Phùng thị hồng nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và định lượng đồng thời natri benzoat, benzyl alcohol và acid salicylic trong dầu gội đầu bằng phương pháp hplc luận văn thạc sĩ dược học hà nội 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG THỊ HỒNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
NATRI BENZOAT, BENZYL ALCOHOL VÀ
ACID SALICYLIC
TRONG DẦU GỘI ĐẦU
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2023


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG THỊ HỒNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
NATRI BENZOAT, BENZYL ALCOHOL VÀ
ACID SALICYLIC
TRONG DẦU GỘI ĐẦU
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210
Người hướng dẫn khoa học: TS. Tống Thị Thanh Vượng
PGS. TS. Lê Đình Chi

HÀ NỘI 2023


LỜI CẢM ƠN
Tơi muốn bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến tập thể thầy hướng dẫn, TS. Tống Thị
Thanh Vượng và PGS. TS. Lê Đình Chi – những người thầy đã khơng quản
ngại khó khăn, dành nhiều thời gian q báu và giúp đỡ tận tình cho tơi hồn
thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung
Ương, Khoa Kiểm Nghiệm Mỹ Phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn
thành việc học và làm đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại Học Dược Hà Nội, Khoa Hóa Phân Tích
và Kiểm Nghiệm Thuốc đã cho tơi một mơi trường học tập nghiêm túc, giúp tôi
bồi đắp kiến thức chuyên mơn và hồn thiện bản thân.
Khơng thể nói hết sự cảm kích của tơi đối với đồng nghiệp và gia đình đã ln
u thương, động viên, nhường nhịn để tơi đi đến chặng cuối của chương trình
học Thạc sĩ.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 03 năm 2023
Học viên

Phùng Thị Hồng


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN .............................................................................. 3
1.1. ĐẶC ĐIỂM CÁC CHẤT BẢO QUẢN NGHIÊN CỨU ........................... 3
1.1.1. Natri benzoat ........................................................................................... 3
a. Cơng thức hóa học ......................................................................................... 3
b. Tính chất ........................................................................................................ 3
c. Ứng dụng ....................................................................................................... 3
d. Độ an tồn ..................................................................................................... 4
1.1.2. Acid salicylic ........................................................................................... 5
a. Cơng thức hóa học ......................................................................................... 5
b. Tính chất ........................................................................................................ 5
c. Ứng dụng ....................................................................................................... 5
d. Độ an toàn ..................................................................................................... 6
1.1.3. Benzyl alcohol ......................................................................................... 7
a. Cơng thức hóa học ......................................................................................... 7
b. Tính chất ....................................................................................................... 7
c. Ứng dụng ....................................................................................................... 8
d. Độ an toàn ..................................................................................................... 9
1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHẤT BẢO QUẢN NGHIÊN
CỨU .................................................................................................................. 9
1.2.1. Một số phương pháp phân tích natri benzoat ........................................ 10
1.2.2. Một số phương pháp phân tích acid salicylic........................................ 12
1.2.3. Một số phương pháp phân tích benzyl alcohol ..................................... 13
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC ........................................... 13


1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................... 13
1.3.2. Cấu tạo máy HPLC ............................................................................... 14
1.3.3. Detector và bộ phận ghi nhận tín hiệu .................................................. 14
1.3.4. Các thơng số đặc trưng của quá trình sắc ký......................................... 15
1.3.4.1. Thời gian lưu ...................................................................................... 15

1.3.4.2. Độ phân giải ....................................................................................... 15
1.3.4.3. Tính đối xứng của pic sắc ký ............................................................. 15
1.3.4.4. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết ........................................ 16
1.3.5. Ứng dụng HPLC ................................................................................... 16
1.3.5.1. Định tính............................................................................................. 16
1.3.5.2. Định lượng ......................................................................................... 16
1.3.6. Kỹ thuật HPLC với detector DAD ........................................................ 18
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 20
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 20
2.2. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT ..................................................................... 20
2.2.1. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................ 20
2.2.2.Dung mơi và hóa chất ............................................................................ 21
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 21
2.3.1. Khảo sát, lựa chọn quy trình xử lý mẫu ................................................ 21
2.3.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp ........................................ 22
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ....................................................... 22
2.3.4. Áp dụng trên một số chế phẩm ............................................................. 24
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 24
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ............................................. 25
3.1. XỬ LÝ MẪU ........................................................................................... 25
3.1.1. Điều kiện xử lý mẫu .............................................................................. 25


3.1.2. Cách chuẩn bị mẫu ................................................................................ 26
3.1.2.1. Chuẩn bị mẫu thử ............................................................................... 26
3.1.2.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn ........................................................................... 26
3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ......................................... 27
3.2.1. Xây dựng quy trình phân tích................................................................ 27
3.2.1.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký ............................................................ 27
3.2.1.2. Khảo sát độ ổn định của chất nghiên cứu trong dung môi pha mẫu .. 33

