Đánh giá tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ tế bào gan in vitro và độc tính tiền lâm sàng của cao đặc tỏi khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU PHƯƠNG

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXI
HÓA, BẢO VỆ TẾ BÀO GAN IN VITRO
VÀ ĐỘC TÍNH TIỀN LÂM SÀNG CỦA
CAO ĐẶC TỎI
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2023


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU PHƯƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1801560

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXI
HÓA, BẢO VỆ TẾ BÀO GAN IN VITRO
VÀ ĐỘC TÍNH TIỀN LÂM SÀNG CỦA
CAO ĐẶC TỎI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Thu Hằng
2. ThS. Đỗ Văn Khái
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược lý

HÀ NỘI – 2023


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn
Thu Hằng, người thầy trực tiếp dẫn dắt, quan tâm, chỉ bảo, động viên em và tạo điều
kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài. Ở cô, em không
chỉ học được những kiến thức chun mơn mà cịn được dạy những kỹ năng thực nghiệm
và phương pháp làm việc khoa học, hiệu quả.
Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Đỗ Văn Khái, người luôn giúp đỡ, quan tâm và
theo sát em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Trần Hồng Linh, người thầy luôn bên
cạnh, nhiệt tình hướng dẫn, cho em những lời khuyên q báu trong q trình làm thực
nghiệm tại bộ mơn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến DS. Nguyễn Thị Thủy, DS. Cao Thị
Cẩm Vân, DS. Đinh Đại Độ cùng các bạn, các em sinh viên tham gia nghiên cứu tại bộ
môn Dược lý đã luôn bên cạnh sát cánh, hỗ trợ tận tình trong suốt quá trình thực hiện đề
tài để có được kết quả cuối cùng. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các
thầy cô giáo đã dạy dỗ em suốt năm năm dưới mái trường Đại học Dược nói chung và
bộ mơn Dược lý nói riêng, thầy cơ là người truyền cảm hứng và là tấm gương sáng cho
chúng em về lối sống và đạo đức nghề nghiệp.
Và cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình ln đồng hành, ủng hộ, động viên
con. Cảm ơn những người bạn đã luôn lắng nghe, chia sẻ, cùng nhau nỗ lực, cùng nhau
trải qua những kỉ niệm đáng quý.
Hà Nội, ngày 5 tháng 6 năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thu Phương

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1 Tổng quan về tổn thương gan ................................................................................ 3
1.1.1. Gan và chức năng gan..................................................................................... 3
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh một số bệnh gan ................................................................. 3
1.1.3. Các phương pháp điều trị bệnh gan ................................................................ 6
1.1.4. Thuốc có nguồn gốc dược liệu trong điều trị bệnh gan ................................. 7
1.2. Tổng quan phương pháp in vitro đánh giá tác dụng chống oxi hóa và bảo vệ tế
bào gan ......................................................................................................................... 9
1.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro ................................. 9
1.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro ........................... 13
1.3. Tổng quan dược liệu Tỏi ..................................................................................... 15
1.3.1. Tên khoa học: ............................................................................................... 15
1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố: ..................................................................... 15
1.3.3. Bộ phận dùng và công dụng ......................................................................... 16
1.3.4. Thành phần hóa học: ..................................................................................... 16
1.3.5. Tác dụng dược lý .......................................................................................... 17
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 19
2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................... 19
2.2.1. Động vật và tế bào nghiên cứu ..................................................................... 19
2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ...................................................... 19
2.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 20
2.4. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 21
2.4.1. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro của cao đặc tỏi ...... 21
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro của cao đặc
tỏi ............................................................................................................................ 24
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu độc tính của cao đặc tỏi ....................................... 25
2.5. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................... 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 29
3.1. Tác dụng chống oxi hóa in vitro của cao đặc tỏi ................................................ 29
3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH .................................... 29
3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do OH• ....................................... 29
3.1.3. Kết quả đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do ABTS•+.................................. 30
3.1.4. Kết quả đánh giá khả năng tạo phức chelat với Fe2+ .................................... 30
3.1.5. Kết quả đánh giá khả năng khử Fe3+ theo phương pháp FRAP ................... 31


3.1.6. Kết quả đánh giá khả năng chống oxi hóa tổng (TAC) ................................ 32
3.2. Tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro của cao đặc tỏi ........................................... 33
3.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của cao đặc tỏi lên khả năng sống sót của tế bào
HepG2 ..................................................................................................................... 33
3.2.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro trên mô hình gây độc tế bào
bằng CCl4 ................................................................................................................ 33
3.3. Kết quả xác định độc tính tiền lâm sàng của cao đặc tỏi .................................... 34
3.3.1. Độc tính cấp .................................................................................................. 34
3.3.2. Độc tính bán trường diễn .............................................................................. 34
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ........................................................................................... 43
4.1. Bàn luận về tác dụng chống oxi hóa in vitro của cao đặc tỏi.............................. 43
4.1.1. Bàn luận về khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH của cao đặc tỏi ................... 43
4.1.2. Bàn luận về khả năng bắt giữ gốc tự do ABTS•+ của cao đặc tỏi ................. 43
4.1.3. Bàn luận về khả năng bắt giữ gốc tự do OH• của cao đặc tỏi ....................... 44
4.1.4. Về khả năng chelat Fe2+ của cao đặc tỏi ....................................................... 44
4.1.5. Về khả năng khử Fe3+ theo phương pháp FRAP của cao đặc tỏi ................. 45
4.1.6. Bàn luận về khả năng chống oxi hóa tổng của cao đặc tỏi ........................... 45
4.1.7. Bàn luận về mối liên quan giữa thành phần hóa học và tác dụng chống oxi
hóa của cao đặc tỏi .................................................................................................. 45
4.2. Bàn luận về tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro của cao đặc tỏi ........................ 46
4.2.1. Ảnh hưởng của cao đặc tỏi trên khả năng sống sót của tế bào HepG2 ........ 46

4.2.2. Tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro của cao đặc tỏi trên mơ hình gây độc tế
bào gan bằng CCl4 .................................................................................................. 46
4.3. Bàn luận về thử nghiệm độc tính ........................................................................ 47
4.3.1. Độc tính cấp .................................................................................................. 47
4.3.2. Độc tính bán trường diễn .............................................................................. 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 53


ABTS

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
diammonium salt

ALT
AST
DILI

Alanin transaminase
Aspartate transaminase
Tổn thương gan do thuốc

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

HepG2

Liver hepatocellular cell

HCT
HGB

Hematocrit
Nồng độ hemoglobin

GSH
GPx
MCV

Glutathion dạng khử
Glutathion peroxidase
Thể tích trung bình hồng cầu

PLT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5
diphenyltetrazoliumbromid
Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế (Organization for
Economic Cooperation and Development)
Số lượng tiểu cầu

ROS
RBC

Reactive oxygen species
Số lượng hồng cầu

WBC

Số lượng bạch cầu

MTT
OECD


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 1.1. Một số dược liệu bảo vệ tế bào gan

8

Bảng 1.2. Một số phương pháp chống oxi hóa trong ống nghiệm

9-10

Bảng 1.3. Các tác nhân gây độc tế bào gan

15

Bảng 3.1. Giá trị IC50 của cao đặc tỏi trên khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH
Bảng 3.2. Giá trị IC50 của cao đặc tỏi trên khả năng bắt giữ gốc tự do OH

