Luận văn thạc sĩ sinh học nghiên cứu nhân giống các dòng keo lai năng suất cao bv376, bv586, bb055 bằng phương pháp nuôi cấy mô

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Văn Thu Huyền

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI
NĂNG SUẤT CAO BV376, BV586, BB055
BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Hà Nội – 2021

Luận văn thạc sỹ Sinh học


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Văn Thu Huyền

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI
NĂNG SUẤT CAO BV376, BV586, BB055
BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ
Chuyên ngành :

Sinh học thực nghiệm

Mã số :

8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hƣớng dẫn 1: TS. Lê Sơn
Hƣớng dẫn 2: TS. Đỗ Tiến Phát

Hà Nội - 2021

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Nghiên cứu nhân giống các
dòng Keo lai năng suất cao BV376, BV586, BB055 bằng phương pháp nuôi
cấy mô” là do tôi thực hiện với sự hƣớng dẫn của TS. Lê Sơn và TS. Đỗ Tiến
Phát. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là do tơi trực tiếp thu
thập, đồng thời có kế thừa kết quả các đề tài ―Nghiên cứu chọn tạo giống Keo

lai sinh trưởng nhanh bằng chỉ thị phân tử‖ và đề tài ―Nghiên cứu chọn tạo
giống Keo lai và Keo lá tràm phục vụ trồng rừng gỗ lớn ở một số vùng sinh
thái chính‖ do Viện Nghiên cứu Giống và Cơng nghệ Sinh học Lâm nghiệp –
Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam chủ trì thực hiện.
Mọi kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng của các tác giả khác (nếu có)
đều đƣợc trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ
tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào cũng nhƣ chƣa đƣợc công
bố trên bất kỳ phƣơng tiện nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam
đoan trên.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Tác giả

Văn Thu Huyền

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Lời cảm ơn
Sau khi hồn thành các mơn học trong chƣơng trình đào tạo thạc sĩ,
đƣợc sự đồng ý của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, tôi tiến hành khóa luận ―Nghiên cứu nhân
giống các dịng Keo lai năng suất cao BV376, BV586, BB055 bằng phương
pháp nuôi cấy mô’’. Khóa luận đƣợc thực hiện tại Viện Nghiên cứu Giống và
Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam,
Đức Thắng – Bắc Từ Liêm - Hà Nội.
Để hồn thành khố luận này tơi đƣợc sự quan tâm và giúp đỡ tận tình
về nhiều mặt của Ban lãnh đạo, các cán bộ công nhân viên Viện Nghiên cứu
Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt
Nam cũng nhƣ cũng nhƣ cùng các thầy cơ trực tiếp giảng dạy lớp BIO-19A

khóa 2019A, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàm lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam. Qua đây tơi xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn chân thành và
sâu sắc tới sự giúp đỡ và đóng góp vơ cùng q báu đó.
Tơi cũng xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn đến TS. Đỗ Tiến Phát, TS. Lê
Sơn đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và
ngƣời thân đã giúp đỡ tơi có đƣợc bản luận văn này.
Trong quá trình thực hiện, do năng lực và điều kiện nghiên cứu cịn hạn
chế nên khố luận khơng tránh khỏi thiếu sót. Rất mong nhận đƣợc sự đóng
góp ý kiến của các thầy cơ và các bạn để khố luận đƣợc hồn thiện hơn.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Học viên thực hiện