3.2.2. Kết quả xây dựng phương pháp ............................................................ 34
3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ....................................... 36
3.3.1. Đánh giá độ thích hợp hệ thống ............................................................ 36
3.3.2. Độ đặc hiệu............................................................................................ 37
3.3.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ............................................... 42
3.3.4. Độ tuyến tính ......................................................................................... 44
3.3.5. Độ đúng của phương pháp .................................................................... 47
3.3.6. Độ lặp lại ............................................................................................... 49
3.3.7. Độ chính xác trung gian ....................................................................... 50
3.4. ÁP DỤNG KIỂM TRA CÁC MẪU TRÊN THỊ TRƯỜNG ................... 52
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN ............................................................................... 55
4.1. VỀ CÁC CHẤT BẢO QUẢN NGHIÊN CỨU ....................................... 55
4.2. VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 55
4.2.1. Về phương pháp xử lý mẫu ................................................................... 56
4.2.2. Về xây dựng quy trình phân tích ........................................................... 57
4.2.3. Về thẩm định phương pháp ................................................................... 58
4.3. VỀ KIỂM TRA CÁC MẪU DẦU GỘI ................................................... 59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 60
Tài liệu tham khảo


Phụ lục
Phụ lục 1. Các mẫu dầu gội được sử dụng để xác định sự có mặt của 3 chất bảo
quản.
Phụ lục 2. Một số sắc ký đồ phân tích natri benzoat, acid salicylic và benzyl
alcohol.
Phụ lục 3. Chứng chỉ chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Tên tiếng Việt (tiếng Anh)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)

EU

Liên minh châu Âu (European Union)

UV-VIS

Tử ngoại-khả kiến (Ultraviolet-visible)

DAD

Diod array detector

IR

Hồng ngoại (Infrared Radiation)

MS

Phổ khối (Mass spectrum)

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association of
Official Analytical Chemists)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

r

Hệ số tương quan (Relative coefficient)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số phương pháp định lượng natri benzoat, acid salicylic và benzyl
alcohol………………………………………………………………..10
Bảng 2.1. Các nền mẫu được sử dụng để xác định phương pháp phân
tích……………………………………………………………………20
Bảng 3.1. Các điều kiện đánh giá sơ bộ để lựa chọn cột sắc ký và pha
động…………………………………………………………………..27
Bảng 3.2. Kết quả độ ổn định của chất nghiên cứu trong dung môi pha
mẫu…………………………………………………………………...34

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký…………………36
Bảng 3.4. Giá trị LOD, LOQ của benzyl alcohol, acid salicylic và natri benzoat
trong dung dịch……………………………………………………….42
Bảng 3.5. Giá trị LOD, LOQ của benzyl alcohol, acid salicylic và natri benzoat
của phương pháp……………………………………………………..42
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của benzy alcohol, acid salicylic và
natri benzoat………………………………………………………….45
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng của benzyl alcohol………………………..47
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng của acid salicylic………………………….48
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng của natri benzoat………………………….48
Bảng 3.10. Kết quả độ lặp lại của phương pháp………………………………….49
Bảng 3.11. Độ chính xác trung gian của benzyl alcohol………………………..50
Bảng 3.12. Kết quả độ chính xác trung gian của acid salicylic……....................51
Bảng 3.13. Kết quả độ chính xác trung gian của natri benzoat…….....................51
Bảng 3.14. Hàm lượng của benzyl alcohol, acid salicylic, natri benzoat trong mẫu
dầu gội trên thị trường……………………………………………….53


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ ngun lý của máy HPLC………………………………………14
Hình 3.1. Sắc ký đồ mẫu thử…………………………………………………….26
Hình 3.2. Sắc ký đồ của một số pha động khảo sát………………………………29
Hình 3.3. Phổ UV-VIS của natri benzoat và acid salicylic………………………30
Hình 3.4. Sắc ký đồ phân tích natri benzoat và acid salicylic…………………..31
Hình 3.5. Phổ UV-VIS của benzyl alcohol………………………………………32
Hình 3.6. Sắc kí đồ phân tích benzyl alcohol …………………….……………..33
Hình 3.7. Một số sắc ký đồ tiêu biểu khi thẩm định độ đặc hiệu………………..40
Hình 3.8. Độ tinh khiết pic………………………………………………………41
Hình 3.9. Phổ UV-VIS…………………………………………………………..41
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ

của benzyl alcohol……………………………………………………43
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
của acid salicylic……………………………………………………..44
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
của natri benzoat……………………………………………………...45
Hình 3.13. Sắc ký đồ xác định LOD của benzyl alcohol, acid salicylic và natri
benzoat………………………………………………………………46
Hình 3.14. Sắc ký đồ xác định LOQ của benzyl alcohol, acid salicylic và natri
benzoat………………………………………………………………46


