0158 nghiên cứu ứng dụng các phương pháp sắc ký phân tích thành phần hóa học tâm sen (nelumbo nucifera gaertn nelumbonaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

PHAN QUỐC DUY

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC TÂM SEN
(Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
ThS. ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

Cần Thơ – 2015


i

1LỜI CẢM ƠN
Xin dành tặng quyển luận văn này cho bà nội, người đã luôn thương yêu, động viên
tôi và là nguồn động lực to lớn nhất giúp tơi hồn thành cơng trình này.
Đầu tiên và trân trọng nhất, xin dành lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
ThS. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, người Thầy đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt
những kiến thức và kỹ năng quý báu với tất cả sự nhiệt thành cho tôi trong quá trình
thực hiện.
Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quý thầy cô trong Liên bộ môn Hố
phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất và Liên bộ môn Dược liệu – Thực vật
dược – Dược cổ truyền đã hết lòng giúp đỡ, tạo những điều kiện tốt nhất cho tơi

hồn thành tốt cơng việc. Xin cám ơn tất cả quý thầy cô trường Đại học Y Dược
Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức hữu ích, giúp tơi vượt qua khó khăn hồn
thành tốt cơng việc.
Cũng xin gửi lời cảm ơn đến anh Đức – công ty VIACIMEX, Cần Thơ và anh
Hiếu – phòng kiểm nghiệm, công ty Dược Hậu Giang, Cần Thơ đã cung cấp
những sự hỗ trợ nhiệt tình nhất cho tơi trong q trình làm việc.
Con xin cám ơn gia đình và người thân, đặc biệt là ba mẹ và cô ba đã ln ở bên
con, động viên và chăm sóc con trong suốt thời gian làm việc.
Xin cám ơn các anh chị làm đề tài Kiểm nghiệm – Dược liệu K35 đã chỉ bảo
những kinh nghiệm quý báu, cám ơn các bạn làm đề tài Kiểm nghiệm – Dược liệu
– Hoá dược K36 đã ở bên chia sẻ những vui buồn, giúp đỡ và động viên tôi trong
công việc.


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên Phan Quốc Duy, xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số
liệu và kết quả được nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng
trong bất kỳ tài liệu nào khác.

Thành phố Cần Thơ – tháng 6/2015
Sinh viên

Phan Quốc Duy


iii

2MỤC LỤC

Nội dung

Trang

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT .......................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................vi
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ...................................................................vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY SEN ..............................................................................3
1.2. HÓA HỌC VỀ TÂM SEN ...................................................................................5
1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ỨNG DỤNG TRONG
PHÂN LẬP HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN ................................................................10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 17
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................17
2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ...............................................................................17
2.3. HĨA CHẤT, DUNG MƠI, TRANG THIẾT BỊ ...............................................17
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................18
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 26
3.1. PHÂN LẬP FLAVONOID TÂM SEN .............................................................26
3.2. PHÂN LẬP ALKALOID TÂM SEN ................................................................31
3.2.2. Thu phân đoạn akaloid từ cao TA bằng ..........................................................32
3.3. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA EN-11 VÀ TF-6 .....................................34
3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA EN-11 VÀ TF-6 ..............................................34
Chương 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 39
4.1. THĂM DÒ ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT CAO TOÀN PHẦN FLAVONOID
VÀ ALKALOID TỪ TÂM SEN THÍCH HỢP NHẤT ............................................39

iv

4.2. THĂM DỊ HỆ DUNG MƠI KHAI TRIỂN VLC CHO CAO ALKALOID pH
10 VÀ CAO TOÀN PHẦN FLAVONOID TÂM SEN ............................................42
4.3. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ THÍCH HỢP PHÂN LẬP EN-11 VÀ
TF-6 BẰNG SẮC KÝ LỎNG BÁN ĐIỀU CHẾ ......................................................45
4.4. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CÁC CHẤT THU ĐƯỢC ...............................48
4.5. BIỆN GIẢI CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC ....................49
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 53
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 1
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 9

