Nguyễn thị thanh huyền nghiên cứu chế tạo cao chiết và ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dược liệu tới chất lượng của cao chiết lá phèn đen khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CAO CHIẾT
VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ XỬ
LÝ DƯỢC LIỆU TỚI CHẤT LƯỢNG
CỦA CAO CHIẾT LÁ PHÈN ĐEN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2023


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN
Mã sinh viên: 1801318

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CAO CHIẾT
VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ XỬ
LÝ DƯỢC LIỆU TỚI CHẤT LƯỢNG
CỦA CAO CHIẾT LÁ PHÈN ĐEN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Phạm Thái Hà Văn
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược học cổ truyền

HÀ NỘI – 2023


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện và hồn thành kháo luận, em đã xin được sự giúp
đỡ quý báu của các thầy cơ giáo cùn bạn bè giá đình
Với lịng biết ơn và kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Phạm Thái
Hà Văn – Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội – người
đã tận tình hướng dẫn, ln quan tâm chỉ bảo sát sao và tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho em trong q trình thực khóa luận này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới:
Ban Giám Hiệu và các phòng ban, các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên
trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã luôn tạo điều kiện, tận tình và dạy
bảo cho em trong suốt 5 năm học vừa qua.
Các bạn cùng làm khóa luận khóa 73 Nguyễn Thị Vân Anh, Đỗ Trang
Ngân, Lý Phương Linh trong nhóm nghiên cứu của bộ mơn Dược học cổ truyền,
đã cùng giúp đỡ, động viên, hỗ trợ nhau.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và
bạn bè đã ln khích lệ, giúp đỡ và cổ vũ em trong suốt thời gian qua.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức bản thân cịn hạn chế
nên khóa luận khơng tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp
ý, chỉnh sửa của q thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 5 tháng 6 năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thị Thanh Huyền


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... 7
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... 8
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ 9
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về cây Phèn đen ..................................................................................2
1.1.1. Tên khoa học và vị trí phân loại .....................................................................2
1.1.2. Đặc điểm thực vật ..........................................................................................2
1.1.3. Phân bố, sinh thái ...........................................................................................2
1.1.4. Bộ phận dùng .................................................................................................3
1.2. Tổng quan về lá Phèn đen.....................................................................................3
1.2.1. Thành phần hóa học .......................................................................................3
1.2.2. Tác dụng dược lý............................................................................................6
1.2.3. Công dụng ......................................................................................................8
1.3. Acid gallic .............................................................................................................8
1.4. Phương pháp hỏa chế ............................................................................................9
1.4.1. Đại cương .......................................................................................................9
1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến vị thuốc ..........................................................10
1.5. Tổng quan về cao đặc .........................................................................................11
1.5.1. Định nghĩa ....................................................................................................11
1.5.2. Phương pháp điều chế cao đặc .....................................................................11
1.5.3. Yêu cầu chất lượng với cao đặc ...................................................................12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị .....................................................................................13
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu .........................................................................13
2.1.2. Thiết bị, máy móc ........................................................................................13
2.1.3. Thuốc, hóa chất, chất chuẩn ........................................................................13
2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................13
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................14

2.3.1. Phương pháp định lượng acid gallic trong cao chiết lá Phèn đen ...............14
2.3.2. Quy trình chiết xuất và định lượng acid gallic chiết được trong lá Phèn đen
được xử lý nhiệt .....................................................................................................16
2.3.3. Phương pháp khảo sát các yếu tố của quá trình xử lý nhiệt lá Phèn đen ảnh
hưởng đến chất lượng cao chiết lá Phèn đen .........................................................16
2.3.4. Phương pháp tối ưu hóa các yếu tố của q trình xử lý nhiệt lá Phèn đen tạo
cao chiết từ lá Phèn đen .........................................................................................17
2.3.5. Điều chế cao đặc lá Phèn đen ......................................................................18
2.3.6. Đánh giá một số chỉ tiêu của hai mẫu cao đã điều chế ................................19
2.3.7. Phương pháp xử lí số liệu ............................................................................22
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 23
3.1. Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid gallic trong cao
chiết lá Phèn đen ........................................................................................................23
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ............................................................................23
3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng acid gallic .........................................24
3.2. Kết quả khảo sát các yếu tố của quá trình xử lý nhiệt lá Phèn đen ảnh hưởng
đến chất lượng cao chiết lá Phèn đen ........................................................................27
3.2.1. Thời gian sấy ...............................................................................................27
3.2.2. Nhiệt độ sấy .................................................................................................28
3.3. Kết quả khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu .............................................29
3.3.1. Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm ...............................................29
3.3.2. Kết quả tối ưu hóa quá trình ........................................................................30
3.4. Kết quả điều chế cao đặc lá Phèn đen ................................................................32
3.4.1. Kết quả cao đặc điều chế được ....................................................................32
3.4.2. Xác định độ ẩm và hiệu suất........................................................................32
3.5. Đánh giá một số chỉ tiêu của hai mẫu cao đã điều chế .......................................32
3.5.1. Định lượng acid gallic .................................................................................32
3.5.2. Định lượng polyphenol toàn phần ...............................................................33
3.5.4. Tác dụng chống oxy hóa invitro ..................................................................34

3.6. Bàn luận ..............................................................................................................36
3.6.1. Về phương pháp định lượng acid gallic trong cao chiết chiết lá Phèn đen .36


3.6.2. Về tối ưu hóa điều kiện xử lý nhiệt tạo cao chiết từ lá Phèn đen ................37
3.6.3. Về đánh giá một số chỉ tiêu của hai mẫu cao đã điều chế ...........................38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................................... 39
Kết luận......................................................................................................................39
Đề xuất .......................................................................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DĐTQ