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong đời sống hàng ngày hiện nay, các loại mỹ phẩm, trong đó có dầu
gội đầu, là những sản phẩm tiêu dùng thiết yếu. Dầu gội đầu là sản phẩm thường
được đóng gói để sử dụng nhiều lần nên cần duy trì được các đặc tính ban đầu
trong một thời gian nhất định, trong đó có việc kiểm sốt giới hạn vi sinh vật,
vì vậy các nhà sản xuất thường sử dụng chất bảo quản trong thành phần của
dầu gội đầu. Lý tưởng nhất là chất bảo quản có hiệu quả kháng khuẩn ở nồng
độ thấp mà có tác dụng với nhiều loại vi sinh vật khác nhau và không ảnh hưởng
đến các thành phần khác trong sản phẩm, ít độc trên người và có giá cả phù
hợp.
Theo hiệp định hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm, các chất bảo
quản như natri benzoat, benzyl alcohol, acid salicylic và phenoxyethanol thuộc
danh mục chất bảo quản có giới hạn (chẳng hạn, natri benzoat có giới hạn cho
phép là 2,5 % trong các sản phẩm tẩy rửa, benzyl alcohol và phenoxyethanol
cho phép không quá 1%, acid salicylic và muối của nó khơng được q 0,5%)
[4]. Sở dĩ cần có quy định giới hạn là vì các chất bảo quản nếu sử dụng với
nồng độ, hàm lượng quá lớn trong mỹ phẩm sẽ gây ra các tác dụng phụ khi sử
dụng quá nồng độ cho phép. Như benzyl alcohol có thể gây kích ứng da, natri
benzoat có thể gây dị ứng da, acid salicylic có thể gây ra một số tác dụng phụ

trên da nhạy cảm (gây ngứa châm chích, phát ban, nổi mề đay, gây khô da, v.v.)
[9], [10]. Do vậy, các chất bảo quản này cần

1


Ương). Tuy vậy, cho tới nay vẫn chưa có phương pháp chính thức để
kiểm tra hàm lượng một số chất bảo quản phổ biến hay được sử dụng riêng rẽ
hoặc phối hợp trong các mỹ phẩm được quảng cáo “không chứa paraben” như
benzyl alcohol, natri benzoat hay acid salicylic. Xuất phát từ yêu cầu thực tế
trên, nghiên cứu này hướng tới xây dựng quy trình phát hiện và định lượng
đồng thời natri benzoat, benzyl alcohol và acid salicylic trong dầu gội đầu với
các mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời natri benzoat, benzyl
alcohol và acid salicylic trong dầu gội đầu.
2. Áp dụng phương pháp xây dựng được để kiểm tra một số mẫu dầu gội
trên thị trường.

2


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM CÁC CHẤT BẢO QUẢN NGHIÊN CỨU
1.1.1. Natri benzoat
a. Cơng thức hóa học
- Cơng thức hóa học: C7H5NaO2

- Phân tử lượng: 144,1
- Cách gọi khác: E211

b. Tính chất
Bột kết tinh hay hạt hoặc mảnh màu trắng, hơi hút ẩm. Dễ tan trong nước,
hơi tan trong ethanol 90% (tt/tt) [1].
c. Ứng dụng
Natri benzoat ức chế sự phát triển của vi khuẩn, nấm mốc và các vi sinh vật
khác trong thực phẩm, do đó ngăn chặn sự phân hủy. Nó đặc biệt hiệu quả trong
thực phẩm có tính acid. Natri benzoat được dùng làm chất bảo quản để ngăn
thực phẩm bị mốc. Nó giúp giữ cho sản phẩm có hạn sử dụng trong ít nhất hai
năm kể từ ngày sản xuất. Được dùng phổ biến trong các thực phẩm có tính acid
như salad dầu giấm, đồ uống có gas, các loại mứt và nước trái cây, dưa chua và
các loại gia vị. Ngồi ra, nó cịn được sử dụng như một chất bảo quản trong các
loại thuốc và mỹ phẩm. Natri benzoat thường được sử dụng làm chất bảo quản
trong mỹ phẩm và các mặt hàng chăm sóc cá nhân, chẳng hạn như sản phẩm
dưỡng tóc, khăn lau trẻ em, kem đánh răng và nước súc miệng. Chất bảo quản
trong một số loại thuốc (nhất là thuốc dạng lỏng như siro), kéo dài thời hạn sử

