Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat bằng phương pháp tự nhũ hóa

NGHIÊN CỬU BÀO CHÉ TIẺU PHÂN NANO ARTESUNAT
BẰNG PHƯƠNG PHÁP T ự NHŨ HÓA
ĐănR Tuấn Anh‘
HDKH: ThS. Nguyễn Hạnh Thủy^ PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến^
‘hớp M1K64 - Trường Đại học Dược Hà Nội
^Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia - Trường Đại học Dược Hà Nội
Từ khóa: artesunat, tiểu phân nano artesunat, tự vi nhũ tương hóa, SMEDDS.
Tóm tắt
Hệ tiểu phân nano artesunat được hình thành bằng phương pháp tự nhũ hóa
khi sử dụng hệ chất mang gồm Chất diện hoạt - Chất đồng diện hoạt - Dầu. Các
khảo sát trên nhiều chất mang phổ biến dùng cho nhũ tương cho thấy hệ Transcutol
HP - Labrasoỉ - Labrafil cho kết quả khả quan nhất dựa trên các đặc tính được xem
xét: khả năng hình thành nhũ tương, độ ổn định nhũ tương, độ tan - độ ổn định của
dược chất, kích thước tiểu phân.
Đặt vấn đề
Artesunat (ART) là một dược chất được bán tổng họp từ Artemisinin, tác
dụng chính được biết đến là điều trị sốt rét [7]. Nghiều nghiên cứu cho thấy ART có
tác dụng kìm hãm và tiêu diệt được các tế bào ung thư, và đang mở ra nhiều hướng
nghiên cứu nhằm đưa ART đến đích tác dụng là các tế bào ung thư [4, 6]. Khi sử
dụng đường uống sinh khả dụng của ART khá thấp do đặc tính cấu tạo phân tử nhạy
cảm với môi trường đường tiêu hóa, do khả năng hấp thụ qua niêm mạc hoặc các
kênh riêng trong đưòng tiêu hóa không tốt. Để cải thiện các đặc tính dược động học
của ART, việc đưa ART vào một hệ chất mang tạo ra các siêu vi nang có kích thước
nano đảm bảo sự ổn định, cải thiện sinh khả dụng và khả năng giải phóng dược chất
so với các dạng bào chế đường uống thông thường là một việc cần thiết [2, 3].
Có nhiều chất mang, hệ chất mang có những đặc tính phù hợp: hòa tan tốt nâng cao độ ổn định của dược chất, không độc, dễ sử dụng và cải thiện khả năng giải
phóng dược chất như Transcutol p/ HP, Labrasol, Labraíĩl, Tween 80, Cremophor
RH40 [1, 5],
Nghiên cứu này đề cập tới việc lựa chọn chất mang, hệ chất mang phù họfp
tạo ra một hệ tự nhũ hóa vi nhũ tương ưu việt khắc phục các điểm yếu dược động
học của dược chất. Các tiêu chí lựa chọn sẽ được đánh giá dựa trên; Khả năng hòa

tan dược chất, khả năng duy trì độ ổn định dược chất, khả năng giải phóng dược
chất, kích thước tiểu phân.


Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu
Artesunat (ART) từ Sao Kim Pharma (Hà Nội, Việt Nam), Transcutol HP,
Transcutol p, Labrafil M 1944 c s , Labrasol, Acrysol K-100, Plurol từ SapharChem
(Sài Gòn, Việt Nam), Tween 80, Tween 60, Span 80 từ Trung Quốc, Cremophor RH
40 từ Dow Com. Methanol, acetonitril (ACN), ethanol đạt tiêu chuẩn HPLC, các hóa
chất khác đạt tinh khiểt hóa học.
Phương phảp nghiên cứu
Đánh giả độ tan, độ ổn định của artesunat trong các chất mang: Thêm từ từ
ART vào microtube 2 ml chứa chính xác khoảng Ig chất mang. Hỗn họp được votex
trong 15 phút ART không tan thêm, rồi để cân bằng quá trình hòa tan trong 12 giờ ở
điều kiện phòng. Sau đó đem ly tâm hỗn hçfp, lọc qua màng 0,45)im, pha loãng dịch
trong bằng ACN định lượng ART bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký
như ở dưới. Các thành phần cho hệ chất mang được lựa chọn dựa vào độ tan, độ ổn
định của ART trong đó. Phần còn lại của dịch trong để ở điều kiện phòng, theo dõi
độ ổn định của ART.
Định lượng hàm lượng dược chất trong hệ tự nhũ hỏa bằng HPLC: Cân
chính xác khoảng 100,0 mg mẫu thử, hòa tan ừong 10,0 ml ethanol rồi tiêm vào hệ
thống sắc ký. Các điều kiện sắc kí sử dụng: Cột Agilent C l 8-150 mm X 4,5 mm, 5
^m, pha động: Đệm phosphat pH 3:acetonitril - 50:50; tốc độ dòng; 1 ml/phút; thể
tích tiêm mẫu: 20 ^1; bước sóng: 216 nm
Xây dựng giản đồ pha: Hệ gồm 3 thành phần: Chất diện hoạt - chất đồng diện
hoạt - dầu sẽ được thử khả năng tạo thành vi nhũ tưofng. Hỗn hợp 0,2 ml 3 thành
phần trên theo các tỉ lệ khác nhau được nhỏ vào 300 ml nước trong cốc thủy tinh ở
37°c, khuấy nhẹ bàng khuấy từ. Quan sát xu hướng tạo thành vi nhũ tương. Vi nhũ
tương được coi là “tốt” nếu các giọt phân tán nhỏ trong nước, dịch tạo thành trong

hoặc trong mờ; và được coi là “xấu” nếu tạo thành dịch sữa hoặc các giọt bị tụ lại.
Các hệ tạo thành sau đó được thêm dược chất ở lượng vừa đủ, tiến hành nhũ hóa vào
môi trường nước sau đó đem đo kích thước tiểu phân. Giản đồ pha được xây dựng từ
các vùng hệ cho kích thước tiểu phân nhỏ hơn 1000 nm.
Khả năng tự nhũ hóa và độ ổn định của các hệ chất mang: Trên giản đồ pha,
các hệ tạo vi nhũ tương được chọn để thử khả năng tự nhũ hóa và đánh giá độ ổn
định. 0,2 ml hệ được nhỏ vào cốc 300 ml nước trong 2 điều kiện; có sử dụng lực
khuấy và không sử dụng lực khuấy. So sánh thời gian hình thành vi nhũ tương của


các hệ. Đồng thời, quan sát sự biến đổi về màu sắc, sự phân lớp của các hệ được
chọn trên. Hệ có khả năng tự nhũ hóa tốt nhất và ổn định nhất sẽ được lựa chọn tiến
hành các khảo sát tiếp theo.
Kết quả
Đánh giá độ tan của artesunat trong chất mang:
Bảng 1. Ket quả tính toán độ tan của artesunat trong chất mang
stt

Chât mang

Chỉ sô HLB

Độ tan (%kỉ/kl)

1

Transcutol HP

4,2

15,74

2

Transcutol p

4,0

15,47

3

Labrasol

14

6,09

4

Labrafil M

4

0,94

5

Tween 80

15

5,59

6

Cremophor RH 40

14-16

6,85

7

Tween 60

14,9

-

8

Acrysol K 100

9

Span 80

10

Plurol

1944 cs

-

-

4,3

-

-

-

hòa tan artesunat tốt nhất nên được lựa chọn là chất đồng diện hoạt trong hệ tự vi
nhũ tương; Labrafil M l944 cs làm pha dầu và chất diện hoạt có thể là Labrasol,
Tween 80 hoặc Cremophor RH 40.
Giản đồ pha
MI

! jim>ci!tol I IP - 1 abrasnl - I ahralll

M2: I

ỉ l l ’ - R IU O - t.abratìl

M3, i í^iiNCiiioị H I '- ! uccn XO - l.abraftl

VranvHI’

ỉ ftbín'í'l

Lj'afuîüi

KHií*

l4ÌKatì!


