/mL,
khuấy trong 2 giờ và điều chỉnh về pH 5,6. Hỗn hợp tiếp tục được đun nóng ở 80 oC
trong 1 giờ để thu được hệ tiểu phân nano albumin, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ 4
o
C. Để phối hợp dược chất vào hệ tiểu phân nano, DOXO hydrochlorid (ở dạng bột hoặc
dạng dung dịch trong nước) được khuấy với hệ tiểu phân nano albumin trong 12 giờ ở
điều kiện tránh ánh sáng, điều chỉnh pH về 7,4-8,2, sau đó tiếp tục được khuấy 24 giờ.
12


Kết quả cho thấy, hệ tiểu phân nano trước khi phối hợp dược chất có KTTP TB nằm
trong khoảng từ 131 ± 11 (nm) đến 226 ± 12 (nm), giá trị PDI thay đổi từ 0,12 ± 0,05
đến 0,24 ± 0,05. Khi thay đổi tỷ lệ DOXO/BSA từ 25 % - 100 % và pH phối hợp từ 7,4
- 8,2, tỷ lệ dược chất được nano hóa nằm trong khoảng từ 57,9 ± 4,6 (%) đến 82,6 ± 7,8
(%). Kết quả giải phóng in vitro cho thấy nano DOXO giải phóng dược chất chậm hơn
dược chất tự do. Trên mơ hình chuột thí nghiệm mang khối u ung thư gan H22, nano
DOXO cho thấy độc tính thấp hơn và cải thiện tỷ lệ sống còn tốt hơn so với DOXO tự
do [49].

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu

Bảng 2.1. Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT

Nguyên liệu

Tiêu chuẩn

Xuất xứ

1

Paclitaxel

USP 2021

Canada

2

Albumin huyết thanh bò

NSX

Trung Quốc

3

Dicloromethan

NSX

Trung Quốc

7

Acetonitril

HPLC

Đức

8

Dinatri hydrophosphat dodecahydrat

Phân tích

Trung Quốc

9

Kali dihydrophosphat

Phân tích

Trung Quốc

10

Natri chlorid

Phân tích

Trung Quốc

11

Natri lauryl sulfat (SLS)

NSX

Trung Quốc

12

Tween 80

NSX

Trung Quốc

13

Cremophor EL

NSX

BASF, Đức

15

Acid acetic

NSX

Trung Quốc

16

Methanol

HPLC

Đức

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
Bảng 2.2. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm
STT

Tên thiết bị

Model

Xuất xứ

1

Bể lắc điều nhiệt

1086

GFL – Đức

2

Bể siêu âm

WUC - A10H

Hàn Quốc

3

Cân phân tích

AB204

Mettler Toledo – Thụy
Sỹ

4

Cân phân tích

ES-2255M-DR

Precisa – Thụy Sỹ

5

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Agilent 1200

Agilent Technologies –
Đức

6

Kính hiển vi kết nối camera

Eclipse Ci-L

Nikon – Nhật Bản

7

Màng lọc kích thước lỗ lọc 5 µm

-

Millipore – Đức

8

Màng lọc nylon kích thước lỗ lọc 0,2
µm

-

Millipore – Đức

9

Màng thử giải phóng PVDF kích thước
lỗ lọc 0,1 µm

-

Millipore – Đức

10

Máy đo pH

FiveEasy™
FE20

Mettler Toledo – Hoa
Kỳ

11

Máy đồng nhất hóa áp suất cao

Emusiflex-C5

Avestin – Canada

12

Máy khuấy từ

Wisestir MSH –
20A

Daihan Scientific – Hàn
Quốc

14


13

Máy ly tâm lạnh

GmBH - Z326K

HERMLE Labortechnik
– Đức

14

Máy phân tích nhiệt

DSC 1
StarSystem

Mettler Toledo – Thụy
Sỹ

15

Máy siêu âm đầu dò

UP200Ht

Hielscher – Đức

16

Ống ly tâm chứa màng thẩm tích
10kDa

-

Millipore – Đức

17

Thiết bị đánh giá PB KTTP Zetasizer

Ultra Blue
(ZS3300)