3


dụng của thuốc hỗ trợ không kê đơn.
Natri benzoat được sử dụng để điều trị rối loạn chu trình urê do khả năng
liên kết các acid amin của nó. Điều này dẫn đến bài tiết các acid amin này và
giảm nồng độ amoniac. Natri benzoat cùng với phenylbutyrat, được sử dụng
để điều trị chứng tăng natri huyết. Natri benzoat, cùng với caffein, được sử
dụng để điều trị đau đầu sau chọc thủng màng cứng, suy hô hấp liên quan đến
sử dụng quá liều chất ma túy và cùng với ergotamine để điều trị đau đầu do co
thắt mạch máu [10].
Natri benzoat còn được dùng trong pháo hoa như là nhiên liệu trong việc
hòa hợp âm, một chất bột phát ra tiếng nổ khi nén vào ống và đốt cháy [10].
d. Độ an toàn

Một mối quan tâm lớn đối với việc sử dụng natri benzoat là khả năng chuyển
đổi thành benzen, một chất gây ung thư đã biết [10]. Các yếu tố khác, bao gồm
tiếp xúc với nhiệt và ánh sáng, cũng như thời gian bảo quản lâu, có thể làm tăng
nồng độ benzen trong sản phẩm. Một tỷ lệ nhỏ dân số có thể quá mẫn cảm với
các chất bảo quản như natri benzoat và có thể gặp các triệu chứng dị như là:
ngứa và sưng tấy, mề đay tiếp xúc quanh miệng...
Theo FDA, natri benzoat được công nhận là an tồn và có thể được sử dụng
như một chất chống vi khuẩn và chất tạo hương vị trong thực phẩm với mức sử
dụng tối đa là 0,1%. Khi natri benzoat kết hợp với vitamin C sẽ tạo ra benzen
có nguy cơ gây ung thư. Tuy nhiên hàm lượng sử dụng này thường rất nhỏ [10].
Khi sử dụng natri benzoat trên da có thể gây ra các phản ứng dị ứng, ngứa,
nổi mẩn. Vì vậy natri benzoat thuộc danh mục chất có giới hạn cần kiểm sốt
khi sử dụng trong mỹ phẩm với hàm lượng cho phép không quá 2,5% trong sản
phẩm tẩy rửa [4].
1.1.2. Acid salicylic
a. Cơng thức hóa học

4


- Công thức phân tử: C7H6O3
- Phân tử lượng: 138,1
- Cách gọi khác: acid 2-hydroxybenzencarboxylic [1].
b. Tính chất
Tinh thể hình kim màu trắng hoặc không màu hay bột kết tinh trắng. Khó
tan trong nước, dễ tan trong ethanol 96% và ether, hơi tan trong chloroform.
Dung dịch chế phẩm có phản ứng acid [1].
c. Ứng dụng
Acid salicylic thuộc nhóm thuốc kháng viêm không steroid, là một thành
phần thường thấy trong các thuốc điều trị bệnh về da như mụn, gàu, vảy nến,

viêm da tiết bã nhờn trên bề mặt da thông thường và da đầu, sẹo lồi, ngứa, mụn
cơm và một số loại mỹ phẩm (với tên gọi BHA). Acid salicylic có tác dụng
làm tróc mạnh lớp sừng da và sát khuẩn nhẹ khi bôi trên da nên đã được dùng
để điều trị tại chỗ một số bệnh da tăng sừng hóa và bong da như viêm da tiết
bã nhờn, bệnh vảy nến, gàu, trứng cá, hột cơm, chai gan bàn chân… tùy theo
nồng độ thuốc. Ở nồng độ thấp, thuốc có tác dụng tạo sừng (điều chỉnh q
trình sừng hóa bất thường); ở nồng độ cao (≥ 1%) thuốc có tác dụng làm tróc
lớp sừng. Acid salicylic làm mềm và phá hủy lớp sừng bằng cách tăng hydrat
hóa nội sinh (tăng nồng độ của nước), có thể do làm giảm pH, làm cho lớp
biểu mơ bị sừng hóa phồng lên, sau đó bong tróc ra. Khi bơi q nhiều, thuốc
có thể gây hoại tử da bình thường. Ở nồng độ cao (ví dụ 20%), acid salicylic
có tác dụng ăn mịn da nên thường được dùng để điều trị chai gan bàn chân.
Môi trường ẩm là cần thiết để acid salicylic có tác dụng làm lợt và làm bong
tróc mơ biểu bì.

