Sản Xuất Protein Trị Liệu Tái Tổ Hợp.docx

KHOA SINH HỌC

TIỂU LUẬN
SẢN XUẤT PROTEIN TRỊ LIỆU TÁI TỔ HỢP

CÔNG NGHỆ PROTEIN

THÁNG 06 NĂM 2020


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.............................................................................................................1
NỘI DUNG.......................................................................................................... 2
I. TỔNG QUAN VỀ PROTEIN TRỊ LIỆU...................................................2
1. Định nghĩa...........................................................................................2
2. Phân loại và chức năng........................................................................2
II. SẢN XUẤT PROTEIN TRỊ LIỆU TÁI TỔ HỢP.....................................5
1. Hệ thống biểu hiện protein trị liệu tái tổ hợp.......................................5
1.1. Hệ thống vi sinh vật để sản xuất protein trị liệu........................5
1.2. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào côn trùng...................10
1.3. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào động vật có vú...........11
1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp ở cây chuyển gen...........................12
2. Quy trình ngược dịng.......................................................................16
3. Xử lý xi dịng................................................................................19
III. ỨNG DỤNG..........................................................................................21
Theo Tạp chí nghiên cứu y học, có bài báo “TINH SẠCH PEPTID
NGƯỜI TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG THẤM QUA MÀNG, KHẢ
NĂNG ỨNG DỤNG TRONG PROTEIN TRỊ LIỆU”................................22
1. Mục tiêu......................................................................................22
2. Chuẩn bị protein Tái tổ hợp........................................................22
3. Đánh giá khả năng vận chuyển trên tế bào..................................23

4. Kết quả........................................................................................24
5. Kết luận......................................................................................25
KẾT LUẬN.......................................................................................................26


MỞ ĐẦU
Protein trị liệu được sản xuất bằng công nghệ/kỹ thuật sinh học, là một
dược phẩm quan trọng có tiềm năng rất lớn để cải thiện sức khỏe con người.
Những phân tử protein này về cơ bản là bản sao hoặc phiên bản tối ưu của
protein người nội sinh. Chúng có thể được phân lập như các chất xuất hiện tự
nhiên từ động, thực vật, hoặc vi sinh vật, hoặc được tạo ra bằng cơng nghệ
DNA tái tổ hợp. Có nhiều loại thuốc protein khác nhau, bao gồm kháng thể đơn
dòng, vắc-xin, hormon peptide, các yếu tố máu, cytokine, kháng sinh peptide,
các loại enzyme trị liệu... Nhiều loại protein tái tổ hợp được phê duyệt gần đây
đã được phát triển và sử dụng để điều trị rộng rãi trong lâm sàng, bao gồm cả
những bệnh nan giải như ung thư, bệnh tự miễn/viêm nhiễm, hay rối loạn di
truyền. Trong tổng quan này, các tác giả nhấn mạnh các xu hướng và phương
pháp tiếp cận mới trong nghiên cứu và phát triển thuốc protein, chủ yếu trên cơ
sở công nghệ/công nghiệp protein.
Qua bài tiểu luận “Sản xuất protein trị liệu tái tổ hợp” để làm rõ hiểu vấn
đề hơn.

1


NỘI DUNG
I. TỔNG QUAN VỀ PROTEIN TRỊ LIỆU
1. Định nghĩa
Protein được thiết kế để sử dụng như một dược phẩm/ thuốc được gọi là
protein trị liệu, hay thuốc protein sinh học (biologics). Protein là cơ sở/nền

tảng của sự sống và việc sử dụng thuốc protein/protein trị liệu đã có một lịch
sử lâu dài. Protein trị liệu truyền thống được phân lập như các hợp chất xuất
hiện tự nhiên từ động vật, thực vật, vi sinh vật... Hiện nay, nhiều dạng thuốc
protein sinh học mới được tạo ra bằng công nghệ DNA tái tổ hợp
Hiện có khoảng 239 protein trị liệu và 380 biến thể thuốc đã được Cơ quan
Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê chuẩn.[5]

Hình: Biểu đồ về số lượng thuốc hóa học và thuốc sinh học mới được FDA phê
duyệt trong hai thập kỷ qua
2. Phân loại và chức năng
Protein trị liệu khác nhau ở nhiều khía cạnh so với các loại thuốc phân tử
nhỏ/hóa học truyền thống. Chúng khác nhau khơng chỉ về kích thước, thành
phần, phương thức sản xuất, độ tinh sạch, tác dụng phụ, sự ổn định, cơng thức,
mà cịn ở các khía cạnh pháp lý... Những khác biệt cơ bản này lý giải cho việc
các thuốc protein sinh học được xem xét như một nhóm thuốc/dược phẩm đặc

2


biệt, với nhiều đặc tính chung khác với các thuốc phân tử nhỏ. Protein trị liệu
có thể được phân loại dựa trên các thể loại phân tử như:
− Các protein từ máu và sản phẩm liên quan
− Hormone và các nhân tố tăng trưởng
− Các cytokine và interferon
− Các vaccine và kháng thể
Dựa trên vai trò hoặc phương thức hoạt động, các protein trị liệu được phân
thành 4 nhóm khác nhau.
− Nhóm I bao gồm các protein có hoạt tính enzym hoặc điều hịa.
− Nhóm II gồm các protein có khả năng gắn đích đặc hiệu/cụ thể.
− Nhóm III là các protein sử dụng tạo vắc xin.

− Nhóm IV bao gồm các protein sử dụng trong chẩn đốn (hình 2).