3


v

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Ý nghĩa

Nguyên gốc

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

Bz

Benzene
Capillary electrophoresis,
Capillary zone electrophoresis
Chloroform

Benzen
Điện di mao quản, điện di mao
quản vùng
Chloroform
Dược điển Việt Nam

EtOAc

Dược điển Việt Nam
Electrospray interface/mass
spectrometry
Ethylacetate

H2O

Nước

Nước

HCOOH

Acid formic

IR

Acid formic
High – performance liquid
chromatography
Infrared – Red

MeOH

Methanol

Methanol

NMR

Nuclear magnetic resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

NH4OH

Amonium hydroxyd

Amoni hydroxyd

PDA

Photo diode array

Đầu dò dãy diod quang

QTOF

Quadrupole Time of Flight

Tứ cực thời gian bay

Rf

Retardation factor

Hệ số lưu trữ

SKĐ

Sắc ký đồ

Sắc ký đồ

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng

TEA

Triethylamin

Triethylamin

TT

Thuốc thử

Thuốc thử

UV – VIS

Ultraviolet – Visible

Tử ngoại khả kiến

VLC

Vacumn liquid chromatography Sắc ký lỏng hỗ trợ chân không

VS

Vanillin - sulfuric

CE, CZE
Cf
DĐVN
ESI/MS

HPLC

Giao diện phun ion/khối phổ
Ethylacetat

Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Hồng ngoại

Vanillin – sulfuric


vi

4DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 1.1. Cấu trúc của các alkaloid tâm Sen nhân bisbenzylisoquinolin .................. 5
Bảng 1.2. Cấu trúc các alkaloid tâm Sen nhân benzylisoquinolin ............................. 5
Bảng 1.3. Cấu trúc hóa học alkaloid tâm Sen khung aporphin, proaporphin ............. 6
Bảng 1.4. Tổng hợp các nghiên cứu về chiết xuất phân lập tâm Sen ......................... 8
Bảng 1.5. Các nghiên cứu ngoài nước về flavonoid tâm Sen ..................................... 9
Bảng 1.6. Một số loại gel dextran Sephadex G và tính chất của gel ........................ 12
Bảng 1.7. So sánh sắc ký lỏng phân tích, bán điều chế và điều chế ......................... 13
Bảng 1.8. Tương quan khối lượng mẫu – đường kính cột của HPLC bán điều chế 14
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát điều kiện chiết xuất flavonoid toàn phần tâm Sen ....... 26
Bảng 3.2. Các phân đoạn flavonoid sau cột VLC cao toàn phần flavonoid ............. 27
Bảng 3.3. Các phân đoạn flavonoid F3 sau Sephadex.............................................. 28
Bảng 3.4. Các phân đoạn flavonoid F4 sau Sephadex.............................................. 29
Bảng 3.5. Kết quả thu hứng TF-6 từ phân đoạn F3-5............................................... 30

Bảng 3.6. Các phân đoạn alkaloid sau khi chạy cột VLC cao TA ........................... 32
Bảng 3.7. Kết quả thu hứng alkaloid từ phân đoạn A3 tinh chế .............................. 33
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát dung môi khai triển VLC cao TA tâm Sen................... 43
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát dung môi khai triển VLC cao TF ................................. 44
Bảng 4.3. Các pha động thăm dò phân lập EN-11 từ phân đoạn A3 tinh chế .......... 46
Bảng 4.4. Các pha động thăm dò phân lập TF-6 từ phân đoạn F3-5 ........................ 47
Bảng 4.5. Dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR, COSY, HMBC của EN-11. .......................... 50
Bảng 4.6. Dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR, COSY, HMBC của TF-6. ............................. 52

5


vii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH
Hình

Trang

Hình 1.1. Sen hồng và Sen trắng ................................................................................ 3
Hình 1.2. Cấu trúc của lotusin và demethylcoclaurin ................................................ 6
Hình 1.3. Cấu trúc của pronuciferine và liriodenine .................................................. 6
Hình 1.4. Cấu trúc của methylcorypallin ................................................................... 7
Hình 1.5. Cấu trúc của cinnamoyl-4-(2-aminoethyl)-phenol ..................................... 7
Hình 1.6. Cấu trúc của Sephadex LH-20.................................................................. 11
Hình 1.7. Minh họa cơ chế tách trong Sephadex LH-20 .......................................... 13
Hình 2.1. Quy trình chiết cao toàn phần flavonoid bằng ngấm kiệt với cồn acid .... 18
Hình 2.2. Quy trình chiết cao tồn phần flavonoid bằng chiết hỗ trợ siêu âm......... 19
Hình 2.3. Quy trình chiết xuất dịch chiết nước acid từ nguyên liệu tâm Sen .......... 21
Hình 2.4. Quy trình chiết xuất cao alkaloid pH 10 tâm Sen (cao TA) ..................... 22

Hình 2.5. Quy trình lắc phân bố lỏng – lỏng với pH thay đổi tinh chế A3 .............. 23
Hình 3.1. Quy trình chiết xuất cao tồn phần flavonoid (cao TF) ........................... 27
Hình 3.2. SKLM các phân đoạn VLC cao TF với hệ EtOAC – MeOH – H2O –
HCOOH (100:17:13:1).............................................................................................. 28
Hình 3.3. SKLM các phân đoạn sau sắc ký rây phân tử của phân đoạn F3 với hệ
EtOAC – MeOH – H2O – HCOOH (100:17:13:1) ................................................... 29
Hình 3.4. SKLM các phân đoạn sau sắc ký rây phân tử của phân đoạn F4 với hệ
EtOAC – MeOH – H2O – HCOOH (100:17:13:1) ................................................... 30
Hình 3.5. SKĐ 6 lần thu hứng TF-6 từ phân đoạn F3-5 .......................................... 31
Hình 3.6. SKLM cao TA với hệ Cf – MeOH – NH4OH (90:10:5) .......................... 31
Hình 3.7. SKLM VLC cao TA với hệ Cf – MeOH – NH4OH (90:10:5) ................. 32
Hình 3.8. SKĐ 6 lần thu hứng EN-11 từ phân đoạn A3 tinh chế............................. 33
Hình 3.9. Phổ UV-Vis của EN-11 trong MeOH ...................................................... 35
Hình 3.10. Phổ MS của EN-11 ................................................................................. 35
Hình 3.11. Phổ 1H – NMR của EN-11 ..................................................................... 36


viii

Hình 3.12. Phổ 13C-NMR của EN-11 ....................................................................... 36
Hình 3.13. Phổ UV-Vis của TF-6 trong MeOH ....................................................... 37
Hình 3.14. Phổ MS của TF-6.................................................................................... 37
Hình 3.15. Phổ 1H – NMR của TF-6 ........................................................................ 38
Hình 3.16. Phổ 13C – NMR của TF-6 ....................................................................... 38
Hình 4.1. SKLM khảo sát pH thích hợp chiết xuất flavonoid từ dịch nước acid với
hệ dung môi EtOAc – MeOH – H2O – HCOOH (100:17:13:1) ............................... 40
Hình 4.2. SKLM các hệ S3, S4, S6, S7 với thuốc thử Dragendorff ......................... 43
Hình 4.3. Overlay SKĐ khảo sát điều kiện sắc ký phù hợp nhất phân lập EN-11... 46
Hình 4.4. Overlay SKĐ khảo sát điều kiện sắc ký phù hợp nhất phân lập TF-6 từ
phân đoạn F3-5 .......................................................................................................... 48

Hình 4.5. Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-11 (apoglaziovin) ............ 51
Hình 4.6. Cấu trúc hóa học của TF-6 (calycosin) .................................................... 52