•

Bảng 3.3. Giá trị IC50 của cao đặc tỏi trên khả năng bắt giữ gốc tự do ABTS

Bảng 3.4. Giá trị IC50 của cao đặc tỏi trên khả năng chelat Fe
Bảng 3.5. Giá trị IC50 của cao đặc tỏi trên khả năng khử Fe

29
29-30

•+

2+

3+

30
31
32

Bảng 3.6. Giá trị IC50 của cao đặc tỏi trên khả năng chống oxi hóa tổng

33

Bảng 3.7. Tỷ lệ tế bào HepG2 sống sót khi ủ với cao đặc tỏi ở các nồng độ

33

khác nhau
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của cao đặc tỏi trên tỷ lệ sống sót tế bào khi gây độc
với tác nhân CCl4

33

Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm cho thử nghiệm độc tính cấp của cao đặc tỏi

34

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của cao đặc tỏi đến thông số huyết học trên chuột

36

nhắt trắng
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cao đặc tỏi đến thơng số sinh hóa trên chuột nhắt

37

trắng
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của cao đặc tỏi đến tỉ lệ khối lượng các cơ quan so
với khối lượng cơ thể chuột nhắt

38

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của cao đặc tỏi đến mô bệnh học gan chuột nhắt đực

39

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của cao đặc tỏi đến mô bệnh học gan chuột nhắt cái

40

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của cao đặc tỏi đến mô bệnh học thận chuột nhắt đực

41

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của cao đặc tỏi đến mô bệnh học gan chuột nhắt cái

42


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 1.1. Ngun tắc phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do
DPPH

11

Hình 1.2. Nguyên tắc phương pháp đánh giá khả năng khử Fe3+

11

Hình 1.3. Nguyên tắc phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do
ABTS•+

11

Hình 1.4. Ngun tắc phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do

12

OH•

Hình 1.5. Ngun tắc phương pháp đánh giá khả năng chelat Fe2+

12

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu

21

Hình 2.2. Quy trình xác định độc tính bán trường diễn

27

Hình 3.1. Đồ thị tuyến tính OD – Nồng độ Trolox (µg/ml)

31

Hình 3.2. Hàm lượng Tỏi – Tương đương Trolox (µg/ml)

32

Hình 3.3 Ảnh hưởng của cao đặc tỏi lên khối lượng cơ thể chuột nhắt đực

35

Hình 3.4 Ảnh hưởng của cao đặc tỏi lên khối lượng cơ thể chuột nhắt cái

35


ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan là một bệnh lý gây ra bởi nhiều tác nhân, có thể dẫn tới các hậu quả
như xơ gan, ung thư gan và là nguyên nhân dẫn tới gia tăng gánh nặng bệnh tật hoặc tử
vong. Các nguyên nhân hàng đầu gây bệnh gan trên toàn cầu là viêm gan do thuốc, viêm
gan do rượu, viêm gan nhiễm mỡ không do rượu, viêm gan virus [45]. Một nghiên cứu
về sự thay đổi dịch tễ học các bệnh gan năm 2016 chỉ ra ở khu vực Đông Nam Á bao
gồm Việt Nam có tỷ lệ nhiễm HBV và HCV lần lượt là 3.8% và 1.7% (giảm 29% và
29.6% với năm 2006); tỷ lệ nhiễm bệnh gan do rượu là 1.9% (tăng 33.2% so với năm
2006); bệnh gan do các nguyên nhân khác chiếm 2% (tăng 29.7% so với năm 2006).
Như vậy, HBV vẫn là nguyên nhân chính gây ra bệnh gan ở khu vực Đông Nam Á tuy
nhiên gan nhiễm mỡ do rượu và tổn thương gan do thuốc đang ngày càng tăng dẫn đến
gia tăng các biến chứng xơ gan và ung thư gan [105]. Thống kê của Tổ chức y tế thế
giới năm 2020 cho thấy, tỷ lệ mắc mới ung thư gan tại Việt Nam nằm trong top 6 quốc
gia và tỷ lệ tử vong do ung thư gan nằm trong top 15 quốc gia cao nhất thế giới [100].
Các bệnh về gan là mối quan tâm của sức khỏe cộng đồng vì các phương pháp
điều trị thông thường mang lại kết quả hạn chế với các tác dụng phụ kèm theo. Việc
thiếu các phương pháp điều trị hiệu quả và số lượng bệnh nhân mắc bệnh gan ngày càng
tăng đã đã thu hút sự quan tâm nghiên cứu đối với các thuốc điều trị mới, hiệu quả và ít
tác dụng khơng mong muốn.
Stress oxi hóa có vai trị lớn trong phát sinh bệnh lý tại gan. Các nghiên cứu đã
chứng minh được vai trị của stress oxi hóa trong bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu,
bệnh gan do thiếu máu cục bộ, bệnh gan do rượu, xơ gan, viêm gan siêu vi và tổn thương
gan do thuốc [64]. Do vậy, liệu pháp chống oxi hóa có thể có lợi trong việc kiểm sốt
các bệnh gan và là một trong những hướng đi trong nghiên cứu phát triển thuốc mới
trong điều trị bệnh gan. Việt Nam với nguồn dược liệu đa dạng phong phú với nền y học
cổ truyền có hệ thống lý luận chặt chẽ và kinh nghiệm trong việc sử dụng cây thuốc
trong phịng và chữa bệnh. Nhiều lồi dược liệu có tác dụng bảo vệ tế bào gan đã được
sử dụng trong dân gian để phòng và điều trị các bệnh lý gan như diệp hạ châu
(Phyllanthus urinaria.), actiso (Cynara scolymus), nhân trần (Adenosma
caeruleum),….[4].
Tỏi (Allium sativum L.) là cây được trồng rộng rãi để làm gia vị và làm thuốc [4].

Tỏi có nhiều hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm các hợp chất organosulfur, saponin,
hợp chất phenolic và polysacarit. Các nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới cho thấy
chiết xuất Tỏi có tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ tim mạch, chống ung thư [21], [77],
[93],[96],[106]... tuy nhiên có rất ít nghiên cứu về tác dụng bảo vệ tế bào gan của Tỏi.
Nhằm xây dựng căn cứ khoa học trong việc đánh giá tác dụng và tiềm năng nghiên cứu
phát triển thuốc bảo vệ tế bào gan từ Tỏi, nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Đánh giá
1


tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ tế bào gan in vitro và độc tính tiền lâm sàng của cao đặc
tỏi” với 3 mục tiêu sau:
1. Đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro của cao đặc tỏi
2. Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro của cao đặc tỏi
3. Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của cao đặc tỏi.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về tổn thương gan
1.1.1. Gan và chức năng gan
Gan là một cơ quan có nguồn cung cấp máu kép từ tĩnh mạch cửa (khoảng 75%)
và động mạch gan (khoảng 25%). Gan chiếm khoảng 2% trọng lượng cơ thể của một
người trưởng thành, là một cơ quan quan trọng trong cơ thể con người chịu trách nhiệm
cho một loạt các chức năng giúp hỗ trợ trao đổi chất, miễn dịch, tiêu hóa, giải độc, dự
trữ vitamin,...[31].
Bài tiết mật: Mật được tiết ra từ tế bào gan vào ống mật, cuối cùng tiết vào tá
tràng hoặc được dự trữ trong túi mật. Sau khi được tiết vào tá tràng, mật vào tuần hoàn
ruột để thực hiện chức năng hấp thụ và tiêu hóa lipid. Các thành phần mật không được
bài tiết được vi khuẩn đường ruột chuyển thành axit mật để tái hấp thụ ở hồi tràng và

