0915 nghiên cứu hoạt tính sinh học một số hợp chất ngoại bào của xạ khuẩn phân lập từ vùng biển đông bắc bộ và miền trung việt nam luận văn tốt nghiệp

MỞĐẦU
ViệtNamlàquốcgiavenbiểnnằmbênbờTâycủaBiểnĐơng,cóđịachínhtrịvàđịakinhtếrấtqua
ntrọngkhơngphảibấtkỳquốcgianàocũngcó.Vớibờbiểndàitrên
3.260 km trải dài từ Bắc xuống Nam, đứng thứ 27 trong số 157 quốc gia ven biển,
cácquốcđảovàcáclãnhthổtrênthếgiới.Chỉsốchiềudàibờbiểntrêndiệntíchđấtliềncủanướctalàxấp
xỉ0,01(nghĩalàcứ100km2đấtliềncó1kmbờbiển).Trong63tỉnh,thànhphốcủacảnướcthì28tỉnh,thànhphốcóbiển
vàgầnmộtnửadânsốsinhsốngtạicáctỉnh, thành ven biển. Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy, vùng
biển
nước
ta
là
mộttrongsốcácvùngbiểncóhệđadạngsinhhọcphongphúnhất.Đồngthời,VSVbiểncósựphânbốrấtdồi
dàovàđadạng,tuynhiênchotớinay,ởnướctachưacónhiềucơngtrìnhnghiêncứucáchợpchấtthứcấpđượ
csinhtổnghợptừcácVSVbiển.
Ngược lại, việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học được
sảnsinh từ VSV biển trên thế giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể, nhiều hợp chất
thứcấp với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học lý thú đã được phát hiện. Đồng thời
nhiềuhợpchấttrongsốnàyđãvàđangđượcthửnghiệmsâuhơnnhằmứngdụngtrongydược.Nhiều
loại
khángsinhđượcchiếtxuấttừnấm,vikhuẩn,xạkhuẩn,màxạkhuẩnchiếmphần lớn trong đó có các xạ khuẩn biển. Do
đại
dương
chiếm
70%
diện
tích
bề
mặt
tráiđất,lànơicósựđadạngvềsinhhọclớnnhấttrêntráiđất.Vìmơitrườngbiểnđãđượcbiếtđếnnhưmộtnguồ
nphongphúcungcấpcáchợpchấtthiênnhiên,nhưmộtkhodượcliệukhổnglồđangchờđượckhaithácvàkhámphá.
Đặcthùmơitrườngsốngkhắcnghiệtdưới biển sâu chính là điều kiện để hình thành các hợp chất hữu

cơ với những đặc điểmcấutrúchóahọcđộcđáovàhoạttínhsinhhọcqgiá.
Hơnnữa, ngàycàngnhiề uc á c VSVg â y bệnht r on g đócó vikhuẩnlaok h á n g vớ
icáckhángsinhhiệncóvàcácbệnhungthư.Dođó,cơngcuộctìmkiếmcácloạithuốc mới chống lao, ung thư cũng như
các bệnh truyền nhi m khác v n đang là vấn đềmangtínhcấpbáchtrêntồncầu.
Vì vậy chúng tơi thực hiện luận án này với mục đích: “Nghiên cứu hoạt tính
sinhhọcmộtsốhợpchấtngoạibàocủaxạkhuẩnphânlậptừvùngbiểnĐơngBắcbộvàmiền TrungViệt Nam”.
Mụctiêunghiêncứucủaluận án:
- Nghiên cứu hoạt tính sinh học một số hợp chất ngoại bào của xạ khuẩn
phânlập từvùngbiểnĐơngBắcbộvàmiềnTrungViệt Nam.
- Tìmkiếmcácchấtthứcấpcóhoạttínhsinhhọccaotừnguồnxạkhuẩnbiểnthơngquađánh
giásànglọchoạttínhkhángvisinhvậtkiểmđịnh,khánglaovàgâyđộctếbào.
Nhữngđónggópmớicủaluậnán
- Từ 140 m u vật thu thập được từ 1 số vùng biển Việt Nam, 130 chủng vi
sinhvật đãđượcphânlập.
- SànglọchoạttínhkhángVSVKĐ(6chủngvikhuẩnvà1chủngnấm)vàkhánglao(H37Rv
)củacặnchiếtcácchủngxạkhuẩnphânlậpđượcchothấy105/130chủngthểhiệnhoạttínhkhángítn
hất1chủngVSVKĐ,3chủngthểhiệnhoạttínhkhánglao.
- Đã lựa chọn và xác định được tên khoa học của mười chủng có hoạt tính
caobằng giải trình tự gen 16S rRNA. Trong đó các chủng G017, G019, G043, G044,
G047,G068, G120 thuộc chiMicromonospora, các chủng G039, G065 thuộc
chiStretomyces,chủngG057thuộcchiNocardiopsis.
- Dịchl ê nm e n c ủa 5c h ủn g cóhoạ t t í n h c a o đãđượcnghiêncứuthành phần
hóahọcbằngcácphươngphápsắcký.Đãxácđịnhđược44hợpchất.

1


Trong số 44 hợpc h ấ t đ ư ợ c t á c h c h i ế t v à x á c đ ị n h c ấ u t r ú c
h ó a h ọ c , đ ã x á c địnhđược3hợpchấtmớilà3,4-dihydroxy-6,7-dimethyl-quinoline-2carboxylic(G019-1),2-[(5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy]ethanol(G019-2),2-[(2Rhydroxypropanoyl)amino]benzamide(G0571),v à 2 c h ấ t m ớ i l ầ n đ ầ u t i ê n đ ư ợ c tách chiết từ tự nhiên là 3,3’-bis-indole
(G057-2), 3-acetyl-4-hydroxycinnoline (G057-3)và1 h oạ t c hấ t làbis(2-ethylhexyl)

adipate(G043-12)cóhoạt tínhkhánglao.
CHƢƠNG1:TỔNGQUAN
Phầntổngquant ại liệutổnghợpcácnghiêncứ ut rong nướcvàngồinước đềcập
đếncácvấnđềchínhsau:
1.1. Đadạngvisinhvậtbiển
1.2. Sựhìnhthànhchất khángsinhởxạkhuẩn
1.3. Xạkhuẩnbiển
1.3.1. HọStreptomycetaceae:
1.3.2. HọMicromonosporaceae:
1.3.3. Cáchọ kháccủa xạkhuẩnbiển
1.4. Hoạthínhsinhhọccủaxạkhuẩnbiển
1.4.1. Tìnhhìnhnghiêncứungồinước
Hoạt tính kháng
laoHoạt tính kháng
sinhHoạttínhchốngungth
ư
1.4.2. Tìnhhìnhnghiêncứutrong nước
CHƢƠNG2:VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
2.1. Vậtliệunghiêncứu
2.1.1. Vậtliệu
- Tổng số m u thu thập được là 140 m u, trong đó có: 76 m u ở Vịnh Bái
TửLong, 29 m u ở Đảo Cô Tô – Thanh Lân , 9 m u trầm tích ở Hạ Long - Cát Bà, 10 m
uHải miên Hải Vân – Sơn Chà và 16 m u Vịnh Vân Phong – Khánh Hịa và được lưu
giữtiêubảntạiViệnHóasinhbiển,ViệnTàingunvàmơitrườngbiểnHảiPhịngdoPGS.TSĐỗCơ
ngThungđịnhtên.
- Cặpmồidùngđểkhuếchđạigen 16srARNcủa xạkhuẩn.
- Các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế: 3 chủng vi khuẩn Gram –
(EscherichiacoliATCC25922,PseudomonasaeruginosaATCC27853,S.entericaATCC122
28),3chủngGram+(E.faecalisATCC13124,StapphylococusaureusATCC25923,Bacillus
cereusATCC 13245),1 chủng Nấm menCandida albicansATCC10231 được

cungcấpbởiviệnKiểmnghiệmvệsinhantồnthựcphẩmquốcgia.
- Các dịng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:KB- ung
thưbiểumô(CCL–17TM);HepG2-ungthưgan(HB–8065TM);MCF-7-ungthưvú(HTB
–22TM)vàLU-1-ungthưphổi(HTB-57TM)đượccungcấpbởiđạihọcUIC–HoaKỳ.
- Chủng vi khuẩn lao H37Rv (ATCC 27294, American Type Culture
Colection,Rockville,MD)đ ư ợ c cungcấpbởi đạihọcUIC–HoaKỳ.
2.1.2. Hóa chất:Các hóa chất dùng cho nghiên cứu vi sinh vật biển và tách chiết
cáchợpchất thứ cấpđ ư ợ c muacủacáchãnguytín củaĐức, Ý,Ấnđộ.