1

0ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong kho tàng thực vật và cây thuốc Việt Nam, cây Sen (Nelumbo nucifera
Gaertn., Nelumbonaceae) đã gắn liền với cuộc sống tâm linh của người Việt, tượng
trưng cho sự tinh khiết và trường thọ. Cây Sen mọc ở ao hồ, có ở khắp mọi miền đất
nước, đặc biệt là ở Đồng Tháp Mười, nơi được xem là xứ sở của những cánh đồng
Sen. Sen là một trong số ít các dược thảo mà tất cả các bộ phận đều là những vị
thuốc q, có giá trị sinh học cao. Danh y Hải Thượng Lãn Ông đã viết: “Cây mọc
từ dưới bùn đen mà không ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm trong lành của trời đất
nên củ, lá, hoa, tua, vỏ quả, ruột đều là thuốc hay”.
Với sự tiến bộ của y học và khoa học kỹ thuật, thêm nhiều tác dụng dược lý
quý giá của cây Sen đã được tìm ra như giảm co thắt cơ trơn [1], cầm máu [1], [12],
kháng HIV [58], kháng serotonin [50], điều trị cao huyết áp [30], chống loạn nhịp
tim [59], tiểu đường [35], hạ cholesterol [56], chống oxy hoá [14], [31], [44], [55],
chống ung thư [42]… Trong đó, các alakaloid và flavonoid là những thành phần
chính đóng góp vào các tác dụng sinh học đó.
Ngày nay với sự tiến bộ của khoa học phân tích, trên thế giới đã có nhiều cơng
trình nghiên cứu về chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc, tiêu chuẩn hóa một số
thành phần alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong cây Sen, nhằm tìm ra
hướng điều trị mới hiệu quả, an tồn cũng như kiểm soát chất lượng nguồn nguyên
liệu và các chế phẩm từ Sen.
Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay việc sử dụng tâm Sen làm thuốc trong
đông y hay các chế phẩm bào chế từ tâm Sen như thuốc viên uống, cao thuốc, các
loại trà… hầu như là ở dạng cao toàn phần, dịch chiết toàn phần. Việc xác định
thành phần alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học với hàm lượng là bao nhiêu thì

vẫn cịn đang bỏ ngỏ do việc nghiên cứu các thành phần hóa học, tiêu chuẩn hóa các
alkaloid, flavonoid này bằng kỹ thuật sắc ký hiện đại trên tâm Sen Việt Nam dùng
làm chất chuẩn đối chiếu để khảo sát tác dụng sinh học cũng như việc định tính,
định lượng chưa được thực hiện.


2

Do đó nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và tiêu chuẩn hóa thành phần
alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong tâm Sen Việt Nam là một yêu cầu rất
cần thiết nhằm góp phần bổ sung dữ liệu thành phần hóa học, nghiên cứu tác dụng
sinh học, đồng thời nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của một dược liệu quí, được sử
dụng rộng rãi trong nước, ứng dụng trong đảm bảo chất lượng dược liệu và các chế
phẩm từ tâm Sen mang lại hiệu quả điều trị cao và an tồn trong cơng tác chăm sóc
sức khỏe nhân dân.
Chính vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài:
"Nghiên cứu ứng dụng các phương pháp sắc ký phân tích thành phần
hóa học tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn, Nelumbonaceae)".
Với mục tiêu:

- Chiết xuất, phân lập thành phần alkaloid, flavonoid có trong tâm sen Việt Nam.
- Xác định độ tinh khiết các chất phân lập bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao với đầu dò dãy diod quang (HPLC/PDA).

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được bằng phương pháp phổ học: NMR, MS,
UV-VIS.
Ý nghĩa:

- Bổ sung vào cơ sở dữ liệu thành phần hoá học của cây Sen Việt Nam.
- Cơ sở cho cơng tác tiêu chuẩn hố chất lượng tâm Sen, góp phần nâng cao chất

lượng các sản phẩm từ tâm Sen trên thị trường.

- Tạo tiền đề cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn về định lượng, thử tác dụng sinh
học của tâm Sen sau này.


3

1Chương 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY SEN
1.1.1. Tên gọi và vị trí phân loại [1], [12]

- Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae.
- Tên đồng nghĩa: Nelumbium nelumbo (L.) Druce.
- Tên khác: Liên, Quỳ, Ngậu (Tày), Bó bua (Thái), Lìn ngó (Dao).
- Tên nước ngồi: Sacred lotus, Chinese water-lily, Indian lotus, Egypian bean.
- Vị trí phân loại
Giới: Plantae (Thực vật)
Ngành: Magnoliophyta (Ngọc Lan)
Lớp: Magnoliopsida (Ngọc Lan)
Phân lớp: Nelumbonidae (Sen)
Bộ: Nelumbonales (Sen)
Họ: Nelumbonaceae (Sen)
Chi: Nelumbo
Loài: Nelumbo nucifera Gaertn
Chi Nelumbo có 2 lồi là Nelumbo nucifera Gaertn. – Sen hồng và Nelumbo lutea
Willd. – Sen trắng. Các loài trong chi Nelumbo có hoa rất giống với lồi hoa súng (họ
Nymphaeaceae), nhưng lá 2 lồi có đặc điểm riêng. Lá súng có vết khía hình chữ V đặc
trưng từ mép lá vào tâm trong khi lá Sen có hình khiên hay trịn.

Nelumbo nucifera Gaertn.

Nelumbo lutea Willd.