Dược điển Trung Quốc

DĐVN

Dược điển Việt Nam

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

SKLM

Sắc kí lớp mỏng

TT

Thuốc thử

YHCT

Y học cổ truyền

OFAT

One factor at the time

STT

Số thứ tự

EtOH

Ethanol

MeOH

Methanol

GA

Acid gallic


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Xây dựng dãy dung dịch chuẩn acid gallic ................................................... 20
Bảng 2.2. Xây dựng dãy dung dịch thử ......................................................................... 22
Bảng 2.3. Hỗn hợp phản ứng ......................................................................................... 22
Bảng 3.1. Kết quả tính phù hợp hệ thống của phương pháp định lượng....................... 24
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính định lượng acid gallic .......................... 25
Bảng 3.3. Kết quả thẩm định độ chính xác của phương pháp định lượng .................... 26
Bảng 3.4. Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp định lượng ............................ 27
Bảng 3.5. Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm................................................. 29
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mơ hình biểu thị mối tương quan
giữa hàm lượng acid gallic chiết được trong dược liệu với các biến đầu vào............... 31
Bảng 3.7. Kết quả kiểm định mơ hình bằng thực nghiệm (n=2) ................................... 31
Bảng 3.8. Kết quả xác định độ ẩm và hiệu suất điều chế cao ....................................... 32
Bảng 3.9. Kết quả định lượng acid gallic trong cao đặc điều chế được ........................ 32
Bảng 3.10. Độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn .......................................................... 33
Bảng 3.11. Hàm lượng polyphenol toàn phần trong các mẫu cao chiết........................ 34
Bảng 3.12. Độ hấp thụ quang và % ức chế gốc tự do của cao chiết lá Phèn đen không
xử lý nhiệt và xử lý nhiệt ...............................................................................................34


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của các tanin pyrogallic ..................................................... 3
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của tanin pyrocatechic ....................................................... 3
Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của acid gallic .................................................................... 4
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của một số triterpenoid ...................................................... 4
Hình 1.5 . Cơng thức cấu tạo của một số sterol............................................................... 5
Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của một số flavonoid ......................................................... 5

Hình 1.7. Cơng thức cấu tạo của một số thành phần khác .............................................. 6
Hình 2.1. Quy trình điều chế cao đặc lá Phèn đen được xử lý nhiệt ............................. 18
Hình 2.2. Quy trình điều chế cao đặc lá Phèn đen không xử lý nhiệt ........................... 18
Hình 2.3. Sơ đồ các bước tiến hành định lượng polyphenol tồn phần ........................ 20
Hình 3.1. Hình ảnh phổ của acid gallic trong khoảng 220 – 350 nm ............................ 23
Hình 3.2. Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu và mẫu thử (từ 3-9 phút)................................. 24
Hình 3.3. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng GA. ............... 25
Hình 3.4. Kết quả khảo sát nhiệt độ sấy ........................................................................ 28
Hình 3.5. Kết quả khảo sát thời gian sấy....................................................................... 28
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng acid gallic chiết được trong
dược liệu với các biến đầu vào. ..................................................................................... 30
Hình 3.7. Hình ảnh cao đặc điều chế được.................................................................... 32
Hình 3.9. Đồ thị thể hiện khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá Phèn đen khơng xử
lý nhiệt ...........................................................................................................................35
Hình 3.10. Đồ thị thể hiện khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá Phèn đen xử ...... 35
lý nhiệt ........................................................................................................................... 35


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong mỗi vị thuốc có chứa nhiều nhóm thành phần hóa học khác nhau, có tác
dụng khác. Thậm chí đối lập nhau. Đa số thành phần hoạt chất có hàm lượng nhỏ. Vì
vậy, chế biến khơng hợp lý sẽ có nguy cơ làm giảm tác dụng điều trị và tăng tác dụng
không mong muốn của vị thuốc,
Hỏa chế - một trong ba phương pháp (thủy chế, thủy hỏa hợp chế) được sử dụng
rộng rãi nhất để chế biến các vị thuốc; thực chất sử dụng tác động trực tiếp hoặc gián
tiếp của “nhiệt khô” đến dược liệu. Tùy theo mục đích sử dụng mà chọn phương pháp
chế biến khác nhau (mức nhiệt độ và thời gian khác nhau). Các cơng trình nghiên cứu
về sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần hóa học cho thấy: nhiệt độ ảnh hưởng
đáng kể đến hàm lượng và thành phần của vị thuốc (thay đổi các chất cả về lượng và
chất hoặc chuyển hóa sang chất khác,...)

Phèn đen là một lồi cây mọc hoang rất phổ biến ở Việt Nam, trong dân gian lá
Phèn đen được biết đến là một dược liệu quý với tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát
khuẩn, tiêu viêm, chữa mụn nhọn, chữa tiêu chảy, giun sán,... Các nghiên cứu thực
nghiệm hiện đại cũng đã chỉ ra các tác dụng sinh học tiềm năng của lá Phèn đen về tính
kháng khuẩn, chống viêm, chống oxy hóa. Điều này cho thấy Phèn đen là một loại dược
liệu tiềm năng để phát triển các dòng sản phẩm kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy
hóa từ thiên nhiên với giá thành rẻ. Tuy nhiên hiện nay loại dược liệu có số lượng dồi
dào và giá thành rẻ này lại chưa được khai thác đúng tiềm năng.
Thành phần hóa học của lá Phèn đen được xác định chứa các nhóm chất tanin,
flavonoid, đường khử, sterol. Trong đó, các tanin gallic và acid gallic cũng góp phần
mang lại tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm cho lá Phèn đen. Tiêu chí để đánh giá hàm
lượng các thành phần này đó là dựa vào hàm lượng acid gallic trong lá Phèn đen.
Để hướng tới phát triển dòng sản phẩm kháng khuẩn, kháng viêm từ lá Phèn đen,
việc nghiên cứu điều chế dạng bào chế cho dịch chiết dược liệu này là cần thiết, trong
đó cao chiết là dạng bán thành phẩm trung gian để tiếp tục chuyển sang dạng bào chế
khác. Trong quá trình bào chế cao, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng trong đó nhiệt độ xử
lý dược liệu tác động khơng nhỏ đến chất lượng cao chiết.
Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu chế tạo cao chiết và ảnh hưởng của
nhiệt độ xử lý dược liệu tới chất lượng của cao chiết lá phèn đen” được đề xuất
nghiên cứu với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát và tối ưu điều kiện xử lý nhiệt của dược liệu tạo cao chiết lá Phèn đen
2. Điều chế cao đặc lá Phèn đen theo các thông số đã tối ưu.
1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Phèn đen
1.1.1. Tên khoa học và vị trí phân loại
Tên khoa học: Phyllanthus reticulatus Poir. [4]
Tên khác: Anisonema multiflora (Willd.)Wight [40]