2.1.3. Thiết bị:Máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu vi sinh bao gồm : Máy
sốcnhiệt;máyvortex;máykhuấytừ;tủcấyantồnsinhhọcClassII;tủnicấy;máyly


tâm Centrifuge 5430; cân phân tích; máy PCR Mygenie 96 Thermal Block; máy điện
di;máylắc;tủlạnh-80oC và -20oC; máy khửtrùng; thiết bị lặnScuba, thuyềnđánhc á loạivừa,thiếtbị
lấymuthôngthườngnhưc u ố c , t ờ i , m á y đ o t ọ a đ ộ , m á y đ o đ ộ sâu;kính hiển
vi điện tử quét SEM; máy quang phổ Hewlett Packard; máy đo phổ hồngngoại FTIRImpact-410; máy đo phổ khối Quardrupole LC MS- Agilent Technologestheo kiểu phun
mù điện tử (ESI); máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Brucker Avance500 (500 MHz),
sử dụng TMS làm chất chuẩn; máy độ quay cực Tasco P-2000; máy
đođiểmnóngchảyMel Temp3.0củacácnướcMỹvàChâuÂu.
Các dụng cụ dùng trong nghiên cứu vi sinh thơng thường như: que cấy (Đức);đĩa
pepri(Đức,Ý); bìnht a m g i á c ; q u e r i a ; q u e t r a n g ( Đ ứ c ) ; Ố n g
e p p e n d o f 1 . 5 m l ; 2 ml; 15 ml; 50 ml; đầu típ các loại: 10, 100, 200, 1000 µl;
Bình tam giác các loại dungtíchtừ125ml–5000ml.
2.2. Phƣơngphápnghiêncứu
2.2.1. Phươngphápthuthậpmẫu
2.2.2. Phươngpháp phânlập chủngxạkhuẩnbiển
2.2.3. Phươngpháplàmsạchcácchủngbằngquecấyvịng
2.2.4. Phươngphápgiữgiốngxạkhuẩn sauphânlập

2.2.5. Phươngpháphoạthốvànicấy
2.2.6. Phươngpháptạocặnchiếttừdịchnicấyđểsànglọchoạttínhsinhhọc
2.2.7. Phươngphápđịnhdanhchủngxạkhuẩnnghiêncứu
2.2.8. Phươngphápsinhkhốilượnglớn
2.2.9. Phươngpháptáchchiếtcáchợp chấtthứcấp,địnhlượngcáchợpchất
2.2.10. Phươngphápxácđịnhcấutrúchóahọccủacáchợpchấtsạchtáchchiếtđược
2.2.11. PhươngphápthửhoạttínhkhángVSVKĐ
2.2.12. Phươngpháp thửhoạttínhgâyđộctếbào
2.2.13. Phươngphápthửhoạttínhkhánglao
CHƢƠNG3.KẾTQUẢNGHIÊNCỨU
3.1. Kết quả thu mẫu:Thu thập được là 140 m u, trong đó có: 76 m u ở Vịnh Bái
TửLong, 29 m u ở Đảo Cô Tô – Thanh Lân , 9 m u trầm tích ở Hạ Long - Cát Bà, 10 m
uHải miên Hải Vân – Sơn Chà và 16 m u Vịnh Vân Phong – Khánh Hòa. Các m u
đượclấyở cáctọađộvàđộsâukhácnhau.
3.2. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn:Từ 140 m u được nuôi cấy trên các
mơitrườngkhácnhau(M1,NZSG,ISP1,ISP2,A1,SWA),chúngtơiđãchọnđược130chủngxạkhuẩn.
ĐasốcácchủngđềumọctrênmơitrườngA1vàM1.CácchủngđềupháttriểntốttrênmơitrườngA1.Vì
vậychúngtơichọn mơitrườngA1đểnicấygiữchủngtrongA1+10%glycerolở–80oC.
3.3. Khảosáthoạttínhsinhhọccácchủngphânlậpđƣợc
KếtquảthửhoạttínhkhángVSVKĐvớicặnthơthuđược105130chủngphânlậpcótínhkhángcá
cchủngVSVKĐ80,8%,trongđócó29130chủngphânlậpcóhoạttínhkháng từ 3 chủng VSV kiểm
định trở lên, chiếm 22,3% và 59 130 chủng có hoạt tínhkháng nấm chiếm 45,4%.Ngồi
ra, có 11 130 chủng phân lập là có hoạt tính khángVSVKĐ Gram âm, chiếm 8,5%. Đặc
biệt, các chủng G002, G004, G026, G057, G119,G120, G124, G126,G039,G065, LC09
và LC19 thể hiện hoạt tính phổ rộng trên cả vikhuẩnvi khuẩnGram(+),vikhuẩnGram(-)
vànấm.
Các cặn chiết của các chủng xạ khuẩn phân lập được cũng đã được khảo sát
sànglọchoạttínhkháng lao.Kếtquảkhảosátchothấytrongsốcácchủng đượcthử nghiệm,

có3chủngG017,G019vàG043thểhiện hoạttínhđốivớiMycobacteriumtuberculosis
H37Rvvớigiátrị MIClần lượtlà21,25 và18μg/ml.g/ml.
Từ các kết quả sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ cũng như hoạt tính kháng
lao,trong luận án này đã lựa chọn được 10 chủng xạ khuẩn có hoạt tính tốt nhất để thực
hiệncácnghiêncứutiếptheo.
3.4. Kếtquảđịnh danh10 chủngxạkhuẩncóhoạttính
3.4.1. Quansátđặcđiểm hìnhtháicác chủngnghiêncứu
Cácchủngnghiêncứuđượcnicấytrong14ngàyở30ºCtrênmơitrườngthạch(ISP2).Kếtquảqua
nsáthìnhtháichothấysợikhuẩntycơchấtpháttriểntốttrênnềncơchấtcủamơitrường,nhưngsợikhuẩntykhísinhthì
mọc
yếu
hơn.
Màu
sắc
của
các
sợikhísinhrấtphongphú,làmàuvàng,trắngsangmàucamsốngđộnghoặctừnâuđensangmàuđensaukhih
ìnhthànhbàotử(Hình3.13).ThêmvàođóviệcquansátdướikínhhiểnviđiệntửSEM,bàotửđượcsinhrađơn
lẻvàcóđườngkínhkhoảng0,5-1µm.Cácbàotửlàdạngnốtvàmịntrênbềmặtvàkhơngdichuyểnđược(xemHình3.13).Các
hìnhtháibàotửđượccoilàmộttrongnhữngđặcđiểmquantrọngtrongviệcđịnhlồixạkhuẩn.

Hình 3.13.Hình ảnh khuẩn lạc trên đĩa thạch và bào tử dưới kính hiển vi điện tử
qt(SEM)tươngứngcủa10chủngnghiêncứu.
3.4.2. Nhângen16SrRNA
TừDNAgenomcủa10chủngnghiêncứu,sửdụngcặpmồi16SF,16SR,chúngtơitiến
hànhPCR nhânđoạngen16SrRNA, vớichutrìnhnhiệt:
Nhiệtđộ
Thờigian(phút)
94oC
3

94oC
1
(30cycles)
46oC
1
72oC
1,5
72oC
8
4oC


Vớicặpmồiđượcthiếtkếdựatrêntrìnhtựbảothủcủagen16SrRNAxạkhuẩnvàkhnlàDNAgen
omthìtheolýthuyếtsảnphẩmPCRcóđộdàixấpxỉ1500bp(Hình3.14).
1

2

3

4

5

M

6

7

8

9

10

Ghi chú: Giếng M: thang DNA chuẩn Thermo 250bp; Giếng 1- 10 là sản phẩm PCR theo thứ tự của các
chủngG017,G019,G039,G043,G044,G047,G057,G065,G068vàG120.
Hình3.14.ĐiệndiđồsảnphẩmPCRgen16SrRNA của 10chủngnghiêncứu