\1J I fiinsciiu»! í‘ - I iibr-jsol -1 .thMliH

M.v I nnvoiiiol I' - RIMÍ) - 1ahwsol

\t
Hình 1. Giản đồ pha các hệ tự nhũ hóa M l, M2, M3, M4, M5, M6.
Trong đó: MI là: Trasnscutol HP - Labrasoỉ - Labrafil; M2 là Trasnscutol HP- Cremophor
RH40 - Labrafil; M3 là Tmnscutol HP - Tweeen 80 - Labrafil; M4 là Transcutol p Labrasol - Labrafil; M5 là Transcutol p - Cremophor RH40 - Labrafil; M6 là Transcutol p
- Tween 80 - Labrafil.
Ket quả Ở hình 1 frên cho thấy rằng, 6 hệ được tạo thành từ 6 chất mang đều
có khả năng tạo vi nhũ tương, trong đó hệ M 1 và M4 vùng tạo vi nhũ tương giống
nhau. Vùng tạo vi nhũ tương của các hệ khá rộng, đặc biệt là hệ có chứa Cremophor
RH 40 (M2 và M5), điều này đem lại nhiều lựa chọn cho việc xây dựng và xác định
công thức để tiến hành thử nghiệm, tuy nhiên có khả năng trong vùng đó có những
vùng tạo micell. Việc đo kích thước tiểu phân sẽ xác định rõ ràng phân vùng vi nhũ
tương và vùng tạo micell của các hệ. Kết quả đo kích thước tiểu phân (ở bảng 5) của
các hệ đã được ghi nhận, kết quả cho thấy không có sự hình thành micell.
Bảng 2 cho thấy kích thước tiểu phân hệ M5 trước khi cho thêm dược chất, ở

các điểm mà dịch nhũ hóa khi tạo thành quan sát bằng mẳt thường thấy trong suốt.
Bảng 2: Kết quả đo kích thước tiểu phân hệ
M5: Transcutol p - Cremophor RH 40 - Labrafil (nm)
Tỷ lệ S-mix
Tỉ lệ S-mix: Labrafíl
TransHP-RH40
6:4
8:2
9:1
7:3
205,2
234,6
324,2
5:5
246,8
237,2
177,5
9:1
252,9
348,7
1:9
150,4
195,5
154,8
164,6
8:2
205,2
585
172
2:8

190,4
7:3
232,1
198,8
3:7
201,4
194,6
6:4
148,6
155,9
238,4
200,2
4:6


Khä năng tự nhũ hóa và độ ỗn định của các hệ chất mang
Các tỉ lệ khác nhau của các hệ chất mang M1-M6 được theo dõi ở điều kiện
thường và quan sát sự biến đổi về màu sắc, thể chất trong 4 tuần. Đánh giá các hệ ở
tỉ lệ dầu là 30%, tỉ lệ chất diện h o ạ t: đồng diện hoạt thay đổi theo tỉ lệ từ 3:7 đến 7:3
Bảng 3. Kết quả theo dõi độ ổn định của hệ chất mang
MĨ
M2
M3
M4
M5
M6
Sau 28 ngày 100% các tỉ
100% các tỉ
Sau 28 ngày, 100% các tỉ
100% các tỉ

các hệ vẫn
lệ có sự phân lệ có sự phân các hệ vẫn
lệ có sự tách lệ có sự phân
ổnđịrứi
lóp sau 7
lóp sau 25
ổn định
lớp sau 14
lớp sau 28
ngày
ngày
ngày
ngày
Các quan sát cụ thê cho thây, ở hệ M2 và M5, hỗn hợp chât mang càng sử
dụng nhiều Cremophor RH 40 thì tách lớp càng sớm. Các hệ M3 và M6 ổn định
hơn, nhưng sau 28 ngày, cả 2 hệ đề có sự tách lóp, sự tách lóp của các hệ cũng như
hệ M2 và M5, nghĩa là hỗn họp sử dụng nhiều Tween 80 sẽ tách lớp trước. Hệ MI
và M6 ổn định nhất khi không có sự biến đổi về thể chất, màu sắc. Khả năng tự nhũ
hóa của các hệ cũng được đánh giá thực nghiệm trên các tỉ lệ cụ thể, tỉ lệ pha dầu là
30%, tỉ lệ chất diện h o ạ t: đồng diện hoạt thay đổi từ 3:7 đến 7:3.