Văn Thu Huyền

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Viết tắt

Nghĩa đầy đủ

BAP

6- Benzyl Amino Purine

HSNC

Hệ số nhân chồi

B5

Môi trƣờng Gamborg

Ca(OCl)2

Canxi Hypoclorit

GA3

Gibberellic Acid

HgCl2

Clorua thuỷ ngân

IAA

Indol 3- Acetic Acid

IBA

Indol Butiric Acid

Kn

Kinetin

MS*

Môi trƣờng MS cải tiến

NAA

Naphthy Acetic Acid

NaClO

Hypoclorit Natri

PVP

Poly Vinyl Pyrrolidone

Tb

Trung bình

TLBCHH

Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu

TLCHH

Tỷ lệ chồi hữu hiệu

WPM

Môi trƣờng cho cây thân gỗ

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Danh mục các bảng
Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm khử trùng Keo lai ............................................ 44
Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng của từng giống nghiên cứu ............................. 47
Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm xác định mơi trƣờng ni cấy cơ bản ............. 49
Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của BAP và Kn ở nồng độ
khác nhau đến khả năng nhân chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy .................. 51
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tạo cụm chồi
Keo lai sau 25 ngày ni cấy .......................................................................... 53
Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm xác định chế độ chiếu sáng thích hợp cho ni
cấy các dịng Keo lai sau 25 ngày cấy chuyển ................................................ 56
Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm xác định Phƣơng pháp cấy thích hợp.............. 57
Bảng 3.8. Kết quả thí nghiệm kích thích tạo rễ cho các dịng Keo lai dịng
BV376, BV586 và BB055............................................................................... 59
Bảng 3.9. Kết quả thí nghiệm huấn luyện cây con Keo lai ............................. 62
Bảng 3.10. Kết quả thí nghiệm các loại giá thể cho cây con Keo lai ............. 64

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Quá trình phân hố và phản phân hố tế bào .................................. 18
Hình 3.1. Chồi bất định Keo lai sau 25 ngày khử trùng ................................. 48
Hình 3.2. Cụm chồi Keo lai dịng BB055 sau 25 ngày nuôi cấy trong các môi
trƣờng nhân chồi khác nhau ........................................................................... 50

Hình 3.3. Các cụm chồi Keo lai đƣợc nuôi cấy trong các công thức môi
trƣờng nhân chồi khác nhau ............................................................................ 52
Hình 3.4. Các chồi Keo lai dịng BV568 sau 25 ngày ni cấy trong các cơng
thức thí nghiệm khác nhau. ............................................................................. 54
Hình 3.5. Cụm chồi Keo lai sau các giai đoạn nuôi cấy: cụm chồi ban đầu,
cụm chồi sau nuôi cấy lần 1 và cụm chồi trong mơi trƣờng tối ƣu ................ 58
Hình 3.6. Các chồi Keo lai dịng BB055 ra rễ trong mơi trƣờng có bổ sung
IBA và NAA.................................................................................................... 60
Hình 3.7. Các chồi Keo lai dịng BV376 ra rễ sau 10 ngày ........................... 61
Hình 3.8. Bình ra rễ Keo lai ............................................................................ 61
Hình 3.9. Cây con Keo đã ra rễ đƣợc cấy vào bầu đất .................................... 63
Hình 3.10. Luống cây con Keo lai tại vƣờn ƣơm ........................................... 65

Luận văn thạc sỹ Sinh học


1

MỤC LỤC
MỤC LỤC ..................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 6
1.1. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống cây rừng ...... 6
1.1.1. Trên thế giới ........................................................................................ 6
1.1.2. Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô cho các giống cây rừng
ở Việt Nam .................................................................................................. 12
1.2. Khái niệm và cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật ........................................................................................................ 15
1.2.1. Khái niệm .......................................................................................... 15
1.2.2. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp ni cấy mơ tế bào ..................... 17

1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật ................................................ 17
1.2.2.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào ..................................... 17
1.3. Các nhân tố ảnh hƣởng tới nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào ........ 19
1.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy ......................................................................... 19
1.3.1.1. Mơi trƣờng hóa học ........................................................................ 19
1.3.1.2. Mơi trƣờng vật lý ........................................................................... 22
1.3.2. Vật liệu nuôi cấy ............................................................................... 23
1.3.3. Điều kiện vô trùng............................................................................. 23
1.3.4. Buồng nuôi cấy ................................................................................. 24
1.4. Những vấn đề trong nhân giống in vitro .............................................. 25
1.4.1. Sự nhiễm mẫu ................................................................................... 25
1.4.2. Tính bất định về mặt di truyền .......................................................... 25
1.4.3. Sản sinh chất độc từ mẫu ni cấy .................................................... 25
1.4.4. Hiện tƣợng thủy tinh hóa .................................................................. 26
1.5. Các giai đoạn chính trong q trình nhân giống .................................. 27
1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị ............................................................................ 27
1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động ................................................................... 27
1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh ....................................................................... 28