3.4.3. Giảitrìnhtựgenvàdựngcâyphânloạicủa cácchủng
12

HF674982Micromonosporas p . S 6 E g y p t JX503
975Micromonospora sp. PVA 112-08

17

NorwayKR906525Micromonosporasp.HBUM179191ChinaKF678405

97

Micromonospora sp.NEAU-GLH9 ChinaKF793800
46

22

Micromonosporasp. SW3Tunisia
G068 COTOTHANHLANVN

55

GU002092 Micromonospora sp. FXJ6.144

97
31

ChinaEU437824 Micromonospora sp. 206203
ChinaG043COTOTHANHLAN VN
GQ339909Micromonosporasp.JSM5-

92

1ThailanG044COTOTHANH LANVN

21

94

AY040625Micromonosporasp.CNH394USA

12

G047COTOTHANH LAN VN

5
10

GQ339909 Micromonospora sp. JSM5-1
ThailandEU714258Micromonosporasp.R1MexicoFJ263420Micr

5

omonosporasp.213425ChinaHF674981Micromo
nosporasp.S12EgyptKM456226Micromonospor

99

asp.MSSRFM60IndiaKM456224Micromonospora

7

sp.MSSRFM95IndiaEU437804Micromonosporas
34

0

p.202203China
0

G019HALONGCATBAVN
0

KP339505Micromonosporasp.S70

SC13ThailandKM456224Micromonosporasp.M

0

SSRFM95IndiaG017HALONGCATBAVN

1
4

KM456225Micromonosporasp.MSSRFM107IndiaG0
39 Ha LongCatBa VN

100

33

EU214935Streptomycessp.CNQ153SD01USAJQ670764 Streptomyces sp.
135001 ChinaHQ873939 Streptomyces sp.

97

AML828 MexicoG065VANPHONGVN

100
34

GU808333Streptomycessp.VITTK3IndiaA
Y336514Nocardiopsissp.20039ChinaG05
7COTOTHANH LAN VN

100
90

KM886195Nocardiopsissp.13-338ChinaG120BAITU LONGVN

Hình3.15.Câyphátsinhlồidựatrêntrìnhtựgen16SrRNAcủacácchủngnghiêncứu

Câyphátsinhlồidựatrêntrìnhtựgen16SrRNAh o à n chỉnhchothấymốiquanhệ giữa các chủng
nghiên cứu với các thành viên đại diện của các chiMicromonosporasp.,Stretomycessp.,Nocardiopsissp..
Nghiên cứu quan hệ của các chủng trên cây phátsinh lồi (Hình 3.15) cho thấy: Chủng
G017, G019,G043, G044, G047, G068, G120 cómối quan hệ gần gũi với các chủng
thuộc
chiMicromonosporasp.,
chủng
G039,
G065thuộcchiStretomycessp.,chủngG057thuộcchiNocardiopsissp.


Trong số các chủng thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ hoặc kháng lao, 5
chủng(G019, G043, G057, G065 và G120) được lựa chọn sinh khối lượng lớn hơn (30 l)
vàtiến hànhnghiêncứucáchợpchấtthứcấp.
3.5. Kếtquảsinhkhốilƣợnglớncácchủngcóhoạttínhcaonhất
Tiến hành thao tác như đã nêu ở phần phương pháp, đĩa cấy được ni ở tủ
ấm28oC,sau7ngàykiểmtrađộthuầnkhiếtcủacáckhuẩnlạc.Khuẩn
lạccủa5chủngđượclựachọncómàusắc,bềmặt,hìnhdạngđặctrưng,khơngcócácmàusắcvàsắctốlạ.Tiến
hànhnhângiốngcấp1:Dùngquecấylấymộtsốkhuẩnlạcriêngrẽcấyvàobìnhtamgiác125mlchứa10mlm
ơitrườngA1.Nilắc(200vịng/phút)ở28oCtrong7ngày,sauđónhângiốngcấp2:Chuyển10mldịchnigiốngcấp
1vàomỗibìnhtamgiác1000mlchứa 500 ml mơi trường mới A1 (với tỉ lệ bổ sung giống 2%), chế
độ ni tương tự nhưnhângiốngcấp1(Hình3.16).

Hình3.16.Hìnhảnhhoạthốvànhângiốngcấp1củacácchủngnghiêncứu

Tiến hành lên men 30 lít cho mỗi chủng: Chuẩn bị 30 bình tam giác 2800 ml
cóchứa sẵn 1000 ml mơi trường A1+, khử trùng và để nguội. Bổ sung mỗi bình 20ml
dịchnhân giống cấp 2 (với tỉ lệ bổ sung giống 2%). Sinh khối với các điều kiện trình bày

ở(Bảng3.10), sau7-14ngàythuhồi sảnphẩm(Hình3.17).

Hình3.17.Hìnhảnhnhângiốngcấp2vàsinhkhối30lít/1chủng


Bảng3.10.Điềukiệnnicấylượnglớncủa5 chủngnghiêncứu

STT
1

Ký
hiệu

Tênđịnhdanh

Điềukiệnnicấy

Thờigianlên men7ngày,nhiệtđộ28
o
Ct ố c độlắc200vịng/phút
2
Thờigianlênmen7ngày,nhiệtđộ28oCG043 Micromonosporasp.G043
30oC,tốcđộlắc200vịng/phút
3
Thờigian lênmen7ngày,nhiệtđộ28
G057 Nocardiopsissp.G057
o
Ctốcđộ lắc200vịng/phút
4
Thờigianlênmen10ngày,nhiệtđộ28oCG065 Streptomycessp.G065

30oC,tốcđộlắc200vịng/phút
5
Thờigianlênmen14ngày,nhiệtđộ28oCG120 Micromonosporasp.G120
30oC,tốcđộlắc200vịng/phút
3.6. Táchchiếtvàxácđịnhcấutrúchóahọccáchợpchấtthứcấp
36.1.Cáchợp chấtthứcấp từ chủngxạkhuẩnMicromonosporasp. G019
Q trình chiết xuất và tách chiết các hợp chất thứ cấptừ
chủngMicromonosporasp.G019đãđượcthựchiệnbằngcácphươngphápsắcký.
Từcáccặnchiếttừdịchlênmen,10hợpchấtkýhiệutừG019-1đếnG01910đãthuđược.Cấutrúchóahọccủacáchợpchấtnàyđượcxácđịnhbằngcácphươngphápphổ,đặcbiệtp
hổMSvàNMR.
Hợpchất3,4-Dihydroxy-6,7-dimethyl-quinolin-2-carboxylic(G019-1)
Hợp chấtG019-1thu được dưới dạng chất rắn màu vàng. Phổ khối phân giải
caoHRESI-MSchopicionphântửprotonhóaởm/z234,0761 [M+H]+(tính tốn cho CTPTC12H11NO4làm/
z234,0766), cho phépxác định cơng thức phân tử của là C 16H11NO4. Trênphổ1H- NMR cho
tínhiệu của 2 nhóm metin vịng thơm dưới dạng singlet ở δ H7,89 (1H, s,H-5)và7,68(1H,s,H8),2nhómmetylởδH2,45(3H,s,CH3-10)và2,48(3H,s,CH3-11).
Dựavàophổ13C-NMR,DEPTvàHSQCchophépxácđịnhhợpchấtG019-1có12 nguyên tử
cacbon trong đó có 2 nhóm metyl ở δ C19,4 (CH3-10) và 20,0 (CH3-11),
1nhómcacbonylởδC160,5(COOH)và9cacbonvịngthơmởδC125,8(C-8),128,6(C-5),129,8(C4a),138,5(C-8a),144,8(C-7),146,3(C-2)và149,9(C-3).Độchuyểndịchhóa
họccủa4cacbonbậc4vềphíatrườngthấplàC-8a,C-2,C-3vàC-4chophépxácđịnh4cacbonnàyliênkếtvớidị
tố (nitơ hoặc oxy). Các cacbon này cũng tương đồng như hợpchất3,4-dihydroxy-quinolin-2carboxylicđượctáchchiếttừmộtsốloàihảimiên(JayatilakeGSetal.,1996;WangLetal.,2012)
(xemBảng3.1).
Bảng 3.1.DữliệuphổN M R củahợp chất(G019-1)(DMSO,
1
H:500.13MHz,13C:125.76MHz)
C
H,mult.J(Hz)
C
H,mult.J(Hz)
C
C

