Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa artesunat 1

NGHIÊN c ứ ư BÀO CHÉ TIỂU PHÂN NANO CHỨA ARTESUNAT
Nguyễn Hanh Thủy', Trần Tuấn Hiệp^
HDKH; Nguyễn Ngọc Chiến’, Chui Soon Yong^
' Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Trường Đại học Dược Hà Nội
^Phòng thỉ nghiệm bào chế, Khoa Dược, Đại học Yeungnam, Hàn Quốc
Từ khóa: artesunat, PLGA, tiểu phân nano, tác dụng chông ung thư
Tóm tẳt
Tiểu phân nano poly-d,l-lactide-co-glycolide (PLGA) chứa artesunat
(ART) được bào chế bằng phương pháp bay hơi dung môi từ nhũ tương dần/nước
(0/W) với dỉcloromethan là dung môi pha dầu. Tỷ lệ giữa 2 pha dầu nước, nồng
độ PLGA trong pha dầu cũng như loại và tỷ lệ chất nhũ hóa có ảnh hưởng khá
lớn tới kích thước tiểu phân thu được. Lượng thuốc đưa vào hệ được khảo sát từ
2,5-10 mg và cho khả năng nạp thuốc cao nhất khi sử dụng Tween 80 1,5%
(kl/tt). Hệ tiểu phân thu được có kích thước nhỏ hơn 170 nm và khả năng giải
phóng kẻo dài tới trên 24 giờ, ổn định khi được đông khô với manitol ở tỷ lệ 5%
(kl/tt) và ban đầu cho thấy có tác dụng khảng lại các dòng tê bào ung thư trên
mô hình in vitro.
Đặt vấn đề
Tác dụng kháng sốt rét của artesunat (ART) và các dẫn chất của
artemisinin đã được các nhà khoa học nghiên cứu và chứng minh từ lâu [1, 2].
Bên cạnh đó, một số nghiên cứu gần đây còn cho thấy tác dụng chống ung thư
của ART trên nhiều dòng tế bào như tế bào biểu mô, tế bào phổi nhỏ, thận, bạch
cầu,... [2], Cơ chế tác dụng chống ung thư của ART vẫn đang được nghiên cứu
với nhiều giả thuyết được đưa ra như ngăn cản sự tăng sinh của nội mạc mạch
máu, giảm sự phá hủy về DNA hay ức chế sự xấm lấn hay di căn khổi u [2, 8],
Tuy nhiên thời gian bán thải ngắn của ART cùng với tính kém ổn định nên việc
gắn ART vào các chất mang để kéo dài sự giải phóng và độ ổn định của dược
chất vẫn là cần thiết [1, 3], Tá dược có khả năng phân hủy sinh học hiện nay
được sử dụng phổ biến như các chất mang cho các hệ đưa thuốc vì có khả năng

tăng sinh khả dụng, ít độc tính, hiệu suất bao gói và kiểm soát giải phóng dược

chất tốt. PLGA là một polyme có các đặc tính này và được ứng dụng khá phổ
biến trên thế giới cho bào chế các dạng tiểu phân nano [4]. Vì vậy, mục tiêu của
nghiên cứu này là phát triển hệ đưa thuốc cho ART có các đặc tính hóa lý phù
họp và tăng hiệu quả chống ung thư của ART. Công thức thu được sẽ được đánh
giá ảnh hưỏmg của các yếu tố tới kích thước tiểu phân, phân bố kích thước, khả
năng nạp thuốc, bề mặt tiểu phân, đặc tính hóa lý và sự giải phóng in vitro cũng
như nghiên cứu độc tính in vitro trên các dòng tế bào ung thư khác nhau.


Nguyên liệu và phưotig pháp nghiên cứu
Nguyên liệu
Artesunate (ART) từ Sao Kim Pharma (Hà Nội, Việt Nam). PLGA
(Lakeshore 5050 DLG 2A) tò Enovik, Germany. Natri lauryl sulfat (SLS),
polysorbat 80 (Tween 80) từ Duksan Chemical Co. (Ansan, Korea). Polyvinyl
alcol (PVA), sucrose, trehalose và manitol của Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).
Poloxamer 188 từ BASF Chemical Co. (Ludwigshafen, Germany). Methanol,
ethanol, acetonitril (ACN), dicloromethan (DCM) đạt tiêu chuẩn HPLC. Các
nguyên liệu khác đạt tinh khiết hóa học.
Phương pháp bào chế tiểu phân nano chửa artesunat
Tiểu phân nano PLGA chứa ART được bào chế bằng phương pháp bốc
hơi dung môi từ nhũ tương dầu/nước (0/W) [5]. Polyme và ART được hòa tan
trong 5ml dicloromethan (DCM), sau đó nhỏ vào pha nước có chứa chất nhũ hóa.
Nhũ tương OAV được đồng nhất sử dụng đầu siêu âm (Vibracell VCX130;
Sonics, USA) ở 100W trong 5 phút rồi khuấy trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng để
loại dung môi, ly tâm, rửa với nước để loại chất nhũ hóa rồi đông khô thu sản
phẩm.
Đánh giá đặc tính hóa lý của hệ tiểu phân nano
Kích thước tiểu phân được xác định bằng phương pháp đo tán xạ ánh sáng
(DLS) sử dụng thiết bị Zetasizer Nano 90 (Malvem Instruments Ltd.,
Worcestershire, UK). Tiểu phân được chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền

