Phân tích cấu trúc, hàm lượng của zerumbon được phân lập từ củ gừng gió bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ OANH

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƢỢNG CỦA
ZERUMBON ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ CỦ GỪNG GIÓ
BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Thái Nguyên-2018

Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!!


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn:
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phạm Thị Thắm cô
đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo và truyền đam mê nghiên cứu cho em trong
suốt q trình hồn thành luận văn, cơ đã tận tình hướng dẫn để em hồn
thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo khoa Hóa học trường Đại
học Khoa học - ĐHTN, tập thể các thầy cô, anh chị và các bạn tại khoa Hóa
học trường Đại học Khoa học - ĐHTN đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong
suốt q trình hồn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể cán bộ giáo
viên Trường THPT Nguyễn Trãi - An Dương- Hải Phòng đã tạo điều kiện
thuận lợi về thời gian và cơng việc để em hồn thành luận văn.
Em xin cảm sự hỗ trợ của nhóm nghiên cứu công ty TNHH Công
nghệ cao Hải Anh đã hỗ trợ cùng hoàn thành các kết quả thực nghiệm.

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô đã dạy dỗ em nên
người!
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã
giúp đỡ em hoàn thành luận văn.
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Oanh

a


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... a
MỤC LỤC ..................................................................................................... b
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... c
DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................... d
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... e
DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................... f
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
Chương 1 TỔNG QUAN .............................................................................. 2
1.1. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc ................................. 2
1.1.1. Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1-4] ........................................... 2
1.1.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1] ................................................ 4
1.1.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................ 5
1.2. Phân tích hàm lượng các chất bằng HPLC [23]................................... 10
1.3. Đặc điểm thực vật cây gừng gió .......................................................... 14
1.4. Thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) ............. 14
1.5. Các đặc trưng của zerumbon.................................................................. 20
1.5.1. Phân lập và chuyển hóa zerumbon ...................................................... 20
1.5.2. Hoạt tính sinh học của gừng gió và zerumbon ................................. 22

1.6. Mục tiêu của luận văn .......................................................................... 23
Chương 2 THỰC NGHIỆM ........................................................................ 24
2.1. Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị................................ 24
2.1.1. Phương pháp nghiên cứu................................................................... 24
2.1.2. Hóa chất và dung mơi ....................................................................... 24
2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng
sắc kí lớp mỏng ........................................................................................... 24
2.1.4. Xác nhận cấu trúc .............................................................................. 24
2.2. Chuẩn bị mẫu zerumbon ...................................................................... 25
2.2.1. Chuẩn bị mẫu gừng gió ..................................................................... 25
b


2.2.2. Chưng cất tinh dầu gừng gió ............................................................. 25
2.2.3. Phân lập zerumbon ............................................................................ 26
2.3. Phân tích cấu trúc zerumbon bằng các phương pháp phổ.................... 27
2.3.1. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ IR ................................. 27
2.3.2. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ MS................................ 27
2.3.3. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ 1H-NMR ....................... 27
2.3.4. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ 13C-NMR...................... 28
2.4. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ 2D (HSQC, HMBC,
NOESY) ...................................................................................................... 28
2.5. Phân tích độ sạch của zerumbone bằng LC ......................................... 29
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 30
3.1. Mục tiêu của đề tài ............................................................................... 30
3.2. Kết quả chuẩn bị mẫu nghiên cứu ........................................................ 30
3.2.1. Phân tách tinh dầu ............................................................................. 30
3.2.2. Khảo sát điều kiện tách mẫu nghiên cứu .......................................... 30
3.2.3. Phân tách zerumbone bằng sắc ký cột .............................................. 31
3.3. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ IR .................................... 31

3.4. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ MS ................................. 33
3.5. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ NMR ............................. 34
3.6. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ HSQC và HMBC .......... 37
3.7. Phân tích độ sạch của zerumbone bằng phương pháp LC ................... 41
KẾT LUẬN ................................................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 44

c


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MS

Phương pháp phổ khối lượng

EI

Phương pháp bắn phá bằng dịng electron

CI

Phương pháp ion hóa hóa học

FAB

Phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh

GC

Phương pháp sắc ký khí

LC

Phương pháp sắc ký lỏng

IR

Phương pháp phổ hồng ngoại

SKLM

Sắc kí lớp mỏng

TMS

Chất chuẩn

HSQC

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều biểu
hiện tương tác trực tiếp giữa H với C mà nó
liên kết trực tiếp.