2
149,9
4a
129,8
3
146,3
8a
138,5
5
128,7 7,89 (s,1H)
CH3-10
19,4
2,46 (s,3H)
6
144,8
CH3-11
20,0
2,48 (s,3H)
7
139,0
COOH
160,5
8
125,8 7,68 (s,1H)
G019

Micromonosporasp.G019

Phổ HMBC (hình 3.20-3.21 và bảng 2.1 phụ lục 3) cho tương tác xa giữa
protoncủanhómCH 3ởδ H2, 45 (CH 3-10)với C - 6, C -5, C-

7c ho phépxá c đ ị n h nhómmetylnàygắnvớicacbonC6.TươngtácxagiữaprotoncủanhómCH 3ởδ H2,48(CH 3-11)


với C-6, C-7, C-8 cho phép xác định nhóm metyl này gắn với cacbon C-7. Ngoài ratương
tác giữa H5 với C-4 và C-8a cho phép xác định liên kết giữa C-4a với C-4, C-5 vàC-8a.Kết
hợp các dữ kiện phổ MS, 1D- NMR và 2D- NMR cho phép xác định chấtG019-1là3,4-dihydroxy-6,7-dimethylquinolin-2-carboxylic.Đâylàmộthợpchấtmới.

CấutrúchóahọccủahợpchấtG019-1
Hợpchất2-((-5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy)ethanol(G019-2)
ChấtG019-2thu được dưới dạng chất dầu không màu Phổ khối phân giải
caoHRESI-MS cho pic ion hóa giả phân tử ởm/z199,0946 [M+Na]+(theo tính tốn
lýthuyếtc ho C T P T C 8H16NaO4l à m/z199,0941), chophépxá cđ ịn h công thức phântử
củalàC8H16O4. Phổ13C- NMR và DEPT cho thấy phân tử có 8 nguyên tử cacbon, trongđócó2
nhóm metin lai hóa sp3ở δC71,2 (C-2); 75,5 (C-5), 5 nhóm metylen ở 69,2 (C-3),71,2(C10),71,4(C-9),71.5(C-7)và75,7(C-6) và1 nhómmetyl ởδC17,7.
Phổ1H- NMR xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm metyl ở δ H1,10 (d,J= 6,5 Hz, 3H,CH311)và12protonnằmtrongkhoảngδ H3,35–3,63.Độchuyểndịchhóahọccủacác nhóm
metinvàmetylentrênphổ1H- NMR và13C- NMR cho phép xác định tất cảcácnhómnàyđềugắnvới
oxy (xemBảng3.2).
Bảng 3.2.DữliệuphổN M R củahợpchấtG019-2(CD3)2CO,
1
H:500.13MHz,13C:125.76MHz)
Cno
2
3
5

C(ppm)
71,2
69,2

75,5

6

75,7

1’

71,5

3’
4’
CH3-5

71.4
71,2
17,7

H(ppm),J(Hz)
3,59(m,1H)
3,63(m,2H)
3,62(m,1H)
3,35(dd,J=5,0;10,0Hz,1H)
3,47(dd,J=6,0;10,0Hz,1H)
3,56(m,1H)
3,58(m,1H)
3,59(m,2H)
3,59(m,2H)
1,10(d,J=6,5Hz,3H)

Phổ HMBC cho tương tác xa giữa các proton ở δ H3,35 and 3,47 (CH2-6) với C-2
và tương tác giữa proton của nhóm CH 2-3 ở 3,63 với C-5 cho phép xác định vịng 1,4dioxane. Tương tác xa giữa nhóm metylv ớ i C - 5 v à C - 6 v à t ư ơ n g t á c g i ữ a
n h ó m metylen CH2-9 với C-7, tương tác giữa CH2-7 với C-3 cho phép xác định nhóm
metylgắn ở vịtrí C-5 vànhómetylenglycolgắnvớiC-7quanguntửoxy.
Hai proton của nhóm CH2-6 cho 1 tương tác lớn (J=10,0 Hz) và 2 tương tác
nhỏhơn (J= 5,0 và 6,0 Hz). Tương tác lớnJ=10,0 Hz được xác định là tương tác
germinalgiữa 2 proton của CH2-6. Hai tương tác nhỏ khơng đặc trưng cho tương
tácantihaygauche.Mặtkhác,docáctínhiệuchồnglấpnêncấuhìnhtươngđốicủaC-2vàC-5khơngxác
địnhđược1cáchrõràng.Từcácdữliệuphổ 1H- NMR,13C- NMR, HSQC, HMBC,chophépxácđịnhchấtG019-2là
2-((-5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy)ethanol. Hợpchấtnàylầnđầutiênđượccôngbố.


CấutrúchóahọccủahợpchấtG019-2
Hợp chấtN-(4-hydroxyphenylethyl)propionamide (G0193)vàhợpchấtN-(4-hydroxyphenylethyl)acetamide(G019-4)
ChấtG019-3thuđượcdướidạngchấtrắnmàutrắng.PhổESIMScủachấtG0193xuấthiệnpiciongiảphântửtạim/z194[M+H]+.Phổ1HHNMRchotínhiệucủa4protonvịngthơmhệA2B2ở
δH6,73(2H,d,J=7,0Hz,H-3,
5),7,04(2H,d,J=7,0
Hz,H-2,H6),2nhómmethylenởδH2,18(2H,q,J=7,5Hz,CH2CH3),2,70(2H,t,J=7,5Hz,CH2-Ar),3,32
(m,-CH2-N)vàmộtnhómmetylcóδH1,11(t,J=7,5Hz,CH2CH3).Phổ13C-NMRvàDEPT
củaG0193chotínhiệucủa11nguntửcacbontrongđócó1nhómcarbonylởδC177,0,4metinvịngthơm,1nhó
mmetyl,2nhómmetylen,1nhómmetylengắnvớinitơởδC42,2và2cacbonbậcbốnlaihóasp2ởδC131,3(
C-1)và156,9(C-4).ĐộchuyểndịchhóahọccủaC1ởδC131,3chophépxácđịnhcacbonnàygắnvớioxy.Sựxuấthiệncủanhómamideđượckhẳngđịnhbởitương
táctrên phổ HMBCgiữaprotons của CH2-2’ (δH3,32) vớicacboncarbonylởδC177,0(C4’).KếthợpcácdữliệuphổvàsosánhvớitàiliệuthamkhảochophépxácđịnhchấtG019-3làN-(4-

hydroxyphenylethyl)propionamide.
ChấtG019-4thuđượcdướidạngchấtrắnmàutrắng.PhổkhốiESI-MS(negative)xuấthiệnpicionphân
tử deproton hóa tạim/z178,1 [M-H]-. Số liệu phổ NMR của chấtG0194tươngtựnhưphổcủachấtG019-3.Sosánhsựkhácnhaucủaphổgiữahaihợpchấtthấy xuất hiện một nhóm
acetyl thay vì các nhóm propionyl. Các dữ liệu phổ NMR củaG019-4phù hợp dữ liệu phổ của chấtN-(4hydroxyphenylethyl)-acetamide.Hợp
chất
này

cókhảnăngứcchếenzimaldosereductasevớigiátrịIC501,6×10-4M.
Hợp chấtA d e n i n e (G019-5), hợp chất 2’-deoxyadenosine (G019-7) và
hợpchấtAdenosine(G019-8)
Phổ khối ESI củaG019-5xuất hiện pic ion giả phân tử tạim/z136,1 [M+H]+.Trên
phổ1H- NMR củaG019-5thấy xuất hiện tín hiệu của 2 proton vòng thơm tại δH8,13 (1H, s,
H-8), 8,20 (1H, s, H-2).Phân tích số liệu phổ NMR và so sánh với tài
liệuthamkhảochophép xácđịnhchấtG019-5làadenine.
ChấtG019-7thu được dưới dạng chất rắn không màu. Phổ ESI MS của G019-7cho
pic ion phân tử proton hóa tạim/z252,1 [M+H]+. Phổ 1D- NMR (1H và13C) củaG019-7thấy
xuất hiện tín hiệu của2 nửa 2-deoxy-arabionoside như trong cấu tạo của G019-6. Tuy
nhiên, trong vùng trường thơm, chấtG019-7cịncó tín hiệu của các protonvàcacboncủaadenine
[δC120,8 (C-5), δC141,5, δH8,20 (CH-8), δC149,9 (C-4), δC153,6 δH8,34 (CH-2) và δC157,5
(C-6)]. Phân tích chi tiết các dữ liệu phổ MS, NMRcho phépxácđịnhhợpchấtG019-7là2'deoxyadenosine.
ChấtG019-8thuđượcdướidạngchấtrắnmàutrắng.PhổESIMScủaG019-7chỉra pic ion giả phân tử
tạim/z268,1 [M+H]+. Phổ 1D NMR củaG019-8có tín hiệu gầngiống với những tín hiệu


củaG019-7, ngoại trừ sự có mặt của một oxymethine trong G019-8thayvìcácmethylene
trongG019-7.Hơnnữa,protonH-1’xuất hiệndướidạng


một doublet trong phổ1H NMR củaG019-8. Trong khi đó, proton này xuất hiện dướidạng
double doublet trong phổ1H NMR củaG019-7. Điều này cho phép giả thiết chất G0198làmộtadenosine.DữliệuphổNMRtrùngvớibáocáotrướcđấycủaadenosine.