Dựa trên hoạt động / hoạt tính dược lý, các protein trị liệu được chia thành
5 nhóm:
− Thay thế một loại protein bị thiếu hoặc bất thường;
− Gia tăng một q trình chuyển hóa hiện có;
− Cung cấp một chức năng hoặc hoạt động mới
− Can thiệp vào một phân tử hoặc cơ thể;
− Vận chuyển/cung cấp các hợp chất hoặc protein khác, chẳng hạn như
một hạt nhân phóng xạ, thuốc gây độc tế bào...
3


Ngồi ra, các protein trị liệu cũng có thể được chia nhóm dựa trên cấu trúc
phân tử của chúng, bao gồm thuốc được thiết kế dựa trên kháng thể, protein
dung hợp với Fc, thuốc chống đơng máu, protein hình thái xương, protein được
thiết kế hình dàn (scaffold), enzym, hormon, interleukin... Chúng cũng có thể
được phân loại dựa trên cơ chế hoạt động ở mức phân tử là:
− Liên kết không cộng hóa trị với đích gắn (mAbs);
− Tác động đến liên kết cộng hóa trị (enzym);
− Tác động mà khơng có tương tác cụ thể (Albumin huyết thanh).
Hầu hết các protein trị liệu hiện có trên thị trường là tái tổ hợp và hàng trăm
trong số chúng đang trong quá trình thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư,
rối loạn miễn dịch, nhiễm trùng... Các protein được thiết kế mới, bao gồm
BisAbs (bispecific mAbs), protein dung hợp đa yếu tố, mAbs liên kết với các
loại thuốc phân tử nhỏ và protein với dược động học được tối ưu hóa hiện đang
được phát triển.
Ngoài các protein trị liệu dựa trên sinh vật nhân chuẩn, một số
protein/enzym trị liệu dựa trên sinh vật nhân sơ cũng đã được phát triển, sản
xuất và ứng dụng lâm sàng. Ví dụ, L-asparaginase (một loại enzym hóa trị

liệu), methionine gamma-lyase (một tác nhân chống ung thư tiềm năng), Lglutaminase (một loại enzym chống thiếu máu) và L-methionase (tham gia xây
dựng các phân tử protein khác và tổng hợp axit amin L-cysteine) là những
protein đang được sử dụng phổ biến nhất trong điều trị các bệnh khác nhau.[5]
Ưu điểm của protein trị liệu tái tổ hợp[1]: 
− Thay thế thuốc tổng hợp hóa học.
− Có chức năng trị liệu đặc hiệu cao.
− Ít làm ảnh hưởng đến các quá trình sinh học bình thường.
− Nhanh chóng được phát triển ở mức độ lâm sàng và nhanh chóng được
FDA chấp thuận.
− Có ít khả năng tạo ra các phản ứng miễn dịch

4


II. SẢN XUẤT PROTEIN TRỊ LIỆU TÁI TỔ HỢP
1. Hệ thống biểu hiện protein trị liệu tái tổ hợp
1.1. Hệ thống vi sinh vật để sản xuất protein trị liệu
Mặc dù có nhiều hệ thống vật chủ khác nhau để sản xuất protein tái tổ hợp,
vật chủ vi sinh vật cung cấp một số lợi thế so với các hệ thống khác, vì sản xuất
nhanh, rẻ và kinh tế:
− Sinh học phân tử và sinh lý học được đặc trưng và ghi lại đầy đủ.
− Dễ dàng bảo trì và thao tác.
− Sử dụng các nguồn dinh dưỡng rẻ tiền.
− Tăng trưởng nhanh chóng và tích lũy sinh khối để đạt được mật độ tế
bào cao.
− Mở rộng quy mô rất dễ dàng và thuận tiện.
− Máy móc biểu hiện của chúng có thể có nhiều chất xúc tiến cảm ứng
mạnh.
Promoter cảm ứng có thể yêu cầu chất cảm ứng, hoặc sự cạn kiệt hoặc bổ
sung một chất dinh dưỡng cụ thể, hoặc thay đổi pH hoặc thay đổi các yếu tố

hóa lý để bắt đầu q trình biểu hiện gen. Các hệ thống cảm ứng có nhược
điểm là chất cảm ứng hóa học có thể đắt tiền và độc hại và cần phải loại bỏ
trong quá trình xử lý sau khi sản phẩm được sử dụng cho con người. Do đó,
việc sử dụng các hệ thống điều nhiệt đã được sử dụng để sản xuất các protein
dược phẩm tái tổ hợp vì sự biểu hiện phụ thuộc vào chất xúc tiến mạnh được
điều chỉnh nhiệt giúp giảm thiểu rủi ro khi bổ sung bất kỳ tác nhân hóa học
nào.
Cũng như cấu trúc tế bào của vi khuẩn, nó có thể nhanh chóng thích nghi
với các điều kiện ni cấy với thời gian sao chép rất ngắn (20 phút). Yêu cầu
về môi trường của tế bào vi khuẩn rất đơn giản và bao gồm nguồn cacbon và
nitơ đơn giản. Do đó, đầu vào tổng thể ở vi khuẩn thấp hơn 90% so với tế bào
của động vật có vú. Một số phương pháp điều trị có nguồn gốc từ vi khuẩn đã
được phê duyệt (bởi Liên minh Châu Âu hoặc FDA, Hoa Kỳ) bao gồm các
hormone (insulin người và các chất tương tự insulin, calcitonin, hormone tăng
trưởng người, glucagons, hormone tuyến cận giáp, somatropin và yếu tố tăng