Kirganelia reticulata (Poir.) Baillon [40]
Cicca reticulata (Poir.) Kurz [40]
Glochidion microphyllum Ridley [40]
Phyllanthus multiflorus Poir. [11], [40]
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009), Phèn
đen thuộc:
Giới:

Thực vật (Plantae)

Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp:
Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida)
Bộ:
Họ:
Chi:

Sơ ri (Malpighiales)
Thầu dầu (Euphorbiaceae)
Diệp hạ châu (Phyllanthus)

1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây nhỏ, mọc thành bụi, cao 2-4m. Cành mềm, màu nâu nhạt, lúc đầu có lơng
màu xám, sau nhẵn. Lá mọc so le, phiến mỏng, hình trái xoan hoặc bầu dục, gốc và đầu
tù hoặc hơi nhọn, dài 1,5-3 cm, rộng 0,6-1,2 cm, hai mặt nhẵn, gần như cùng màu hoặc
mặt trên hơi sẫm hơn mặt sau; cuống rất ngắn 2-5mm; lá kèm hình tam giác hẹp [4], [6].
Hoa mọc ở kẽ lá, đơn độc hoặc 2-3 cái mơi; hoa đơn tính cùng gốc; hoa đực có 5
lá dài, 5 nhị, 3 cái dính nhau và 2 cái rời nhau; hoa cái có đài giống hoa đực nhưng to
hơn, bầu 6-12 ô, mỗi ô có 2 nỗn. Quả mọng, hình cầu thn, rộng 4-6 mm,khi chín
màu đen. Hạt hình tam giác, 1,6-2 mm, màu nâu nhạt. Mùa hoa quả: tháng 8-10 [4], [6].

1.1.3. Phân bố, sinh thái
Phèn đen là loài cây nhiệt đới, phân bố khá phổ biến ở các nước vùng Đông –
Nam Á và Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, cây mọc hầu như ở khắp các tỉnh, từ vùng
đồng bằng đến trung du và vùng núi thấp ở độ cao dưới 500m. Song các tỉnh có Phèn
đen mọc tập trung nhất lại ở vào vùng trung du Bắc Bộ, gồm Bắc Ninh, Bắc Giang, Vĩnh
Phúc, Phú Thọ, Hà Tây, Hịa Bình [4], [6].
Phèn đen là cây ưa ẩm, hơi chịu bóng, thường mọc thành bụi lớn dọc theo các bờ
nước, ở ven rừng núi đá vôi, bờ nương rẫy và lẩn trong các lùm bụi quanh làng. Cây có
khả năng phân cành nhiều ngay từ gốc, ra hoa quả nhiều hàng năm. Nước và chim là
những tác nhân phát tán hạt giống đi khắp nơi. Cây có khả năng tái sinh cây chồi khỏe
sau khi bị chặt [4], [6].
2


1.1.4. Bộ phận dùng
Rễ thu hái vào mùa thu, lá thu hái vào mùa xuân hạ, vỏ thân cũng được dùng.
Dùng tươi hoặc phơi khô [4], [6].
1.2. Tổng quan về lá Phèn đen
1.2.1. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học trong lá Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) gồm các
nhóm chất: triterpenoid, sterol, flavonoid , tanin, acid phenolic, ...
1.2.1.1. Tanin
Tanin trong lá gồm 2 nhóm: tanin pyrogallic và tanin pyrocatechic
Tanin pyrogallic: Phân đoạn butanol trong dịch chiết methanol của lá được phát
hiện có corilagin [34]. Methylmyricetin rhamnoside-gallat cũng được tìm thấy trong
dịch chiết methanol [49].

Corilagin

Methylmyricetin rhamnoside-gallat

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của các tanin pyrogallic
Tanin pyrocatechic: (5R*, 6R*)-4, 6- Dimethoxycarbonyl-5- [2', 3', 4'trihydroxy6'-(methoxycarbonyl) phenyl]-5, 6- dihydro-2H-pyran-2- on là dẫn xuất mới
của acid geraniinic được phân lập ở dạng hình kim khơng màu từ phân đoạn
dichloromethane trong dịch chiết methanol của lá Phèn đen [40].

(5R*, 6R*) - 4, 6 – Dimethoxycarbonyl – 5 - [2', 3', 4' – trihydroxy 6'(methoxycarbonyl) phenyl]- 5, 6 – dihydro - 2H – pyran – 2 – on
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của tanin pyrocatechic
1.2.1.2. Acid phenolic
3


Acid gallic [34], [40], [47]

Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của acid gallic
1.2.1.3. Triterpenoid
Dịch chiết dầu hỏa của lá phèn có friedelin [22], golchinonol [22], epifriedelanol
(friedelan-3β-ol) [12]. Trong dịch chiết methanol thu được lupeol, lupeol acetat [47].

Glochidonol

Epifriedelanol

Lupeol

Friedelin

Lupeol acetat

Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của một số triterpenoid

1.2.1.4. Sterol
Dịch chiết của lá trong các dung môi (dầu hỏa, ethanol 75%) đều chứa βSitostreol [34]. Stigmasterol, β-sitosterol glucoside, stigmasterol-3-O-β-glucoside được
phát hiện trong dịch chiết methanol của lá phèn đen [24], [32], [34].

β-Sitosterol

Stigmasterol

β-Sitosterol-3-O-β-glucoside
∆22trans: Stigmasterol-3-O-β-glucoside
4


Hình 1.5 . Cơng thức cấu tạo của một số sterol
1.2.1.5. Flavonoid
Lá phèn đen được chiết bằng methanol sau đó tách phân đoạn với butanol. Phân
đoạn butanol được xác định có 5 flavonoid: rutin (quercetin - 3-O-rutinosid) [2], [17],
[34], [47] (hàm lượng 2,503% [17]); kaempferol 3-rutinoside (kaempferol-3-O-α-Lrhamnopyranosyl-(6→1)-β-D-glucopyranosid) [34], [47]; isoquercitrin (quercetin 3-Oβ-D-glucopyranosid); astragalin (kaempferol 3-O-β –D glucopyranosid); quercitrin
(quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid) [2], [34].