Cấu trúchóahọccủaG019-5,G019-7vàG019-8
Hợp chất 2’-deoxythymidine (G019-6), hợp chất2’-deoxyuridine (G0199)vàhợpchấtUridine (G019-10)
PhổkhốiESIcủaG019-6xuấthiệnpiciongiảphântửtạim/z243.1[M+H]+.Trênphổ1H- NMR
củaG019-6thấy xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại δH7,83 (s, H-6), một nhóm
methyl tạiδH1,90 (s, CH3-7) và một dải proton aliphatic ởδH2,27 (2H, m,H2’),3,75(1H,dd,J=3,5,12.0Hz,H a-5’),3,82(1H,dd,J=3,0,12,0Hz,H b-5’),3,93
(1H,m,H-4’),4,42(1H,m,H-3’),6,30(1H,t,J=7,0Hz,H-1’).Phổ13C-NMRvàDEPT

củaG019-6chỉracó10carbonvịngthơm,trongđócó2nhómcarbonyltạiδC152,4(C-2),166,4(C4),mộtnhómmetinsp2tạiδC138,2(C-6),mộtcarbonbậc4tạiδC111,5(C5),mộtnhómmetyltạiδC12,4(CH3-7),hainhómmetylentạiδC41,2(C-2’)và62,8(C-5’)và 3 nhóm
metin tạiδC73,1 (C-3’), 87,1 (C-4’) và 89,9 (C-1’). Độ chuyển dịch hóa họccủaCH-3’,CH4’vàCH2-5’chỉracácnguntốcóliênkếtvớioxy,mặtkhácCH-1’cókhănăngliênkếtvớicảnitơvàoxy.Phântíchsố
liệuphổNMRvàsosánhvớitàiliệuthamkhảochophépxácđịnhchấtG019-6là2’-deoxythymidine.
ChấtG019-9thuđượcdướidạngchấtrắnmàuvàngnhạt.PhổESIMScủaG0199xuấthiệnpiciongiảphântửtạim/z229,1[M+H]+.Phổ1DNMRcủaG0199chotínhiệucủaphầnđường2-deoxy-arabionosidegiốngnhưcủachấtG019-6vàG0197.Trongvùngtrườngthấpcótínhiệucủa2doublettại5,72(1H,d,J=8,0Hz,H-5)và7,99(1H,d,J=8,0Hz,
H-6). Phổ13C- NMR, DEPTcủaG019-9cho tín hiệu của 2 nhóm carbonyl tại 152,2 (C2)và166,6(C4),2nhómmetinsp2,2nhómmetylen,3nhómoxymetin.PhântíchsốliệuphổMS,NMRchophépxácđịnh
G019-9là2’-deoxyuridine.
PhổESIMScủachấtG019-10xuấthiệnpiciongiảphântửtạim/z245,1[M+H]+.Phổ1HNMRcủaG019-10chotínhiệugầngiốngvớichấtG019-9.Sựkhácbiệtgiữahaihợp chất này là sự hiện diện của
phân đường arabionoside thay vì 2-deoxy-arabionosidetrongG019-9,do sự vắng mặt của một tín hiệu
methylene
thay
vào
đó
là
một
nhómoxymethine.Nhưvậy,hợpchấtG01910đượcxácđịnhlàuridine.

Cấu trúchóahọccủaG019-6,G019-9vàG019-10
Táchc h i ế t v à x á c đ ị n h c ấ u t r ú c c á c h ợ p c h ấ t t h ứ c ấ p t ừ c h ủ n g x ạ k h
uẩn
Nocardiopsissp.G057
3.7.1. CấutrúchóahọccáchợpchấttừchủngxạkhuẩnNocardiopsissp.G057
Hợpchất2-[(2R-hydroxypropanoyl)amino]benzamide(G057-1)
Hợpc h ấ t G 0 5 7 - 1 th u đ ư ợ c d ư ớ i dạ ng c hấ t r ắ n m à u t r ắ n g , độ qu ay cực [ α]D] 2 8
+21,2(c0,007,acetone).PhổkhốiphângiảicaoHR-ESI-MSchopiciongiảphântửở

3.7.


m/z231,0730 [M+Na]+(tính tốn cho CTPT C10H12N2NaO3làm/z231,0746). Trên phổ13CNMR cho thấy sự có mặt của 10 nguyên tử cacbon trong đó có 1 nhóm metin laihóa sp3ở
δC68,3 (C-2’), 1 nhóm metyl ở δC21,2 (CH3-3’), 2 nhóm cacbonyl ở 170,8(C-7); 174,7 (C1’), 6 cacbon vịng thơm trong đó có 4 nhóm metin ở δ C120,4 (C-3),132,4(C-4),123,2(C5),128,8(C-6)và2cacbonbậc4.

Phổ1H- NMR củaG057-1đo trong CD3OD thấy xuất hiện tín hiệu của 4
nhómmetin vịng thơm, 1 nhóm metin sp 3và 1 nhóm metyl. Giống như đo trong CD3OD,
phổ1H- NMR củaG057-1đo trong DMSO-d6cho tín hiệu của 4 nhóm metin vòng thơm
thếở dạng 1,2-disubstituted ở δH8,45 (1H, d,J=7,8 Hz, H-3), 7,46 (1H, dt,J= 1,5; 7,8 Hz,H4),7,11(1H,t,J=7,8 Hz,H-5),7,70 (1H,dd,J=1,5;7,8Hz,H-6),1nhómmetylvà1
nhóm metin dưới dạng A3X ở δH1,28 (3H, d,J= 7,0 Hz, CH3-3’), 4,09 (1H, q,J=7,0Hz, H2’), dựa vào độ chuyển dịch hóa học của proton H-2’ cho phép dự đoán protonnày gắn
với oxy. Ngồi ra trên phổ 1H- NMR cịn có thêm tín hiệu của 4 proton(exchangeable)
dưới dạng singlet ở δ H11,88 (1H, s, NH), 8,13 (1H, br. s, NH 2-a), 7,05(1H,br. s, NH2-b),
6,05(1H,br.s, OH)x3mbảng3.3.
Bảng 3.3.DữliệuphổN M R củaG057-1(1H:500 MHz,13C:125MHz,DMSO-d6).
C
C
Hmult.(JinHz)
C
C
Hmult.(JinHz)
1
121,4
1’
174,7
2
138,7
2’
68,3
4,09 q(7,0)
3
120,4
8,45 d(7,8)
3’
21,2
1,28 d(7,0)

4
132,4
7,46 dt(1,5,7,8)
OH
6,05 br,s
5
123,2
7,11t(7,8)
NH
11,88s
6
128,8
7,70dd(1,5,7,8)
NH2
7,05br,s
7
170,8
8,13br,s
Phổ HMBC cho tương tác xa giữa proton của nhóm NH với C-1’, C-3 cho
phépxác định C-1’ gắn với C-2 của vịng benzen qua ngun tử nitơ. Nhóm cacbonyl C7được xác định gắn với C-1 của vòng benzen dựa vào tương tác trên phổ HMBC giữa H6 với C-7. Trên phổ HMBC cho tương tác xa giữa nhóm metyl với cacbonyl C-1
vàprotonoxymetin H-2’vớicacbonylC-1cho phép xácđịnh liênkếtgiữaC-3’/C2’/C-1’.
OH