1H-NMR

Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của
hiđro

13C-NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của

cacbon
COSY

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều thể hiện
tương tác của các proton gần nhau trong
không gian

DEPT

Phương pháp ghi phổ

HMBC

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều thể hiện
tương tác xa của nguyên tử 1H với 13C

c


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Sự va chạm này đủ để làm bật ra một trong các electron của
phân tử. .......................................................................................................... 2
Sơ đồ 1.2: Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành
các ion ........................................................................................................... 3
Sơ đồ 1.3: Sơ đồ bắn phá các phân tử ........................................................... 3

d


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Phổ khối lượng của axeton (CH3COCH3 ) .................................... 4
Hình 1.2. Phổ hồng ngoại của ancol isopropylic .......................................... 5
Hình 1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của axetanđehit ............................... 7
Hình 1. 4 Phổ cộng hưởng từ 2 chiều ........................................................... 9
Hình 1.5 Phổ COSY của 2 - Clorobutan ..................................................... 10
Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC .................................................... 11
Hình 1.7. Cây Gừng gió (Zingiber Zerssumbet Sm.) ................................. 14
Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất zerumbon ................................................... 32
Hình 3.2. Phổ MS của hợp chất zerumbone ............................................... 33
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất zerumbone....................................... 35
Hình 3.4. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone ............................... 35
Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất zerumbone...................................... 36
Hình 3.6. Phổ DEPT của hợp chất zerumbone ........................................... 37
Hình 3.7. Phổ HSQC giãn của hợp chất zerumbone................................... 38
Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất zerumbone ......................................... 40
Hình 3.9. Phổ HMBC giãn của hợp chất zerumbone.................................. 40
Hình 3.10. Một số tương tác của H với C trong HMBC............................. 41
Hình 3.11. Phổ LC và dữ liệu MS bắn phá đỉnh 2.18 ................................. 42
Hình 3.12. Đường chuẩn LC của zerumbone ............................................. 42

e


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió ....................... 15
Bảng 1.2: Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió .......................... 16
Bảng 1.3: Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió .................. 17
Bảng 1.4: Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió Huế ................ 19
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát TDZ bằng SKLM ............................................. 31

f


MỞ ĐẦU
Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ là một trong số các nhiệm vụ
quan trọng của Hóa học vì chỉ khi biết chính xác cấu trúc, chúng ta mới có
câu trả lời chính xác cho việc định tính, định lượng và phân tích chúng
trong các mẫu nghiên cứu thực cũng như trong đời sống và công nghệ. Để
phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ có thể sử dụng các phương pháp
phổ như phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt
nhân, phổ khối lượng. Mỗi phương pháp cho ph p xác định một số thông
tin khác nhau của cấu trúc phân tử và hỗ trợ lẫn nhau trong việc xác định
cấu trúc các hợp chất hữu cơ.
Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) là cây thuốc quen thuộc của các
dân tộc thiểu số ở miền núi phía Bắc và miền Trung Tây Nguyên Việt
Nam, là loài thực vật phát triển mạnh mẽ và phân bố ở hầu hết các nước
nhiệt đới Châu Á, được sử dụng làm các bài thuốc chữa đau bụng, bồi
dưỡng cho phụ nữ sau khi sinh nở, chống nơn, cảm gió… Gần đây, những
kết quả nghiên cứu trong và ngồi nước cho thấy Gừng gió có hàm lượng
zerumbon rất cao (73,2% trong tinh dầu củ). Kết quả nghiên cứu in vivo và
in vitro cho biết zerumbon không những có khả năng kháng khuẩn mà cịn
có khả năng chống ung thư mạnh và đang được đưa vào thử nghiệm lâm
sàng ở giai đoạn III. Do có cấu trúc phức tạp, hoạt tính sinh học mạnh nên
được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Luận văn này tập trung vào
nghiên cứu phân tích xác định cấu trúc và phương pháp định lượng
zerumbon bằng các phương pháp hóa lý hiện đại.

