Báo cáo thí nghiệm công nghệ sinh học dược

BÁO CÁO

THỰC TẬP

CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC

Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2022


LỜI MỞ ĐẦU
Báo cáo môn học Công nghệ sinh học Dược gồm các bài thực tập liên quan đến
các quy trình, kỹ thuật sinh học có vai trị quan trọng đối với các môn học, định hướng
chuyên ngành sau này đối với sinh viên Dược. Gồm các lĩnh vực phân lập, phát hiện vi
sinh vật có tiềm năng như bài chọn lọc giống vi sinh vật, các kỹ thuật tinh chế enzyme
bằng alginate, có khả năng chuyển gene để tạo dòng biểu hiện protein tái tổ hợp trong
E.coli và tinh chế protein tái tổ hợp, mỗi buổi thực tập sẽ tiến hành các quy trình thí
nghiệm từ đơn giản đến phức tạp. Báo cáo gồm các phần chính như TỔNG QUAN –
MỤC ĐÍCH trình bày khái qt, đặt vấn đề liên quan đến buổi học, mục đích và trả lời
cho câu hỏi tại sao phải tiến hành thí nghiệm này. Phần VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
trình bày về những dụng cụ hóa chất cần thiết, nguyên tắc, phương pháp tiến hành thu
thập và xử lý số liệu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU trình bày hình ảnh trực quan và số liệu
thơ thu được từ thí nghiệm được xử lý tính tốn theo phương pháp trình bày ở phần trên.
Các kết quả thu được sẽ được đánh giá và trình bày trong phần BÀN LUẬN, giải thích
các sai sót và trình bày cách khắc phục nếu có. Cuối cùng là phần KẾT LUẬN để tổng kết
lại bài thí nghiệm, những thí nghiệm đã làm được và ý nghĩa của bài học.
Bên cạnh các bài học chính, các kỹ thuật trong bài cịn được ôn tập và thực hành
chuyên nghiệp hơn từ môn vi sinh học và các môn học trước. Nắm được thao tác trải đĩa,
chuẩn bị môi trường, nuôi cấy và thu vi sinh vật. Biết được cách pha loãng dung dịch, tính
nồng độ và tính tốn xử lý số liệu. Thông thạo sử dụng một số thiết bị phổ biến trong
phịng thí nghiệm như máy lắc, tủ ủ, máy sốc nhiệt, máy ly tâm… Ngoài ra, các kỹ thuật
sắc ký hiện đại cũng được áp dụng vào bài để tiến hành các quá trình tinh chế, chọn lọc

protein.

Trang 2


MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU....................................................................................................................2
DANH MỤC BẢNG BIỂU................................................................................................4
DANH MỤC HÌNH ẢNH..................................................................................................5
A. CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT.............................................................................6
B. TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINATE........................................….16
C. TẠO DÒNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG E. coli..........................25
D. TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP...........................................................................32


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng A. 1. Danh sách các vật liệu sử dụng trong nghiên cứu.............................................7
Bảng B. 1. Danh sách các vật liệu sử dụng trong nghiên cứu...........................................17
Bảng B. 2. Phương pháp pha dung dịch của ống thử và ống chứng..................................19
Bảng B. 3. Phương pháp pha giải mẫu xác định đường chuẩn tính hoạt động amylase.. . .20
Bảng B. 4. Kết quả đo OD của các ống thử và ống chứng trong thí nghiệm.....................21
Bảng B. 5. Kết quả đo OD giải mẫu xác định đường chuẩn..............................................22
Bảng C. 1. Danh sách các vật liệu sử dụng trong nghiên cứu...........................................27
Bảng D. 1. Danh sách các vật liệu sử dụng trong nghiên cứu...........................................34
Bảng D. 2. Số liệu và kết quả tính tốn các thơng số trong thí nghiệm.............................38


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình A. 1. Sơ đồ phương pháp phân lập chủng vi sinh vật có khả năng sinh amylase.......8
Hình A. 2. Sơ đồ phương pháp phân lập chủng vi sinh vật có khả năng sinh protease.......8