Rutin

Isoquercitrin

Astragalin

Kaempferol 3-rutinoside

Quercitrin

Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của một số flavonoid
1.2.1.6. Một số thành phần khác
Methyl gallat [34], [37], [41], [47]; methyl brevifolincarboxylat [34]; acid ellagic
[34], [37], [47]; acid pyrogallic [37]; acid p-coumaric [25], [37]; 2,7-di-O-methylellagic
[34], acid 3,4,3′-tri-O-methylellagic [45] được tìm thấy dịch chiết methanol và một số
phân đoạn (buthanol, dichoromethan) từ dịch chiết methanol của lá Phèn đen.

Methyl gallat

Acid ellagic

Acid pyrogallic

Acid p-coumaric

2,7-di-O-methylellagic
5

Methyl brevifolincarboxylat

Acid 3, 4, 3′ – tri – O – methylellagic


Hình 1.7. Cơng thức cấu tạo của một số thành phần khác
1.2.2. Tác dụng dược lý
1.2.2.1. Tác dụng kháng khuẩn
Lá Phèn đen được thử hoạt tính kháng khuẩn invitro của bằng phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch [11], [23],[29], [32], [50], [52].
Cao chiết ethanol, ether dầu hỏa, chloroform, methanol và nước của lá có tác
dụng chống lại vi khuẩn gram âm (Shigella dysenteriae, Salmonella typhi,

Pseudomonas aeruginosa, Shigella sonnei) và vi khuẩn gram dương (Sarcina lutea,
Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,
Streptococcus-β-haemolytica). Trong đó cao chiết ethanol có tác dụng kháng khuẩn trên
nhiều chủng nhất [11], [23],[29], [32], [50].
Các cao chiết methanol, chloroform và hexan từ lá phèn đen, đã được đánh giá
về hoạt tính kháng khuẩn chống lại tụ cầu vàng kháng Methicillin - MRSA. Cao chiết
methanol thể hiện tác dụng mạnh nhất [52].
Tuy nhiên cao chiết lá Phèn đen lại khơng có tác dụng trên Escherichia coli [56].
1.2.2.2. Tác dụng giảm đau
Tác dụng giảm đau ngoại vi
Cao chiết methanol, ether dầu hỏa và dichloromethan cho tác dụng giảm đau quặn
bụng ở chuột nhắt trắng gây bởi acid acetic ở các liều 250 và 500mg/kg [23], [45]. Cao
chiết ethylacetat ở liều 150 và 300mg/kg cũng có tác dụng làm giảm đau quặn ở chuột
[49]. Cao chiết methanol 85% của lá cho thấy tác dụng giảm đau quặn do acid acetic và
giảm đau do formalin ở cả 2 liều 100 và 200 mg/kg [35].
Tác dụng giảm đau trung ương
Cao chiết methanol, ethyl acetat của lá Phèn đen có tác dụng giảm đau trung ương
trên chuột nhắt trắng. Ở liều 300 mg/kg làm kéo dài thời gian phản ứng đau (6,2 – 6,7
giây) và làm tăng tỷ lệ ức chế đau (60,49%), trong khi với morphin dùng liều 2 mg/kg,
tiêm dưới da cho tác dụng ức chế đau (96,8%) [35].
1.2.2.3. Tác dụng chống viêm
Mơ hình gây phù chân bằng carrageenan được dùng đánh giá tác dụng chống
viêm của cao chiết từ lá Phèn đen [12], [30], [35], [48], [50]. Cao chiết ether dầu hỏa,
ethyl acetat và methanol đều có tác dụng giảm viêm trên chuột nhắt trắng [30], [35].
Cao chiết methanol ở cả hai liều 200 và 400 mg/kg cho thấy tác dụng chống viêm tương
đương với diclofenac natri (100 mg/kg) [35].
1.2.2.4. Tác dụng chống oxy hóa
Cao chiết methanol và ethanol của toàn cây phèn đen đã được chứng minh là có
hoạt tính chống oxy hóa bằng các thử nghiệm invitro khác nhau ở các nồng độ khác
nhau (100, 200, 400 mg/kg). Kết quả của thử nghiệm invitro cho thấy cao chiết methanol

6


cho hoạt tính cao hơn so với cao chiết ethanol, tồn cây có tác dụng chống oxy hóa lên
đến 90% ở nồng độ 400mg/kg trong khi butylated hydroxyl toluene (BHT) chống oxy
hóa 85% ở nồng độ 400 µg/ml [40]. Trong thử nghiệm tổng khả năng chống oxy hóa,
người ta thấy rằng 1 mg cao chiết toàn cây tương đương với 51µg acid ascorbic [22].
Các nghiên cứu chống oxy hóa in vivo của cao chiết phèn đen đã chứng minh
được việc giảm malondialdehyd ở gan cùng với sự cải thiện đồng thời glutathione ở gan
và nồng độ catalase [58].
1.2.2.5. Tác dụng khác
1.2.2.5.1. Tác dụng cầm tiêu chảy
Cao chiết methanol lá Phèn đen đã được tiến hành thử tác dụng cầm tiêu chảy.
Chuột bị gây tiêu chảy theo hai cách: dùng dầu thầu dầu và dùng magie sulfat. Cao chiết
methanol ở cả hai liều 200 mg/kg và 400 mg/kg đều có hiệu quả đáng kể trong việc kiểm
soát tiêu chảy, làm giảm số lần tiêu chảy khi gây tiêu chảy bằng dầu thầu dầu hoặc magie
sulfat [37].
1.2.2.5.2. Tác dụng hạ glucose máu
Cao chiết methanol, ether dầu hỏa và ethanol của lá của lá ở liều 150 và 300
mg/kg đều làm hạ đường huyết trên chuột nhắt trắng được gây tăng đường huyết và đái
tháo đường bởi alloxan [47].
Tác dụng hạ đường huyết phụ thuộc liều. Ngay cả ở liều thấp nhất (100 mg/kg)
của cao chiết methanol, mức đường huyết đã giảm (18,4%). Tác dụng hạ đường huyết
tối đa được tìm thấy với liều 400 mg/kg (35,0%) [44].
1.2.2.5.3. Tác dụng trên cholesterol máu
Cao chiết nước và methanol của lá Phèn đen cũng làm giảm cholesterol máu của
ở chuột bị tăng cholesterol máu do poloxamer gây ra ở liều 500 và 750 mg/kg. Các cao
chiết làm giảm đáng kể cholesterol tự do, triglycerid và chỉ số xơ vữa động mạch và làm
HDL- cholesterol tăng rõ rệt. β-sitosterol, một loại phytosterol được tìm thấy trong lá
Phèn đen, được báo cáo là hữu ích trong điều trị chứng tăng lipid máu [39].