qua (TEM, H7600, Hitachi, Tokyo, Japan) ở mức điện thế 100 kv.
Hiệu suất vi nang hỏa và khả năng nạp thuốc
Định lượng hàm lượng dược chất tự do sử dụng ống ly tâm có màng
10000 Da (MWCO 10000, Millipore, USA) [3, 7], Điều kiện sắc ký gồm cột C18
Inertsil ODS (150x4,6mm, 0,5^m, GL Sciences Inc., Japan), pha động ACN đệm phosphat pH 3,0 (55-45), bước sóng 216 nm, thể tích tiêm mẫu 50 Ịil, tốc độ
dòng Iml/phút sử dụng hệ thống HPLC Hitachi, Nhật Bản. Hiệu suất vi nang hóa
(EE) và khả năng nạp thuốc (LC) được tính theo công thức;
Tông ART-ART tưdo „ _
X100%
(I)
LC(%)

Khôi iưọngtièuphảrnano ART

(2)
^^

Thử khả năng giải phỏng thuốc từ tiểu phân nano
Thử nghiệm giải phóng dược chất được tiến hành trong túi thẩm tích (kích
thước màng lOOOODa - Membrane Cel, Chicago, IL, USA) chứa khoảng 3 mg
dược chất, phân tán 3 ml đệm phosphat pH 6,8 [1, 3], Túi thầm tích được đặt
trong ống chứa 30 ml dung dịch đệm phosphate pH 6,8. ống được giữ trong bể


điều nhiệt (HST-205 sw, Hambaek ST Co., Hàn Quốc) ở 37°c, lắc với tần suất
50 vòng/phút. Hút 2 ml dịch và bổ sung môi trường tại từng thời điểm và định
lượng hàm lưọng dược chất giải phóng.
Thử độc tính in vitro của tiểu phân nano PLGA chứa ART
Thử độc tính tế bào SCC7 (tế bào ung thư biểu mô), A549 (tế bào ung thư
phổi người) và MCF-7 (tể bào ung thư vú ở người) (lấy từ ngân hàng tế bào Hàn

Quốc và được nuôi trong môi trưòng RPMI-1640 (HyClone, USA) bổ sung huyết
thanh bò 10% (FBS) và 1% streptomycin, 5% CO2 ở 37°C) bằng phương pháp
MTT: 100 hỗn dịch tế bào ở nồng độ IxlO'* tế bào/ml được nhỏ vào các giếng
trong đĩa môi trường 96 giếng và ủ trong 24 giờ. Mầu tiểu phân PLGA trống,
ART tự do và tiểu phân ART-PLGA (nồng độ từ 10 I^g/ml tới 100 |ig/ml dược
chất) được thêm vào các giếng và ủ trong 24 giờ. Môi trường cùng với mẫu được
loại bỏ và dung dịch MTT (100 i-il dung dịch MTT 1,25 mg/ml trong đệm RPMI)
được thêm vào và ủ trong 4 giờ ở 37°c. Loại bỏ môi trường MTT và thêm 100 |a,l
dimethy sulfoxyd (DMSO), ủ trong 15 phút và đo độ hấp thụ ờ bước sóng 570 sử
dụng thiết bị đọc đĩa micro (Multiskan EX, Thermo Scientific, Waltham, MA,
USA) [5]. Tỷ lệ tế bào hoạt động được tính theo công thức:
ODs7o(mấu)-ODs7o(trăng;i
xlOO%
Tv lệ TB hoat động =
(3)
ODs7o(chứng)-OD57(j(trắng)
Kết quả
Kết quả bào chế tiểu phân nano PLGA
Ảnh hưỏTig của tỷ lệ pha dầu (DCM) và pha nước (dung dịch PVA 0,1%)
được khảo sát từ 1;5 đến 1;20. Kết quả trong hình 1 cho thấy tiểu phần PLGA tạo
thành trong khoảng từ 220-270 nm. Khi tỷ lệ pha nước tăng lên làm giảm kích
0.4
0.3