Hình A. 3. Sơ đồ phương pháp phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh.............9
Hình A. 4. Kết quả thí nghiệm khả năng sinh amylase ngoại bào.....................................10
Hình A. 5. Kết quả thí nghiệm khả năng sinh protease ngoại bào.....................................10
Hình A. 6. Kết quả thí nghiệm vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh...........................11
Hình A. 7. Sơ đồ phương pháp giữ giống trên thạch.........................................................14
Hình A. 8. Sơ đồ phương pháp giữ giống trong cát..........................................................14
Hình B. 1. Sơ đồ phương pháp thu enzyme thơ................................................................16
Hình B. 2. Sơ đồ phương pháp tinh chế enzyme thơ.........................................................17
Hình B. 3. Sơ đồ phương pháp xác định hàm lượng protein bằng OD280.........................................17
Hình B. 4. Biểu đồ đường chuẩn biểu thị khối lượng tinh bột bị thủy phân......................21
Hình C. 1. Cấu trúc vector pET28b+................................................................................25
Hình C. 2. Cấu trúc của E. coli BL21(DE3) và tương tác với vector pET28b(+)..............25
Hình C. 3. Sơ đồ phương pháp tách plasmid sử dụng spin column...................................27
Hình C. 4. Sơ đồ phương pháp biến nạp plasmid vào E. coli............................................27
Hình C. 5. Sơ đồ phương pháp nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu..............27
Hình C. 6. Kết quả cấy E. coli được biến nạp plasmid trên đĩa thạch...............................28
Hình C. 7. Kết quả cảm ứng biểu hiện protein..................................................................28
Hình D. 1. Cơ chế sắc ký ái lực kim loại (IMAC).............................................................31
Hình D. 2. Sơ đồ phương pháp chuẩn bị cột.....................................................................35
Hình D. 3. Sơ đồ phương pháp phá tế bào........................................................................35
Hình D. 4. Sơ đồ phương pháp tinh chế protein His-tag...................................................36


A. CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT
I. TỔNG QUAN – MỤC ĐÍCH
1. Tổng quan nghiên cứu
Q trình chọn lọc giống vi sinh vật là quá trình tiến hành phân lập vi sinh vật từ tự
nhiên, gây đột biến, phân lập và phát hiện dịng với đặc tính mong muốn, khả năng kháng
khuẩn và lưu trữ, bảo quản giống.
Trong bài thực tập 1 về chọn lọc giống vi sinh vật gồm các thí nghiệm:

- Thí nghiệm 1: Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
(amylase ngoại bào, protease ngoại bào). Thời gian theo dõi 24h, khảo sát hoạt tính sinh
enzyme của vi sinh vật dựa vào đường kính của vịng phân giải.
- Thí nghiệm 2: Phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh. Thời gian theo
dõi 18h, ghi nhận kết quả dựa vào đường kính vùng ức chế xung quanh lỗ trong bản
thạch.
2. Mục đích nghiên cứu
- Phân lập và phát hiện dịng vi sinh vật với đặc tính mong muốn (khả năng sinh
protease, amylase ngoại bào).
- Xác định và nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của chủng vi sinh vật.
- Lưu trữ và bảo quản các giống vi sinh vật.


II. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
1. Vật liệu nghiên cứu
STT

Vật liệu sử dụng

Nghiên cứu sử dụng

Ghi chú

1

Đĩa Petri

[1] [2] [3]

2

Eppendorf

[1] [2] [3]

3

Micropipette

[1] [2] [3]

4

Ống nghiệm

[1] [2]

5

Tăm bông cấy

[3]

6

Dụng cụ đục lỗ

[3]

7

Mẫu đất

8

Các chủng Bacillus

[3]

9

Chủng E. coli

[3]

phát hiện vi sinh vật có khả

10

Agar

[1] [2] [3]

năng sinh protease ngoại

11

Nước cất

[1] [2] [3]

bào

12

Mơi trường TSA

[1] [2] [3]

13

Môi trường TSB

[3]

[3] Phân lập và phát hiện

14

Đệm PBS

[1] [2]

vi sinh vật có khả năng

15

Tinh bột

[1]

16

Lugol

[1]

17

Gelatin

[2]

18

TCA 50%

[2]

[1] [2]

[1] Nghiên cứu phân lập và
phát hiện vi sinh vật có khả
năng sinh amylase ngoại
bào
[2] Nghiên cứu phân lập và

sinh kháng sinh

Bảng A. 1. Danh sách các vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

2. Phương pháp nghiên cứu
2.1.

Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
Amylase ngoại bào
Phương pháp tiến hành:

Hình A. 1. Sơ đồ phương pháp phân lập chủng vi sinh vật có khả năng sinh amylase
Phát hiện: Mơi trường sẽ chuyển thành màu tím than do tinh bột hấp phụ iod. Nếu
trong mẫu đất có chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme amylase ngoại bào thì xung
quanh khuẩn lạc sẽ có vịng sáng – do tinh bột tại vị trí này đã bị thủy phân bởi amylase.
Đường kính của vịng sáng này tỷ lệ thuận với hoạt tính của enzyme.
Protease ngoại bào
Phương pháp tiến hành:

Hình A. 2. Sơ đồ phương pháp phân lập chủng vi sinh vật có khả năng sinh protease


Phát hiện: Môi trường sẽ trở nên đục do gelatin kết tủa với TCA. Nếu trong mẫu
đất có chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease ngoại bào thì xung quanh khuẩn
lạc sẽ có vịng sáng – do gelatin tại vị trí này đã bị thủy phân bởi protease. Đường kính
của vịng sáng này tỷ lệ thuận với hoạt tính của enzyme.
2.2. Phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh

Hình A. 3. Sơ đồ phương pháp phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh
Phương pháp tiến hành:
Phương pháp phân tích kết quả: Trên bề mặt đĩa thạch sẽ đục do E. coli sinh
trưởng. Nếu các chủng B1, B2, B3, B4 có khả năng sinh kháng sinh thì xung quanh lỗ cấy

sẽ có một vòng trong suốt – do kháng sinh được tiết ra sẽ ức chế sự sinh trưởng của E.
coli. Đường kính của vịng sáng này tỷ lệ thuận với hoạt tính của kháng sinh.


III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
1.1. Amylase ngoại bào

Hình A. 4. Kết quả thí nghiệm khả năng sinh amylase ngoại bào
1.2. Protease ngoại bào

Hình A. 5. Kết quả thí nghiệm khả năng sinh protease ngoại bào


2. Phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh

Hình A. 6. Kết quả thí nghiệm vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh
IV. BÀN LUẬN
1. Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
1.1. Amylase ngoại bào
Sau khi ủ 37˚C trong 24h, đĩa thạch được tráng bằng Lugol (nhỏ Lugol trực tiếp
lên khuẩn lạc), quan sát lần lượt các đĩa thạch 4, 5, 6. Kết quả cho thấy cả 3 đĩa đều khơng
có vịng sáng sau khi nhỏ thuốc thử, chứng tỏ xung quanh khuẩn lạc vẫn còn tinh bột (khi
tiếp xúc với thuốc thử thì tinh bột sẽ chuyển màu tím than do tinh bột hấp phụ iod). Nếu
xung quanh khuẩn lạc có enzyme amylase thì tinh bột sẽ bị thủy phân và khơng có khả
năng tạo màu với iod, sẽ tạo thành vịng sáng khi nhỏ thuốc thử. Ở thí nghiệm này, cả 3
đĩa đều cho thấy vi sinh vật được phân lập từ mẫu đất trên khơng có khả năng sinh
amylase ngoại bào.
1.2. Protease ngoại bào
Sau khi ủ 37˚C trong 24h, đĩa thạch được tráng bằng TCA 50% (nhỏ TCA trực tiếp

lên khuẩn lạc), quan sát lần lượt các đĩa thạch 4, 5, 6. Kết quả cho thấy cả đĩa 5, 6 đều
khơng có vịng sáng sau khi nhỏ thuốc thử, chứng tỏ xung quanh khuẩn lạc vẫn còn
gelatin (khi tiếp xúc với thuốc thử thì gelatin sẽ bị tủa làm môi trường trở nên đục). Nếu
xung quanh khuẩn lạc có enzyme protease như đĩa 4 thì gelatin sẽ bị thủy phân và không
bị tủa bởi TCA, sẽ tạo thành vịng sáng khi nhỏ thuốc thử. Ở thí nghiệm này, đĩa 4 cho
thấy có khuẩn lạc có vịng sáng nên vi sinh vật được phân lập từ mẫu đất trên có chủng có
khả năng sinh enzyme protease ngoại bào.