1.2.2.5.4. Tác dụng chống loét dạ dày
Cao chiết methanol, ethyl acetat, n-hexan của lá liều 400 mg/kg làm giảm loét
dạ dày (giảm số điểm loét, acid tổng và làm tăng pH dịch vị) trên chuột nhắt trắng bị
gây loét dạ dày bằng ethanol [27].
1.2.2.5.5. Tác dụng bảo vệ gan
Hai phân đoạn hữu cơ của cao chiết ethanol 95% từ các bộ phận trên mặt đất có
hoạt tính bảo vệ gan ở chuột cống chống lại tổn thương gan do CCl4 thể hiện qua: làm
tăng thời gian ngủ do pentobarbital, giảm nồng độ sGPT, sGOT, sALP và bilirubin máu
[19].
1.2.2.5.6. Tác dụng chống virus viêm gan B hoạt động
7


Hai phân đoạn hữu cơ của cao chiết ethanol 95% từ các bộ phận trên mặt đất cịn
có hoạt tính kháng virus viêm gan B với kháng nguyên bề mặt (Anti-HbsAg) ở cả nồng
độ 20 và 40 mg/ml trong thử nghiệm invitro. Các phân đoạn ở nồng độ cao có tác dụng
kháng virus tốt hơn [59].
1.2.2.5.7. Tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét
Cao chiết lá phèn đen được tiến hành thử hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét in
vivtro đối với chủng Plasmodium falciparum nhạy cảm với chloroquine (K67) và kháng
chloroquine (ENT36). Cao chiết từ lá cho hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét tốt với
IC50 ≤ 10 µg/ml [42].
1.2.2.5.8. Tác dụng cầm máu
Đã áp dụng trên lâm sàng cao lỏng bào chế từ lá của Phèn đen, Ngũ bội tử, Xạ
can làm thuốc cầm máu tại chỗ cho 100 ca cắt amidan. Thuốc có tác dụng cầm máu
nhanh khi chấm vào hốc amidan mới bóc tách khỏi vị trí [4].
1.2.3. Cơng dụng
Theo y học cổ truyền Việt Nam, lá Phèn đen có tác dụng thanh nhiệt, giải độc,
sát trùng [5].
Lá phèn phơi khô chế thành viên dùng riêng hay phối hợp với lá long não, xuyên

tiêu ngậm chữa chữa chảy máu chân răng. Dùng bột lá rắc lên vết thương, vết loét cho
chóng lành và lên da non. Lá tươi nhai nuốt nước, bã đắp còn chữa rắn độc cắn [4].
Ở Malaysia, nhân dân dùng lá phèn đen để xát lên ngực để làm giảm hen, dùng
nước sắc lá trị viêm họng. Ở Philippin, nước sắc lá là thuốc lợi tiểu, hồi phục chức năng,
lọc máu, làm mát và chữa đau răng, lá giã đắp vào bụng chữa giun kim. Ở Lào,
Campuchia, phèn đen dùng trị đậu mùa và giang mai [4].
Ở Nam Phi, lá phèn đen khô tán bột rắc lên vết thương giúp mau lành. Ở Tây Phi,
nước sắc phần trên mặt đất cây phèn đen trị ngứa da [4].
Ở Tanzania, lá phơi khô dùng làm thuốc lợi tiểu, chữa xuất huyết ruột và thiếu
máu. Nước ép lá tươi được sử dụng cho co thắt cơ; nước sắc lá tươi và khô được sử dụng
để chống giun móc, điều trị bệnh hen suyễn, sốt, sốt rét [13], [29]. Ở Ấn Độ, nước sắc
từ lá phơi khô dùng làm thuốc lợi tiểu, làm mát và cũng được dùng trị bệnh đậu mùa,
nước ép từ lá được dùng trị tiêu chảy ở trẻ em [27], [36].
1.3. Acid gallic
Acid gallic được phát hiện trong dịch chiết lá Phèn đen [34], [40], [47].

Hình 1.8. Cơng thức cấu tạo của acid gallic
8


Acid gallic là một chất chống oxy hóa nguồn gốc tự nhiên, về cơ bản là một chất
chuyển hóa polyphenol thứ cấp. Acid gallic là chất chống oxy hóa phổ biến và quan
trọng. Acid gallic cịn có tác dụng bảo vệ gan khỏi các tác hại của các gốc tự do trong
cơ thể, làm đều màu da, mịn da, điều trị các vấn đề về tăng sắc tố da nhờ khả năng ức
chế sự tổng hợp melanin và có tác dụng kháng nấm. Tác dụng chống tăng lipid máu của
acid gallic ở chuột gây ra chế độ ăn nhiều chất béo cho thấy giảm triglycerid và LDLcholesterol, và tăng HDL-cholesterol. Tác dụng bảo vệ tim trong nhiễm độc do
isoprenaline gây ra và chuột bị bệnh tiểu đường do streptozotocin gây ra cho thấy tác
dụng bảo vệ của acid gallic đối với một số thơng số sinh hóa và mơ bệnh học. Các tác
dụng hạ đường huyết, chống oxy hóa lipid và chống oxy hóa có thể là cơ chế hoạt động
có thể xảy ra chịu trách nhiệm cho hoạt động bảo vệ tim mạch của acid gallic. Trong