Hình 1.1. Sen hồng và Sen trắng


4

1.1.2. Đặc điểm thực vật [1], [12], [29]
Sen là loài cây thân thảo, mọc ở dưới nước. Thân rễ hình trụ mọc bị dài trong bùn,
thường gọi là ngó sen hay ngẫu tiết. Lá sen mọc lên khỏi mặt nước, mép lá uốn
lượn. Cuống lá dài 1-1,5m, màu xanh, hình trụ, nhiều gai nhỏ, đính giữa phiến lá.
Phiến lá hình khiên, to, đường kính 60 - 70 cm, có gân tỏa tròn. Hoa đơn độc, to,
màu trắng hay đỏ hồng, đều, lưỡng tính, có mùi thơm. Quả bế màu xanh, hình bầu
dục, chứa một hạt, khơng nội nhũ. Hạt màu trắng, dài 1,3-1,5 cm, phần ngồi mỏng,
cứng, màu lục tía, phần giữa mềm chứa tinh bột màu trắng ngà, bên trong có tâm
Sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá mầm.
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến và công dụng [1], [12], [29], [45]

- Lá sen (Folium Nelumbinis - liên diệp): lá bánh tẻ, thu hái vào mùa thu, bỏ
cuống, phơi khô. Lá Sen khi tươi dùng để làm thuốc giải thử hay chữa cảm nắng.
Lá Sen cịn có tác dụng cầm máu: chảy máu cam, trĩ ra máu, xuất huyết dưới da,
tử cung xuất huyết... Khi dùng cần sao cháy, sắc uống. Ngồi ra cịn tác dụng an
thần, chống tim loạn nhịp, có thể phối hợp với bình vơi, lá vơng.

- Quả (Fructus Nelumbinis - liên thạch): thu hái lúc quả chín, hạt cịn màng đỏ bên
ngoài (liên nhục). Hạt Sen, trong thành phần chứa nhiều tinh bột, nhiều acid amin
không thay thế: treolin, methionin, phenylalanin, leucin, isoleusin, các acid béo:

acid miristic, palmitic, oleic, linoleic, linolenic... có tác dụng bổ tỳ, kích thích
tiêu hóa, làm cho ăn ngon cơm, hoặc bổ thận trong trường hợp thận kém gây đái
dầm ở trẻ em, di tinh ở nam giới. Ngồi ra, hạt Sen cịn dùng trong trường hợp
trẻ em bị còi xương, suy dinh dưỡng, chậm lớn.

- Tâm sen (Plumula Nelumbinis - liên tâm): chồi mầm nằm giữa hạt sen, có vị rất
đắng, có tác dụng an thần, gây ngủ và hạ huyết áp. Để tăng tác dụng, có thể phối
hợp với một số vị thuốc an thần khác, như lá vơng, bình vơi, bá tử nhân...

- Gương Sen (Receptaculum Nelumbinis - liên phòng): đã lấy quả đem phơi khô.
Gương Sen sau khi thu hái, phơi khô, khi dùng thì thái nhỏ, sao cháy, sắc uống
để chữa các trường hợp chảy máu, như chảy máu cam, trĩ ra máu...


5

- Tua Sen (Stamen Nelumbinis - liên tu): chỉ nhị của hoa, bỏ đầu, phơi khơ, sao
đen, có tác dụng cầm máu, nhất là đường niệu, dùng trị di tinh nam giới.

- Ngó Sen (Nodus Nelumbinis rhizomatis): thu hái quanh năm, làm thuốc cầm
máu, chữa đại tiện ra máu, nôn ra máu, chảy máu cam, tử cung xuất huyết.
Ngày nay với nhiều nghiên cứu hiện đại, người ta đã phát hiện ra rất nhiều tác dụng
sinh học có giá trị của Sen như kháng viêm [37], cải thiện thiếu máu cục bộ gan
[27], cải thiện trí nhớ [38], giảm xơ hóa phổi [62], chống béo phì [39], kháng sốt rét
và kháng nấm [51].
1.2. HÓA HỌC VỀ TÂM SEN
1.2.1. Thành phần hóa học của tâm Sen
1.2.1.1. Alkaloid [1], [14], [22]
Hàm lượng alkaloid tồn phần trong tâm Sen khoảng 0,85-0,96%. Alkaloid
trong

tâm

Sen

thuộc

4

khung

alkaloid

chính:

bisbenzylisoquinolin,

benzylisoquinolin, aporphin và tetrahydroisoquinolin.
Khung bisbenzylisoquinolin
Bảng 1.1. Cấu trúc của các alkaloid tâm Sen nhân bisbenzylisoquinolin
R

R1

R2

Neferin

CH3

H

CH3

Liensinin

CH3

H

H

H

H

CH3

Isoliensinin

Khung benzyisoquinolin
Bảng 1.2. Cấu trúc các alkaloid tâm Sen nhân benzylisoquinolin
R1

R2

R3

Armepavine

CH3

CH3

CH3

N-methylcoclaurine

CH3

H

CH3

H

CH3

CH3

N-methylisococlaurine


6

Lotusin

Demethylcoclaurin

Hình 1.2. Cấu trúc của lotusin và demethylcoclaurin

Bảng 1.3. Cấu trúc hóa học alkaloid tâm Sen khung aporphin, proaporphin
R1

R2

R3

Nuciferine

CH3

CH3

CH3

N-nor-nuciferine

CH3

CH3

H

O-nor-nuciferine

H

CH3

CH3

Roemerine

-CH2-

CH3

Anonaine

-CH2-

H

Dehydronuciferine CH3

CH3 CH3

Dehydroroemerine

-CH2-

CH3

Dehydroanonaine

-CH2-

H

Pronuciferine

Liriodenine

Hình 1.3. Cấu trúc của pronuciferine và liriodenine
Với khung tetrahydroisoquinolin, có một alkaloid đã biết là methylcorypallin.
Ngồi ra trong tâm Sen cịn có một proto alkaloid kiểu phenylalkylamin là
cinnamoyl-4-(2-aminoethyl)-phenol.