Lực khuây
Tôc độ tạo VNT

Bảng 4. Khả năng tự nhũ hóa của các hệ
MI
M2
M3
M4
M5

+
+
+
Ngay lập
Khuây
Khuây
Ngay lập
Khuây
tức khi
mạnh
nhẹ 20s tức khi nhỏ mạnhlp
nhỏ vào
Iphút
vào nước
nước
-

-

M6
+
Khuây
30s

Các hệ M2, M3, M5, M6 khi không sử dụng lực khuấy, pha dầu vẫn phân tán
vào nước nhưng tạo ra các giọt lớn, quan sát rõ bằng mắt thường và có xu hướng kết
tụ lại với nhau. Với 4 hệ chất mang này, chỉ khi có lực khuấy thì mới có sự hình
thành vi nhũ tương ở các tỉ lệ xác định. Theo quan sát cường độ và biên độ lực
khuấy cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành nhũ tương, vi nhũ tương của các hệ
này. Hệ M I và M4 hình thành vi nhũ tương ngay trong điều kiện không sử dụng lực

khuấy với tốc độ nhanh, gần như ngay lập tức khi có sự tiếp xúc của hỗn họp chất
mang với nước.Theo các kết quả của các thí nghiệm này, có thể thấy rằng hệ chất
mang MI và M4 cho những kết quả khả quan nhất. Các thử nghiệm tiếp theo của
nghiên cứu sẽ tiến hành trên hệ MI và M4.


Độ tan của artesunat trong hệ chất mang
Các thử nghiệm về độ tan của artesunat trong M I đã được tiến hành với các tỉ
lệ chất mang khác nhau, dựa trên các điểm tỉ lệ trên giản đồ pha. Kết quả xác định
độ tan theo bảng 5 cho thấy rằng, lượng ART được hòa tan bởi hệ hỗn hợp các chất
mang nhiều hơn khi sử dụng đơn chất mang. Tại tỉ lệ Transcutol
HP:Labrasol:Labrafil - 63:27:10 độ tan của ART là lớn nhất - đạt 31,83% kl/kl. (xấp
xỉ 2 lần so với đơn chất mang có khả năng hòa tan ART tốt nhất là Transcutol HP đạt 15,74% kl/kl.
Bảng 5. Độ tan của Artesunat trong hệ
M l; Transcutol HP - Labrasol - Labrafil (%kl/kl)

Tỉ lệ s-mix
TransHP :
Labrasol

Tỉ lệ S-mix:Labrafil
5:5

6:4

5:5
9:1
1:9

13,13

13,52

7:3

8:2

9:1

19,51

23,30

23,63

14,93

23,53

27,57

21,76

29,25

31,81
8:2
25,11
22,37
31,45

2:8
26,59
29,40
31,83
13,68
7:3
16,89
24,02
24,39
29,33
19,11
3:7
Ỉ7,54
23,41
24,74
6:4
19,06
19,96
26,76
4:6
Bàn iuận
- về ảnh hưởng của chất đồng diện hoạt: Trong các thí nghiệm trên,
Transcutol p và Transcutol HP đóng vai trò là chất đồng diện hoạt. Có thể nhận thấy
rằng, tỉ lệ của 2 chất này quyết định nhiều đển khả năng hòa tan dược chất của hệ
chất mang. Độ tan của dược chất ART trong 2 chất này cũng là lớn nhất (lần lượt là
15.47 và 15.74 %kl/kl với Transcutol p và Transcutol HP), do đó các kết quả thử
nghiệm với hệ chất mang thấy rằng, tỉ lệ 2 chất này càng cao, thì khả năng hòa tan
dược chất của hệ cũng cao hơn.
- về độ tan của dược chất trong hệ: Khi sử dụng hệ chất mang, độ tan của
dược chất có thay đổi, đa số các trường hợp là tăng lên so với việc sử dụng đơn chất