vận chuyển trở lại gan [15].
Chuyển hóa thuốc: Gan có chức năng biến đổi xenobiotic (chất ngoại sinh) chủ
yếu thông qua 2 phản ứng: giai đoạn I và giai đoạn II. Phản ứng giai đoạn I tạo ra một
chất tan thân nước hơn thơng qua q trình oxi hóa, khử và thủy phân sử dụng chủ yếu
là họ enzyme cytochrome P450 (CYP450). Có ba con đường chính để liên hợp được
thực hiện trong các phản ứng giai đoạn II: liên hợp với glucuronate, glutathione hoặc
sulfate [15].
Chuyển hóa protein, lipid, glucid: Gan đóng vai trị như một kho dự trữ năng
lượng, lưu trữ glucose dưới dạng glycogen để giải phóng theo nhu cầu. Do đó, nó đóng
một vai trị rất quan trọng trong việc duy trì nồng độ đường huyết bình thường [31].
Gan cũng đóng vai trị trung tâm trong q trình tổng hợp, oxi hóa, dự trữ và phân
phối lipid. Nó khơng chỉ hỗ trợ q trình hấp thụ chất béo thơng qua hoạt động của muối
mật, mà cịn (1) tổng hợp và oxi hóa axit béo, cholesterol, tri acylglycerol và
phospholipid (thành phần chính của màng tế bào); (2) tổng hợp hầu hết các lipoprotein
huyết tương; và (3) chuyển đổi carbohydrate và protein thành chất béo [31].
Các chức năng quan trọng nhất của gan trong chuyển hóa protein là (1) khử amin
của axit amin để sử dụng làm năng lượng hoặc chuyển đổi thành chất béo và
carbohydrate, (2) tổng hợp và chuyển đổi các axit amin và các hợp chất chuyển hóa quan
trọng, (3) tổng hợp ure để bài tiết amoniac, và (4) tổng hợp protein huyết tương [31].
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh một số bệnh gan
1.1.2.1. Viêm gan virus cấp
a. Dịch tễ học
Theo nghiên cứu của Linh-Vi Lê và cộng sự từ năm 2015 đến năm 2020 tại khu
vực Châu Á Thái Bình Dương tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính giảm từ 4,69% xuống 4,30%
và tỷ lệ hiện mắc HCV giảm từ 0,64% xuống 0,58%. Tuy nhiên, tỷ lệ mắc ung thư biểu
3


mô tế bào gan (HCC) liên quan đến nhiễm HBV và HCV vẫn tăng lần lượt 9% và 7%.
Tử vong liên quan đến gan do HBV tăng 8% và tỷ lệ tử vong do HCV không giảm [35].

b. Cơ chế bệnh sinh:
Q trình sinh bệnh có thể chia ra các thời kì sau: [3]
Thời kỳ thâm nhập của virus: Virus A,E thâm nhập theo đường tiêu hóa. Virus
B,C,D,G thâm nhập vào đường máu
Thời kỳ nhân lên của virus: tại các tổ chức của đường tiêu hóa và sau đó là các
hạch lympho mạc treo, virus được nhân lên. Do tác động của virus đến các tổ chức này
làm tăng tính thấm của tế bào, thối hóa, hoại tử tổ chức và tạo ra những biến đổi không
đặc hiệu
Thời kỳ nhiễm virus tiên phát: virus từ hạch lympho vào máu gây ra phản ứng của
cơ thể biểu hiện bằng sốt
Thời kỳ lan tràn tổ chức: virus từ máu thâm nhập vào tất cả các cơ quan chủ yếu
là gan. Quan trọng nhất trong thời kỳ này là virus gây tổn thương gan. Tổn thương gan
biểu hiện ở 3 mặt: phân hủy tế bào nhu mô gan, tổn thương tế bào và ứ tắc mật. Trên
lâm sàng thời kỳ này tương ứng với thời kỳ toàn phát của bệnh.
Thời kỳ nhiễm virus huyết thứ phát: virus từ gan trở lại máy gây nên những đợt
bột phát, hiện tượng nhiễm độc dị ứng, phát sinh biến chứng và tái phát.
1.1.2.2. Bệnh gan do rượu (ALD)
a. Dịch tễ học:
Kết quả tổng quan hệ thống và phân tích tổng hợp của Xu et al. đã xác định rằng
tỷ lệ ALD chung ở người trưởng thành ở châu Á là 4.81%. Tỷ lệ mắc ALD ở nam giới
cao hơn nhiều (7,80%) so với phụ nữ (0,88%) phù hợp với đặc điểm xã hội về tình trạng
kinh tế xã hội và mức độ tiêu thụ rượu của nam giới và phụ nữ ở châu Á. Tỷ lệ mắc
ALD và tỷ lệ ung thư biểu mô tế bào gan do rượu ở châu Á đã tăng lên trong hai thập
kỷ qua, tỷ lệ gộp các trường hợp xơ gan do rượu là 12,57% và tỷ lệ ung thư biểu mô tế
bào gan do rượu là 8,30% [74].
b. Cơ chế bệnh sinh:
Trong tế bào gan, rượu được chuyển hóa thành acetaldehyde bởi alcohol
dehydrogenase (ADH), acetaldehyde tiếp tục được chuyển hóa thành acetat bởi
acetaldehyde dehydrogenase (ALDH). Acetaldehyde là chất gây độc cho gan và có thể
chuyển thành acetat gây xơ gan [59].

Uống rượu mãn tính dẫn đến việc tăng tạo ra cytochrom P450 2E1 (CYP2E1) để
chuyển hóa rượu thành acetaldehyde. Các gốc tự do oxi hóa (ROS) được tạo ra như một
sản phẩm phụ của hoạt động CYP2E1. ROS cũng được tạo ra thơng qua q trình viêm;
ví dụ như trong bệnh viêm gan do rượu. ROS có thể liên kết với các protein và tạo ra
các kháng nguyên mới kích hoạt phản ứng miễn dịch. ROS cũng có thể dẫn đến peroxi
4


hóa lipid và tạo ra các sản phẩm peroxi hóa lipid như 4-hydroxinonenal (4-HNE) hoặc
malondialdehyd (MDA). Cả hai hợp chất có thể liên kết với DNA gây ung thư. ROS
cũng có thể kích thích các tế bào hình sao ở gan, dẫn đến q trình xơ hóa. Do đó, ROS
là nguyên nhân chính dẫn đến sự tiến triển của bệnh gan do rượu [59].
1.1.2.3. Bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD)
a. Dịch tễ học:
Kết quả từ một phân tích tổng hợp năm 2016 về dịch tễ học của NAFLD ước
tính rằng 25% dân số trưởng thành trên thế giới mắc NAFLD và thay đổi theo bối cảnh
lâm sàng, chủng tộc/dân tộc và khu vực địa lý. Tỷ lệ lưu hành cao nhất được báo cáo từ
Nam Mỹ (31%) và Trung Đông (32%) trong khi tỷ lệ lưu hành thấp nhất được báo cáo
từ Châu Phi (14%). Ở Châu Á, tỷ lệ mắc được ước tính là 27.37% với độ tuổi chiếm tỷ
lệ cao nhất là 70-79 tuổi [77].
b. Cơ chế bệnh sinh:
Các yếu tố di truyền, chế độ ăn uống và môi trường dẫn đến kháng insulin, tăng
sinh và rối loạn chức năng tế bào mỡ, thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột. Sau đó, kháng
insulin dẫn đến phân giải lipid, giải phóng các cytokin tiền viêm như TNF-α, IL-6 và
kích thích sự hình thành và tích tụ chất béo trong gan. Kết quả là, acid béo tự do tăng
lên gây ra sự tích tụ triglyceride, gây rối loạn chức năng ty thể và stress mạng lưới nội
chất (ER). Các yếu tố trên đồng thời tấn công (multiple parallel hits) dẫn đến sự phát
triển của NAFLD và tiến triển thành xơ hóa và xơ gan. [23]
1.1.2.4. Tổn thương gan do thuốc (DILI)
a. Dịch tễ:

Tỷ lệ mắc DILI đã tiếp tục tăng và được công nhận là một mối quan tâm lớn về
sức khỏe cộng đồng. Ở các nước phát triển, tỷ lệ mắc DILI trong dân số nói chung được
ước tính rơi vào khoảng từ 1/100.000 đến 20/100.000. Dữ liệu từ Pháp và Iceland cho
thấy tỷ lệ mắc mới hàng năm của DILI lần lượt là khoảng 13,9/100.000 và 19,1/100.000.
Tỷ lệ mắc ở Trung Quốc bệnh nhân bị DILI cấp tính chiếm khoảng 20% bệnh nhân nội
trú bị tổn thương gan cấp tính [78]
b. Cơ chế bệnh sinh:
DILI có thể là kết quả của độc tiń h trực tiếp của thuốc hoặc các chất chuyển hóa
của thuốc hoặc tổn thương có thể do các cơ chế qua trung gian miễn dịch [76]
Q trình chuyển hóa thuốc ở gan thường trải qua hai giai đoạn. Pha 1 chủ
yếu là phản ứng oxi hóa khử xúc tác bởi Cytochrom P450, thuốc bị ion hóa có thể tương
tác với các bào quan tế bào khác nhau (ví dụ như ty thể) dẫn đến rối loạn chức năng tế
bào gan và chết tế bào. Pha 2 xảy ra các phản ứng liên hợp glucurono-, glutathione hoặc
sulfa- tại tế bào chất của tế bào. Nếu tốc độ tạo ra các sản phẩm pha I vượt quá khả năng
5


liên hợp của gan sẽ dẫn đến cạn kiệt thiếu hụt các hợp chất cho các phản ứng liên hợp
giai đoạn II có thể dẫn đến sự tích tụ các chất chuyển hóa độc hại [31]
Rối loạn chức năng ty thể là nguyên nhân chính gây hoại tử tế bào gan. Tăng
stress oxi hóa ty thể có thể làm giảm sự tổng hợp protein ty thể và tăng quá trình chuyển
đổi tính thấm ty thể. ROS cũng được tạo ra do sự mở kênh MPT gây tăng cường stress
oxi hóa và tổn thương DNA. Chuỗi hơ hấp β oxi hóa bị tổn hại và quá trình sản xuất
ATP bị gián đoạn, dẫn đến giảm năng lượng và cạn kiệt ATP. Các ty thể sau đó bị tổn
thương và bắt đầu một chuỗi các con đường chết tế bào [76]
Cơ chế tự miễn dịch cũng là một cơ chế quan trọng của DILI. Các chất chuyển
hóa của thuốc hoặc phức hợp thuốc-protein gây ra stress oxi hóa trong tế bào gan. Các
tế bào bị tổn thương kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh (tế bào Kupffer, bạch cầu
trung tính, tế bào NK, tế bào NK T và tế bào mast) kích thích phản ứng miễn dịch gây
tổn thương tế bào gan. Các chất chuyển hóa của thuốc hoặc phức hợp thuốc-protein

được trình diện bởi tế bào trình diện kháng nguyên (APC), dẫn đến kích hoạt đáp ứng
miễn dịch tế bào (tế bào T và tế bào B). Trong khi đó, các tế bào T điều hịa giảm và
khơng duy trì được khả năng dung nạp miễn dịch [37].
1.1.3. Các phương pháp điều trị bệnh gan
1.1.3.1 Viêm gan virus cấp
Hơn 95% người lớn bị viêm gan virus B cấp sẽ hồi phục một cách tự nhiên mà
không cần điều trị thuốc kháng vi rút [1] . Khoảng 20-50% người bệnh nhiễm HCV cấp
có thể tự khỏi [2]. Điều trị viêm gan virus chủ yếu là nghỉ ngơi, điều trị hỗ trợ, điều trị
triệu chứng. Nhóm thuốc điều trị triệu chứng: Thuốc lợi tiểu, lợi mật ở bệnh nhân tích
nước, vàng da. Nhóm thuốc có tác dụng bảo vệ tế bào gan, làm giảm transaminase như
BDD (Biphenyl Dimetyl Dicarboxylate với biệt dược Fortec, Nissel, Omitan,…)[3],
Silymarin (legalon) [6].
Một số thuốc được sử dụng trong những trường hợp đặc biệt: corticoid trong
trường hợp viêm gan ác tính hoặc vàng da ứ mật kéo dài; thuốc chống virus entecavir
hoặc tenofovir [1] , Sofosbuvir/velpatasvir hoặc glecaprevir/pibrentasvir [2]. Để tăng
hiệu quả điều trị thuốc chống virus được dùng kết hợp với interferon-alpha… Hiện tại
các thuốc này ít được sử dụng trong bệnh viêm gan virus cấp mà thường dùng phổ biến
trong viêm gan virus mạn.
1.1.3.2. Bệnh gan do rượu
Ngừng rượu là phương pháp điều trị chính và quyết định thành công của các liệu
pháp điều trị. Chế độ dinh dưỡng giàu calo, giàu dinh dưỡng giàu vitamin cho bệnh nhân
viêm gan do rượu.
Corticosteroid (prednisolone hoặc methylprednisolone) và N-acetylcystein là
những thuốc được cân nhắc điều trị trên bệnh nhân xơ gan do rượu [91].
6


1.1.3.3. Tổn thương gan do thuốc:
Ngừng tất cả các loại thuốc
Chỉ định steroids trong trường hợp viêm gan tự miễn hoặc có dấu hiệu quá mẫn