một nghiên cứu về độc tính cấp tính qua đường miệng, ở liều 5000 mg/kg đường uống
khơng thấy có dấu hiệu độc tính gây chết người. Và trong một nghiên cứu độc tính bán
cấp tính, 1000 mg/kg uống được phát hiện là khơng độc, cho thấy sự an toàn của acid
gallic. [61]
Những tác dụng của acid gallic có mối tương quan chặt chẽ với tác dụng dược lý
của cao chiết lá Phèn đen.
1.4. Phương pháp hỏa chế
1.4.1. Đại cương
Hỏa chế là phương pháp chế biến sử dụng sự tác động của nhiệt độ trực tiếp hoặc
gián tiếp qua vật liệu trung gian ở các mức nhiệt độ khác nhau [3].
Nhiệt độ hỏa chế: khoảng 80-1000℃
 Nhiệt độ sao: khoảng 80-250℃
 Nhiệt độ nung: khoảng 500-1000℃
Hỏa chế là phương pháp được sử dụng rộng rãi đối với hầu hết các vị thuốc, hỏa
chế thực chất là sử dụng nhiệt độ và thời gian khác nhau nhằm thay đổi tính vị từ đó
thay đổi cơng năng chủ trị của vị thuốc. Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà chọn
phương pháp khác nhau [3]:
 Làm khô, ổn định thành phần thuốc tránh mối mọt để bảo quản thuốc: sao qua ở
nhiệt độ 50-80˚C.
Ví dụ: Hịe hoa sao qua nhằm ức chế sự hoạt động của enzym glycosidase tránh
thủy phân rutin thành quercetin và rutinose
 Truyền nhiệt đồng đều và tránh kết dính thuốc: sao cách cát, cách thạch hoặc văn
cáp, nhiệt độ sao 200-220˚C
 Tăng mùi thơm, tăng tác dụng kiện tỳ: sao cách gạo, cách cám, hoặc sao vàng,
nhiệt độ sao 100-140˚C,theo quan điểm YHCT màu vàng quy vào tạng tỳ phủ vị.
Ví dụ: Hoàng kỳ, bạch truật, hoài sơn, ý dĩ,...
9


 Tăng tác dụng cầm máu: sao đen, sao cháy ở nhiệt độ 180-240˚C, màu đen quy

vào tạng thận, theo quan điểm YDHCT “ Đen chỉ huyết”.
Ví dụ: Trắc bách diệp, hịe hoa, ngải diệp.
 Giảm độc tính, giảm tác dụng quá mạnh của vị thuốc: dùng nhiệt độ cao để phân
hủy các chất gây độc của thuốc (Cortonin/ba đậu, Strychnin/mã tiền)
Ví dụ: Mã tiền sao cách cát ở nhiệt độ 200-250˚C, rán trong dầu lạc, dầu vừng ở
200˚C. Ba đậu sao đen ở nhiệt độ 200-240˚C.
 Phân chia thuốc: Nung thuốc ở nhiệt độ cao, nhiệt lượng lớn, phá vỡ cấu trúc cơ
học của thuốc như phương pháp vô cơ hóa.
Ví dụ: Chế củu khổng, mẫu lệ,...
 Tinh chế thuốc: Một số thuốc có nguồn gốc khống vật, hoạt chất là chất vơ cơ
có tính chất thăng hoa, ở nhiệt độ cao, hoạt chất thăng hoa, tách ra khỏi tạp chất
khác.
Ví dụ: Lưu huỳnh, thủy ngân, arsen,...
1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến vị thuốc
Trong quá trình chế biến, tiêu chuẩn đánh giá sản phẩm sao dựa trên cảm quan:
màu sắc, mùi vị, khói thuốc,...do đó thành phần hóa học của vị thuốc thường không ổn
định, ảnh hưởng đến tác dụng của vị thuốc.
Nhiều cơng trình nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần hóa học và
hàm lượng hoạt chất, tùy vào mức nhiệt độ khác nhau mà sự thay đổi hàm lượng các
chất theo các xu hướng khác nhau (tăng lên hoặc giảm đi)
Hoạt chất tăng lên bởi nhiệt độ
 Tanin (Ngũ bội tử) ở các mức nhiệt độ 80-120˚C/10, 15, 20 phút : hàm lượng
tăng cao hơn mẫu sống 5-12% [8].
Hoạt chất giảm bởi nhiệt độ
 Hoạt chất có tính thăng hoa: Lưu huỳnh, coumarin, cafein, anthranoid ở nhiệt độ
cao các chất này thăng hoa, làm giảm hàm lượng hoạt chất trong vị thuốc.
Anthranoid (Đại hoàng): ở nhiệt độ 140˚C/30 phút giảm 46%, 200 ˚C/30 phút
giảm 68%, ở nhiệt độ 220˚C/30 phút giảm 77% so với mẫu sống [10]
Anthranoid (Thảo quyết minh): ở nhiệt độ ≥ 160˚C/30 phút hàm lượng
Anthranoid giảm 30-60% so với mẫu sống, ở 220/30 phút Anthranoid chuyển

hoàn toàn sang dạng oxy hóa [9].
 Hoạt chất có tính bay hơi: Tinh dầu, nhiệt độ cao làm giảm hàm lượng hoạt chất
trong vị thuốc.
Hương phụ khi sao vàng, hàm lượng tinh dầu giảm 40-50%.
Trần bì sao qua, hàm lượng tinh dầu giảm 30% [3].
 Hoạt chất bị phân hủy bởi nhiệt
10