1

Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về c c phƣơng ph p

c

nh cấ

c

1.1.1. Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1-4]
Phổ khối lượng là phương pháp công cụ xác định cấu trúc khác nhiều
nhất so với các phương pháp sẽ được nói đến ở chương này. Phương pháp
phổ khối lượng không phụ thuộc vào sự hấp thụ chọn lọc các tần số cụ thể
của bức xạ điện từ mà chú trọng nhiều hơn những gì xảy ra với phân tử khi
nó bị bắn phá bởi các electron có năng lượng cao. Nếu một electron có
năng lượng khoảng 10 electronvolt ( 10 eV = 230,5 kcal/mol) va chạm với
một phân tử hữu cơ thì năng lượng được chuyển giao do kết quả của sự va
chạm này đủ để làm bật ra một trong các electron của phân tử.
A:B
Phân tử

+

e
electron

→.

+

cation gốc

2eHai electron

Sơ đồ 1.1: Sự va chạm để làm bật ra một trong các electron
của phân tử.
Chúng ta nói phân tử AB bị ion hóa bởi sự va chạm electron. Dạng
thu được gọi là ion phân tử mang điện tích dương và có số lẻ electron, được
gọi là cation gốc. Ion phân tử có cùng khối lượng (k m hơn một khối lượng
không đáng kể của một electron) như phân tử mà từ đó nó được tạo thành.
Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng
dịng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn
phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dịng electron có năng lượng cao để
bắn phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất. Khi bắn phá các
phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện
tích dương hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:

2


2e (1) > 95%

ABC
ABC

e
ABC

2

3e (2)

ABC-

Sơ đồ 1.2: Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành
các ion
Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là
các ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-). Năng lượng bắn phá các
phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhưng với năng lượng cao thì ion
phân tử có thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các
gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta thường thực hiện bắn
phá các phân tử ở mức năng lượng 70 eV.
ABC

A

ABC

AB

AB

A

BC
B
B

Sơ đồ 1.3: Sơ đồ bắn phá các phân tử
Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và
năng lượng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa. Các ion dương
hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e, tỉ số m/e được gọi là
số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau
và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối
liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì đồ thị này
được gọi là phổ khối lượng (Hình 1.1).

3


Hình 1.1. Phổ khối lượng của axeton (CH3COCH3 )

Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng
phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác
định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong
những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một
chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau.
1.1.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1]
Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho
nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất. Khi chiếu các bức xạ
hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân
tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn. Có hai
loại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị và biến dạng,
dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến
dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết.
Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ
hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp
thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết

nhất định (Hình 1.2).

4


Hình 1.2. Phổ hồng ngoại của ancol isopropylic

Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc
trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong
phân tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng
ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau
của các vân ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường
được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau.
Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được
chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng.
Các pic nằm trong vùng từ 4000 – 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc
biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH,
C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 – 626
cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là
để xác định nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ
hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ khoảng 3000 cm-1 đến
1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay.
1.1.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [1]
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện
đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến
5


được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và
13

C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường khơng đổi thì moment từ

của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là
spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [2].
Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các
hạt nhân 1H và

13

C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc

trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học
δ; đối với hạt nhân 1H thì:


 TMS  x 6
.10 ( ppm)
o

Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của
hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định
nghĩa một các tổng quát như sau:


 chuan  x 6
.10 ( ppm)
o

Trong đó: νchuẩn, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao
quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C
trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn
đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa
học của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường
yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [3].
Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có
mặt trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học khơng có thứ
ngun mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá
trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm.

6


Hình 1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của axetanđehit

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân
không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi là vân phổ, mỗi
vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên
sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các
hạt nhân có từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron
liên kết. Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết
và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác [3].
Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa
các hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có
thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với
nhau [2].
Phổ 2D-NMR

NMR (nuclear magnetic resonance) là kỹ thuật có giá trị nhất để xác
định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Phương pháp NMR có hạn chế là chỉ áp
dụng cho các hạt nhân nguyên tử với số hiệu nguyên tử (số thứ tự Z) lẻ

7


hoặc số khối (A) lẻ vì các nguyên tử loại này có spin hạt nhân thì mới có
tính chất từ như 1H, 13C, 15N, 19F, 31P… Các hạt nhân không có tính từ như
2