[90].
1.1.3.4. Viêm gan mạn
Những nhóm thuốc chính được sử dụng trong điều trị viêm gan mạn là:
Thuốc tác động tới tình trạng miễn dịch: Thuốc ức chế miễn dịch corticoid, thuốc
điều biến miễn dịch Levamisol, thuốc kích thích miễn dịch Thymogen, Thymodulin.
Thuốc kháng virus, interferon alpha.
Thuốc nguồn gốc thực vật (thảo dược): Hiện nay có nhiều loại thuốc có nguồn gốc
thảo dược đang được ứng dụng vào điều trị viêm gan cấp và mạn do HBV cần được
nghiên cứu một cách nghiêm túc với số lượng bệnh nhân lớn hơn. Một số thuốc đã được
sử dụng tại Trung Quốc và Việt Nam: Phyllantus (phyllantin..) được chiết xuất từ cây
diệp hạ châu đắng (Phyllantus amarus); Haina được chiết xuất từ cây cà gai leo
(Solanum hainanese) [6].
1.1.4. Thuốc có nguồn gốc dược liệu trong điều trị bệnh gan
Các thuốc y học cổ truyền hoặc có nguồn gốc dược liệu ít hoặc khơng được đề
cập trong các hướng dẫn chính thức về điều trị các bệnh lý viêm gan mạn do virus hoặc
do các nguyên nhân khác theo y học hiện đại. Tuy nhiên chúng vẫn đóng vai trò quan
trọng trong việc điều trị các bệnh lý gan.Trong những năm qua, nhiều nghiên cứu tập
trung vào tiềm năng bảo vệ tế bào gan của thuốc thực vật đã đạt được những thành tựu
nhất định.
Silymarin là dược chất chiết xuất từ thảo dược được nghiên cứu và sử dụng rất
rộng rãi tại Việt Nam và trên thế giới để hỗ trợ điều trị các bệnh lý viêm gan và bệnh
gan mãn tính do stress oxi hóa (bệnh gan nhiễm mỡ do rượu và không do rượu, nhiễm
độc gan do thuốc và hóa chất) với tác dụng bảo vệ tế bào gan [28].
Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) là thảo dược đã được nghiên cứu và
chứng minh công dụng rõ ràng trong các bệnh lý viêm gan và xơ gan.Gần đây, vai trò
trong hỗ trợ điều trị viêm gan vi rút B mạn tính đã được nghiên cứu lâm sàng trên bệnh
nhân viêm gan vi rút B thể hoạt động. Kết quả thu được 70% bệnh nhân có nồng độ
virus giảm và 6,1% bệnh nhân âm tính HbsAg [8].
Một số dược liệu có tác dụng bảo vệ tế bào gan được tóm tắt trong bảng 1.1

7


Bảng 1.1. Một số dược liệu bảo vệ tế bào gan
Dược liệu bảo vệ tế bào
gan
Bạch quả

Tác dụng trong bảo vệ tế bào gan
Giảm ALT, AST, ALP, TG và CHO. Giảm

TLTK
[75]

(Ginkgo biloba L.)

MDA, tăng GSH, SOD

Lô hội
(Aloe barbadensis)

Giảm AST, ALT, ALP, LDH, bilirubin, TG
huyết thanh

[18]

Diệp hạ châu

Giảm MDA, tăng glutathion, tăng SOD,tăng

[22]

(Phyllanthus amarus)

hoạt động catalase, giảm GST, tăng ALT AST
gan, giảm ALT AST huyết thanh

Cỏ mực
(Eclipta alba)

Giảm AST, ALT, ALP huyết thanh. Giảm
TBARS, hydroperoxid, tăng SOD, CAT, GPx,

[68]

GST gan
Cang mai
(Adhatoda vasica nees)

Giảm LPO tăng GSH, GST, CAT, SOD . Thay
đổi mô bệnh học

[61]

Xuyên tâm liên
(Andrographis
paniculata)

Tăng GSH, GPx, SOD, giảm MDA. Thay đổi
mơ bệnh học

[46]

Tăng tỷ lệ tế bào sống sót. Ức chế q trình

[36]

Dành dành (Gardenia
jasminoides Ellis)

peroxi hóa lipid. Giảm TBARS, LDH.

Keo cao
(Acacia catechu)

Giảm AST ALT ALP, giảm LPO, tăng SOD
GSH. Thay đổi mô bệnh học

[34]

Giảm ALT, giảm MDA

[69]

Giảm AST ALT,giảm MDA, tăng GSH, SOD

[9]

Giảm ALT, AST, LDH huyết thanh. Giảm
MDA, GSH gan.

[5]

Giảm ALT, AST và ALP trong huyết thanh và
MDA gan. Tăng GSH, SOD

[24]

Giảm AST, ALT, SGOT

[67]

Chè
(Camellia sinensis)
Me rừng
(Phyllanthus emblica)
Bí kỳ nam
(Hydnophytum
formicarum Jack.)
Cam thảo
(Glycyrrhiza uralensis)
Húng quế
(Ocimum basilicum)

8


1.2. Tổng quan phương pháp in vitro đánh giá tác dụng chống oxi hóa và bảo vệ tế
bào gan
1.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro

1.2.1.1. Phương pháp trong ống nghiệm
Dựa trên phản ứng hóa học liên quan giữa các hợp chất chống oxi hóa và các gốc
tự do, các phương pháp đánh giá khả năng chống oxi hóa trong ống nghiệm được phân
thành hai loại:
Các phương pháp dựa trên phản ứng chuyển điện tử (ET): Các phương pháp này
đo khả năng khử của các hợp chất chống oxi hóa. Sự khử bởi các hợp chất chống oxi
hóa dẫn đến sự thay đổi màu của thuốc thử được đo bằng sự thay đổi độ hấp thụ ở bước
sóng thích hợp [66].
Các phương pháp dựa trên phản ứng chuyển nguyên tử hydro (HAT): Các
phương pháp này đo và định lượng khả năng cho nguyên tử hydro của các hợp chất
chống oxi hóa bằng phản ứng chuyển cặp proton – electron [66].
Ưu điểm-hạn chế: Các phương pháp in vitro đánh giá tác dụng chống oxi hóa
trong ống nghiệm được thực hiện đơn giản, nhanh chóng, nhạy cảm, chi phí thấp và cho
phép sàng lọc một số lượng lớn các hợp chất, có thể cung cấp thơng tin có giá trị về khả
năng của chất chống oxi hóa trong việc bảo vệ các phân tử khỏi tác hại của q trình oxi
hóa. Tuy nhiên, tất cả các phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm, không
phải trong môi trường tế bào sống và không cung cấp thông tin về ảnh hưởng thực sự
trên hệ thống sống. Vì lý do này nên thông tin cung cấp bởi các phương pháp trong ống
nghiệm thường chỉ ở dạng khả năng chống oxi hóa. Các phương pháp chống oxi hóa
trong tế bào thường cho kết quả chính xác hơn [13].
Một số phương pháp chống oxi hóa trong ống nghiệm được tóm tắt trong bảng 1.2
Bảng 1.2: Một số phương pháp chống oxi hóa trong ống nghiệm
STT Cơ chế

Các phương pháp chống oxi hóa in vitro

1

Phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH (DPPH
free radical scavenging assay)

2
3
4
5
6

Chuyển
điện tử
(ET
based
assays)

Phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do O2•− (Superoxide
anion radical scavenging assay)
Phương pháp đánh giá khả năng khử Fe3+ (FRAP assay)
Phương pháp đánh giá khả năng chống oxi hóa tương đương Trolox
bằng ABTS (TEAC, using ABTS)
Phương pháp đánh giá khả năng khử Cu2+ (CUPRAC assay)
Phương pháp xác định tổng hàm lượng phenol (FCR, the total
phenols assay)
9


7

Phương pháp đánh giá khả năng khử (Reducing power assay)

8

Phương pháp đánh giá khả năng ức chế giải phóng NO (Nitric oxide
radical inhibition activity)

9

Phương pháp đánh giá tình trạng peroxi hóa lipid (TBARS assay)

10

Phương pháp đánh giá khả năng hấp thụ gốc oxi hóa (ORAC)