5


trưởng giống insulin 1), interferon (alfa-1, alfa-2a, alfa-2b và gamma-1b),
interleukin 11 và 2, chuỗi nhẹ và nặng tăng lên chống lại yếu tố tăng trưởng nội
mô mạch máu-A, yếu tố hoại tử khối u alpha, protein tiểu đơn vị tả B, khuẩn
lạc bạch cầu hạt - yếu tố kích thích và chất kích hoạt plasminogen .
Vi khuẩn được lựa chọn đầu tiên để sản xuất protein tái tổ hợp là vi khuẩn
enterobacterium E. coli . Hệ thống cung cấp các sửa đổi nhanh chóng và dễ
dàng, dễ dàng phát triển trong điều kiện mơi trường có thể quản lý được và
vịng đời ngắn. Tế bào vi khuẩn có thể chịu đựng và thích ứng với những thay
đổi của mơi trường một cách nhanh chóng, do đó việc mở rộng quy mơ dễ dàng
hơn. Tuy nhiên, hệ thống có một số nhược điểm .
− Các gen của con người hoặc động vật có vú được nhân bản trong vi

khuẩn khơng thể trải qua q trình ghép nối do thiếu máy móc nối, do đó,
phiên bản gen khơng có intron được nhân bản để có kết quả tối ưu .
− Các tín hiệu liên quan đến phiên mã của gen có thể khác nhau; do đó,
gen quan tâm thường được hợp nhất với gen vi khuẩn dưới sự kiểm sốt của
trình tự khởi đầu của nó, và protein thu được như một sản phẩm dung hợp, sau
này có thể được phân cắt, tinh sạch và sử dụng.
− Chất xúc tiến Lac là một trong những chất xúc tiến vi khuẩn phổ biến
nhất. Tuy nhiên, đối với biểu hiện cấp cao, T7 promoris cũng được ưu tiên hơn
(hiện diện trong vectơ pET). Nó có thể thúc đẩy biểu hiện protein mục tiêu lên
gần 50% tổng số protein tế bào. Gen quan tâm có thể được đặt dưới sự kiểm
soát của thực khuẩn thể xúc tiến được điều chỉnh.
− Đối với quá trình dịch mã, sự phong phú của t-RNA có liên quan đến tần
suất xuất hiện của các codon khác nhau (xu hướng codon). Do đó, các codon
hiếm đối với E. coli có thể gây ra sự kết hợp sai axit amin hoặc kết thúc sớm
ảnh hưởng đến sản lượng của protein điều trị. Điều này có thể được giải quyết
bằng cách thay thế theo hướng vị trí của các codon hiếm thành các codon (cho
cùng một axit amin) được ưa thích bởi E. coli . Một cách tiếp cận khác có thể
là đồng biểu hiện của t-RNA hiếm ở E. coli (các chủng E. coli, BL21 codon
cộng, và Rosetta được thiết kế cho mục đích này). Để bổ sung các axit amin
trong q trình dịch mã, vì có nhiều hơn một codon cho một số axit amin, do

6


đó, xu hướng codon xảy ra là ưu tiên của một codon cụ thể của axit amin trong
một loài cụ thể .
− Tính phức tạp: Tế bào nhân thực có ưu điểm là tạo ra các protein có đầy
đủ chức năng và được gấp nếp đúng cách. Các kháng thể có bốn tiểu đơn vị có
thể được tiết ra bởi tế bào nhân thực ở dạng đầy đủ chức năng. Mặt khác, rất
khó có được protein đa miền từ E. coli . Ngay cả khi thu được protein, việc

biến tính và gấp nếp trong điều kiện phịng thí nghiệm có thể rất tốn kém hoặc
protein có thể thiếu hoạt tính.
− Thiếu các biến đổi sau vận động (PTM) là một vấn đề, không thể giải
quyết được và là điều bắt buộc đối với hoạt động của nhiều protein điều trị.
Quá trình glycosyl hóa là dạng biến đổi phổ biến nhất, và những dạng khác là
q trình phosphoryl hóa và hình thành liên kết disulfide, về cơ bản cần thiết
cho khả năng hoạt động đầy đủ của nhiều protein của con người. PTM đóng
một vai trị quan trọng trong việc gấp protein, xử lý, ổn định, nhắm mục tiêu
mô, hoạt động, phản ứng miễn dịch và thời gian bán hủy của protein. Thiếu
những chất này dẫn đến sản phẩm khơng hịa tan, không ổn định hoặc không
hoạt động.
− Tuy nhiên, hệ thống glycosyl hóa liên kết N của Campylobacter jejuni
đã được chuyển thành cơng sang E. coli , do đó mở ra khả năng sản xuất
protein glycosyl hóa trong đó. Một số vi khuẩn E. coli đột biến nhất định đang
được phát triển để thúc đẩy sự hình thành liên kết disulfide (AD494, Origami,
Rosetta-gami) với hoạt tính protease giảm (BLZ1).
− Sản xuất quá mức protein tái tổ hợp ở vi khuẩn có thể dẫn đến mất khả
năng hịa tan và lắng đọng nhiều loại protein dưới dạng tập hợp protein hoặc cơ
thể bao gồm. Sự thay đổi trong điều kiện tăng trưởng có thể làm cho sản phẩm
ở dạng khơng hịa tan. Nhiều protein của sinh vật nhân thực được tìm thấy
trong các thể bao gồm khả năng chống lại các q trình xử lý tiếp theo. Thành
cơng đã đạt được trong việc tinh chế insulin và betaferon từ các cơ quan đưa
vào cơ thể. Việc lấy lại các protein bằng cách sử dụng điều kiện biến tính với
sự tái cấu trúc và biến tính tiếp theo có thể khơng phải lúc nào cũng dễ dàng và
được chứng minh là cực kỳ tốn kém.