Malvern – Anh

18

Thiết bị thử khuếch tán kiểu nằm

ngang (side-by-side diffusion)

-

Crown Glass Company
– Hoa Kỳ

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Đánh giá các tính chất lý hóa của dược chất
 Đánh giá trạng thái kết tinh của dược chất.
 Đánh giá độ tan trong các dung môi khác nhau.
 Khảo sát độ tan của dược chất trong các môi trường khác nhau.
2.2.2. Nghiên cứu bào chế HD nano albumin chứa PTX
 Nghiên cứu lựa chọn thành phần công thức.
 Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về cơng thức bào chế đến kích thước
giọt NT.
 Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp đồng nhất hóa và các thơng số của quy
trình đến tính chất của NT chứa PTX.
 Đánh giá ảnh hưởng của kỹ thuật bốc hơi dung mơi đến đặc tính tiểu phân HD.
2.2.3. Đánh giá các đặc tính của HD nano
 Đánh giá độ ổn định của HD sau khi bay hơi dung mơi.
 Đánh giá các đặc tính của tiểu phân nano: phân bố kích thước tiểu phân (PB
KTTP), dạng thù hình của dược chất, tương tác phân tử dược chất - tá dược.
 Đánh giá tỷ lệ nano hóa dược chất trong HD.
 Đánh giá khả năng hòa tan – khuếch tán dược chất từ HD khi pha loãng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bào chế
Phương pháp bào chế hệ tiểu phân albumin chứa PTX
Quá trình bào chế nano albumin chứa PTX diễn ra qua 3 giai đoạn chính: Tạo NT
thô, tạo NT nano và bay hơi NT tạo HD.

Bước 1. Tạo nhũ tương thô
15


Q trình tạo NT thơ được thực hiện ở nhiệt độ 5-10 ºC bằng máy siêu âm kết hợp với
với khuấy từ [32], [38], [43].
 Cân BSA và hòa tan vào nước, để polyme trương nở hoàn toàn trong 4 giờ. Thêm
các thành phần khác tan trong pha nước (ví dụ NaCl,…).
 Cân dược chất và hòa tan trong dung môi pha dầu.
 Phối hợp pha dầu vào pha nước. Đồng nhất hai pha bằng siêu âm kết hợp với
khuấy từ. Sản phẩm thu được là NT thô.
Bước 2. Đồng nhất hóa áp suất cao
Q trình đồng nhất hóa được thực hiện ở nhiệt độ 15-25 ºC bằng thiết bị EmusiflexC5, Avestin [32], [38], [43].
 Đưa NT thô vào ngăn chứa mẫu.
 Điều chỉnh van khí để đồng nhất hóa tại áp suất xác định.
 Lặp lại quá trình đồng nhất hóa theo số chu kỳ mong muốn, sản phẩm thu được
là NT nano.
Bước 3. Bốc hơi dung môi
Tiến hành bốc hơi dung môi sử dụng một trong hai phương pháp:
 Khuấy ở nhiệt độ phòng: Khuấy NT trên máy khuấy từ ở nhiệt độ phịng và áp
suất khí quyển.
 Cất quay: Cất quay NT ở nhiệt độ 35 ± 1 ºC, áp suất khí quyển, tốc độ 90
vịng/phút. Khảo sát thời gian cất quay tại thời điểm 60 phút ([32], [38], [43]).
Phương pháp lựa chọn khoảng biến thiên của tỷ lệ thành phần và thông số kỹ
thuật quá trình bào chế NT
Bào chế nhũ tương nano với thành phần cơ bản gồm pha dầu là dung dịch PTX
trong DCM và pha nước là dung dịch BSA trong nước bão hịa DCM, trong đó các thơng
số được thay đổi bao gồm nồng độ PTX trong pha dầu, nồng độ BSA trong pha nước,
tỷ lệ hai pha, áp suất đồng nhất hóa và số chu kỳ đồng nhất hóa. Q trình bào chế được
mô tả trong mục 2.3.1.1. trong Bước 1 và 2. Sau đó xác định phân bố KTTP của nhũ