11

Phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do ABTS•+ (ABTS
radical scavenging method)

12

Phương pháp đánh giá khả năng làm mất màu Corin (Crocin

13
14
15
16
17

Chuyển
nguyên

Bleaching Assays)

Phương pháp đánh giá khả năng bắt huỳnh quang với P-PE (TRAP)

Phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do OH• (Hydroxil
tử hydro
radical scavenging activity)
(HAT
Phương pháp đánh giá khả năng bắt gốc tự do OH• (HORAC)
based
Phương pháp đánh giá tình trạng peroxi hóa lipid (LPIC assay)
assays)
Phương pháp đánh giá khả năng loại H2O2 (Scavenging of H2O2
radicals)

18

Phương pháp đánh giá tổng khả năng loại bỏ chất oxi hóa (IOC)

19

Phương pháp đánh giá khả năng loại gốc tự do linoleate (β-carotene–
linoleic acid (linoleate) assay)

20

Phương pháp đánh giá hàm lượng ascorbic (Ascorbic acid content
assay)

21
22
23

24

Phương
pháp
khác

Phương pháp đánh giá hoạt động chống oxi hóa tế bào (CAA)
Phương pháp đánh giá khả năng kháng oxi hóa tổng
(Phosphomolybdenum assay)
Phương pháp xanthine oxidase (Xanthine oxidase method)
Phương pháp đánh giá khả năng chelat kim loại (Metal chelating
activity)

Một số phương pháp thường sử dụng:
a. Phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH (DPPH free radical
scavenging assay): DPPH phản ứng với chất khử thích hợp tạo ra liên kết mới, do đó
làm thay đổi màu của dung dịch từ màu tím sang màu vàng nhạt. Sự có mặt của các chất
chống oxi hóa làm giảm gốc tự do DPPH và giảm độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm [98].

10


R=H, gốc alkyl
Hình 1.1. Nguyên tắc phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH
b. Phương pháp đánh giá khả năng khử Fe3+(FRAP assay): Phương pháp đo màu
sử dụng các chất chống oxi hóa để khử phức [Fe3+ -(2,4,6-Tris(2-pirydyl)-s-triazine)2]3+
khơng màu thành phức có màu xanh đậm [Fe2+-( TPTZ)2]2+ trong môi trường axit làm
tăng độ hấp thụ ở bước sóng 630nm [104].

Hình 1.2. Ngun tắc phương pháp đánh giá khả năng khử Fe3+

c. Phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do ABTS•+ (ABTS radical
scavenging method): Gốc tự do được tạo ra bằng cách cho muối ABTS phản ứng với
chất oxi hóa mạnh (kali persulfate). Phương pháp dựa trên sự khử ABTS•+ bởi chất
chống oxi hóa cho hydro. Trong phản ứng này, cation gốc ABTS xanh lục lam được
chuyển đổi trở lại dạng trung tính khơng màu của nó làm giảm độ hấp thụ ở bước sóng
734 nm [83].

Hình 1.3. Ngun tắc phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do ABTS•+
11


d. Phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do OH• (Hydroxil radical
scavenging activity assay): Phương pháp này dựa trên phản ứng của Fe2+ với 1,10phenanthroline tạo thành phức hợp tri-phenanthroline màu đỏ cam. Nếu H2O2 là được
thêm vào ống trước khi thêm 1,10-phenanthroline, thì tất cả các gốc hydroxil được tạo
ra từ phản ứng Fenton giữa H2O2 và Fe2+ sẽ oxi hóa Fe2+ thành Fe3+, khơng thể tạo phức
tri-phenanthroline. Sự có mặt của các chất chống oxi hóa làm giảm q trình chuyển
Fe2+ thành Fe3+ và làm giảm độ hấp thụ ở bước sóng 536 nm [95].

Hình 1.4. Nguyên tắc phương pháp đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do OH•
e. Phương pháp đánh giá khả năng chelat kim loại (Metal chelating activity):
Trong môi trường hơi axit (pH= 6), Fe2+ phản ứng với ferrozine, tạo thành phức chất có
màu xanh lam có thể được theo dõi bằng phương pháp đo quang phổ. Sự có mặt các hợp
chất chống oxi hóa làm giảm hình thành phức hợp Fe2+-ferrozine (do liên kết của Fe2+
với chất chống oxi hóa) dẫn đến giảm độ hấp thụ ở λ = 562 nm. Độ hấp thụ ở λ=562 nm
càng cao thì khả năng liên kết sắt (hoạt tính chống oxi hóa) của các hợp chất hóa học có
trong mẫu thử càng yếu [56].

Hình 1.5. Nguyên tắc phương pháp đánh giá khả năng chelat Fe2+

12

1.2.1.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxi hóa trên tế bào
Trước những hạn chế của phương pháp trong ống nghiệm, các phương pháp đánh
giá tác dụng chống oxi hóa trên tế bào đã được mơ tả là phương pháp thay thế hoặc sàng
lọc sơ bộ [13].
Có hai cơ chế chống oxi hóa chính có thể được thử nghiệm ở cấp độ tế bào:cơ chế
trực tiếp là khả năng của một mẫu để trung hòa các gốc tự do nội bào hoặc ROS khác
(đặc biệt là H2O2). Loại thứ hai, được gọi là cơ chế gián tiếp, có liên quan đến biểu hiện
gen, chủ yếu thông qua ảnh hưởng của chất nghiên cứu trên con đường ARE / Nrf2, điều
chỉnh phiên mã protein và các enzyme chống oxi hóa và bảo vệ tế bào. Mặc dù ưu điểm
của phương pháp này, tuy nhiên do mức độ phức tạp của phương pháp, cho đến nay, chỉ
có bốn cách tiếp cận đã đạt được mức độ tiêu chuẩn hóa: (1) Phương pháp giống catalase
(the catalase-like assay), (2) Phương pháp chống oxi hóa tế bào (CAA), (3) Phương pháp
AOP1, (4) Phương pháp đánh giá biểu hiện con đường gen Nrf2/ARE. [92]
Ưu điểm- hạn chế: Mặc dù được công nhận rộng rãi là mơ hình đại diện và có liên
quan để nghiên cứu mối quan hệ nguyên nhân trong các hệ thống sống, phương pháp
đánh giá tác dụng trên tế bào cho thấy một số hạn chế. Ví dụ, điều kiện ni cấy có thể
dẫn đến sản xuất ROS, sự thiếu hụt hệ thống chống oxi hóa tự nhiên trong mơi trường
ni cấy, môi trường nuôi cấy đôi khi được coi là chất chống oxi hóa. Stress oxi hóa
được điều hịa trong ni cấy tế bào có thể dẫn đến đánh giá chưa chính xác tác dụng
chống oxi hóa của các mẫu thử nghiệm [92].
1.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro
1.2.2.1. Dòng tế bào
Các tế bào gan nguyên phát của con người vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong
mơ hình ni cấy tế bào gan in vitro. Các chức năng của chúng gần giống với chức năng
hồn chỉnh của gan người và do đó cung cấp kết quả dự đoán cao trong nghiên cứu in
vitro dược lý và độc tính [79]. Tuy nhiên, hạn chế của tế bào gan ngun phát là tính
sẵn có; thay đổi kiểu hình nhanh chóng, khi ni cấy trong thời gian dài, các tế bào này
biểu hiện sự mất dần kiểu hình tế bào gan, cả về hình thái và chức năng; đời sống ngắn

và chức năng phụ thuộc đặc điểm của người hiến [25]. Do đó khó lặp lại thí nghiệm
nhiều lần dẫn đến những hạn chế trong nghiên cứu.
Các dòng tế bào từ khối ung thư gan người được sử dụng rộng rãi do tính sẵn có,
khả năng tăng sinh cao và sự trao đổi chất ổn định làm cho chúng trở thành một công cụ
hấp dẫn cho các nghiên cứu in vitro trong các điều kiện tiêu chuẩn hóa và lặp lại thí
nghiệm. Tuy nhiên, tiềm năng tăng sinh cao của các dòng tế bào biến đổi nói chung có
liên quan đến việc mất các chức năng biệt hóa, dẫn đến một số thiếu sót trong biểu hiện
chức năng. Do đó, các ứng dụng của các dịng tế bào gan trong nghiên cứu in vitro phải
tính đến các đặc tính chức năng cụ thể của dịng tế bào được sử dụng [79].
13