Strychnin (hạt Mã tiền) sao cách cát hàm lượng giảm 18%, rán trong dầu vừng
giảm 22,3% so với mẫu sống [3].
Tanin (Ngũ bội tử) khi sao ở nhiệt độ > 160˚C hàm lượng giảm 1-50% (tùy thuộc
vào từng mức nhiệt độ sao) [8].
Tuy nhiên, ở mức nhiệt độ và thời gian khác nhau sự thay đổi hàm lượng là khác
nhau.
 Đối với các chất dễ thăng hoa, bay hơi hàm lượng các chất mất đi ngay cả ở mức
nhiệt độ thấp (tinh dầu giảm hàm lượng khi sao qua, sao vàng, Anthranoid hàm
lượng giảm nhiều ở mức nhiệt độ 100˚C/20 phút [9], 140˚C/20 phút [10]).
 Đối với các chất khác, hàm lượng hoạt chất bị mất đi ở mức nhiệt độ cao hơn:
Rutin (hòe hoa) giảm ở mức nhiệt độ ≥ 180˚C [7], Tanin giảm ở nhiệt độ
160˚C/30 phút và ≥ 180˚C/20 phút [8], còn ở mức nhiệt độ < 140˚C hàm lượng
các chất thay đổi rất ít so với mẫu sống.
Ở các mức nhiệt độ cao:
 Từ 160-180˚C thành phần hóa học của vị thuốc bị ảnh hưởng bởi thời gian tiếp
xúc nhiệt.
 Ở mức nhiệt độ ≥ 200˚C thời gian càng dài hàm lượng hoạt chất càng giảm (Rutin
sai 5 phút hàm lượng giảm 30% [7], Anthranoid (Đại hoàng) sau 10 phút hàm
lượng giảm 16% [10], Tanin (Ngũ bội tử) sau 10 phút hàm lượng giảm 14-25%
[8]).
1.5. Tổng quan về cao đặc

1.5.1. Định nghĩa
Cao thuốc là chế phẩm được điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy
định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung mơi thích
hợp. Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (rửa sạch, phơi khô hoặc sấy
khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp). Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa
men làm phân hủy hoạt chất, cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách
dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác [1].
Cao đặc: Là khối đặc qnh. Hàm lượng dung mơi sử dụng cịn lại trong cao
không quá 20 % [1].
1.5.2. Phương pháp điều chế cao đặc
Giai đoạn 1: Chiết xuất
Chiết xuất dược liệu bằng các dung mơi thích hợp. Tùy theo bản chất của dược
liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm cũng như điều kiện, quy mô sản
xuất và trang thiết bị, có thể sử dụng các phương pháp chiết xuất: Ngâm, hãm, sắc, ngấm
kiệt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm, chiết xuất bằng phương
pháp sử dụng điện trường và các phương pháp khác [1].
11


Giai đoạn 2: Cô đặc, sấy
Dịch chiết được cô đặc đến khi dung mơi dùng để chiết xuất cịn lại không quá
20 % được cao đặc, tiếp tục sấy khô để độ ẩm cịn lại khơng q 5 % thu được cao khô.
Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cơ đặc và sấy khơ dịch chiết thường được tiến
hành trong các thiết bị cô dưới áp suất giảm ờ nhiệt độ khơng q 60˚C. Nếu khơng có
các thiết bị cơ đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô
trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ không quá 80˚C. Trường hợp muốn thu được cao
thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp chất bằng các phương pháp thích hợp
tùy thuộc vào bản chất của dược liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất [1].
1.5.3. Yêu cầu chất lượng với cao đặc
Mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong

chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng [5].
Mất khối lượng do làm khơ (nếu khơng có chỉ dẫn khác): khơng q 20% [5].
Kim loại nặng: Không được quá 20 phần triệu nếu khơng có chỉ dẫn khác. Cách
tiến hành: Lấy 1,0 g chế phẩm tiến hành thử theo phương pháp 3, Phụ lục 9.4.8 – DĐVN
V. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu [1].
Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn
hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui định trong Phụ
lục 10.14 Xác định dung mơi tồn dư – DĐVN V [1].
Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục
12.17 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật – DĐVN V [1].
Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 13.6 Thử giới
hạn nhiễm khuẩn – DĐVN V [1].

12


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
Lá Phèn đen Phyllanthus reticulatus Poir. thu hái tại Long Biên - Hà Nội
(11/2022) được rửa sạch, sấy khô, bảo quản trong túi nilon kín. Mẫu nghiên cứu đã được
giám định bởi ThS. Nghiêm Đức Trọng, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà
Nội. Mã tiêu bản: HNIP/18654/22 (Phụ lục 2).
2.1.2. Thiết bị, máy móc
- Máy HPTLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5 và hệ thống
CAMAG REPROSTAR3 kết nối với máy tính.
-

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Shimadzu, Nhật Bản).

-

Máy quang phổ UV-VIS HITACHI U-1800
Hệ thống lọc chân khơng, màng lọc 0,45 µm x 47 mm Supelco (Mỹ), màng lọc

-

syringe 0,45 µm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản), lọ đựng mẫu (vial) 1,5 ml
Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản).
Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg.

-

Cân kỹ thuật Precisa XT 620M (Precisa, Thụy Sĩ).
Tủ sấy Memmert (Đức).
Máy cơ quay chân khơng IKA® RV 8 (IKA, Đức).
Máy siêu âm WUC-D22H (Daihan Scientific, Hàn Quốc).
Bếp hồng ngoại Kangaroo điều chỉnh được nhiệt độ.
Bình định mức, pipet chính xác các loại, micro pipet...và các dụng cụ thủy
tinh cần thiết khác cần cho phân tích.

2.1.3. Thuốc, hóa chất, chất chuẩn
- Chất chuẩn: Chất chuẩn acid gallic có độ tinh khiết 98,5%: nguồn gốc từ công
ty TNHH khoa học và kỹ thuật VIETPHYTO.
- Các dung môi: Methanol, ethanol đạt tiêu chuẩn phân tích. Các dung mơi dùng
-

cho HPLC, TLC được mua của hãng Merck.
Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 của hãng Merck.

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid gallic trong cao chiết lá
Phèn đen bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2.2.2. Khảo sát các yếu tố của quá trình xử lý nhiệt lá Phèn đen ảnh hưởng đến chất
lượng cao chiết lá Phèn đen
2.2.3. Tối ưu hóa các yếu tố của quá trình xử lý nhiệt lá Phèn đen tạo cao chiết từ lá
Phèn đen
2.2.4. Điều chế cao đặc lá Phèn đen
13