5


Acid salicylic sử dụng trong dầu gội đầu với mục đích chính là tẩy tế bào
chết, làm sạch sâu da đầu làm lỗ chân lơng được thơng thống khiến cho bụi
bẩn và bã nhờn khơng cịn đọng lại trên da. Với đặc tính kháng khuẩn, chống
viêm nên acid salicylic được cho vào các sản phẩm dầu gội trị gàu. Một số
dầu gội acid salicylic có lưu huỳnh, có thể ngăn chặn sự phát triển của nấm.
Khi sử dụng acid salicylic làm thuốc thì có tác dụng chống nấm yếu, nhờ
làm bong lớp sừng ngăn chặn nấm phát triển và giúp cho các thuốc chống nấm
thấm vào da, do đó cũng được dùng để điều trị một số bệnh nấm ngoài da. Khi
phối hợp, acid salicylic và lưu huỳnh có tác dụng hiệp lực làm tróc lớp sừng.
Khơng dùng acid salicylic đường tồn thân, vì tác dụng kích ứng rất mạnh
trên niêm mạc tiêu hóa và các mơ khác.
Acid salicylic được hấp thu dễ dàng qua da và bài tiết chậm qua nước tiểu,

do vậy đã có trường hợp bị ngộ độc cấp salicylat sau khi dùng quá nhiều acid
salicylic trên diện rộng của cơ thể [2], [8].
d. Độ an toàn
Acid salicylic có thể gây kích ứng da khi mới bắt đầu sử dụng. Nó cũng có
thể loại bỏ quá nhiều dầu, dẫn đến khơ da và gây kích ứng, da ngứa ran hoặc
châm chích, bong tróc da.
Dầu gội đầu có chứa acid salicylic có thể làm cho da đầu khơ hơn, và điều
đó có thể dẫn đến bong tróc nhiều hơn. Chúng cũng có thể gây kích ứng da,
gây ra cảm giác buồn nôn hoặc gây ra các vấn đề khác nếu sử dụng nó quá lâu
và quá nhiều trên một khu vực trên da đầu. Một số dầu gội acid salicylic có lưu
huỳnh, có thể ngăn chặn sự phát triển của nấm.
Một trong những tác hại nguy hiểm nhất của acid salicylic là gây ra hội
chứng Reye (hội chứng gây tổn thương não, tổn thương gan, hôn mê, nôn…)
vốn có thể gây tử vong cho người sử dụng hoặc có thể khiến họ tàn tật suốt đời
(95% trường hợp gây hội chứng Reye là do sử dụng các sản phẩm mỹ phẩm,
dược phẩm có chứa acid salicylic và aspirin). Acid salicylic cịn có thể gây ung
6


thư da vì làm tăng tính nhạy cảm của da trước tia cực tím, dẫn đến nguy cơ
bỏng nắng hoặc hoặc gây tổn thương da. Vì vậy những người sử dụng mỹ phẩm
có chứa acid salicylic khi ra đường phải dùng những loại kem chống nắng với
yếu tố chống nắng SPF 30 [8].
1.1.3. Benzyl alcohol
a. Cơng thức hóa học

- Cơng thức phân tử: C7H8O
- Phân tử lượng: 108,14
- Cách gọi khác: Tên IUPAC: Phenylmethanol, tên khác: phenylcarbinol,
benzenemethanol [3], [23].

b. Tính chất
Benzyl alcohol là chất lỏng khơng màu, có mùi thơm nhẹ dễ chịu. Nó là một
dung mơi hữu ích do tính phân cực, độc tính thấp và áp suất hơi thấp. Rượu
benzyl có độ hịa tan vừa phải trong nước (4g/100 ml) và có thể trộn lẫn trong
rượu và ete dietyl, chloroform. Anion được tạo ra bằng cách khử nhóm rượu
được gọi là benzylat hoặc benzyloxid [9].
c. Ứng dụng
Benzyl alcohol dùng trong mỹ phẩm chủ yếu với công dụng bảo quản,
ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, được sử dụng như một chất bảo quản
chống lại các vi khuẩn Gram dương, nấm mốc, nấm men, mặc dù nó chỉ có khả
năng kháng khuẩn nhẹ, pH mà benzyl alcohol có hoạt tính tối ưu là dưới 5 và
giảm hoạt động khi pH lớn hơn 8. Ngoài ra, khả năng kháng khuẩn bị suy giảm
khi có mặt của chất diện hoạt không ion, chẳng hạn như polysorbate 80 và giảm
7


hoạt tính nhẹ khi kết hợp cùng este hydroxybenzoat hoặc các hợp chất amoni
bậc 4. Hoạt tính của benzyl alcohol cũng có thể bị giảm do khơng tương hợp
với một số bao bì đóng gói đặc biệt là polythylen. Cồn benzyl alcohol có cơng
dụng diệt khuẩn và kháng khuẩn trong mỹ phẩm. Hoạt chất này vô cùng cần
thiết đối với các loại mỹ phẩm hay đóng mở thường xuyên và hay tiếp xúc
với ngón tay như nước hoa; sữa rửa mặt; kem dưỡng. Chúng còn dùng để
bảo vệ các loại mỹ phẩm dễ bị vi khuẩn tấn công như mỹ phẩm gốc nước,
peptide, carbohydrat… [9].
Benzyl alcohol chủ yếu được dùng để tạo mùi hương khi sử dụng ở nồng
độ cao. Vì cơ bản, hoạt chất này có nguồn gốc từ các lồi hoa như hoa hồng,
hoa nhài, lục bình, dầu hoa cam; dầu ylang ylang. Do đó loại cồn này mang
lại mùi hương như hoa cho các loại mỹ phẩm. Tuy nhiên, benzyl alcohol sẽ
bị biến tính khi để ngồi khơng khí trong thời gian dài và bị oxy hóa.
Benzyl alcohol cịn có cơng dụng như một dung mơi hịa tan vào mỹ