7

Hình 1.4. Cấu trúc của methylcorypallin

Hình 1.5. Cấu trúc của cinnamoyl-4-(2-aminoethyl)-phenol
Tính chất lý hóa của một số alkaloid chính trong tâm Sen

- Neferin: C38 H44N2O6. M = 624,77. Bột kết tinh màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy
60-61oC. Góc quay cực: -100o (c=0,24, MeOH). Dạng base tan tốt trong dung
môi hữu cơ kém phân cực, kém tan trong nước. max: 282nm (methanol).

- Liensinin: C37H42N2O6. M = 610,73918. Dạng rắn màu trắng vơ định hình. Nhiệt
độ nóng chảy 95-99oC. Góc quay cực: +15,85o (c=0,883, acetone). Liensinin
dạng base tan tốt trong dung môi hữu cơ kém phân cực, kém tan trong nước.
max: 278nm (methanol).

- Isoliensinin: C37H42N2O6. M = 610,73918. Dịch dầu không màu hoặc tinh thể
vàng nhạt. Nhiệt độ nóng chảy 69-71oC. Góc quay cực: +50,68o (c=0,302,
aceton). Isoliensinin dạng base tan tốt trong dung môi hữu cơ kém phân cực, kém
tan trong nước. max: 284,2 nm (methanol).
1.2.1.2. Flavonoid [1]

Flavonol chiếm phần lớn thành phần flavonoid tâm sen, bao gồm: kaempferol,
isoquercitrin, hyperosid, rutin, kaempferol-3-O-robinobiosid, isorhamnetin-3-Orutinose. Ngồi ra cịn có flavanol là catechin.
1.2.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học tâm Sen
Cuối thế kỷ XIX, Greshoffetal đã cơng bố về sự có mặt của alkaloid trong tâm Sen.
Sau đó là nhiều nghiên cứu về tâm Sen đã được công bố trên thế giới.


8

Bảng 1.4. Tổng hợp các nghiên cứu về chiết xuất phân lập tâm Sen
TT
1

Năm
1962

2

1964

3

1966

4

1970

5

1970

6

1991

7

2000

8

2003

9

2004

10

2004

11

2004

12

2005

13

2005

14

2005

Jian Yang.[25].

15

2007

Zhang Ji –

Tác giả
Chao Tse –
Yuan và cộng sự
[16].
Masao Tomita,
và cộng sự [36].
Hiroshi
Furukawa [21].
Tsang – Hsiung
và Chi Minh –
Chen [48].
Hideo
Kohiyama, và
cộng sự [20].

Wang J, Hu
X, Yin W, Cai H
[52].
Wang Jialing
[53].

Jian Yang,
Kailan Zhou
[24].
Pan Yuanjiang
và cộng sự [41].
Liu Shao và
cộng sự [32].
Wu shihua và
cộng sự [54].
Pan Yang, Gang
Ming Yang, Bao
Chang Cai [40].
Hiroshi,
Tanahashi,
Yamada,
Sugimoto [23].

Nghiên cứu hóa học về Tâm sen
Phân lập liensinine, kết tinh dưới dạng muối
liensinine perchlorate từ phân đoạn alkaloid
phenolic.
Phân lập isoliensinine bằng cách kết tinh dưới
dạng muối isoliensinine HCl.
Xác định cấu trúc liensinine bẳng phổ cộng

hưởng từ hạt nhân (NMR), phân lập
nuciferine, pronuciferine và lotusine.
Phân lập methylcorypalline và neferine từ
phân đoạn non – phenolic.
Phân lập lotusine và demethylcoclaurine bằng
sắc ký trao đổi ion.
Phân lập và xác định cấu trúc lotusine,
nuciferine, neferine, pronuciferine, liensinine,
và isoliensinine.
Phân lập liensinine và isoliensinine (kết tinh
dưới dạng liensinine perchlorate và
isoliensinine hydrochloric lần lượt trong
methanol và benzen – ethylacetate (95:5)).
Phân lập neferine, isoliensinine và xác định
cấu trúc bằng NMR.
Phân lập neferine, liensinine, Isoliensinine
bằng sắc ký ngược dòng liên tục.
Phân lập và tiêu chuẩn hóa neferine với độ
tinh khiết 98,85%.
Phân lập liensinin, isoliensinin và neferin bằng
sắc ký ngược dòng bán điều chế.
Phân lập và xác định cấu trúc của neferine,
liensinine, isoliensinine bằng NMR (1HNMR,
13
CNMR, 2D – NMR).
Xây dựng quy trình chiết xuất và phân lập
neferine, liensinine và isoliensinine bằng sắc
ký cột cổ điển với dung môi rửa giải là
chloroform – methanol, nồng độ methanol
tăng dần từ 1% đến 20%.

Phân lập và xác định cấu trúc lotusin trong
tâm Sen bằng phổ NMR
Phân lập ra neferine, liensinine, isoliensinine


9

16

2007

17

2008

18

2010

19

2011

20

2012

21

2012

22

2013

23

2013

bằng nhựa trao đổi ion trên 3 loại nhựa (AKSW, AB-8 và H21). Định lượng bằng HPLC
Phân lập, xác định và định lượng nhanh
liensinin, isoliensinin và neferin trong tâm Sen
bằng HPLC/PDA-MS
Lu Yabin và
Phân lập phenolic alkaloids trong tâm Sen
cộng sự [34].
bằng chiết vi sóng dung mơi ion hố.
Quingping
Phân lập các alkaloid tâm Sen bằng kỹ thuật
Duanmu và
sắc ký ngược dòng bán điều chế rửa giải theo
cộng sự [43].
pH.
Atsuko Itoh và
Phân lập 3 alkaloid mới thuộc khung
cộng sự [14].
bisbenzylisoquinolin:
nelumboferin,
nelumborin A và B cùng 4 chất đã biết:
neferin, liensinin, isoliensinin và acid anisic.