7


− Với vật chủ là E. coli , rất khó thu được protein lớn hơn 60 kDa ở dạng

hòa tan.
− Do những hạn chế nhất định đối với việc sản xuất protein ở E. coli , các
hệ thống vật chủ khác đang được thảo luận để sản xuất protein.
Glycosyl hóa:
+ Sự gắn kết cộng hóa trị của nhóm carbohydrate với protein để tạo thành
glycoprotein được gọi là quá trình glycosyl hóa. Trong glycoprotein, protein
chiếm một phần chính. Những chất này đóng vai trị quan trọng trong các q
trình sinh lý khác nhau và là thành phần của màng tế bào.

+ Các carbohydrate thường được gắn vào protein có thể là fucose (Fuc),
galactose (Gal), N-acetylgalactosamine (GalNAc), glucose (Glc), Nacetylglucosamine (GlcNAc), mannose (Man) và axit sialic (Sia).
+ Các chất đường này có thể liên kết thông qua nguyên tử nitơ amide của
chuỗi bên của asparagin (Asn) được gọi là glycosyl hóa liên kết N hoặc với
nguyên tử oxy trong chuỗi bên của serine (Ser) hoặc threonine (Thr) được gọi
là glycosyl hóa liên kết O.
+ Khơng phải tất cả asparagin (Asn) có trong polypeptit đều có thể chấp
nhận gốc cacbohydrat. Các gốc có trình tự Asn-X-Ser hoặc Asn-X-Thr, trong
đó X là bất kỳ axit amin nào ngoại trừ proline, là mục tiêu cho q trình
glycosyl hóa. Khơng chỉ trình tự cịn lại mà các khía cạnh khác của cấu trúc
của protein và loại tế bào xác định vị trí glycosyl hóa.
+ Tất cả các gốc đường liên kết N đều có một lõi chung là pentasaccharid.
Các

pentasaccharide

này

8

bao

gồm

ba

mannose

và

hai

gốc

N-


acetylglucosamine. Phần lõi có thể gắn với các oligosaccharide khác nhau để
tạo thành các glycoprotein khác nhau.
+ Glycosyl hóa là một trong những biến đổi quan trọng sau chuyển dịch,
xảy ra bên trong lòng của lưới nội chất (ER) và trong phức hợp Golgi. Phức
hợp ER và Golgi rất quan trọng trong việc xác định mục tiêu và vận chuyển
protein. Q trình glycosyl hóa liên kết N bắt đầu trong lưới nội chất và tiếp
tục trong phức hợp Golgi sau khi polypeptit được tổng hợp trên ribosome. Tuy
nhiên, quá trình glycosyl hóa liên kết O chỉ xảy ra trong phức hợp Golgi.
+ Trong quá trình này, oligosaccharide được gắn vào protein sẽ liên kết
với một lipid chuyên biệt có trong ER, dolichol phosphate, bao gồm khoảng 20
đơn vị isoprene (C5). Thông qua photphat dolichol photphat, oligosaccharid
được chuyển đến phần dư asparagin cụ thể của chuỗi polypeptit trên ribosom.
Enzyme chịu trách nhiệm cho protein glycosyl hóa và oligosaccharide được
hoạt hóa nằm ở phía lumen của ER.

+ Sau đó, chúng được vận chuyển đến phức hợp Golgi, nơi các đơn vị
carbohydrate được thay đổi và hoàn thiện. Phức hợp Golgi chịu trách nhiệm
cho việc gắn đường liên kết O và sửa đổi đường liên kết N. Sau đó, các protein
được nhắm mục tiêu và vận chuyển đến đích của chúng.
Do những vấn đề gặp phải ở E. coli đối với việc sản xuất protein lớn hơn
hoặc protein biến đổi, hệ thống tiếp theo có hiệu quả về chi phí, nhanh chóng,
mật độ cao và dễ xử lý là nấm. Saccharomyces cerevisiae (nấm men) là hệ
thống được lựa chọn khi khó thu được protein điều trị ở dạng hòa tan và với
các biến đổi sau chuyển giao thích hợp trên vật chủ vi khuẩn. Trong nấm men
có sẵn các thể đột biến có thể cho năng suất cao. Các sản phẩm đã được phê
duyệt thu được từ các hormone, vắc xin, các yếu tố kích thích thuộc địa của đại
thực bào bạch cầu hạt tái tổ hợp (GM-CSF), albumin, hirudin và yếu tố tăng
trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (PDGF).
Những ưu điểm của S. cerevisiae là:
−

Nó tiết ra protein tái tổ hợp trong mơi trường ni cấy,

−

Protein được gấp lại đúng cách,

−

Nó thực hiện hầu hết các biến đổi sau thể chế.