phẩm. Dung mơi giúp thành phần hịa tan vào dung dịch; pha lỗng cơng
thức mỹ phẩm; nhờ vậy mà khi tiếp xúc lên da mỹ phẩm dễ dàng lan rộng
hơn trên bề mặt.
Benzyl alcohol được minh chứng là hoạt chất chống oxy hóa cho làn da;
song cịn bảo vệ chống lại các gốc tự do. Ức chế và chống khả năng xuất
hiện các nếp nhăn trên làn da. Giúp da thêm phần căng mịn, tươi trẻ.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng benzyl alcohol có cơng dụng giảm độ
nhớt của mỹ phẩm nhất là các loại sữa rửa mặt; sữa tắm… khi độ nhớt nhiều,
làn da sẽ mất đi độ ẩm vốn có và khiến chúng dễ khơ hơn. Khi thêm benzyl
alcohol vào mỹ phẩm hay sữa tắm, dung dịch sẽ dễ trôi hơn khi tiếp xúc với
nước [9].
d. Độ an toàn
Hội đồng chuyên gia đánh giá mức độ an toàn của thành phần trong mỹ
phẩm (CIR – Cosmetic ingredients review) cho rằng benzyl alcohol không
8


có tác dụng phụ nào trong các nghiên cứu phơi nhiễm mãn tính ở miệng.
Khi tiếp xúc với hóa chất này hồn tồn an tồn và lành tính. Tuy nhiên, đối
với một số trường hợp đặc biệt như da nhạy cảm, benzyl alcohol vẫn có thể
gây ngứa hoặc nổi mẩn đỏ cho làn da, mặc dù tình trạng này khơng quá
nghiêm trọng. Khả năng trầm trọng chỉ khi nồng độ lên đến 5% so với mức
bình thường. Nói tóm lại, Hội đồng đánh giá thành phần kết luận rằng benzyl
alcohol là hoạt chất an toàn khi sử dụng trong mỹ phẩm. Theo hiệp định hòa
hợp Asean về quản lý mỹ phẩm thì benzylalcohol thuộc danh mục chất có
giới hạn khơng được quá 1% [4], [9].
1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHẤT BẢO QUẢN
NGHIÊN CỨU
Một số phương pháp định lượng natri benzoat, acid salicylic và benzyl
alcohol được liệt kê trong Bảng 1.1

Bảng 1.1. Một số phương pháp định lượng natri benzoat, acid salicylic và
benzyl alcohol
Hoạt chất

Phương pháp

Natri benzoat

-Phương pháp chuẩn độ thể tích
- Phương pháp HPLC
- Phương pháp LC-MS/MS

Acid salicylic

-Phương pháp chuẩn độ thể tích
-Phương pháp UV-VIS
- Phương pháp LC-MS/MS
- Phương pháp GC-MS
- Phương pháp HPLC

Benzyl alcohol

-Phương pháp chuẩn độ thể tích
- Phương pháp HPLC
- Phương pháp LC-MS/MS
- Phương pháp GC-MS

9

1.2.1. Một số nghiên cứu phân tích natri benzoat bằng phương pháp HPLC
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phân tích natri benzoat. Cột C18
(250 x 4,0; 10 µm). Pha động là đệm phosphat - methanol (60:40, tt/tt), đệm là
hòa tan 6,8 g KH2PO4 trong 1000 ml nước, thêm 1ml triethylamin, điều chỉnh
pH 5,5 bằng H3PO4. Dung mơi hịa tan mẫu là pha động, bước sóng phát hiện
là 254 nm, tốc độ 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu là 20 µl [11].
- Thẩm định phương pháp phân tích sắc ký lỏng pha đảo trong phân tích các
chất phụ gia thực phẩm, natri benzoat trong nước ngọt và mứt. Cột C18, pha
động là methanol - nước (70:30, tt/tt), điều chỉnh pH 3,45 với acid acetic băng,
tốc độ dòng 0,45 µl/phút, bước sóng 245 nm [12].
- Phát triển và thẩm định phương pháp HPLC xác định đồng thời betamethason
và natri benzoat trong dạng dược dụng dạng lỏng đường uống. Cột C18 (150 x
3,9 mm; 4 µm), chương trình gradient dung môi với thành phần pha động gồm
đệm phosphat pH 2,9 và acetonitril. Dung môi pha mẫu là ethanol - nước
(40:60, tt/tt) [13].
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định chất bảo quản trong đồ uống.
Cột C18 (300 x 4,0 mm; 3 µm), pha động gồm đệm phosphat pH 3,7 và
methanol (80:20), tốc độ 1ml/phút, nhiệt độ cột 250C, bước sóng phát hiện là
225 và 255 nm. Dung môi pha mẫu là methanol - nước (50:50, tt/tt) [14].
- Xác định đồng thời 11 chất bảo quản trong mỹ phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (methyl paraben, propyl paraben, ethyl paraben, isopropyl paraben,
butyl paraben, isobutyl paraben, acid benzoic, acid salicylic, acid sorbic, acid
dehydroacetic và phenoxyethanol). Cột C18 (250 x 4,6 mm; 3 µm), chương
trình gradient dung mơi với thành phần pha động gồm dung dịch amoni format
5 mM/lít pH 4,2 điều chỉnh bằng acid formic và acetonitril, tốc độ 1ml/phút,
bước sóng 230 nm. Nhiệt độ cột 400C, thể tích tiêm mẫu là 10 µl. Dung mơi
pha mẫu là methanol [15].
- Xác định các chất bảo quản trong mỹ phẩm, sản phẩm làm sạch và dạng dược
10