tương theo phương pháp ở mục 2.3.2.1.
Tiêu chí lựa chọn: KTTP TB của NT ≤ 500 nm, PDI ≤ 0,5 và Di 90 ≤ 1000 nm (90
% tiểu phân có kích thước nhỏ hơn 1000 nm, dựa trên cường độ tín hiệu).
Phương pháp thiết kế thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công thức và thông
số quá trình bào chế đến phân bố KTTP của hệ tiểu phân nano PTX
Phương pháp thiết kế thí nghiệm: sử dụng mơ hình Plackett Burman với sự hỗ trợ
của phần mềm MODDE 12.0 (Umetrics Inc., USA).

16


Biến đầu vào: Các yếu tố thuộc về công thức và thơng số kỹ thuật có thể ảnh hưởng
đến PB KTTP của HD.
Biến đầu ra: Thông số phân bố KTTP: KTTP TB (Z-average), PDI, KTTP TB của
píc chính (được hiểu là píc có diện tích lớn nhất trên đồ thị PB KTTP theo tín hiệu), độ
rộng píc chính (độ rộng chân píc của píc chính).
Tiến hành thí nghiệm và xác định các giá trị biến đầu ra của các công thức trong
bảng thiết kế thí nghiệm. Mối quan hệ giữa các biến đầu vào và các biến đầu ra được
mô tả bởi các phương trình hồi quy dạng bậc nhất. Các phương trình hồi quy này được
thiết lập với sự trợ giúp của phần mềm MODDE 12.0.
2.3.2. Các phương pháp đánh giá
Phương pháp đánh giá phân bố KTTP
Phân bố kích thước giọt/tiểu phân của mẫu NT và HD được xác định bằng phương
pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS).
Thiết bị: Hệ thống đánh giá KTTP bằng tán xạ ánh sáng động Zetasizer Ultra Blue
(ZS3300), Malvern – Anh.
Nguyên tắc: Chiếu một chùm tia laser vào hệ tiểu phân để tạo ra chùm tia tán xạ.
Sự chuyển động của hệ tiểu phân sẽ khiến cường độ ánh sáng tán xạ thay đổi theo thời
gian. Dựa vào sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ và phương trình StockesEinstein có thể đánh giá được PB KTTP trong hệ.
Tiến hành:

 Thơng số máy: Nhiệt độ: 25 oC. Góc đo 173o.
 Pha loãng hệ tiểu phân cần đo bằng một lượng nước cất đã lọc qua màng 0,22 μm
sao cho thông số count rate nằm trong khoảng từ 100-1000 kcps, tối ưu từ 300-500
kcps [47] và đo KTTP ngay sau khi pha loãng.
 Sử dụng cuvet thủy tinh, tiến hành đánh giá PB KTTP. Mỗi mẫu được đo 3 lần
và được lấy giá trị trung bình.
Phương pháp định lượng PTX bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
a. Điều kiện sắc ký
Qua tham khảo các tài liệu [10], [11], [12], tiến hành định lượng PTX trong các
mẫu đánh giá bằng phương pháp HPLC với điều kiện cụ thể như sau:
 Cột sắc ký: Cột C18, kích thước 4,6 x 150 mm, kích thước hạt nhồi 5 μm.
 Pha động: H2O:ACN (45:55, v/v). Pha động được lọc qua màng lọc 0,22 μm và
được siêu âm đuổi bọt khí.
 Thể tích tiêm mẫu: 10 μL.
 Tốc độ dòng: 1,7 mL/phút.
17