Yang Guagming Tách lotusin, liensinin, isoliensinin và neferin
và cộng sự [57]. trong tâm sen bằng kỹ thuật điện di mao quản
vùng.
Liu Xiao và
Định tính alkaloid tâm sen bằng sắc ký lỏng
cộng sự [33].
pha đảo.
Katsumi và cộng Phân lập neferin, liensinin và isoliensinin từ
sự [28].
tâm sen, tổng hợp nelumboferin và tạo Omethylnefrin.
Zongtao Lin và Phân lập một số alkaloid tâm Sen bằng kỹ
cộng sự [63].
thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng với đầu dò
DAD ghép ESI/QTOF/MS
Xiang và cộng
sự [60].
Chen Yi và cộng
sự [18].

Bảng 1.5. Các nghiên cứu ngoài nước về flavonoid tâm Sen
TT Năm
Tác giả
1 2007 CH Geng, Wang
WY, Lin M, Ye
JN [17].
2 2011 Sha Chen và
cộng sự [46].

Kết quả
Định lượng được catechin, hyperin và

kaempferol trong tâm sen bằng phương pháp
điện di mao quản.
Phân lập và phát hiện 20 flavonoid thuộc 6
nhóm trong 12 loại mơ khác nhau của sen bằng
phương pháp HPLC-DAD-ESI-MS.

Các nghiên cứu trên sử dụng rất nhiều kỹ thuật khác nhau từ cổ điển như sắc ký cột
đến hiện đại như điện di mao quản. Tuy nhiên, rất ít nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng
điều chế trong phân lập các thành phần hóa học từ tâm Sen. Ngoài ra, các nghiên
cứu trong và ngoài nước về thành phần flavonoid tâm Sen còn rất hạn chế.


10

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ỨNG DỤNG TRONG
PHÂN LẬP HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
1.3.1. Sắc ký cột pha thuận [2], [6]
Khi muốn phân lập nhiều hợp chất tinh khiết từ hỗn hợp nhiều thành phần, kỹ
thuật sắc ký cột cổ điển pha thuận (pha tĩnh phân cực mạnh) thường được sử dụng.
1.3.1.1. Nguyên tắc
Một mẫu thử được nạp lên đầu cột chứa chất hấp phụ (silica gel, nhơm oxyd)
đóng vai trị pha tĩnh. Một dung mơi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ
làm di chuyển các cấu từ của mẫu thử. Do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau
nên ái lực của chúng đối với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng sẽ bị dung môi
giải hấp và bị đẩy đi với các vận tốc khác nhau, tạo thành các băng có vị trí khác
nhau, ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau.
1.3.1.2. Một số loại chất hấp phụ thường sử dụng trong sắc ký cột cổ điển

- Silica gel: là loại pha tĩnh phổ biến nhất, là polymer 3 chiều của những đơn vị tứ
diện oxyd silicon SiO2, H2O và trên bề mặt có các lỗ rỗng. Hạt silica gel sử dụng

cho sắc ký cột cổ điển thường có đường kính 40-200µm, lỗ rỗng có đường kính
khoảng 4-30µm.

- Alumina (nhôm oxyd): là oxyd aluminium Al2O3 với bề mặt có thể điều chỉnh
được pH acid, kiềm hay trung tính. Alumina là chất hấp thu mạnh hoạt động như
ion lưỡng cực tùy tính chất bề mặt alumina và dung mơi khai triển.

- Kieselguhr: là loại đất sét diatomit có các lỗ rỗng lớn, diện tích bề mặt lớn và
hấp thu rất yếu nên thường được sử dụng trong kỹ thuật sắc ký phân chia.
1.3.1.3. Các bước tiến hành sắc ký cột cổ điển

- Nhồi và ổn định cột: chất hấp phụ sau khi được hoạt hóa ở điều kiện thích hợp
sẽ được nhồi vào cột thủy tinh. Có thể nhồi dưới dạng bột khô hoặc dạng hỗn
dịch. Cột sau khi nhồi được ổn định trong dung môi nền khai triển 6-12h.

- Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu: tùy loại mẫu mà có thể nạp bằng phương pháp khơ
(trộn mẫu với pha tĩnh) hay phương pháp ướt (hòa mẫu trong dung môi rồi
nạp lên đầu cột).


11

- Khai triển và theo dõi quá trình sắc ký: tiến hành khai triển cột với hệ dung
môi phân cực dần (đã thăm dị trước đó trên sắc ký lớp mỏng), hứng các phân
đoạn thu được và tiến hành kiểm tra thành phần bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các
phân đoạn có thành phần giống nhau. Kết thúc q trình sắc ký khi thu hồi được
75-80% lượng mẫu nạp ban đầu.
1.3.2. Sắc ký rây phân tử [2], [6], [13]
Khi tiến hành nghiên cứu hợp chất thiên nhiên từ thực vật, tạp mang màu có
phân tử lượng lớn, kích thước phân tử lớn như clorophyl, caroten rất thường gặp.

Kỹ thuật sắc ký rây phân tử (sắc ký lọc gel) với cơ chế phân tách theo khối lượng và
kích thước phân tử tỏ ra rất hiệu quả trong việc loại các tạp này.
1.3.2.1. Cấu trúc của gel Sephadex
Gel Sephadex là tên thương mại của gel Dextran, là polysaccharid thiên nhiên,
mạch thẳng, nghĩa là chuỗi dây polyglucose nối với nhau bởi nối α-1,6-glucosid.
Mỗi chuỗi dây polysaccharid của dextran được tạo mạng ngang, bởi nối glyceryl,
giữa các nhóm –OH khi cho phản ứng với hợp chất epiclorohydirn trong dung môi
hữu cơ ở điều kiện kiềm. Sản phẩm tạo thành là chất rắn, dạng hình cầu, khơng tan
trong nước, nhưng có tính ái nước cao vì có mang nhiều nhóm hydroxyl.
Một loại Sephadex thường được sử dụng là Sephadex LH-20. Đó chính là
Sephadex G-25 trong đó các –OH được biến đổi thành hydroxypropyl ether.
Việc điều chế dẫn xuất này giúp cho gel có thêm tính thân dầu bên cạnh
tính thân nước sẵn có.