dụng sử dụng sắc ký lỏng nhanh. Cột C18 (50 x 2 mm; 3 µm), chương trình
gradient dung mơi với thành phần pha động gồm acetonitril và dung dịch acid
formic 0,1%, tốc to 0,7 ml/phút, bước sóng 237 nm (natri benzoat), 257 nm
(benzylalcohol). Nhiệt độ cột 400C, thể tích tiêm mẫu là 10 µl. Dung mơi pha
mẫu là methanol [16].
- Phát hiện và định lượng chất bảo quản trong mỹ phẩm xanh: Cột C18 (250 x
4,0 mm; 10µm), pha động gồm dung dịch đệm phosphat và methanol (60:40,
tt/tt), đệm phosphat gồm 6,8 g KH2PO4 trong 1000 ml nước và 1ml
triethylamine, điều chỉnh pH 5,5 bằng H3PO4, tốc độ 1ml/phút, bước sóng 254
nm, thể tích tiêm mẫu là 20 µl. Dung môi pha mẫu là methanol [17].
1.2.2. Một số nghiên cứu phân tích acid salicylic bằng phương pháp HPLC
- Phương pháp sắc ký lỏng xác định đồng thời Methylisothiazolinone, acid
Salicylic và Parabens trong mỹ phẩm. Cột silica nguyên khối Chromolith Speed
Rod (100 x 4,6 nm). Chương trình gradient pha động gồm acetonitril và đệm
phosphat 10 mM pH 3,0. Tốc độ 1ml/phút, bước sóng 235 nm. Dung mơi pha
mẫu là methanol [18].
- Xác định acid salicylic trong mỹ phẩm bằng phương pháp HPLC (Asean).
Pha động là methanol: acid acetic băng 1,5% (55:45). Cột C18 (150 x 4,6 mm;
5µm). Tốc độ 1ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, bước sóng 236nm hoặc 302 nm.
Dung môi pha mẫu là methanol và pha động [19].
- Phân tích đồng thời acid dehydroacetic, acid benzoic, acid sorbic và acid
salicylic trong sản phẩm mỹ phẩm bằng chiết pha rắn và sắc ký lỏng hiệu năng
cao. Cột TSK gel ODS-80TM (150 x 4,6 mm, 5 µm). Pha động bao gồm hỗn
hợp nước và metanol (65:35) chứa 2,5 mM hydroxyd tetrabutylamonium được
điều chỉnh bằng acid phosphoric đến pH 7,0. Bước sóng 235 nm, dung mơi pha
mẫu là methanol [20].
- Phân tích acid salicylic, arbutin và corticosteroid trong kem bôi da ở Pakistan
sử dụng phương pháp sắc ký lỏng. Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm). Pha động là
11