300 Ị

I Ị -250

57-ĩ-r:-

É1
I
t
1

0.2 gi I I 200J
-4)

1

ị •§ 150

100

- 0 4

-P D I

^ K T T P (nm)

'r '" 1

ML

0.3

0.2 Q

0 1

0,0

1
1.5
N ồ n g đ ộ P L G A (k l/tt)

Hình 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu/nước Hình 2. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA tới
tới kích thước tiểu phân
kích thước tiểu phân
Tỷ lệ polyme trong pha nội cũng ảnh hưởng khá lớn tới sự hình thành của
các tiểu phân nano. Hình 2 cho thấy kích thước tiểu phân tăng lên khi tăng nồng


độ polyme từ 0,5 đển 2% (Id/tt). ở tỷ lệ PLGA cao (>1%) (MW 17000-18000
Da), kích thước tiểu phân cũng như chỉ số PDI thu được tăng lên. Tuy nhiên, khi
tỷ lệ nước quá cao hay nồng độ polyme quá thấp, mật độ tiểu phân thấp, Idió để
thu lấy sản phẩm cho các nghiên cứu tiếp theo. Do vậy, tỷ lệ dầu - nước và nồng
độ PLGA được lựa chọn lần lượt là 1; 10 và 1% cho các nghiên cứu tiếp theo.
Ảnh hưởng của chất diện hoạt: tiểu phân nhỏ nhất là 208,0 ± 2,1 Inm;
72,69 ± 0,74nm và 166,4 ± 3,44 nm khi sử dụng dung dịch pha nước lần lượt là
PVA 0,25% (Hình 3A), SLS 0,75% (Hình 3B) va Tween 80 1,5% (Hình 3C).
íĩi^KTTP

r 0.1

0.25

0.5
0.75
1

N ồ n g đ ộ PVA (k l/tt)

0.25

0 ,5
0.75
N ồ n g đ ộ S L S (k i/tt)

1

■4

0.5
1
1.5
N ồ n g đ ộ T w een 80 (k»/tt)
í,

Hình 3. Ảnh hưởng của chất diện hoạt tới kích thước tiểu phân,
trong đó (A) PVA; (B) SLS; (C) Tween 80
Bảng 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ thuốc đưa vào hệ nano tới đặc tính tiểu phân
Lượng
Chất
diện hoạt ART (mg)

Tween 80
(1,5%)

SLS
(0,25%)

0
2,5
5
10
0
2,5
5
10

Kích thước
(nm)
166,4±3,4
162,4±1,2
167,2±2,8
177,7±1,7
72,5±0,1
11,1±Q,\
78,5±0,5
82,7±0,5

0,228±0,004
0,191±0,015
0,183±0,040
0,143±0,025
0,125±0,021
0,118±0,012
0,177±0,035

Hiệu suất

vi nang hóa
EE (%)
83,40±0,50
78,57±0,46
77,52±1,03
77,76±1,57
60,5 5± 1,24

0J84±0,009

59,55±5,28

PDI

Khả năng
nạp thuốc
LC (%)
8,12±0,34
13,58±0,41
23,67±0,61
8,06±0,92
12,32±0,53
19,43±1,72


o

208,0±3,4 0,201±0,010
PVA
2,5

289,6±4,6
0,214±0,015 42,36±0,76
4,34±0,23
(0,25%)
5
295,9±1,2
0,237±0,008 40,32±1,96
7,46±0,66
10
305,5±4,3 0,209±0,037 41,34±1,66 14,19±0,56
Ó ty le cúa tímg chát dién hoat có kích thirác tiéu phán nhó nhát, tién hánh
phoi hgp dirgc chát tír 2,5-10 mg (PLGA la 25mg/2,5ml DCM) dé dánh giá hieu
suát vi nang hóa va khá náng nap thuóc cúa he (báng 1). Khi táng lirgng ART,
kích thiróc tiéu phán déu táng song táng nhiéu nhát khi düng PVA la chát nhü
hóa. Các cóng thúc sú dung PVA cüng cho két quá vi nang hóa tháp hcm dáng ké
so vói khi sú dung Tween hay SLS. He có khá náng bao gói tót han Ichi lugng
ART dua váo tháp, tot nhát vói cóng thúc düng Tween 80 khi phói hop 2,5 mg
ART (lén tói > 80%). Tuy nhién, dé có tác dung chong ung thu, ART dirgc cho la
cán düng vói liéu khá lón [1, 9]. Vi vay, lugng ART dua váo he dugc chgn la 10
/1 1 ^