OH
2'

O

O

2'
1'

3
4

5

NH

4

2
1

NH 2

67

O

3

1'3'

5

N
2
1

3'

H
O

67

NH2

Cấu trúchóahọccủahợpchấtG051-1
Các
dữkiện
phổ(UV,MS,NMR)xác
nhậnhợpc h ấ t G 0 5 7 - 1 c ó c ấ u
t r ú c phẳngvàđượcxác địnhlà 2-[(2-hydroxypropanoyl)amino]benzamide.Đ ộ q u a y
c ự c củaG057-1là[α]]D+21,2(c0.007,acetone)ngượcdấuvớihợpchất2-[(2Shydroxypropanoyl)amino]benzamideđượcDaivà
đồng
nghiệptáchchiếttừ
chủngPenicillium
chrysogenumTHOM(Dai
MC,
Tabacchi
R,
SatuminC.,1993).Dov ậ y , hợpchấtG057-1đượcxácđịnhlàđốiquangcủa2-[(2Shydroxypropanoyl)amino]benzamide.Đâylàmộthợpchấtmớivàđượcxácđịnh2-[(2Rhydroxypropanoyl)amino]benzamide.TínhiệucủanhómNHv ề p h í a t r ư ờ n g t h ấ p dư
ớidạngsingletsắcnhọnởδ H11,88đượcgiảthiếtlàdoliênkếthydronộiphântửvớinhó
mcacbonylC-7.


Hợpchất3,3’-Bis-indole(G057-2)

Hợp chấtG057-2thu được dưới dạng chất rắn màu vàng. Phổ khối phân giải
caoHRESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ởm / z 233.1079 [M+H]+(tính tốn
choCTPTC16H13N2làm/z233,1086),chophépxácđịnhcơngthứcphântửcủal à C16H12N2. Trên
phổ1H- NMR cho tín hiệu của 4 nhóm metin vịng thơm thế ở dạng 1,2- disubstitutedởδH8,05
(d,J= 7,5 Hz, H-4/H-4’), 7.08 (t,J= 7,5 Hz, H-5/H-5’), 7,12 (t,J= 7,5 Hz, H-6/H-6’), 7,41
(d,J= 7,5 Hz, H-7/H-7’) và 1 proton dưới dạng singlet ở δH7,84xembảng3.4.
Bảng 3.4.DữliệuphổN M R củaG057-2 (CDCl3)
C
C
Hmult.(JinHz)
2, 2'
131,2
7,84 s
3, 3'
110,8
3a,3'a
126,6
4, 4'
121,2
8,05 d(7,5)
5, 5'
120,5
7,08t(7,5)
6, 6'
121,8
7,12t(7,5)
7, 7'
112,0
7,41 d(7,5)
7a,7'a

136,5
Trênphổ13C-NMR,DEPT cho thấy sựcó mặtc ủ a
8
nguyêntử
c a c b o n t r o n g đóc ó 5n hó m metinvò ng t hơ m và3 c a cb on bậc 4,d ự a vào đ ộ ch uy ể
n dị c h hó a học chophépxácđịnhcacbonbậc4ởδCδC136,5 và nhóm metin ở 131,2 gắn với nitơ. Từcác
dữ liệu phổ MS, 1H- NMR,13C- NMR cho phép xác định hợp chấtG057-2có
cấutrúcđốixứngvàlà1hợpchấtb i s -indole.TươngtácxatrênphổHMBCgiữaH-4/H4’ với C-3/C-3’ (δC110.8) và H-2/H-2’ với C-3/C-3’ và C-7a/C-7a cho phép ghép
nốicácm ả n h p h â n t ử c ủ a v ò n g b e n z e n v ớ i v ò n g p y r o l e ở v ị t r í C - 3 a / C 3 ’ a v à C - 7 a / C - 7’a.KếthợpcácdữliệuphổMS,1D-NMRvà2D-NMRchophépxácđịnhchấtG057-2là 3,3’-bisindole phụ lục 13. Đây là một hợp chất lần đầut á c h
chiết
từ
t ự nhiên.Hợpchấtđãđượctổnghợpvàonăm1967.

Cấu trúchóahọchợpchấtG057-2
Hợp chất3-Acetyl-4-hydroxycinnoline(G057-3)
HợpchấtG057-3t h u
được
dưới
dạng
chất
r ắ n m à u v à n g . P h ổ I R c h o đ ỉ n h hấpthụđ ặ c t r ư n g c ủ a n h ó m
c h ứ c h y d r o x y l v à k e t o n e ở  max3412c m 1, 1669c m -1.Phổ khối phân giải
cao HRESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ởm/z189,0657[M+H]+(tính tốn cho
CTPT C10H9N2O2làm/z189,0664),c h o p h é p x á c đ ị n h c ô n g thức phân tử của là
C10H8N2O2tương ứng với 8 nối đơi tương đương. Trên phổ1H-NMRchotínhiệucủa 4nhóm
metinv ị n g t h ơ m
thế
ởdạng
1,2d i s u b s t i t u t e d ở δ H8.36( d , J = 8 . 0 H z , H - 5 ) , 7 . 6 3 ( t , J = 8 , 0 H z , H 6),7.85(t, J=8.0Hz, H-7)and
7.89(d,J= 8.0Hz, H-8), 1nhóm metyl ởδ H2.77( s , C H 3-9) và 1p r o t o n c ủ a

n h ó m OHởδ H9.95(br.s,OH).


Bảng3.5. DữliệuphổN M R củaG057-3 (DMSO-d6)xembảng3.5.
C
C
Hmult.(JinHz)
3
145,3
4
160,6
4a
123,5
5
126,9
8,36 d(8,0)
6
129,4
7,63t(8,0)
7
134,9
7,85t(8,0)
8
129,2
7,89 d(8,0)
8a
147,7
9
194,1
10

24,0
2,77 s
OH
9,95 br.s
Trênphổ13CNMRvàDEPTchothấysựcómặtcủa10nguntửcacbontrongđócó1nhómmetylởδC24,0(CH310),1nhómketonởδC194,1(C-9),4nhómmetinvịngthơmvà4cacbonbậc4ởδC145,3(C3),160,6(C-4),123,5(C-4a),147.7(C8a),dựavàođộchuyểndịchhóahọcchophépxácđịnhcacbonbậc4ởδC160,6(C-4)gắnvớioxy.
Phổ HMBC cho tương tác xa giữa proton của nhóm H-5 với C-8a và C-4,
tươngtác giữa H-8với C-4a chophép xác địnhliênkết giữa C-4a với C-4, C-5v à C 8 a . Tươngtựn hó m acetylđ ư ợ c xá cđ ị n h l i ê n kết vớ i c a cb on C3d ự a vào t ư ơ ng tá ct rê nphổHMBC giữaCH3-10với C-9vàC-3.
Kết hợp các dữ liệu phổ MS, 1D- NMR và 2D- NMR cho phép xác định
chấtG057-3là 3-acetyl-4-hydroxycinnoline. Đây là một hợp chất lần đầu tách chiết từ
tựnhiên.Hợpchấtđãđượctổnghợpvàonăm1991.