acetonitril – methanol - nước (40:40:20), pH 7,0. Tốc độ 0,8 ml/phút, bước sóng
254 nm [21].
- Xác định đồng thời bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao salicylamid, acid salicylic
và deferasirox trong nguyên liệu đầu vào, tạp chất và sản phẩm cuối cùng trong
1 loạt các mẫu API. Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm). Pha động là acetonitril đệm pH 3,2 (60:40), dung dịch đệm gồm 1,36 g KH2PO4 hòa tan trong 1000 ml
nước, điều chỉnh pH bằng acid phosphoric. Tốc độ 1,0 ml/phút, bước sóng 245
nm. Dung môi pha mẫu là hỗn hợp acetonitril - nước (99,5: 0,5, tt/tt) [22].
1.2.3. Một số nghiên cứu phân tích benzyl alcohol bằng phương pháp
HPLC
- Phát triển và thẩm định phương pháp HPLC cho việc ước lượng giá trị chấp
nhận của các chất bảo quản độc hại trong các dạng dược dụng. Cột C18 (250 x
4,6 mm; 5µm), nhiệt độ cột 600C, chương trình gradient dung mơi với thành
phần pha động gồm acid formic 0,1 % - acetonitril. So sánh với chương trình
pha động đẳng dịng với thành phần pha động gồm acid formic 0,1% và 2propanol pH 2,9 (70:30, tt/tt). Tốc độ dịng 2ml/phút, bước sóng 254nm [24].
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phân tích benzyl alcohol. Cột
C18 (250 x 4,0 mm; 10 µm). Pha động là methanol - acid phosphoric 0,02M
(70:30, tt/tt). Tốc độ 1,0 ml/phút, bước sóng 215 nm. Dung mơi pha mẫu là pha
động [25].
- Phát hiện và định lượng chất bảo quản trong mỹ phẩm xanh: Cột C18 (250 x
4,6 mm; 5µm), chương trình gradient dung mơi với thành phần pha động gồm
dung dịch acid formic 0,1 % và acetonitril tốc độ 1ml/phút, bước sóng 257 nm.
Nhiệt độ cột 200C, thể tích tiêm mẫu là 20 µl. Dung mơi pha mẫu là methanol
[17].
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định đồng thời amcinonid và
benzylalcohol trong dược phẩm. Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5µm). Pha động là
nước - acetonitril (70:30, t/tt). Tốc độ 1,5 ml/phút, bước sóng 254 nm. Dung
12

môi pha mẫu là pha động [26].
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của
sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của
pha động lỏng dưới áp suất cao. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ
số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các
chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ
thuộc vào các yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi
detector và được ghi lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành sắc ký đồ
với các thơng tin về pic của chất phân tích.
Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc
ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại
cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [7].
1.3.2. Cấu tạo thiết bị HPLC
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha
động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa
mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, hệ thu nhận và xử lý dữ liệu [7].
Hệ thống cấp
dung môi

Bơm

Hệ thu nhận
xử lý số liệu

Detector

Bộ phận tiêm

mẫu

Cột sắc ký

Thải
Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý của thiết bị HPLC
1.3.3. Detector và bộ phận ghi nhận tín hiệu
13


Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tùy
thuộc bản chất lý hóa của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp.
-Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả
năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).
-Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh
quang.
-Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hóa: các cation, anion,
các hợp chất có tính dẫn điện…
-Detector khối phổ: thường được dùng để nhận biết và xác định các hợp chất
khi chúng rất khó tách bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ, chẳng hạn như
các chất có khối lượng phân tử lớn, các hợp chất không bền nhiệt và các hợp
chất phân cực.
Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính [7].
1.3.4. Các thơng số đặc trưng của q trình sắc ký
1.3.4.1. Thời gian lưu
Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector được gọi
là thời gian lưu tR. Đối với những chất không lưu giữ thì tốc độ di chuyển của
nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử pha động. Thời gian t M
của chất không lưu gọi là thời gian chết [7].
1.3.4.2. Độ phân giải

Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột
sắc ký
Rs =
Trong đó:

2(𝑡𝑅2−𝑡𝑅1)
𝑊1+𝑊2

Rs: độ phân giải
tR1, tR2: thời gian lưu chất 1, 2
W1, W2: độ rộng pic 1, 2 ở các đáy pic
Rs ≥ 1,5 thì 2 pic coi như tách được hoàn toàn

14


1.3.4.3. Tính đối xứng của pic sắc ký
- Hệ số bất đối: AF =

𝑏
𝑎

b: nửa chiều rộng phía sau pic
a: nửa chiều rộng phía trước pic
-Hệ số kéo đi: As =

𝑎+𝑏
2𝑎

1.3.4.4. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Cột sắc ký được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai
pha được coi là đạt đến trạng thái cân bằng. những lớp mỏng này được gọi là
đĩa lý thuyết.
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện
sắc kí nhất định. Cột có số đĩa lý thuyết lớn sẽ có hiệu lực cao, khi đó độ
dỗng pic nhỏ.
1.3.5. Ứng dụng HPLC
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 4 ứng dụng chính: định tính, định
lượng, thử tinh khiết và điều chế.
1.3.5.1. Định tính
Người ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau [7]:
- So sánh thời gian lưu của các chất phân tích trong dung dịch thử với
thời gian lưu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký.
- So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích
đã thêm chuẩn đối chiếu.
- So sánh phổ UV-VIS (chồng phổ) giữa phổ mẫu thử với phổ chất đối
chiếu bằng DAD thông qua hệ số Match.
- Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào
nhóm chức (IR) hoặc số khối (MS).
1.3.5.2. Định lượng
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc [7]:

15