9


Với hệ thống nấm men, thu được một lượng lớn protein tái tổ hợp và

yeastis cũng có khả năng thực hiện các biến đổi sau chuyển dịch như glycosyl
hóa liên kết O, phosphoryl hóa, acetyl hóa và acyl hóa nhưng có sự khác biệt
lớn về các kiểu glycosyl hóa liên kết N. [3]
1.2. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào cơn trùng
Tế bào cơn trùng có thể bị nhiễm vi khuẩn baculovirus là vi rút DNA hình
trịn sợi kép với động vật chân đốt là vật chủ. Biểu hiện gen qua trung gian
Baculovirus ở côn trùng là một phương pháp được nhiều người lựa chọn và
hiệu quả về chi phí, cho năng suất protein tái tổ hợp cao hơn nhiều so với các
hệ thống khác. Có thể tạo ra lượng protein lớn dẫn đến sản xuất protein được
xử lý chính xác và có hoạt tính sinh học.
Virus gây bệnh đa bội nhiễm trực khuẩn Autographa californica
( AcMNPV ) được sử dụng như một vector nhân bản cho các dịng tế bào cơn
trùng. Trong virut này, protein đa diện được sử dụng, cần thiết trong mơi
trường sống bình thường và thể hiện tốc độ phiên mã cao, nhưng không cần
thiết trong ni cấy tế bào. Do đó, trình tự mã hóa của gen được thay thế bằng
DNA ngoại lai. Gen được phiên mã dưới sự kiểm soát của promoter đa diện
mạnh mẽ với năng suất cao (~ 30% tổng số protein tế bào). Sản lượng quan sát
được có thể thay đổi do quá trình nhiễm vi rút và hiệu giá vi rút.
Việc sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào côn trùng tốn nhiều thời gian
(so với hệ thống vi khuẩn) vì tế bào phát triển chậm và chi phí mơi trường cao.
Mỗi khi cần có tế bào tươi, sự lây nhiễm virut có thể gây chết các tế bào. Nó
cũng có những hạn chế trong việc thực hiện các sửa đổi sau giao hợp vì nó thực
hiện glycosyl hóa N khơng được liên kết tổng hợp. Tất cả các tối ưu hóa khác
cần phải hồn hảo vì năng suất phụ thuộc vào hiệu giá virus và thời gian từ khi
nhiễm đến khi biểu hiện. Tế bào côn trùng được ưu tiên hơn khi protein hoạt
động khó có được trong hệ thống E. coli .
Kỹ thuật di truyền đã được sử dụng để chọn MIMIC ™ (Invitrogen) và
SfSWT-3, là các dòng tế bào chuyển gen biểu hiện tất cả các enzym cần thiết
để có được mơ hình glycosyl hóa liên kết N phức hợp được nhân bản hóa. Hệ
thống này đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu cấu trúc vì các protein

10


của sinh vật nhân chuẩn được gấp lại một cách chính xác có thể thu được ở
dạng tiết giúp đơn giản hóa các quy trình tinh sạch. Một số dược phẩm sinh học
đã được phê duyệt từ dòng tế bào côn trùng bị nhiễm bệnh Hi Five là Cervarix
(vi rút papillomavirus tái tổ hợp đầu cuối C cắt ngắn protein capsid chính L1
loại 16 và 18, được sử dụng làm vắc xin ung thư).
Glycosyl hóa là một vấn đề gặp phải khi tế bào côn trùng được sử dụng để
sản xuất các protein glycosyl hóa tái tổ hợp ở người. Cần rất nhiều kỹ thuật di
truyền để tạo ra quá trình glycosyl hóa giống như con người trong tế bào cơn
trùng. Do đó, hệ thống được ưu tiên để sản xuất protein ở người trong điều trị
là hệ thống của động vật có vú (dịng tế bào buồng trứng chuột lang Trung
Quốc). Do mất nhiều thời gian và khó khăn trong việc duy trì các tế bào cơn
trùng, các tế bào của động vật có vú đã được khám phá để sản xuất protein tái
tổ hợp. Tế bào động vật có vú, nhờ các đặc tính gấp, lắp ráp và sửa đổi sau
chuyển dịch của protein, đã trở thành hệ thống ưa thích để sản xuất protein và
hiện chiếm vai trị chính trong sản xuất protein tái tổ hợp.[3]
1.3. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào động vật có vú
Tế bào động vật có vú: Sản xuất các protein phức tạp địi hỏi q trình xử
lý rộng rãi và các sửa đổi sau giao hợp. Tế bào động vật có vú có lợi thế khi
thực hiện PTM một cách chính xác; chúng tiết ra protein tái tổ hợp vào mơi
trường ở dạng tự nhiên, do đó bỏ qua các bước quan trọng của q trình biến
tính và tái cấu trúc, đôi khi dẫn đến các protein không hoạt động. Do đó, các
protein điều trị chính (60–70%) được sản xuất trong tế bào động vật có vú, chủ
yếu là tế bào buồng trứng chuột hamster Trung Quốc (CHO) và tế bào thận
chuột hamster con (BHK). Tế bào CHO tương đối dễ thao tác và các đặc tính
của chúng giúp sản xuất quy mô lớn . Các protein được sản xuất an tồn để sử
dụng ở người mà khơng có phản ứng phụ nào do mơ hình glycosyl hóa tương

tự. Tế bào buồng trứng (CHO) và thận của chuột hamster Trung Quốc (BHK)
là những nhà sản xuất nổi bật của protein tái tổ hợp .
Trong tế bào động vật có vú, các gen có thể được biểu hiện nhất thời hoặc
ổn định. Để có được các dịng tế bào được biến đổi ổn định yêu cầu sử dụng
một số điểm đánh dấu có thể lựa chọn. Một ưu điểm chính khác của các tế bào

11


này là chúng có thể được ni cấy ở dạng huyền phù, trong mơi trường khơng
có huyết thanh (SF), khơng chứa protein và được xác định về mặt hóa học. Sản
phẩm an tồn mà khơng có nguy cơ nhiễm prion của bệnh não xốp ở bò (BSE)
từ albumin huyết thanh bò và nhiễm trùng biến thể bệnh Creutzfeldt-Jakob
(vCJD) từ huyết thanh người.
Sản xuất khơng có huyết tương bao gồm việc loại bỏ các dẫn xuất huyết
tương trong mỗi bước (như phát triển dòng tế bào, xử lý ngược dòng, xử lý tiếp
theo và cơng thức cuối cùng) của quy trình với các kiểm tra thích hợp sau sản
xuất. Các nhà sản xuất đã chuyển từ việc sử dụng huyết thanh sang mơi trường
ni cấy tế bào khơng có huyết thanh với môi trường không chứa sản phẩm
động vật và cuối cùng là mơi trường khơng chứa protein, hồn tồn tổng hợp
được xác định về mặt hóa học. Mơi trường bao gồm các chất thủy phân protein
có nguồn gốc từ nấm men, đậu nành và lúa mì với các axit amin, peptit,
carbohydrate, vitamin và các nguyên tố thiết yếu, được siêu lọc để loại bỏ bất
kỳ chất gây ô nhiễm không mong muốn nào .[3]
1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp ở cây chuyển gen
Thực vật chuyển gen có khả năng tăng cường sản xuất dược phẩm sinh học
tái tổ hợp. Hệ thống này có một số lợi thế, viz. chi phí thấp, an tồn (ít nguy cơ
ơ nhiễm mầm bệnh động vật), dễ mở rộng quy mơ, ổn định, có mặt các chất
chuyển hóa và khả năng sản xuất protein N-glycosyl hóa . Sinh học dựa trên
thực vật đã mở rộng để bao gồm các chất điều trị miễn dịch ung thư . Một số