Cấu trúchóahọchợpchấtG057-3
Hợpchất3,3-(2,3-dihydroxypropyl)diindole(G057-4)
25
Hợp chấtG057-4thu được dưới dạng chất rắn màu vàng, độ quay cực [α]]
D
o
+
129 (c0,17; CDCl3). Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử ởm/z307,2 [M+H] .Trên
phổ proton, ở vùng aromatic xuất hiện các tín hiệu giống với hợp chấtG057-3tương ứng
với 2 nhân indol ở δ H7,06 (2H, m, H-6’, 6”); 7,15-7,26 (4H, m, H-5’,5”,2’,2”);7,26-7,37
(2H,H-4’,4”);7,63-7,69 (2H,H-7’,7”).Kếthợp phổ1H-NMRvới
13
C- NMR và DEPT cho biết phân thử cịn có 1 nhóm metin ở( δ H4,76; δC37,0), 1nhóm
oximetinở(δH4,56;δC65,4)và1nhóm oximetylenở(δH3,66và3,76;δC74,8).Phân tích phổ
COSY của hợp chấtG057-4nhận thấy hợp chấtG057-4có 2 hệtương tác spin. Hệ thứ nhất
là ở vùng aromatic của nhân indol bắt đầu từ H-4’ (δ H8,34)qua H-5’, H-6’(δH7,33-7,46)
và kết thúc ở H-7’ (δH7,45). Hệ spin thứ 2 bắt đầu từ H-1(δH4,76) qua H-2 (δH4,56) đến 2
proton
thuộc

nhóm
oximetylen
ở
(δH3,66
và
3,76)
thểhiệnt ư ơ ng tá cliềnk ề gi ữ a 2nhóm CH 3v à nhómoximetin.Cáctươngtácc h í n h trê
nphổCOSYđượctrìnhbàybằngliênkếtđậmtrongphụlục14.TrênphổHMBC,protonthuộcnhómmetinởδH4,76 có tương tác
đồng
thời
với
các
ngun
tử
cacbon
thuộc
2nhânindolởδC115,5;116,9;126,9,127,4chứngtỏcósựgắnkếtgiữaC-1củahệspin


thứ 2 với cả 2 nhân indol ở C-3’ và C-3” của nhân indol trong phụ lục 14. Từ những phân
tích trên kết hợp với phổ khối có thể thiết lập nên cấu trúc của hợp chất G0574nhưởhìnhvẽxácđịnhđượchợpchấtG057-4là3,3-(2,3-dihydroxypropyl)diindole.

Cấu trúchóahọchợpchấtG057-4
Hợp chất 2-hydroxy-1-(1H-indol-3-yl)-1-propanone (G057-5), Hợp chất 3hydroxyacetylindole(G057-6), Hợp chấtacid3-indolylacetic(G057-7)
vàHợpchất3-indolecarbadehyde(G057-8).
HợpchấtG57-5thuđượcdướidạngchấtrắnmàuvàng,độquaycực[α]]2 5 D
42o(c0,21;CDCl3).PhổkhốiESI-MSxuấthiệnpicởm/z188,07[M+H]+.Trênphổ1HNMRởvùngtrườngthấpxuấthiệncáctínhiệucủa5protonthuộcvùngaromaticởδH7,36(2H,m,H5’,6’);7,45(1H,m,H-7’);7,91(1H,d,J=3,0Hz,H-2’);8,34(1H,m,H-4’),cịnởvùng
trườngcaocótínhiệucủamộtnhómmetylởδH1,54(3H,d,J=7,0Hz,H3),ngồiraphổprotoncũngchobiếtsựcómặtcủamộtnhómmetincóliênkếtvớioxiở4,96(1H,q,J=7,
0Hz,H-2).Phổ13C- NMR và DEPT củaG57-5xuất hiện các tín hiệu của 11 nguyên tửcacbon
bao gồm 6 nhóm CH trong đó có 5 CH thuộc vùng aromatic ở δ C111,5;

122,3;123,1;124,2;131,5;1nhómCHcóliênkếtvớioxiởδC69,8;mộtnhómmetylởδC23,6và4cacbo
n bậc 4 trong đó có một nhóm C=O ở δ C197,1. Phân tích phổ COSY của hợp chấtG575nhậnthấyhợpchấtG57-5có2hệspin.HệthứnhấtlàởvùngaromaticbắtđầutừH-4’(δH8,34)quaH5’,H-6’(δH7,33-7,46)vàkếtthúcở
H-7’(δH7,45).Hệspin
thứ2thểhiệntươngtácliềnkềgiữa2nhómCH3vànhómoximetin(hình3.13phụlục3).TrênphổHM
BC, tín hiệu proton ở δH7,91 (1H, d,J=3,0 Hz, H-2’) và δH7,45 (1H, m, H-7’); δH8,34(1H, m,
H-4’)đều có tương tác với C-3’a và C-7’a, tương tác giữa H-2’ (δ H7,91) và H4’a(δH8,34)vớiC-3’(δC113,9)chứngtỏsựcómặtcủanhânindoltrongphântửcủahợpchấtG575.Ngồira,protonthuộcnhómmetylởδH1,54vàprotonH2’thuộcnhânindol(δH7,91)cùngcótươngtácvớinhómC=OtrênphổHMBCthiếtlậpnêncấutrúccủ
ahợpchấtG57-5.Nhưvậy,bằngcáchphântíchkếthợpcácphổMS,1Dvà2D-NMRvàsosánhvớitài
liệuthamkhảochophépxácđịnhđượccấutrúccủachấtG57-5là 2-hydroxy-1-(1H-indol-3-yl)-1-propanone.

Cấu trúchóahọccáchợpchấtG057-5đếnG057-8
Hợp chấtG57-6thu được dưới dạng chất rắn màu vàng. Trên phổ 1H- NMR, ởvùng
aromatic xuất hiện các tín hiệu tương tự như ở hợp chấtG57-5đó là δH7,31 (2H,m,H5,6);7,45(1H,m,H-7);7,92(1H,brs,H-2);8,24(1H,m,H-4).Sựkhácnhau
trên phổ proton của hai hợp chấtG57-5vàG57-6đó là tín hiệu singlet của một
nhómmetylen có liên kết với oxi ở δ H4,76 trên phổ củaG57-6thay vì tín hiệu doublet
củanhóm metyl và tín hiệu quartet của nhóm oximetin trên phổ của hợp chất G575.Từnhững phân tích trên kết hợp với tham khảo tài liệu có thể xác định được hợp
chấtG57-6là dn xuất củahợpchấtG57-5có tênlà3-hydroxyacetylindol(phụ lục16).
HợpchấtG57-7thuđượcdướidạngchấtrắnmàuhồng,độquaycực[α]]2 5 D
o
72 (c0,42;C DC l 3).Ph ổ k h ố i E SI -M S x u ấ t h i ệ n c á c t í n h i ệ uở m / z 176, 07 [ M + H ]
+
,1 98, 05


[M+Na]+.Phổ1H-NMRcủahợpchấtG577ởvùngaromaticxuấthiệncáctínhiệutươngtựnhưcủahợpchấtG57-5vàG576đólàδH6,93(1H,t,J=7,5Hz,H-5);7,03(1H,t,J=7,5Hz,H-6);7,16(1H,brd,H2);7,30(1H,d,J=7,5Hz,H-7);7,50(1H,d,J=8,0Hz,H-4).
Tuynhiên,ởvùngtrườngthấpxuấthiệnthêmtínhiệusingletởδH10,75cịnởvùngtrườngcaoxuấthiện
tínhiệusingletởδH3,48.Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtG577chobiếtphântửcó10nguntửcacbonbaogồm:5nhómmetinthuộcvùngaromaticởδC111,0;117,9;11
8,8;120,6;123,4;3cacbonbậc4cũngthuộcvùngaromaticởδ C110,0;127,6
;136,0;1nhómcacbonylởδC174,0vàcuốicùnglà1nhómmetylenởδC33,0.Từnhữngphântíchtrênphổ
1D-NMRkếthợpsosánhvớicácphổcủaG57-5vàG57-6cóthểthấysơbộphântửcủaG577baogồm1nhânindol,1nhómmetylenvà1nhómcacbonyl.Phântíchphổ HMBC cho thấy tín
hiệusinglet của nhóm metylen ở δH3,48 một mặt có tương tác vớiC-2(δC123,4),C-3(110,0),C4