1.3. Bàn luận chung
Ở cả 2 thí nghiệm phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme đều
chưa phát hiện được nhiều chủng mục tiêu mong muốn.
Thứ nhất, kết quả thu được đều xuất hiện ở đĩa số 4 hoặc cả 3 đĩa đều khơng có,
các đĩa 4, 5, 6 đều có nồng độ giảm dần và được pha loãng cấp 10 từ ống 1. Nguyên nhân
có thể từ thao tác pha lỗng, sai nồng độ dẫn đến các ống 4, 5, 6 trước khi cho trải lên đĩa
thạch quá loãng, nồng độ dịch huyền phù quá thấp không đủ để sinh khuẩn lạc, dẫn đến
lượng enzyme được tạo thành không đủ để phát hiện.
Thứ hai, có thể thao tác trải vi khuẩn ảnh hưởng đến kết quả như quá trình khử
trùng que cấy quá nhanh (chưa chờ để nguội), khi trải vi khuẩn ngay sau khi hơ lửa có thể
làm giết chết lượng vi khuẩn vừa được thêm vào (100µL đã được tiếp xúc với que cấy
nóng trên đĩa thạch).
Thứ ba, có thể mẫu đất khơng có hoặc rất ít vi khuẩn sinh enzyme mục tiêu, chưa
trộn kĩ hoặc mẫu đất trước khi được thu thập đã bị phun thuốc, hóa chất hoặc dụng cụ
trong phịng thí nghiệm rửa chưa kỹ có thể dính hóa chất làm giảm khả năng sống của vi
sinh vật.
Thứ tư, có thể vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng sinh enzyme nhưng cần nuôi
cấy ở điều kiện khác, ví dụ như cần điều kiện kị khí, mơi trường bổ sung một số nguyên
tố vi lượng hoặc cần nhiều thời gian hơn để tạo thành khuẩn lạc và sinh enzyme do có
thời gian thế hệ dài hơn.
Do đó, cần chú ý thao tác pha loãng, thao tác trải đĩa và các kỹ thuật sử dụng

micropipette tránh ảnh hưởng kết quả thí nghiệm, nhất là trên nhiều dãy nồng độ. Có thể
chờ thêm vài ngày sau đó mới đọc kết quả thí nghiệm để có đủ thời gian tạo thành khuẩn
lạc và sinh enzyme (nếu có). Nếu làm lại thí nghiệm này có thể làm thêm 1 đến 2 đĩa
thạch ở nồng độ cao hơn để dễ phát hiện vi sinh vật, tuy nhiên phải luôn ưu tiên và
nghiêm túc thực hiện đúng chuẩn thao tác phịng thí nghiệm để tránh tốn thời gian và hóa
chất sử dụng.
2. Phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh
Sau khi ủ 37˚C trong 18h, quan sát và đo đường kính vòng trong suốt quanh 5 lỗ
trên đĩa thạch. Kết quả cho thấy lỗ cho dịch B1 có đường kính d = 24 mm, tương tự với


các lỗ còn lại lần lượt là B2 (d = 18 mm), B3 (d = 21 mm), B4 (d = 0 mm), lỗ chứng âm
(-) có d = 0 mm. Các lỗ B1, B2, B3 có vịng kháng khuẩn chứng tỏ có hoạt tính kháng
sinh làm


ức chế sự tăng trưởng của chủng E. coli, lỗ B4 khơng có vịng kháng khuẩn chứng tỏ
khơng có kháng sinh (hoặc có sinh kháng sinh nhưng bị chủng E. coli đề kháng), lỗ chứng
âm khơng có vịng kháng khuẩn để đảm bảo các vòng kháng khuẩn đến từ dịch lọc cho
vào lỗ mà không phải từ nguyên nhân nào khác. Dựa vào đường kính ta có thể đánh giá
hoạt tính kháng khuẩn của các dịch lọc từ các chủng Bacillus, đường kính càng lớn chứng
tỏ hoạt lực càng cao trên chủng thí nghiệm là E. coli. Dựa vào kết quả trên có thể thấy
đường kính giảm dần lần lượt là B1, B3, B2, B4 dẫn đến hoạt lực kháng sinh tương tự,
với B1 có hoạt tính kháng sinh cao nhất, B4 thấp nhất.
Bàn luận
Dựa vào hình ảnh đĩa thạch có thể thấy các lỗ được đục với đường kính rất đều,
khơng bị tróc thạch, đường kính vịng kháng sinh tương đối tốt ở các lỗ B1, B2, B4, lỗ B3
hơi gần mép đĩa mặc dù có đường kính nhỏ hơn B1 nhưng lại khơng tạo thành vịng trịn
kháng sinh hồn chỉnh (đã khắc phục bằng cách đo đường kính ở vị trí khác của vịng).
Đĩa thạch tuy dễ nhìn và đo được đường kính vịng kháng sinh tuy nhiên thao tác trải bằng