mang. Một số kết quả ghi nhận, độ tan của dược chất tăng 100% so với việc sử dụng
đơn chất mang. Vậy iệc sử dụng hệ chất mang cải thiện khả năng hòa tan dược chất,


thông qua đó làm tăng lượng dược chất vào cơ thể mà không làm tăng quá lớn lưọng
chất mang.
Theo sự đánh giá kích thước tiểu phân sơ bộ ở bảng 2, tất cả các điểm hệ
quan sát bằng mắt thường thấy trong suốt hoặc trong mờ đều đạt kích thước tiểu
phân trong khoảng từ 1-1000 nm (chủ yếu từ 150-350 nm). Như vậy có thể nhận
định rằng, với cấu trúc gồm chất diện hoạt - chất đồng diện hoạt - dầu, hệ sẽ hình
thành vi nhũ tương ở các tỉ lệ nhất định. Khoảng phân bố kích thước tiểu phân của
các hệ chất mang tại các tỉ lệ khác nhau là khác nhau, do đó cần xem xét tỉ lệ có
khoảng phân bố hẹp nhất, để đảm bảo sự đồng đều kích thước của tiểu phân nano và
đảm bảo tính chính xác trong các thử nghiệm có mặt của dược chất, tác dược và các
tác động môi trường về sau.
Kết luận
Kết quả các thử nghiệm cho thấy rằng việc đưa artesunat vào chất mang là
khả thi. Đặc biệt trong việc cải thiện nồng độ dược chất đưa vào cơ thể, với cùng
lượng như nhau, hệ hỗn họp chất mang có khả năng đưa được nhiều dược chất vào
cơ thể hơn. Các nghiên cứu về độ ổn định và đưa ra công thức, dạng bào chế cuối
cùng sẽ tiếp tục được nghiên cứu. Theo các tài liệu tham khảo, hiện nay vẫn chưa có
phương pháp chính xác và tối ưu nào xác định rõ được cấu trúc của vi nhũ tương tạo
thành, do đó việc kết luận dạng, cấu trúc của các vi nhũ tương hiện vẫn dựa trên các
lý thuyết khoa học về bào chế.
Tài liệu tham khảo
1. Ajeet K. Singh, Akash Chaurasiya, Manish Singh, Satish c. Upadhyay, Rama
Mukherjee, and Roop K. Khar. Exemestane Loaded Self-Microemulsifying Drug
Delivery System (SMEDDS): Development and Optimization. AAPS PharmSciTech,
Vol. 9, No. 2 (2008).
2. Chadha, R., Gupta, s., and Pathak, N. Artesunat-loaded chitosan/lecithin

nanoparticles: Preparation, characterization, and in vivo studies. Drug Development
and Industrial Pharmacy, 38, 1538-1546 (2012).
3. Chen, Y., Lin, X., Park, H., and Greever, R. Study of artemisinin nanocapsules as
anticancer drug delivery systems. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and
Medicine, 5, 316-322 (2009).
4. Efferth, T. Willmar Schwabe Award 2006: antiplasmodial and antitumor activity
o f artemisinin-from bench to bedside. Planta medica, 73, 299-309 (2007).


5. Medha Joshia, Sulabha Pathakb, Shobhona Sharmab, Vandana Patravalea. Solid
microemulsion preconcentrate (NanOsorb) o f artemether for effective treatment of
malaria. International Journal o f Pharmaceutics 362, 172-178(2008)
6. Thomas Efferth, Armin Olbrich, Rudofl Bauer. mRNA expression profiles for the
response of human tumor cell lines to the antimalarial drugs artesunat- arteether- and
artemether. Biochemical Pharmacology, 64, 617 - 623 (2012).
7. Xiao, X.-C., and Hong, Z.-G. Firstborn microcrystallization method to prepare
nanocapsules containing artesunat. International journal o f nanomedicine, 5, 483
(2010).