D, 12C, 16O, 32S… khơng thể hiện trên phổ NMR.
Ngày nay phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là công cụ hữu

hiệu cho nhiều ngành khoa học như vật lý, hóa học, sinh học, dược học, y
học, v.v. Nó đã đạt được nhiều thành cơng trong phạm vi chế tạo thiết bị,
cải tiến phương pháp đo và ứng dụng. Một trong những hành động gần đây
nhất là xây dựng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều ( 2DNMR), ba chiều (3D-NMR), bốn chiều (4D-NMR). Sự phát triển của
phương pháp 2D-NMR đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân tích cấu
trúc các phân tử phức tạp. Trước đây nhờ nâng cao cường độ từ trường nam
châm, chế tạo các máy cộng hưởng từ hạt nhân có tần số cao từ 300 đến
1000 MHz đã làm giảm nhẹ đi một số khó khăn cho việc phân tích phổ 1HNMR của các phân tử phức tạp, tuy nhiên trong nhiều trường hợp vẫn chưa
giải quyết được chính xác được cấu tạo của chất, ngày nay phương pháp
phổ 2D-NMR cho ta một lượng lớn thông tin, giúp cho việc phân tích phổ
một cách dễ dàng hơn, đặc biệt phổ 3D-NMR cho ph p xác định cấu trúc
các phân tử sinh học phức tạp.

8

Hình 1. 4 Phổ cộng hưởng từ 2 chiều
Cơ sở của phương pháp 2D-NMR dựa theo phương pháp cộng
hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier do đó được gọi là phương pháp phổ
cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier hai chiều (2D-FT-NMR).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều COSY hay HHCOSY chỉ ra
sự tương tác của các proton ở hai nguyên tử C cạnh nhau.
Khi có hai nhóm proton tương tác với nhau sẽ tạo ra hình vng, hai
đỉnh hình vng nằm trên đường ch o, đó là vị trí hai tín hiệu của chúng
cịn hai đỉnh khác nằm phía ngồi đường ch o.
Ví dụ phổ COSY của 2-clorobutan
CH3-CH2-CH(Cl)-CH3

9


Hình 1.5 Phổ COSY của 2 - Clorobutan
Trên phổ thấy H-1(CH3, t) tương tác với H-3(m) tín hiệu của chúng
tạo thành hình vng, H-2 (CH3, d) tương tác với H-4 (m) tín hiệu của
chúng cũng tạo thành hình vng và H-3 tương tác với H-4 tương tự như
vậy.
1.2. Phân tích hàm lƣợng các chất bằng HPLC [23]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao đơi khi cịn được gọi là sắc ký lỏng áp
suất cao (High - Pressure) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân
tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố,
trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân
tích sắc ký, các chất được hịa tan trong dung mơi thích hợp và hầu hết sự
phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các hợp chất
khơng bền với nhiệt khơng bị phân hủy khi sắc ký. Sắc ký thường được
hoàn thành trong một thời gian ngắn (khoảng 30 phút). Chỉ những thành

phần có hệ số chọn lọc khác nhau mới có thể phân tích được bằng HPLC.
10


Ngày nay HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích
hóa học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích
sinh dược nói riêng.

Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC
(1) Bình chứa pha ộng: Máy HPLC thường có 4 đường dung môi

vào đầu bơm cao áp cho ph p chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung mơi cùng
một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%.
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung mơi cùng
một lúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được
pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình
rửa giải. Lưu ý: Tất cả dung mơi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh
khiết sử dụng cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha
hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.Việc sử dụng hóa
chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên
các pic tạp trong q trình phân tích.
(2) Bộ khử khí Degases: Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ
các bọt nhỏ cịn sót lại trong dung mơi pha động, tránh xảy ra một số hiện
tượng có thể có như sau:


Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời
gian lưu của peak thay đổi.
11