Hình 1.6. Cấu trúc của Sephadex LH-20


12

Bảng 1.6. Một số loại gel dextran Sephadex G và tính chất của gel
Loại
Sephadex
gel

Kích
thước
hạt gel
khơ (µm)

G-10

G-15
LH-20
G-75
G-100
G-150
G-200

40-120
40-120
25-100
40-120
40-120
40-120
40-120

Lượng Thể tích
nước gel
gel nở
có thể
trong
hút
nước
(ml/g)
(ml/g)
1,0 ± 0,1
2-3
1,5 ± 0,1 2,5 – 3,5
2,1
4,0 - 4,5
7,5 ± 0,5 12 - 15

10,0 ± 1,0 15 – 20
15,0 ± 1,5 20 – 30
20,0 ± 2,0 30 – 40

Khả năng tách các hợp chất
theo trọng lượng phân tử
Peptid, protein
hình cầu

Các phân
đoạn dextran

0 – 700
0 – 1.500

0 – 700
0 – 1.500

3 – 70.000
4 – 150.000
5 – 400.000
5 – 800.000

1 – 50.000
1 – 100.000
1 – 150.000
1 – 200.000

1.3.2.2. Nguyên tắc phân tách của sắc ký gel
Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này

được phủ đầy dung môi dùng làm pha động. Các lỗ rỗng phải có kích thước đồng
nhất vì kích thước lỗ đóng vai trị quan trọng trong q trình sắc ký: một hỗn hợp
gồm nhiều hợp chất có trọng lượng phân tử khác nhau có thể tách riêng được hay
khơng là tùy vào kích thước của lỗ rỗng. Các phân tử có kích thước to hơn lỗ rỗng,
khơng thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng, nhanh chóng theo dịng chảy của pha động
đi ra khỏi cột. Các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn kích thước của lỗ rỗng,
sẽ toàn phần hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, tuy rằng cuối cùng rồi cũng theo dòng
chảy đi ra khỏi cột nhưng sẽ chậm trễ hơn.
Dòng chảy của pha động khiến cho các phân tử lớn không thể chui vào lỗ rỗng
của mạng gel, nhanh chóng đi xuyên ngang qua cột, ra khỏi cột, trong khi phân tử
nhỏ ra khỏi cột lâu hơn vì cịn phải mất thời gian chui vào rồi đi ra khỏi lỗ rỗng gel.
Như vậy, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu đi ngang qua cột sắc ký gel,
sẽ ra khỏi cột lần lượt theo trọng lượng phân tử, phân tử lớn đi ra khỏi cột trước,
phân tử nhỏ đi ra khỏi cột sau.


13

Hình 1.7. Minh họa cơ chế tách trong Sephadex LH-20
1.3.3. Sắc ký lỏng bán điều chế [3], [49]
1.3.3.1. Khái niệm
Đối với việc phân lập một lượng chất tinh khiết (vài chục miligam đến vài
gam) thì sắc ký lỏng bán điều chế (semi – preparative HPLC) là một kỹ thuật tiện
lợi và hiệu quả. Kỹ thuật này dựa trên cơ sở sắc ký phân tích được mở rộng bởi sự
gia tăng kích thước cột, mở rộng kích thước hạt nhồi cột và hệ thống. Các hợp chất
tinh khiết phân lập được có thể sử dụng cho nhiều mục đích: làm chất chuẩn, chất
trung gian tổng hợp, nguyên liệu thử nghiệm...
Bảng 1.7. So sánh sắc ký lỏng phân tích, bán điều chế và điều chế
Đường kính cột (mm)

Kích thước hạt nhồi (micron)

1-8

1,7-10

Bán điều chế

10-40

5-15

Điều chế

50-100

15-100

Kỹ thuật sắc ký
Phân tích

Một sự khác biệt cơ bản nữa giữa HPLC phân tích và bán điều chế là ở mục
tiêu tiến hành. Trong khi HPLC phân tích chủ yếu quan tâm đến định tính và định


14

lượng một hợp chất thì ngược lại, sắc ký lỏng bán điều chế lại chú trọng vào việc
phân lập các hợp chất tinh khiết từ một hỗn hợp.
1.3.3.2. Các bộ phận

Bơm: Kích thước hạt pha tĩnh trong cột sắc ký lỏng bán điều chế thường lớn
hơn cột phân tích, tốc độ rửa giải các chất thường diễn ra nhanh hơn. Vì lý do đó, áp
suất cần thiết để bơm hoạt động sẽ thấp hơn trong hệ thống phân tích thơng thường
nên có thể mở rộng tốc độ dịng đến 10 ml/phút và áp suất bơm có thể đến vài trăm
bar, lúc này lượng mẫu rửa giải có thể đến vài trăm µg.
Cột: Cột trong HPLC bán điều chế có đường kính trong và kích thước hạt pha
tĩnh lớn hơn, điều này làm gia tăng công suất cột. Tùy lượng mẫu cần tách mà sử
dụng kích thước cột khác nhau. Cột thường được sử dụng trong kỹ thuật sắc ký lỏng
bán điều chế là cột (25cm, 10mm, 10µm), với tốc độ dịng khoảng 2-5 ml/phút có
thể rửa giải lượng mẫu lên đến 500µg.
Bảng 1.8. Tương quan khối lượng mẫu – đường kính cột của HPLC bán điều chế
Đường kính cột
Sự phân tách
Khó (α < 1,2)
Khơng thể q tải cột
Dễ (α > 1,2)
Có thể quá tải cột