W

A

1A

1

^

1^

'

1 rv

^

O/ A

> OT

o \

♦
%•

tú tiéu phán nano PLGA
120

^

100

-i

PLGA chúa ART sú dung Tween 80
120

(A ) A 5 4 9 - 2 4 h
_

(B )S C C -7 -2 4 h

1

100

I “ i
¿
o

V

60 ■

-É 40

■ P LG A ttóng
a ART t i j do

I

OART-PLGA

<a>-

20
O -f-

e ‘
I SOI
f 60 j
I I

.,

- J i- .l

10

25

50

N&ng do (pg/mL)

■‘S

40 -i

"

20 J
O 4-

« P L G A tró n
a ART t y de
O AR T-P LG /

Ití]
25
50
N6ng d 9 (pg/mL)


100
■ P L G A tr ô n g
B A R T tụ- d o

•‘Ä

40

O A R T -P L G A

'

20
O

N ồ n g d ô ( p g /m L )

Hình 6 . Tỷ lệ tế bào hoạt động ở các dòng tế bào,
trong đó (A) A549; (B) SCC-7; (C) MCF-7
Khả năng giải phóng dirợc chất in vitro
Đánh giá khả năng giải phóng in vitro của 2 công thức sử dụng pha nước
Tween 80 1,5% và SLS 0,25% được thể hiện trong hình 4 cho thấy tiểu phân
ART-PLGA có sự bùng nổ giải phóng trong 10 giờ đầu và đạt tới 80% trong

trường hợp, sử dụng SLS và 60% với Tween 80. Điều này có thể do sự liên kết
lỏng lẻo giữa phân tử dược chất và polyme ở bề mặt tiểu phân cũng như do tỷ lệ
dược chất khá cao so với polyme. Ngoài ra, kích thước tiểu phân nhỏ hơn cũng
có thể khiến ART giải phóng từ hệ SLS nhanh hơn so với hệ Tween 80. Với mục
tiêu duy trì được nồng độ thuốc trong máu lâu hom cũng như giảm độc tính do
chất diện hoạt có thể gây ra, Tween 80 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp
theo. Hình ảnh của kính hiển vi điện tử truyền qua TEM có thấy tiểu phân có cấu
trúc khá đồng nhất, cầu, với kích thước khoảng 170 nm (hình 5).
Kết quả thử độc tính tế bào in vitro
Tỷ lệ tế bào hoạt động ở dòng tế bào SCC7, A549 và MCF-7 sau 24 giờ ở
các nồng độ ART từ 10-100 )ag/ml được thể hiện trong hình 6 cho thấy ở tất cả
các dòng tế bào, ART tự do và tiểu phân ART-PLGA đều có hoạt tính mạnh đặc
biệt với dòng A549 và MCF-7 (hình 6A và 6B) trong khi tiểu phân trống duy trì
tỷ lệ tế bào hoạt động tới trên 80% sau 24 giờ cho thấy tiểu phân PLGA trống là
ít độc tính ở các nồng độ khảo sát. Tiểu phân ART-PLGA có khả năng ức chế tế
bào tốt hcm dạng ART tự do ở tất cả các dòng tế bào ung thư.
Độ ổn định của tiểu phân ART-PLGA


Tiểu phân PLGA chứa ART được
làm khô bằng đông khô sử dụng
các chất bảo vệ là manitol, sucrose
hoặc trehalose. Kết quả trong hình
7 cho thấy sự thay đổi về kích
thước của tiểu phân sau khi đông
kliô tăng nhẹ khi sử dụng manitol
hay sucrose ừong khi với ứehalose
kích thước tàng đáng kể.