Trong trường hợp bọt q nhiều, bộ khử khí khơng thể lọai trừ hết
được thì bơm cao áp có thể khơng hút được dung mơi, khi đó ảnh
hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC.
Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.
(3) Bơm cao p: Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá

trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600bar
và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút.
(4) Bộ phận iêm mẫ : Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể
tích bơm có thể thay đồi. Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ
công và tiêm mẫu tự động (autosamper).
(5) Cộ sắc ký: Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ
thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng th p
không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt
nhồi cỡ 0,3-5µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào loại cột và kiểu sắc ký.
(6) Đầ dò: Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và
cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy
theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn loại đầu dị phù
hợp. Tín hiệu đầu dị thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát
xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…Trên cơ sở
đó, người ta sản xuất các loại đầu dò sau:
- Đầu dò quang phổ tử ngoại 190-360nm để phát hiện UV
- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để
phát hiện các chất hấp thụ quang. Đây là loại đầu dị thơng dụng nhất.
- Đầu dị huỳnh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh
quang tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang.
- Đầu dị DAD (Detector Diod Array) có khả năng qu t chồng phổ để

định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.
- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường.
- Đầu dị điện hóa: đo dịng, cực phổ, độ dẫn.
12


- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…
(7)Bộ phận ghi nhận ín hiệ : Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dị
phát hiện. Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm
trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thơng số liên quan
đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính tốn, xử lý
các thơng số liên quan đến kết quả phân tích.
(8) In dữ liệ : Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy
in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển.
Ngày nay, phương pháp HPLC được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh
vực phân tích định tính cũng như định lượng các thành phần trong dược
phẩm, thực phẩm, mơi trường, hóa chất,… Thiết bị HPLC cũng ngày càng
phát triển và hiện đại hơn nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo
và sản xuất thiết bị phân tích. Để đảm bảo chất lượng kết quả phân tích
nhiều loại chỉ tiêu trên các nền mẫu khác nhau, đáp ứng được nhu cầu phân
tích đa dạng của khách hàng, CASE cũng đã đầu tư các hệ thống HPLC
hiện đại của các hãng nổi tiếng trên thế giới trong sản xuất thiết bị phân
tích như Shimadzu (model 10A, 20A), Agilent (LC 1200), Dionex
(UltiMate 3000), Thermo, Mehtrom…với hầu hết các đầu dò như quang
phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ
dẫn (sắc ký ion-IC), khối phổ (MS),… Các hệ thống HPLC này đều có gắn
các bộ chích mẫu tự động nhằm nâng cao tính chính xác và có thể phân tích
đồng thời nhiều mẫu.

13

1.3. Đặc iểm thực vật cây gừng gió

Hình 1.7. Cây Gừng gió (Zingiber Zerssumbet Sm.)
Gừng gió là cây thảo mộc, cao 1 – 1,3 m. Thân rễ dạng củ, phân
nhánh, lúc non màu vàng và thơm, lúc già màu trắng và đắng, có mùi thơm.
Thân khí sinh khỏe, mọc đứng, nhẵn. Lá khơng cuống mọc thành 2 dãy,
hình mác thn dài, gốc hẹp dần, đầu nhọn, dài khoảng 20 cm, rộng 5cm
mặt trên nhẵn, mặt dưới có lơng rải rác. Bẹ lá to nhẵn, lưỡi bẹ tròn dễ gãy.
Cụm hoa dạng trứng, đơi khi hình trụ, kích thước 6 – 14 x 4 – 5 cm, chóp
tù, mọc từ thân rễ trên một cán mập dài 20 – 30 cm phủ bởi những lá bắc
xếp lớp; m p màu lục nhạt. Đài hoa nhỏ, tràng hoa có ống loe thành thùy
hẹp màu trắng; một nhị; bao phấn dài hơn trung đới, cánh mơi rộng màu
vàng nhạt. Các thùy hình mác dài, màu vàng chanh; có 3 thùy, thùy phía
lưng lớn hơn, kích thước 2,5 x 2 cm; các thùy bên nhỏ kích thước 1,6 x 0,7
cm; mơi dài 5 cm. M p có răng trịn, màu trắng hoặc vàng, bao phấn màu
vàng nhạt; bầu 3 ơ, quả nang hình bầu dục, chứa ít hạt màu đen. Mùa hoa
nở từ tháng 7 đến tháng 9 [1,3,9,22].
1.4. Thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.)
Trong Gừng gió có nhiều tinh dầu, dầu b o và nhựa dầu. Trong tinh
14


dầu có 13% các monoterpen và nhiều sesquiterpen, trong đó humulen 27%,
monocyclic, sesquiterpen, xeton, zerumbon 37,5%. Các monoterpen gồm
α - pinen, camphen, limonen, cineol, và camphor. Zerumbon là thành phần
chính của tinh dầu [22].
a)Thành phần hóa học của inh dầ củ Gừng gió
Tinh dầu cây Gừng gió chủ yếu tập trung ở bộ phận củ, tinh dầu củ