2mm

8mm

23mm

1mg

20mg

100mg

10-50 mg

200-1000mg

1-5g

Mẫu tiêm: Tương tự như HPLC phân tích, trước khi tiêm mẫu vào hệ thống
HPLC bán điều chế cần chú ý các yếu tố: chuẩn bị mẫu, dung mơi pha mẫu, khối
lượng mẫu, thể tích mẫu, cơ chế tiêm mẫu, cột và sự lắp ráp. Độ tan của mẫu trong
pha động cũng ảnh hưởng đến số lượng mẫu được tiêm. Nếu thể tích tiêm quá lớn
sẽ làm hiệu quả phân tách giảm và độ lặp lại kém. Mặt khác, nếu mẫu quá đậm đặc
có thể tạo tủa trên bề mặt cột.
Dung môi: Sự bốc hơi một thể tích lớn dung mơi pha động từ các phân đoạn
có chứa các chất tinh khiết có thể tạo ra một lượng tạp đáng kể khi dung môi bị lẫn
các chất không bay hơi, dù chỉ dạng vết. Do đó độ tinh khiết của dung mơi sử dụng
trong HPLC bán điều chế có tầm quan trọng đặc biệt. Tuy nhiên, HPLC bán điều
chế đòi hỏi một lượng lớn dung mơi khi sử dụng nên cần có một sự cân đối giữa


15

yếu tố kinh tế và số lượng dung môi. Đối với các hợp chất phân cực mạnh và/hoặc
các hợp chất tan trong nước, cột pha đảo thường được sử dụng hiệu quả với pha
động là methanol, acetonitril…
Đầu dò: Đầu dò trong HPLC bán điều chế phải thiết kế thích hợp với tốc độ
dòng cao nên các đầu dò thiết kế cho HPLC phân tích khơng thích hợp với HPLC
bán điều chế. Thực tế trong quá trình phân lập, nhiều lúc nồng độ các hợp chất rửa
giải cao đến nỗi đầu dò bị quá tải. Điều này được khắc phục bằng cách đổi bước
sóng phát hiện, nơi mà chất tan hấp thụ kém hơn. Hiện nay các đầu dị thơng dụng
là UV-VIS (đầu dò tử ngoại – khả kiến) và RI (đầu dò chỉ số khúc xạ).

1.3.3.3. Chiến lược phân tách áp dụng trong HPLC điều chế

- Thăm dò bằng SKLM để tìm điều kiện phù hợp: tùy theo bản chất chất cần tách
để tiến hành thăm dò SKLM trên bản mỏng silica gel thường hoặc silica gel pha
đảo (silica gel RP-8, RP-18…) với hệ dung môi sắc ký phù hợp.

- Áp dụng điều kiện SKLM thành công vào HPLC phân tích.
- Nếu kết quả HPLC thăm dị tốt, tối ưu hóa các thơng số phân tách bằng HPLC
phân tích. Thường chọn điều kiện thăm dị có hệ số dung lượng (k’) nhỏ vì khi
chuyển sang hệ thống HPLC điều chế thường giảm hiệu quả tách. Khi hệ số dung
lượng nhỏ thì sự phân tách sẽ diễn ra nhanh chóng và thể tích thu được từ các
đỉnh nhỏ sẽ nhỏ. Độ chọn lọc tốt nhất là >1,5.

- Từ kết quả HPLC phân tích thu được, xác định các điều kiện và thông số áp dụng
cho HPLC điều chế bằng cách dùng các chiến lược mở rộng cỡ mẫu, ví dụ điều
chỉnh áp suất hệ thống HPLC điều chế khoảng 1/3 HPLC phân tích.

- Tiến hành phân tách điều chế. Mục tiêu của giai đoạn này là tăng lượng mẫu về
khối lượng và thể tích tối đa nhưng vẫn đạt chỉ tiêu về độ tinh khiết.

- Thu các hợp chất tinh khiết điều chế được bằng cách bốc hơi dung môi các phân
đoạn có chứa riêng các hợp chất quan tâm. Gom chung các phân đoạn chứa các
chất tinh khiết.

- Kiểm tra độ tinh khiết các chất thu được. Phương pháp tốt nhất là sử dụng HPLC
phân tích với đầu dị PDA.


16

1.3.3.4. Một số kỹ thuật áp dụng trong HPLC điều chế
Kỹ thuật lặp lại: Trong trường hợp chỉ cần một lượng nhỏ chất tinh khiết (vài
µg đến vài mg) thay vì dùng HPLC điều chế với các thiết bị đắt tiền hơn, có thể
dùng các hệ thống HPLC phân tích sẵn có với kích thước cột nhỏ hơn để thu được
chất cần thiết bằng cách tiêm lặp lại mẫu thử nhiều lần. Điều này được thực hiện
trên cơ sở độ lặp lại (repeatability) cao của HPLC. Ngoài ra, kỹ thuật lặp lại còn
được áp dụng trong HPLC điều chế khi muốn thu một lượng lớn chất.
Kỹ thuật cắt lạng và thu hồi: Khi hai hay nhiều thành phần cần phân tách
rửa giải gần nhau mà độ chọn lọc của hệ thống không đủ tách rời hỗn hợp.
Kỹ thuật cột quá tải và cắt tâm: để gia tăng năng lực điều chế, tiết kiệm thời
gian và chi phí ta có thể cho qua cột lượng mẫu cao hơn năng lực cột. Trong trường
hợp này, kỹ thuật cắt tâm có thể được áp dụng để tránh nhiễm các thành phần ít hơn
ở vùng phía trước hoặc phía sau. Ngồi ra, kỹ thuật quá tải cột cũng hữu hiệu trong
việc tách điều chế các chất có hàm lượng nhỏ trong hỗn hợp.