yếu tố quan trọng nhất định cần được xem xét để nâng cao năng suất và chất
lượng của dược phẩm sinh học do thực vật sản xuất, cụ thể là cây ký chủ, băng
biểu hiện, nội địa hóa dưới tế bào, PTM và các phương pháp chiết xuất và tinh
chế protein. Công nghệ DNA và các phương pháp biến đổi gen cũng đã tham
gia ở một mức độ lớn, với những cải tiến đáng kể. Nghiên cứu
glycoengineering chuyên sâu đã được thực hiện để giảm khả năng sinh miễn
dịch của các protein tái tổ hợp được tạo ra trong thực vật. Những nhược điểm
của hệ thống này bao gồm thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, và ô nhiễm chất chuyển
hóa thực vật độc hại của sản phẩm. Các thách thức khác liên quan đến hệ thống
này là kiểm soát mức độ biểu hiện gen chuyển và quá trình tinh sạch phức tạp.

12


Nuôi cấy tế bào thực vật, hệ thống dựa trên mô thực vật và xây dựng cây
chuyển gen chủ yếu được sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp. Gen chuyển
thường được đưa vào tế bào thực vật bằng cách sử dụng nhiễm vi khuẩn
(nhiễm vi khuẩn nông) hoặc nhiễm vi rút hoặc thông qua các phương pháp tiếp
cận trực tiếp như bắn phá sinh học hoặc kỹ thuật qua trung gian PEG. Một ưu
điểm chính của các hệ thống biểu hiện này là sự biểu hiện của protein tái tổ hợp
trong ngăn tế bào hoặc cơ quan thực vật mong muốn. Các protein trị liệu của
con người được tạo ra trong thực vật thường biểu hiện giống như thực vật hơn
là mơ hình glycosyl hóa giống như ở người.
Thực vật chuyển gen đã được sử dụng như một nguồn vắc xin ăn được bao
gồm lúa, chuối, đậu Hà Lan, khoai tây, rau diếp và ngô.

Enzyme β-

glucocerebrosidase tái tổ hợp ở người (taliglucerase alfa được FDA chấp thuận
vào năm 2012) được sản xuất trên quy mô lớn trong nuôi cấy tế bào cà rốt

( Daucus carota ) (ProCellEx ™) để điều trị bệnh Gaucher. IgA mAb có nguồn
gốc thực vật đầu tiên trên thế giới nhận ra kháng nguyên bề mặt I / II của
Streptococcus mutans(CaroRx TM -an anti- S. mutans được sản xuất trong
thuốc lá), nguyên nhân chính gây sâu răng, đã được cấp phép ở Châu Âu và
được sử dụng để ngăn ngừa sâu răng . Thuốc sinh học được sản xuất trong thực
vật đang ở các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng hoặc triển khai trên thị trường
khác nhau . Ví dụ như HAI-05 (Thuốc chủng ngừa Cúm) [đối với vi-rút Cúm A
H5N1; cây ký chủ, thuốc lá ( N. tabacum ); tình trạng, giai đoạn II], Insulin
(SBS-1000) [cho bệnh tiểu đường; cây ký chủ, cây rum ( Carthamus tinctorius),
trạng thái, giai đoạn III], ZMApp (hỗn hợp kháng thể đơn dòng) [đối với vi rút
Ebola; cây ký chủ, thuốc lá ( N. benthamiana ); trạng thái, giai đoạn II], và
Hormone tăng trưởng của con người [để điều trị thiếu hụt; cây ký chủ, hạt đại
mạch ( H. vulgare ); trạng thái, thương mại hóa] . Hormone tăng trưởng ở
người là protein tái tổ hợp đầu tiên được sản xuất trong thuốc lá chuyển gen .
Xử lý kết hợp chất ức chế mannosidase kifunensine (KIF) và swainsonine
(SWA) trong môi trường nuôi cấy tế bào lúa chuyển gen có thể là một phương
pháp hiệu quả để sản xuất axit α-glucosidase tái tổ hợp của người (rhGAA)
hiển thị glycans mannose cao chiếm ưu thế như Man7GlcNAc2,

13


Man8GlcNAc2, và Glycoform Man9GlcNAc2 (Man7 / 8/9) khơng có thao tác
di truyền glycosyl hóa .[4]
Bảng 1: Ưu điểm và nhược điểm của các hệ thống biểu hiện protein trị liệu
tái tổ hợp
Hệ