(118,0)củanhânindol,mặtkháclạicótươngtácvớinhómcacbonyl,từđókếthợpvớiphổkhốicóthểthiếtlập
nêncấutrúccủahợpchấtG577nhưhìnhvẽ.TừnhữngphântíchtrênphổNMR,MSkếthợpvớithamkhảotàiliệucóthểxácđịnhđượchợ
pchấtG057-7làacid3-indolylacetic(G057-7).
HợpchấtG057-8thuđượcdướidạngtinhthểhìnhkimmàuvàngnhạt.Trênphổ1HNMRởvùngaromaticxuấthiệncáctínhiệutươngtựnhưcủahợpchấtG0577đólàδH(ppm)7,32(1H,m,H-5);7,33(1H,m,H-6);7,45(1H,m,H-7);7,85(1H,d,J=3,0Hz,
H-2); 8,32 (1H, m, H-4); cịn ở vùng trường thấp cũng có tín hiệu ở δ H10,1. Phổ13C-NMR
và DEPT xuất hiện các tín hiệu tương ứng với các nguyên tử cacbon thuộc
nhânindolởδC111,4(C-7);120,1(C-7a);122,0(C-4);123,1(C-5);124,0(C-3);124,5(C-6);
135,1(C-2).TuynhiênkhácvớihợpchấtG57-7,trênphổ13C-NMRcủahợpchấtG57-8xuất hiện tín hiệu của
một nhóm andehit ở δC185,1 thay vì nhóm cacbonyl ở δC174,0 ởhợpchấtG577.PhântíchphổHMBCchothấytínhiệuprotonởδH10,1tươngtácvớiC3củanhânindolởδC124,0.Nhưvậy,kếthợpphổkhối,phổNMR1chiềuvàhaichiềuvàthamkhảotàiliệuđiđế
nkếtluậnhợpchấtG057-8là3-indolecarbadehyde.
Hợpchấtacid1-hydroxy-4-methoxy-2-naphthoic(G057-9),Hợpchất7-hydroxy-6metoxycoumarin(G057-10) vàHợp chấtXanthone(G057-11)
Trên phổ1H- NMR xuất hiện các tín hiệu của 5 proton thuộc vùng aromatic ở
δH7,29(1H,s,H-7);7,51(1H,dt,J=1,5;8,0Hz,H-3);7,56(1H,dt,J=1,5;8,0Hz,H-2);8,15
(1H,brd,J=8,0Hz,H-1);8,29(1H,brd,J=8,0Hz,H-4),cịnởvùngtrườngcaocótínhiệucủa1
nhómmetoxyở
δH3,98(3H,s,CH3O-8).Phổ13C-NMRcủaG0579xuấthiệncáctínhiệucủa12nguntửcacbonbaogồm5nhómmetinvùngaromatic,1nhómmetoxyở
δC56,1(8-OCH3);1nhómcacbonylởδC169,8;mộtnhómmetylởδC23,6và4cacbonbậc4trong đócó mộtnhóm
C=O ở δC176,3 (C=O)
và
5 cacbon
bậc
4.
Phổ
HMBC cho
thấytươngtácgiữaprotoncủanhómmetoxyvớiC-8,chophépxácđịnhnhómmetoxygắnvớiC8.Từcácdữliệuphổ1D-NMRvà2DNMRvàsosánhvớitàiliệuthamkhảochophépxácđịnhchấtG057-9làacid1-hydroxy-4-methoxy2-naphthoic.

Cấu trúchóahọccáchợp chấtG057-9đếnG057-11


Hợp chấtG057-10thu được dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ 13C- NMR vàDEPT

của hợp chấtG057-10xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 10 ngun tử
cacbongồmcó:mộtnhómmetoxy(OCH 3)đặctrưngbằngtínhiệuδ C56,4;4nhómmetinsp
2
và5cacbonbậc4trongđócómộtnhómcacbonyl(δ C164,4).Trênphổ 1 H-NMRcủa


hợp chấtG057-10cho thấy: ở vùng nhân thơm xuất hiện tín hiệu của 2 proton ở δ H6,85(s,H5),δH6,92 (s, H-8), tín hiệu singlet của hai proton này chứng tỏ chúng ở vị trí paraso với
nhau trên vịng benzen, từ đó cũng cho biết vịng benzen bị thế ở 4 vị trí. Ngồira, trên
phổ proton cịn xuất hiện 2 proton ở δ H6,27 (d,J= 9,5 Hz), δH7,60 (d,J= 9,5Hz), hằng số
tương tácJ= 9,5 Hz chứng tỏ hai proton này ở vị trí cis so với nhau trênnối đôi. Trên phổ
HMBC, hai proton thuộc liên kết đơi ởδ H6,27; 7,60 cùng có tươngtác với nhóm cacbonyl
(δC161,4), tiếp theo là proton H-4 (δ H7,60) cũng có tương tácvới C-5 (δC107,5), C-8a
(δC150,3), độ chuyển dịch hóa học δC150,3 chứng tỏ C-8a cóliên kết với oxi, độ chuyển
dịch hóa học của C-7 (δ C150,3) cũng chứng tỏ C-7 có liênkết với oxi Sự gắn kết của
nhóm metoxy tại C-6 của vòng benzen được chỉ ra nhờ sựxuất hiện tương tác của C-6
(δC144,0) với nhóm metoxy (δH3,96) trên phổ HMBC(hình 3.17 phụ lục 3). Từ những
phân tích trên phổ 1D và 2D- NMR chứng tỏ hợp chấtG57-10thuộc khung coumarin và
có nhóm metoxy liên kết với C-6, nhóm hydroxy liênkết với C-7 của vòng benzen thuộc
khung coumarin. So sánh với tài liệu tham có thể kếtluậnđượchợpchấtG57-10là7-hydroxy6-metoxycoumarin.
Hợp chấtG057-11thu được dưới dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy174oC.
Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử deproton hóa ởm/z194,9 [M-H]-. Phổ1H-NMR xuất
hiện tín hiệu của4 proton vịng thơm ở δH6,67 (2H, m, H-2+ H-4); 7,30 (1H,t,J= 7,5 Hz,
H-3), 7,92 (1H, d,J= 7,5 Hz, H-1). Trên phổ13C- NMR và DEPT xuất hiệntín hiệu 1
nhómcacbonyl ở δC173,0 (C=O), 4 nhóm metin vịng thơm ở δ C135,0 (C-3);132,1 (C-1),
116,8 (C-4); 116,5 (C-2). Dựa vào các tín hiệu quan sát được có thể dựđốn rằng hợp
chấtG057-11có cấu trúc đối xứng. Phổ HMBC cho thấy tương tác xagiữa H-1 với C-3, C4a và C-9, tương tác giữa H-3 với C-1 và C-4a, tương tác giữa H-2với C-9a, C-4, C-1,
C-3. Từ các dữ liệu phổ MS, 1D và 2D NMR và so sánh với tài liệuthamkhảochophép
xácđịnhchất làG057-11là xanthone.
Hợpc h ấ t C y c l o ( T y r - T r p ) ( G 5 7 - 1 3 ) , H ợ p c h ấ t C y c l o - ( P r o T r p ) ( G 0 5 7 - 1 4 ) , HợpchấtCyclo-(Pro-Phe)(G057-15),HợpchấtCyclo-(Pro-Tyr)(G057-16)vàHợpchất Cyclo(Pro-Leu) (G057-17)
Hợp chấtG57-13thu được dưới dạng chất rắn màu trắng. Trên phổ 1H- NMRcủa

hợp chấtG57-13, ở vùng aromatic xuất hiện các tín hiệu của 1 vịng benzen bị thế ởvịtrí1,4ở
δH6,46 (2H, d,J=7,5 Hz, H-Tyr); 6,63 (2H, d,J=7,5 Hz, H-Tyr) và tín hiệucủa 1 nhân
indol (bao gồm 4 tín hiệu của 1 vịng benzen bị thế ở vị trí 1,6 và 1 protonsinglet ở
δH7,03-7,60), còn ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu của 4 proton ở
δH1,48[1H,d d , J =8,5;1 3 , 5 H z , C H 2a(Tyr)];2 , 5 7 [ 1 H , dd, J =4,0;1 4 , 0 Hz, C H 2b(Tyr)];2 ,
76
[1H,d d , J =6,0;1 4 , 5 H z , C H 2a(Trp)];3 , 0 5 [ 1 H , d d , J =4,0;1 4 , 5 H z , C H 2b(Trp)].P h ổ
13
C- NMR và DEPT cho biết phân tử có 20 nguyên tử cacbon bao gồm: 2 nhóm metylenở
δC31,2; 40,6; 2 nhóm metin có liên kết với nitơ ởδ C57,1; 57,9; 2 nhóm cacbonylamit
ởδ C169,3; 169,7 và 14 cacbon thuộc vùng aromatic ởδ C109,6-157,5. Từ
cácphântíchvềphổ1D-NMRởtrêngợiý đếnhợpchấtG57-13làmộthợpchấtdicyclopeptide là
hợp phần của 2 acid amin tyrosin và tryptophan. Kết hợp so sánh
vớitàiliệuthamkhảođiđếnkết luậnhợpchấtG57-13làCyclo (Tyr-Trp).

Cấu trúchóahọccáchợpchấtG057-13đếnG057-17