Các dịng tế bào có nguồn gốc từ gan bất tử phổ biến được sử dụng là Fa2N-4,
HepG2, Hep3B, PLc / PRFs Huh7, HBG và HepaRG [25]. Các nghiên cứu thường sử
dụng tế bào ung thư biểu mô gan người HepG2 để nghiên cứu in vitro về tính gây độc
tế bào do dịng tế bào HepG2 có tỷ lệ tăng sinh cao, hình thái giống biểu mơ gan và thực
hiện nhiều chức năng gan biệt hóa [87].
1.2.2.2. Các tác nhân gây độc gan và thông số đánh giá
a. Các tác nhân gây độc tế bào gan in vitro
Các tác nhân được sử dụng trong mơ hình in vitro là chất độc gan nội tại, gây ra
tác dụng độc hại nhanh chóng, có thể dự đốn được và phụ thuộc vào liều lượng (carbon
tetrachloride CCl4, thioacetamide, acetaminophen, ethanol,….)[17].
b. Thông số đánh giá
Đánh giá khả năng sống của tế bào:
Khả năng sống của tế bào được định nghĩa là số lượng tế bào khỏe mạnh trong
một mẫu. Việc đo lường khả năng sống của tế bào đóng một vai trị quan trọng đối với
tất cả các phương pháp nuôi cấy tế bào. Xét nghiệm khả năng sống của tế bào về cơ bản
được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các tác nhân lên sự phát triển tế bào [29].
Đánh giá tình trạng tổn thương tế bào
Lactate dehydrogenase (LDH) là một enzyme tế bào chất ổn định được tìm thấy

trong tất cả các tế bào. LDH nhanh chóng được giải phóng vào dịch nổi trên bề mặt nuôi
cấy tế bào khi màng sinh chất bị tổn thương, một đặc điểm chính của các tế bào trải qua
quá trình chết theo chương trình, hoại tử và các dạng tổn thương tế bào khác [32]. Do
đó LDH được coi là một chỉ số đánh giá tình trạng hoại tử tế bào.
Transaminase (AST, ALT) là các enzyme có ở bào tương của tế bào gan. Khi tế
bào bị tổn thương sẽ làm thay đổi tính thấm của màng tế bào dẫn tăng nồng độ các
ennzym [10]
Đánh giá khả năng chống oxi hóa
Glutathione (GSH) là một tripeptide, có nhiều vai trị sinh học như chống lại
stress oxi hóa và peroxi hóa lipid. Superoxide dismutase (SOD) là các metalloenzyme
xúc tác quá trình phân hủy anion superoxide (O2-) và hydro peroxide (H2O2). Sự giảm
nồng độ SOD và GSH dễ dàng gây ra bởi stress oxi hóa, và mức độ hoạt động của các
enzyme này đã được sử dụng để định lượng stress oxi hóa trong tế bào [49].
Malondialdehyde (MDA) là một trong những sản phẩm cuối cùng của q trình
peroxi hóa axit béo khơng bão hịa trong tế bào. Sự gia tăng các gốc tự do gây ra sự sản
xuất quá mức MDA. MDA là một chất đánh dấu peroxi hóa lipid được sử dụng để đánh
giá q trình peroxi hóa lipid do tăng stress oxi hóa [71].
Các tác nhân và thông số đánh giá được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu được
liệt kê ở bảng 1.3
14


Bảng 1.3. Các tác nhân gây độc tế bào gan
Tác nhân

Nồng độ
sử dụng

Thơng số đánh giá

TLTK

CCl4

2mM

Tỷ lệ sống sót tế bào, LDH, GSH

[5]

CCl4

1%

Tỷ lệ sống sót tế bào, AST, ALT, ALP,

[51]

LDH, MDA, GSH
CCl4

2 mM

Tỷ lệ sống sót tế bào, LDH, GSH

[33]

CCl4

0,4%

MDA, SOD, khả năng sống của tế bào

[63]

CCl4

1%

Tỷ lệ sống sót tế bào, AST, ALT, ALP

[55]

Ethanol

50%

AST, ALT, MDA, SOD, GSH, GSTA1

[42]

Ethanol

300 mM

Tỷ lệ sống sót tế bào, LDH, MDA, SOD,
AST, ALT

[62]

Ethanol

300 mM

Tỷ lệ sống sót tế bào, AST, ALT, SOD,
GSH

[26]

Ethanol

600 mM

Tỷ lệ sống sót tế bào

[81]

Paracetamol

40 mM

Tỷ lệ sống sót tế bào, LDH, AST, ALT

[41]

Paracetamol

10 mM

ALT, LSH, GSH, MDA, SOD

[50]

Tert-butyl
hydroperoxide

550 µM

Tỷ lệ sống sót tế bào, GSH

[38]

Tert-butyl
hydroperoxide

200 μM

Tỷ lệ sống sót tế bào, LDH, MDA, SOD,
GSH

[73]

D-galactosamine

50 mM

Phần trăm tế bào chết theo chương trình

[16]

D-galactosamine

50 mM

MDA, TNF-α

[52]

1.3. Tổng quan dược liệu Tỏi
1.3.1. Tên khoa học:
Tên khoa học: Allium sativum L, thuộc họ Hành (Alliaceae)
Ta dùng củ tỏi (Bulbus Allii) là giò của cây tỏi [41].
1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố:
Tỏi là loài cây thảo, sống hàng năm, cao 30-40cm. Thân hành ngắn, hình tháp
gồm nhiều hành con gọi là nhánh tỏi, to nhỏ không đều, xếp ép vào nhau quanh 1 trục
lõi, vỏ ngoài của thân hành mỏng, màu trắng hoặc hơi hồng. Lá phẳng và hẹp, hình dải,
mỏng, bẹ to và dài có rãnh dọc, đầu nhọn hoắt, gân song song, hai mặt nhẵn. Cụm hoa
mọc ở ngọn thành đầu tròn, bao bọc bởi những lá mốc mũi nhọn rất dài, bao hoa gồm 6
phiến hình mũi mác xếp thành 2 hàng, thn, nhị 6, chỉ nhị có cựa dài, đính trên các
mảnh bao hoa, bầu gân hình cầu. Quả nang. Mùa hoa quả: tháng 8-11.