2.2.5. Đánh giá một số chỉ tiêu của hai mẫu cao đã điều chế
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp định lượng acid gallic trong cao chiết lá Phèn đen
Xác định hàm lượng acid gallic trong cao chiết lá Phèn đen xử lý nhiệt bằng sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tham khảo quy trình định lượng acid gallic trong dược
liệu Ngũ Bội tử trong Dược điển Trung Quốc 2015 và Dược điển Việt Nam V [1].
2.3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký.
 Xử lý mẫu
Cân chính xác khoảng 0,1 g cao chiết lá Phèn đen được xử lý nhiệt, siêu âm với
7 ml methanol 50% trong 15 phút. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút, lấy
dịch và định mức vừa đủ 10 ml bằng methanol 50%. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm
thu được dung dịch thử.
 Điều kiện sắc ký khảo sát
 Cột sắc ký: Cột C18 Inersustain GL Sciences (250  4,6 mm; 5 m).
 Chọn pha động: Pha động là một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu
giữ các chất phân tích và hiệu quả của sự tách sắc ký. Qua nghiên tham khảo
một số tài liệu, hệ dung môi MeOH : acid phosphoric 0,1% (15 : 85) được lựa
chọn để khảo sát.
 Chọn tốc độ dòng: tiến hành khảo sát trong khoảng 1,0 – 1,5 ml/phút để xác

định tốc độ dòng phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu.
 Chọn bước sóng phát hiện: Quét phổ UV-Vis của acid gallic để xác định cực
đại hấp thụ.
 Chọn thể tích tiêm: 5 µl.
2.3.1.3. Thẩm định phương pháp định lượng.
Phương pháp định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [25] về sự
phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ chính xác và
độ đúng dựa trên các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn ở trên.
 Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký
Độ phù hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định
bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý.
Cách xác định: tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu và 6 lần dung dịch
thử đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết.
Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp
ứng phân tích.
Yêu cầu: RSD ≤ 2,7% [25].

14


 Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có
mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác).
Trong HPLC, tính đặc hiệu thể hiện: trên sắc ký đồ thu được từ mẫu trắng không
xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chất cần
phân tích trong mẫu đối chiếu và mẫu thử. Trên sắc ký đồ mẫu thử, pic của chất cần
phân tích tách hồn tồn với các pic tạp.
Tiến hành: tiêm lần lượt mẫu trắng, dung dịch thử, dung dịch đối chiếu vào hệ
thống sắc ký, so sánh các sắc ký đồ thu được.
Yêu cầu: tại thời gian lưu của chất đối chiếu không xuất hiện pic lạ trên mẫu

trắng, mẫu nền. [25].
 Độ tuyến tính và khoảng xác định
Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại
lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định. Kết quả
được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan r.
Khoảng xác định: là khoảng nồng độ đã được khảo sát đảm bảo tuyến tính (gọi
là khoảng tuyến tính). Khảo sát nồng độ từ 1 µg/ml đến 1000 µg/ml.
Cách xác định: chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 5 mẫu có nồng độ tăng dần
trong khoảng thích hợp. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
bằng phương trình hồi quy tuyến tính.
Yêu cầu: R2 > 0,99 (r > 0,995) [25].
 Kiểm tra độ chính xác của phương pháp phân tích
Độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết
quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một
mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các
lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu...) đến công
đoạn cuối cùng của quy trình phân tích.
Tiến hành: tiến hành phân tích trong 3 ngày khác nhau, mỗi ngày pha 6 mẫu thử
riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký. Độ lặp lại được
biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích của các mẫu trong
cùng 1 ngày và liên ngày.
Yêu cầu: RSD ≤ 2,7% [25].
 Kiểm tra độ đúng của phương pháp phân tích
Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị
thực.
Cách xác định: pha mẫu thử theo quy trình chuẩn bị mẫu, thêm vào mẫu thử pha
loãng những lượng chất đối chiếu khác nhau sao cho tổng lượng hoạt chất có trong mẫu
15

nằm trong khoảng tuyến tính rồi tiến hành định lượng để xác định hàm lượng của các
chất trong mẫu thử có thêm chất đối chiếu dựa trên phương trình đường chuẩn, mỗi nồng
độ lặp lại 3 lần. Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất đối chiếu
tìm được so với lượng chất đối chiếu thêm vào.
Yêu cầu: độ tìm lại 97,0 – 103,0% [25].
2.3.2. Quy trình chiết xuất và định lượng acid gallic chiết được trong lá Phèn đen
được xử lý nhiệt
2.3.2.1. Quy trình chiết xuất
Lá phèn đen đem sấy ở các điều kiện khảo sát, cân khoảng 5 g sau đó nghiền mịn,
sắc với khoảng 100 ml nước cất, 2 lần, mỗi lần 2 giờ. Gộp dịch chiết nước.
Tiến hành tương tự với mẫu dược liệu sống.
2.3.2.2. Phương pháp định lượng acid gallic chiết được trong lá Phèn đen được xử lý
nhiệt
Xác định hàm lượng acid gallic chiết được trong lá Phèn đen bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC).
 Chuẩn bị mẫu thử:
Dịch chiết nước được ly tâm loại tủa và định mức vừa đủ 100ml. Hút chính xác
10 ml dịch chiết nước, thêm 20 ml ethanol cao độ, siêu âm 15 phút. Cơ cạn, sau đó siêu
âm với khoảng 7 ml methanol 50% trong 15 phút. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút
trong 10 phút, lấy dịch và định mức vừa đủ 10 ml bằng methanol 50%. Lắc đều, lọc qua
màng lọc 0,45 µm thu được dung dịch thử.
 Điều kiện sắc ký: như phương pháp đã được thẩm định ở mục 3.1.
2.3.3. Phương pháp khảo sát các yếu tố của quá trình xử lý nhiệt lá Phèn đen ảnh
hưởng đến chất lượng cao chiết lá Phèn đen
2.3.3.1. Lựa chọn yếu tố khảo sát và thông số đánh giá
 Các yếu tố khảo sát:
Nhiệt độ sấy: 80℃, 100℃, 120℃, 130℃, 140℃, 150℃,160℃, 180℃, 200℃.
Thời gian sấy: 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, 90
phút.
 Thông số đánh giá:

Hàm lượng acid gallic:
Hàm lượng acid gallic chiết được trong dược liệu:
X (mg/g) =

(𝑆−𝑏).𝑉.𝑘
𝑎.𝑚.(100%−𝐴%).1000

Trong đó:
X: Hàm lượng acid gallic chiết được trong lá Phèn đen (mg/g)
S: Diện tích pic (mAU.s)
16