que bông vô trùng chưa tốt, ở mép đĩa đa số khơng có khuẩn lạc, có thể ảnh hướng đến
kết quả đo đường kính. Do đó, ngồi khía cạnh thẩm mỹ thì thao tác trải vi khuẩn cịn cho
thấy sự chun nghiệp và chính xác trong từng thí nghiệm.
V. KẾT LUẬN
Trong thí nghiệm phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme, các
chủng vi sinh vật được phân lập từ mẫu đất trên khơng có khả năng sinh enzyme amylase
ngoại bào, một chủng vi sinh vật được phân lập từ mẫu đất trên có khả năng sinh enzyme
protease ngoại bào (khuẩn lạc ở đĩa số 4).
Trong thí nghiệm phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh, chủng
Bacillus có khả năng sinh kháng sinh và hoạt tính kháng sinh từ cao đến thấp lần lượt là
B1, B3, B2. Chủng B4 không có khả năng sinh kháng sinh hoặc kháng sinh khơng có tác
dụng đối với chủng thí nghiệm là E. coli.
Các thí nghiệm trên đã xác định được phần nào khả năng sinh kháng sinh của vi
sinh vật cần kiểm tra, phân lập và phát hiện khả năng sinh enzyme của vi sinh vật trong
đất. Tuy nhiên để đảm bảo độ chính xác cần tiến hành lại các thí nghiệm trên nhiều lần,
trên nhiều đĩa thạch để đảm bảo tính thống kê và độ tái lặp kết quả.


VI. PHỤ LỤC: CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG
1. Giữ giống trên thạch
Phương pháp tiến hành:

Hình A. 7. Sơ đồ phương pháp giữ giống trên thạch
2. Giữ giống trong cát
Phương pháp tiến hành:

Hình A. 8. Sơ đồ phương pháp giữ giống trong cát
Do đặc tính có khả năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt và nếu gặp điều kiện
thuận lợi sẽ nảy mầm thành dạng dinh dưỡng, phương pháp này thường chỉ áp dụng cho
việc bảo quản bào tử.

3. Đông lạnh và đông khô
Đông lạnh: làm lạnh ống môi trường chứa vi khuẩn đã phát triển từ từ đến độ lạnh
sâu từ 20 đến -30oC, tốt nhất là -80oC với tốc độ làm lạnh thích hợp kết hợp với các tác
nhân bảo vệ chống đơng thích hợp như glycerin (10 – 15%), sữa (5%), lòng trắng trứng,
… Thời gian bảo quản khác nhau tùy thuộc vào độ lạnh như: thời gian là 6 tháng nếu ở
nhiệt độ -20oC hoặc 10 năm nếu nhiệt độ còn -80oC. Để hạn chế làm tan băng nhiều lần thì


có thể dùng que cấy cứng cạo lấy một ít vi sinh vật đã được đông đá rồi cấy lên mơi
trường thích hợp, phần cịn lại thì được đưa về tủ đơng.
Đơng khơ: q trình làm khơ ở áp suất (>1mbar) và nhiệt độ thấp (dưới nhiệt độ
đông đặc của mẫu). Với điều kiện này, nước đá trong mẫu sẽ xảy ra hiện tượng thăng hoa.
Việc này sẽ ít ảnh hưởng đến chất lượng sinh học của mẫu do nước sẽ bị lấy đi từ dạng
rắn sang dạng hơi, nồng độ chất tan trong mẫu sẽ không tăng dần lên. Đồng thời khi mẫu
khơ sẽ có cấu trúc xốp và dễ dàng trở về trạng thái ban đầu khi cho nước vào. Có thể bảo
quản mẫu ở nhiệt độ phịng trong thời gian dài sau khi đã được đông khô.
Tuy chi phí sử dụng cho phương pháp này khá đắt tiền nhưng cho phép lưu trữ và
bảo quản giống tốt, khả năng hồi phục cao cùng với việc ít ảnh hưởng đến hoạt tính của
chủng.


B. TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINATE
I. TỔNG QUAN – MỤC ĐÍCH
1. Tổng quan nghiên cứu
Ngày nay, enzyme amylase được ứng dụng trong các ngành công nghiệp sản xuất
bao gồm thực phẩm, y dược, dệt may... Enzyme này có thể được tinh chế từ nhiều nguồn
khác nhau như thực vật, động vật và chủ yếu ở vi sinh vật. Tuy nhiên, enzyme cần được
trải qua các bước tinh chế từ enzyme thô để được sử dụng trong y dược như sản xuất
glucose làm dịch tiêm truyền, sản xuất tinh bột tan làm tá dược, hỗ trợ chuyển hóa tinh
bột thành dextrin giúp kích thích tiêu hóa, ngồi ra cịn kết hợp với coenzyme điều chế