Ưu điểm

Nhược điểm

thống
biểu
hiện
Vi

−

khuẩn
−
−

Các dòng tế bào được đặc trưng −

Hồ

sơ

glycosyl

tốt

không của con người

Điều kiện tăng trưởng đơn giản −

Các vấn đề xuất khẩu và

và rẻ

gấp

Quy trình tăng trưởng được tối

30kDa)

protein

lớn

hóa

(>

ưu hóa
−

Có thể mở rộng

−

Thích hợp với kỹ thuật di truyền

−

Khoảng thời gian sản xuất rất
ngắn

Côn

−
−

Phê duyệt quy định hiện tại
Mức độ biểu hiện protein cao

trùng

−

Có thể mở rộng

con người có chứa đường

−

Khả năng tạo ra các protein

gây miễn dịch

phức tạp của sinh vật nhân −

Các sửa đổi sau giao dịch

chuẩn với khả năng gấp / hịa

khơng mong muốn

−

Khơng glycosyl hóa của

tan / sửa đổi sau chuyển dịch
chính xác
Tế

−
bào −

Phê duyệt quy định hiện tại
Các sửa đổi sau giao dịch đúng

−

Yêu cầu tăng trưởng

động vật −

Năng suất cao

phức tạp làm tăng chi phí

có vú

Nhiều sản phẩm hiện tại tạo tiền −

Các tế bào phức tạp cản

lệ cho các cơ quan quản lý

trở kỹ thuật và hiểu biết

Nghiên cứu tích cực và tài trợ −

Sản phẩm dị loại

−
−

14


cho ngành
−

−

Phê duyệt quy định hiện tại

Nguy cơ ô nhiễm mầm
bệnh ở người cao hơn

−

Dịng ơ khơng ổn định

−

Thời gian sản xuất dài

−
Khả năng mở rộng quy mơ tối −

Khó mở rộng quy mơ
Glycosyl hóa khơng phải

đa

của con người có chứa

−

Chi phí tăng trưởng thấp

đường gây miễn dịch

−

Có thể tạo ra các protein phức −

-Thiếu sự chấp thuận của

tạp

cơ quan quản lý

Thực vật −

−

Nguy cơ ô nhiễm mầm bệnh ở
người thấp

−

Quy trình tăng trưởng được tối

Động

−

ưu hóa
Khả năng mở rộng quy mô lớn

vật

−

Các sửa đổi sau giao dịch đúng

sức để tạo ra sinh vật

−

Thu hoạch dễ dàng

chuyển gen

−

Kỹ thuật canh tác tối ưu

−

Thời gian sản xuất dài

−

Dòng tế bào ổn định

−

Các vấn đề về quy định

−

Chi phí sản xuất thấp

−

Phê duyệt quy định hiện tại

−

Khó và tốn nhiều cơng

và đạo đức
−

Hệ

thống

sản

xuất

protein tái tổ hợp kém
đặc trưng
Nấm

−

men
−

−
Điều kiện tăng trưởng đơn giản −

Kiểm sốt thấp
Khơng glycosyl hóa của

và rẻ

con người có chứa đường

Tăng trưởng nhanh với mật độ

gây miễn dịch

cao
−

Các dòng tế bào được đặc trưng
tốt

−

Quy trình tăng trưởng được tối
ưu hóa

15


−

Có thể mở rộng

−

Vừa phải thích ứng với kỹ thuật
di truyền

−

Quy trình gấp và xử lý protein
đúng

−

Thời gian sản xuất ngắn

−

Dòng sản xuất ổn định

−

Phê duyệt quy định hiện tại.

2. Quy trình ngược dịng
Trong q trình phát triển tế bào, việc lựa chọn tế bào chủ và vectơ biểu
hiện cũng như các phương pháp chuyển nạp và chọn lọc là rất quan trọng để có
năng suất cao và chất lượng sản phẩm xác định . Quá trình phát triển bắt đầu
với việc xác định các tế bào biểu hiện protein mong muốn và các tế bào đã xác
định được sử dụng cho quy mơ nhỏ (ống nghiệm, bình lắc) và ni cấy bằng lị
phản ứng sinh học để đánh giá mức độ tăng trưởng và sản xuất protein của tế
bào.
Các phương thức nuôi cấy theo lô, theo mẻ và liên tục hoặc tưới máu được
sử dụng để sản xuất dược phẩm sinh học dựa trên protein tái tổ hợp. Trong quy
trình cho ăn theo mẻ, các chất dinh dưỡng được cung cấp trong q trình canh
tác. Trong ni cấy truyền dịch, môi trường được luân chuyển qua môi trường
nuôi cấy đang phát triển để cho phép đồng thời loại bỏ chất thải và cung cấp
chất dinh dưỡng . Trong môi trường nuôi cấy phản ứng sinh học liên tục hoặc
chemostat, thức ăn có chứa các chất dinh dưỡng thiết yếu được đưa vào và sản
phẩm chứa sản phẩm nuôi cấy được thu hồi liên tục. Nếu tốc độ pha loãng
mong muốn nhỏ hơn tốc độ phát triển của tế bào, thì sự tăng trưởng này cần
được kiểm sốt bằng cách sử dụng nuôi cấy turbidostat hoặc chemostat.
Tuy nhiên, nếu tốc độ pha loãng nhiều hơn tốc độ phát triển của tế bào, tế

bào cần được đưa trở lại lò phản ứng sinh học.
Trong một nghiên cứu của Hou et al. (2019) , người ta đã báo cáo rằng mức
độ phosphoryl hóa và hydroxyl hóa của protein dung hợp Fc có thể được giảm