15


Tỏi là cây trồng rộng rãi trên khắp thế giới. Ở Việt Nam, tỏi được trồng ở khắp
các địa phương từ Nam ra Bắc. Hiện nay có 2 nhóm tỏi khác nhau là nhóm tỏi củ nhỏ,
thơm, nhiều tinh dầu được trồng ở các tỉnh phía Bắc và nhóm củ to trồng ở các tính phía
Nam. Vùng trồng tỏi tập trung ở các tỉnh Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Hà Nội,
Bắc Ninh,….[11].
1.3.3. Bộ phận dùng và công dụng

Bộ phận dùng là thân hành (giị). Thu hoạch vào cuối đơng, có thể dùng tươi hay
phơi khơ dùng dần.
Tỏi được dùng làm gia vị và làm thuốc, dùng chữa ho có đờm, cảm cúm, lỵ amip
hay lỵ trực khuẩn, chữa ung nhọt, áp xe, viêm tấy. Những công dụng của tỏi được thử
nghiệm lâm sàng xác nhận là áp dụng điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, dự phòng huyết
khối, điều trị tăng lipid máu, tăng huyết áp nhẹ và những rối loạn về mạch máu.
Trong y học cổ truyền Trung Quốc, tỏi được dùng làm thuốc chống độc, long
đờm, lợi tiểu, diệt giun, tăng cường tiêu hóa, chữa dịch hạch dịch tả, vô kinh và phối
hợp với các dược liệu khác trị các bệnh vàng da, sốt, dự phòng sốt rét [11], [41].
1.3.4. Thành phần hóa học:
Trong tỏi có nhiều hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm các hợp chất
organosulfur, saponin, hợp chất phenolic và polysacarit [101].
Trong củ tỏi bao gồm các hợp chất chứa lưu huỳnh chẳng hạn như ajoene (Eajoene, Z-ajoene), thiosulfinates (allicin), vinyldithiins (2-vinyl-(4H)-1,3-dithiin, 3vinyl-(4H)-1,2-dithiin), sulfua (diallyl disulfua (DADS), diallyl trisulfua (DATS)),….
cho thấy khả năng chống ung thư, chống oxi hóa, chống viêm, điều hịa miễn dịch, kháng
khuẩn, hạ đường huyết và bảo vệ tim mạch. Một số hợp chất organosulfur, Nacetylcysteine (NAC), S-allyl-cysteine (SAC) và S-ally-mercapto cysteine (SAMC), có
nguồn gốc từ alliin [89]. Allicin là hợp chất có hoạt tính sinh học cao nhất của tỏi [99],
được tạo thành từ thủy phân alliin bởi enzyme allinase sau khi phá vỡ nhu mô tép tỏi.
Tác dụng dược lý của allicin là do hoạt tính chống oxi hóa cũng như tương tác của nó
với các protein chứa thiol [99],[84].
Thành phần saponin có sự khác nhau giữa các giống tỏi. Tổng saponin ở tỏi tím
cao gấp khoảng 40 lần so với tỏi trắng. Có 17 saponin steroid thuộc nhóm spirostanol
và furostanol đã được xác định và báo cáo. Mười hai trong số chúng đã được phát hiện
ở cả 2 giống: agapanthagenin, β-chlorogenin, desgalactotigonin, diosgenin, eruboside
B, eruboside-B-rhamnose, gitogenin, proto-eruboside B, sativoside B1-rhamnose,
sativoside R2, sativoside R2-rhamnose và voghieroside E1. Năm saponin
(desgalactotigonin-rhamnose,
proto-desgalactotigonin,
proto-desgalactotigoninrhamnose, voghieroside D1, sativoside B1-rhamnose và sativoside R1) chỉ có ở tỏi tím
[86].
16

Trong tỏi chứa hơn 20 hợp chất phenolic thuộc nhóm flavonols, hydroxicinnamic
acid, hydroxibenzoic acid và các hợp chất phenolic khác. Hợp chất chính là axit βresorcylic, tiếp theo là pyrogallol, axit gallic, rutin, axit protocatechuic, quercetin [97]
Thành phần hợp chất có hoạt tính sinh học của tỏi phụ thuộc vào loại tỏi và
phương pháp bào chế. Ví dụ trong tỏi “laba” được chế biến bằng cách ngâm dấm, nồng
độ của các hợp chất organosulfur giảm trong khi nồng độ của các hợp chất không
organosulfur tăng lên. Các hợp chất phenolic đạt giá trị tối đa vào ngày 12 và các hoạt
động chống oxi hóa giảm dần [94]. Trong một nghiên cứu về chế biến tỏi đen, hàm
lượng của các thành phần dinh dưỡng bị ảnh hưởng đáng kể bởi độ ẩm và nhiệt độ. Hàm
lượng polyphenol tăng khi tăng nhiệt độ và giảm độ ẩm. Duy trì nhiệt độ 75 ° C và độ
ẩm tương đối 85% trong 8 ngày là lý tưởng để giữ lại khả năng chống oxi hóa và chất
dinh dưỡng [102].
1.3.5. Tác dụng dược lý
Tác dụng kháng khuẩn:
Nghiên cứu của Cavallito và cộng sự đã chỉ ra rằng Allicin trong tép tỏi có tác
dụng kìm khuẩn với cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương [59]. Nghiên cứu của Balaji
et al năm 2012 cho thấy dịch chiết nước tỏi có tác dụng chống lại B. subtilis, S. aureus,
E. coli, K. pneumonia, C. albicans với đường kính vịng vơ khuẩn tối đa là 20 mm với
B.subtilis (MIC=100 mcg/ml). Dịch chiết methanol có tác dụng chống lại B. subtilis, E.
coli, K. pneumonia với đường kính vịng vơ khuẩn lớn nhất là 16 mm với B.subtilis
(MIC=100mcg/ml) [43].
Nghiên cứu của nhóm tác giả trên nhóm vi khuẩn Gram âm cho thấy chiết xuất
tỏi trong nước thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với 38 chủng phân lập với MIC nằm trong
khoảng 0.5-3% (100% tương ứng với 10g tỏi/10ml nước). Đối với allicin tinh khiết, thử
nghiệm được tiến hành trên các chủng B.cenocepacia, B.stabilis, B.cepaci với kết quả
MIC dao động từ 8 đến 62 mg/mL và MBC từ 31 đến 62 mg/mL [103].
Tác dụng chống oxi hóa: Nghiên cứu của Abdulhakim et al năm 2017 chỉ ra rằng
chiết xuất nước tỏi già và tỏi tươi có tác dụng chống oxi hóa thơng qua dọn gốc tự do
ABTS (khả năng chống oxi hóa tương đương trolox là 19 ± 0.1 và 12 ± 0.7 μM Trolox

so với acid ascorbic là 19.5 ± 0.3 μM Trolox ), dọn gốc DPPH (IC50 là 15±0,2 mg/ml
và 24 ± 0,5 mg/ml so với acid ascorbic là 11.7 ± 0,2 mg/ml) [21]. Nghiên cứu của Jang
,H.J et al cũng đánh giá khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH và ABTS kết quả tỏi có tác
dụng chống oxi hóa theo các cơ chế này [93]. Ngoài ra, ở nồng độ cao 15-20 mg/mL,
chiết xuất tỏi tươi cho thấy khả năng chelat Fe2+ mạnh [21], dung môi EtOH cho khả
năng chelat mạnh nhất [93].
Tác dụng khác:
17