Banđẳu Man.5%Man.10%Suo,5%Suc.10%Tre,5%Trs.10%

Hình 7. Ảnh hưỏfng của chất mang tới kích
thước tiểu phân sau Iđii đông khô
Bảng 2. Độ ổn định của tiểu phân nano ART-PLGA trong 1 tháng bảo quản
Nhiệt độ phòug
Dạng bào chế — ----------KTTP(nm)
Hàm luựng (%)
KTTP (nm)
Hàm lượng (%)
Hỗn dịch
162,77 ±3,83
95,81 ± 2,65
164,89 ± 1,99
82,60 ± 3,62
Bột đông khô 165,90 ±3,28
99,34 ± 1,65
163,61 ± 3,66
97,12 ±1,36
Kích thước tiêu phân gân như không thay đôi trong quá trình bảo quản ở
cả 2 điều kiện sau 1 tháng theo dõi (bảng 2). Tuy nhiên hàm lượng dược chất ở
mẫu hỗn dịch giảm đáng kể ở điều kiện phòng. Tuy nhiên, bột đông Ichô vẫn cho
kết quả khá ổn định với hàm lượng đạt trên 97%.
Bàn luận
Độ nhớt và sức căng bề mặt phân cách pha ảnh hưởng lớn kích thước tiểu
phân và phụ thuộc vào loại và tỷ lệ chất diện hoạt sử dụng [4], Do đó, khi tăng độ
nhót của 2 pha (tăng nồng độ polyme, ữiay đổi loại chất diện hoạt) hoặc thay đổi
tỷ lệ giữa 2 pha dầu - nước sẽ ảnh hưởng khá lớn tới kích thước và phân bố của
tiểu phân. Với SLS và Tween 80 khi sử dụng là chất nhũ hóa cho tiểu phân có
kích thước nhỏ hơn 200nm đem lại nhiều im điểm khi đi qua hàng rào mạch máu
- mô ung thư. Tuy nhiên, tiểu phân của hệ sử dụng SLS có khả năng nạp thuốc
cũng như khả năng kiểm soát giải phóng dược chất kém hơn so với hệ sử dụng

Tween 80. Tiểu phân sau khi đông khô có thể ổn định hcm cả về vật lý lẫn hóa
học so với dạng hỗn dịch ban đầu.
Đánh giá độc tính tế bào in vitro cho thấy tiểu phân PLGA trống Iđiá an
toàn, trong Iđii ART tự do và tiểu phân ART-PLGA đều có tác dụng khá mạnh
ứên các dòng tế bào sử dụng. Tác dụng trên dòng ung thư của dạng tiểu phân
ART-PLGA mạnh hơn ở dạng thuốc tự do nhưng cần liều khá cao để cho tác
dụng. Điều này phù họp với một số nghiên cứu về liều dùng cùa ART trên các
mô hình ung thư có thể lên tới 100-240 mg/kg thể trọng [1, 7, 8],


Kết luận
Tiểu phân nano PLGA chứa ART được bào chế theo phưong pháp bốc hơi
dung môi từ nhũ tưong dầu/nước. Tiểu phân có hình cầu đều, phân bố kích thước
hẹp, khả năng nạp thuốc cao, kéo dài giải phóng ART tới 24 giờ, ổn định sau khi
đông khô và có hoạt tính tốt trên tất cả các dòng tế bào. Như vậy, tiểu phân nano
PLGA có thể là hệ phân phối thuốc ART các nghiên cứu xa hơn trên các mô hình
chống ung thư in vivo.
Tài liệu tham khảo
1. Chadha, R., Gupta, s., and Pathak, N. Artesunate-loaded chitosan/lecithin
nanoparticles; Preparation, characterization, and in vivo studies. Drug
Development and Industrial Pharmacy, 38, 1538-1546 (2012).
2. Efferth, T. Willmar Schwabe Award 2006; antiplasmodial and antitumor
activity of artemisinin-from bench to bedside. Planta medica, 73, 299-309 (2007).
3. Gabriels, M., and Plaizier-Vercammen, J. Physical and chemical evaluation of
liposomes, containing artesunate. Journal o f pharmaceutical and biomedical
analysis, 31, 655-667 (2003).
4. Kumari, A., Yadav, s. K., and Yadav, s. c. Biodegradable polymeric
nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, 75, 1-18 (2010).
5. Pradhan, R., Poudel, B. K., Ramasamy, T., Choi, H.-G., Yong, c. s., and

Kim, J. o. Docetaxel-Loaded Polylactic Acid-Co-Glycolic Acid Nanoparticles;
Formulation, Physicochemical Characterization and Cytotoxicity Studies.
Journal o f Nanoscience and Nanotechnology, 13, 5948-5956 (2013).
6. Woerdenbag, H. J., Moskal, T. A., Pras, N., Malingré, T. M., El-Feraly, F. s.,
Kampinga, H. H., and Konings, A. w. Cytotoxicity of artemisinin-related
endoperoxides to Ehrlich ascites tumor cells. Journal o f natural products, 56,
849-856 (1993).
7. Xiao, X.-C., and Hong, Z.-G. Firstborn microcrystallization method to
prepare nanocapsules containing artesunate. International journal o f
nanomedicine, 5, 483 (2010).
8. Xu, Q., Li, z.-x., Peng, H.-Q., Sun, Z.-W., Cheng, R.-L., Ye, Z.-M., and Li,
W.-X. Artesunate inhibits growth and induces apoptosis in human osteosarcoma
HOS cell line in vitro and in vivo. Journal o f Zhejiang University SCIENCE B,
12, 247-255 (2011)