thuốc trị bệnh.
Quy trình tinh chế enzyme amylase bằng alginate trong bài 2 gồm:
- Tinh chế enzyme thô từ dịch khoai lang.
- Sử dụng máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến đo độ hấp phụ để xác định hàm
lượng protein trong mẫu enzyme thô và enzyme tinh.
- Xác định hoạt tính enzyme thơ và enzyme tinh bằng phương pháp Heinkel.
2. Mục đích nghiên cứu
- Trình bày và hiểu được q trình tinh chế enzyme thơ từ dịch khoai lang.
- Biết cách tính các thơng số của q trình tinh chế enzyme từ đó xác định hàm
lượng protein bằng OD280 nm và hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel.


II. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
1. Vật liệu nghiên cứu
STT

Vật liệu sử dụng

Nghiên cứu sử dụng

Ghi chú

1

Khoai lang

[1]

2

Eppendorf

[3] [4]

3

Micropipette

[2] [3] [4]

4

Ống nghiệm

[4]

5

Ống Falcon

[1] [2]

6

Đệm phosphate

7

Sodium alginate 2%

[2]

8

CaCl2 0,7M

[2]

9

Tinh bột 1%

[4]

10

Acid sulfosalicylic 20%

[4]

[4] Xác định hoạt tính

11

Thuốc thử Iode

[4]

enzyme bằng phương

12

Nước cất

[4]

pháp Heinkel

13

Glucose 2%

[2]

[1] Thu enzyme thô
[2] Tinh chế enzyme thô

[1] [3] [4]
[3]

Xác định hàm lượng

protein bằng OD280

Bảng B. 1. Danh sách các vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Tinh chế enzyme từ dịch khoai lang
Thu enzyme thơ
Phương pháp tiến hành:

Hình B. 1. Sơ đồ phương pháp thu enzyme thô


Tinh chế enzyme thơ
Phương pháp tiến hành:

Hình B. 2. Sơ đồ phương pháp tinh chế enzyme thô

Xác định hàm lượng protein bằng OD280
Phương pháp tiến hành:

Hình B. 3. Sơ đồ phương pháp xác định hàm lượng protein bằng OD280
Đo độ hấp thu ở bước sóng 280 nm (A < 2.5), nếu (A > 2.5) pha loãng thêm 10 lần.
Phương pháp phân tích kết quả:
Tính tổng lượng protein trong mẫu: Lượng protein A280nm = OD280 x V (mL) với
enzyme thơ có V = 10 mL, enzyme tinh chế V = V tinh chế. Xác định hàm lượng enzyme
amylase dựa trên BSA chuẩn (Bovine serum albumin) với OD = 0.67 ở nồng độ 1
mg/mL.


Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel
Nguyên tắc:
Xác định hoạt độ của amylase bằng phương pháp Heinkel thông qua lượng tinh bột
bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng
với dung dịch Iode. Đơn vị hoạt độ là lượng tinh bột mà enzyme có khả năng phân giải
trong một đơn vị thời gian.
Phương pháp tiến hành:
Pha loãng 100 lần đối với enzyme thơ, pha lỗng 10 lần đối với enzyme tinh chế
với đệm phosphate. Xác định hoạt tính enzyme thơ và enzyme tinh chế, mỗi mẫu thực
hiện trên 2 eppendorf, ống thử và ống chứng.

Ống thử

Ống chứng

0.1

0.1

A. Sulfosalicylic 20%

0

0.5

Đệm phosphate (mL)

0.3

0.3

Enzyme (mL)

0.1

0.1

0.5

0

Tinh bột 1% (mL)

Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
A. Sulfosalicylic 20%

Hút 0.1 mL từ các ống sang eppendorf mới
Thuốc thử Iode

0.9

0.9

Đo OD 560 nm
Bảng B. 2. Phương pháp pha dung dịch của ống thử và ống chứng
Cách tính kết quả:
Tính hiệu số đọc được trên máy giữa mẫu chứng và mẫu thử:
∆ODthô = ODc.thô – ODt.thơ
∆ODtinh = ODc.tinh – ODt.tinh
Từ ¥OD đưa vào đồ thị chuẩn tính được số mg tinh bột bị thuỷ phân tương ứng, từ
đó tính hoạt tính của enzyme (HTE).
Số mol tinh bột bị thủy phân trong mẫu:

Trong đó:
n: số mol tinh bột bị thủy phân trong mẫu