16


thiểu bằng cách tối ưu hóa chất dinh dưỡng trong quy trình cho ăn theo mẻ
CHO. Việc áp dụng MTP theo lơ ni để sàng lọc HTP các dịng E. coli (32
chủng) cũng đã được thiết lập . Nuôi cấy theo lô và nuôi theo lô theo cấp số
nhân được thiết kế để đánh giá ảnh hưởng của tốc độ tăng trưởng cụ thể (μ) và) và
dẫn đến quá trình glycosyl hóa glycoprotein AcrA tái tổ hợp và tốc độ tổng hợp
cụ thể tối đa ở μ) và max . Một nghiên cứu khác đánh giá các phương thức nuôi
trồng liên tục và theo mẻ đối với protein tái tổ hợp ở P. pastoristiết lộ rằng ở
mức μ) và cao nhất và hiệu suất thể tích và cụ thể ở chế độ liên tục lớn hơn khoảng
1,5 và 3 lần so với ở chế độ hàng loạt . Việc sử dụng cơng nghệ lị phản ứng
sinh học để sản xuất bền vững các sản phẩm có nguồn gốc từ tế bào thực vật đã
được mô tả ở những nơi khác .
Để sản xuất mAbs trị liệu bằng cách sử dụng tế bào động vật có vú, phương
pháp ni cấy truyền dịch là lựa chọn ưu tiên, vì chế độ này làm giảm thời gian
cư trú của mAbs trong lò phản ứng sinh học. Trong nuôi cấy truyền dịch, các
thiết bị lưu giữ tế bào (lọc dòng tiếp tuyến, bộ lọc spin và hệ thống lọc dòng
tiếp tuyến xen kẽ) là rất quan trọng để thu hồi môi trường nuôi cấy có chứa sản
phẩm mong muốn từ lị phản ứng sinh học. Việc phát triển và tối ưu hóa quy
trình truyền dịch tập trung vào quy trình truyền dịch, chiến lược cho ăn, thời
gian nuôi cấy và tốc độ truyền dịch . Trong một nghiên cứu gần đây, một quy
trình tưới máu nuôi cấy tế bào tăng cường mới, thay thế đã dẫn đến việc nâng
cao năng suất thể tích gấp 2 lần so với quy trình ni theo lơ được tối ưu hóa,
sẵn sàng thương mại . Trong một nghiên cứu khác, một hệ thống phản ứng sinh
học tưới máu dựa trên thành phần chất lỏng sử dụng một lần đã được phát triển

và cho phép thực hiện kiểm soát mơi trường tích cực . Trong một nghiên cứu
của Bertrand et al. (2019) , tác động của nuôi cấy truyền dịch đối với trạng thái
sinh lý nội bào của dòng tế bào CHO đã được nghiên cứu, cho thấy năng suất
mAb giảm cũng như giai đoạn chuyển tiếp đối với các chất chuyển hóa và chất
lượng sản phẩm trước khi đạt được điều kiện ở trạng thái ổn định. Đối với sản
xuất vắc xin vi rút bằng cách sử dụng các tế bào phụ thuộc vào neo (ví dụ, tế
bào Vero), các chất mang vi mô là cần thiết trong lị phản ứng sinh học. Các
sóng mang vi mơ cũng cung cấp sự bảo vệ cho các tế bào khỏi bị cắt quá mức.

17


Loại lị phản ứng sinh học và kiểm sốt quy trình cũng là những yếu tố
quan trọng cần xem xét để tối ưu hóa quy trình thành cơng và phát triển quy
trình hiệu quả . Các lị phản ứng sinh học được sử dụng để sản xuất dược phẩm
sinh học bao gồm lò phản ứng sinh học thùng khuấy, lò phản ứng sinh học
khơng vận, lị phản ứng sinh học cột bong bóng, lị phản ứng sinh học sợi rỗng
và lị phản ứng sinh học tầng sơi và cố định . Lị phản ứng sinh học dạng màng
cũng có sẵn trên thị trường (lò phản ứng sinh học miniPERM của Vivascience
và CELLine của Integra Biosciences) và được sử dụng để sản xuất mAbs quy
mô nhỏ .
Các thông số vận hành khác nhau [nhiệt độ, pH, kích động, sục khí, oxy
hịa tan (DO), CO 2 và lực cắt thủy động lực học] được sử dụng để ni cấy lị
phản ứng sinh học cũng cần được tối ưu hóa để đạt được năng suất nâng cao
cho dược phẩm sinh học tái tổ hợp sử dụng các hệ thống ký chủ biểu hiện
protein khác nhau. Việc phát triển thành công và tối ưu hóa quy trình sinh học
cũng tính đến sự thay đổi nhiệt độ và trao đổi khí trong q trình canh tác. Việc
tối ưu hóa tất cả các thơng số được mô tả ở trên dẫn đến mật độ tế bào cao và
tăng cường năng suất thể tích và cụ thể với chất lượng sản phẩm tốt hơn. Các
chiến lược tối ưu hóa quy trình thành cơng đã dẫn đến việc tăng năng suất sản

phẩm từ 50 mg / l lên 5–20 g / l đối với mAbs . Trong một nghiên cứu gần đây,
người ta cũng xác định rằng sự thơng khí và căng thẳng cắt là các thơng số quá
trình quan trọng để sản xuất vi rút sởi oncolytic bằng cách sử dụng tế bào
Vero .
Phát triển quy trình thượng nguồn cũng bao gồm việc mở rộng quy mô của
quy trình lên men để đảm bảo sản phẩm có chất lượng tương tự ở quy mô lớn
như được sản xuất ở quy mô nhỏ. Kiến thức kỹ lưỡng về các thơng số lị phản
ứng sinh học ở các quy mô khác nhau giúp mở rộng quy mô thành công các
quy trình sản xuất mạnh mẽ. Các thơng số quan trọng để mở rộng quy mô, rất
quan trọng đối với sự phát triển tế bào, khả năng tồn tại và sản xuất protein
hiệu quả, bao gồm trộn, truyền oxy, đặc điểm truyền nhiệt và lực cắt . Tiêu chí
được sử dụng phổ biến nhất để mở rộng quy mô là giữ cho một hoặc nhiều
tham số giống nhau giữa các thang đo khác nhau. Các thông số như vậy bao

18