Gừng gió có mùi thơm nồng [9]. Tinh dầu củ Gừng gió mọc ở Trị Thiên và
Đắc Lắc – Việt Nam có các chỉ số hóa học được dẫn ra trong bảng 1.1 [9].
Bảng 1.1: Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió
Vùng

Chỉ số xà phịng hóa

Chỉ số axit

Chỉ số este

Bình Trị Thiên

8,9790

5,8796

3,0994

Đắc Lắc

8,5392

5,8769

2,6623

Thành phần hóa học chính của củ Gừng gió vùng Bình Trị Thiên –
Việt Nam cũng được chỉ ra trong bảng sau [9,13].

15


Bảng 1.2: Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió
Tên chất

TT

Hàm TT

Tên chất

Hàm

lượn

lượng

g (%)

(%)

1

Zerumbon

72,3

17 Myrcren

0,2

2

α-Humulen

4,2

18 α-Terpineol

0,2

3

Humulen-oxit I

3,8

19 (E)-nerolidol

0,1

4

Humulen-oxit II

3,3

20 α-Phelandren

0,1

5

Camphen

3,1

21 β-Pinen

0,1

6

Caryophylen oxit

1,5

22 Terpinen-4-ol

0,1

7

Campho

1,2

23 Bornyl axetat

0,1

8

1,8-cineol

0,8

24 Camphenhidrat

0,1

9

α-pinen

0,7

25 p-Cymen

0,1

10 Limonen

0,4

26 Fenchon

0,1

11 Linalol

0,4

27 Isoborneol

0,1

12 12-Norcaryophylen-2-on

0,4

28 Sabinen

0,1

13 Β-Caryophylen

0,3

29 Terpinolen

0,1

14 Bornol

0,2

30 α-Thujen

0,1

15 δ-3-Caren

0,2

31 Tricyclen

0,1

16 β-Eudesmol

0,2

Các chất chưa

4,9

nhận biết được
b) Thành phần hóa học của inh dầ

hân và l Gừng gió.

Tinh dầu thân, lá và hoa Gừng gió đều có màu vàng xanh nhạt, phảng
phất mùi thơm của tinh dầu hoa bưởi [9]. Có khoảng 40 hợp chất tìm thấy
trong tinh dầu thân, lá Gừng gió (chiếm hơn 84% và 82% tinh dầu). Năm
1995, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học
tinh dầu thân, lá Gừng gió vùng Bình Trị Thiên, kết quả được chỉ ra trong
bảng 1.3.
16

Bảng 1.3: Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió
Tên chất

TT

Thân Gừng

Lá Gừng

gió (%)

gió (%)

1

α - thujen

Vết

Vết

2

α – pinen

1,1

1,6

3

Camphen

0,2

Vết

4

Sabinen

0,5

Vết

5

β - pinen

5,4

5,2

6

Myrcen

0,1

Vết

7

∆3 – caren

Vết

0,9

8

P – Cymen

0,1

0,5

9

1,8 – cineol

0,3

0,6

10 Linomen

0,1

0,3

11 (Z) – β - ocimen

Vết

Vết

12 (E) – β - ocimen

0,6

0,6

13 Linalol

1,1

2,4

14 2-metyl-6-metylen-1,7-octadien

0,5

1,0

15 Campho

0,3

1,2

16 Trans-pinocarverol

0,7

0,3

17 Isoborneol

Vết

Vết

18 Borneol

0,8

0,8

19 Terpinen-4-ol

0,8

0,6

-

0,3

21 α - terpineol

0,2

0,4

22 Myrtenol

0,2

0,5

23 2 – Undecanon

0,3

0,6

24 Dihidroedulan I

0,2

0,5

20 Myrtenal

17