Luận văn thạc sỹ Sinh học


2

1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ) ................................................................ 28
1.5.5. Đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên ........................................................ 29
1.6. Một số kết quả nổi bật về chọn giống Keo lai và trồng rừng Keo lai ở
nƣớc ta ......................................................................................................... 30
1.7. Nghiên cứu về nhân giống in vitro các loài keo .................................. 31
1.7.1. Trên thế giới ...................................................................................... 31

1.7.2. Ở Việt Nam ....................................................................................... 34
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...36
2.1. VẬT LIỆU nghiên cứu......................................................................... 36
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 36
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................... 37
2.3.1. Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm ............................................... 37
2.3.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm.......................................................... 37
2.3.3. Xử lý số liệu ...................................................................................... 41
2.3.3.1. Tính tốn các chỉ tiêu theo dõi ....................................................... 41
2.3.3.2. Kiểm tra ảnh hƣởng của các nhân tố đến kết quả thí nghiệm ........ 42
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................44
3.1. Xác định Phƣơng pháp khử trùng mẫu thích hợp cho các dịng Keo lai
nghiên cứu ................................................................................................... 44
3.2. Xác định môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho Keo lai .............................. 48
3.3. Xác định môi trƣờng nhân nhanh số lƣợng chồi Keo lai ..................... 50
3.4. Xác định môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi cho Keo lai ............... 52
3.5. Tối ƣu hóa phƣơng pháp nuôi cấy và chế độ chiếu sáng ..................... 55
3.5.1. Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp .............................................. 55
3.5.2. Xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho các dịng Keo lai ............ 56
3.6. Xác định môi trƣờng ra rễ cho Keo lai ................................................ 58
3.7. Xác định thời gian huấn luyện cây thích hợp ...................................... 62
3.8. Xác định loại giá thể phù hợp cho Keo lai nuôi cấy mô ...................... 63
3.9. Xây dựng quy trình nhân giống cho các dịng Keo lai nghiên cứu ..... 65
3.9.1. Mục tiêu quy trình ............................................................................. 66

Luận văn thạc sỹ Sinh học


3

3.9.2. Phạm vi áp dụng ................................................................................ 66
3.9.3. Điều kiện cần thiết để áp dụng quy trình .......................................... 66
3.9.3.1. Điều kiện khí hậu ........................................................................... 66
3.9.3.2. Nguồn giống ................................................................................... 66
3.9.3.3. Điều kiện nhân lực ......................................................................... 66
3.9.3.4. Cơ sở vật chất ................................................................................. 66
3.9.4. Nội dung quy trình ............................................................................ 67
3.9.4.1. Khử trùng mẫu ............................................................................... 67
3.9.4.2. Nhân tạo mẫu ................................................................................. 67
3.9.4.3. Nhân nhanh .................................................................................... 68
3.9.4.4. Nâng cao chất lƣợng chồi .............................................................. 68
3.9.4.5. Cho ra rễ ......................................................................................... 68
3.9.4.6. Huấn luyện cây ............................................................................... 68
3.9.4.7. Ra ngôi và cấy cây vào bầu đất:..................................................... 69
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................70
4.1. Kết luận ................................................................................................ 70
4.2. Kiến nghị .............................................................................................. 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................72
PHỤ LỤC .................................................................................................................78

Luận văn thạc sỹ Sinh học


4

MỞ ĐẦU
Giống Keo lai tự nhiên giữa Keo tai tƣợng và Keo lá tràm (thƣờng
đƣợc gọi tắt là Keo lai) đã đƣợc ghi nhận là có nhiều đặc điểm ƣu việt hơn so
với 2 loài bố mẹ nhƣ: sinh trƣởng nhanh, thích ứng đƣợc trên nhiều dạng lập
địa và kháng sâu bệnh. Từ năm 1991, các dòng Keo lai tự nhiên đã đƣợc phát

hiện, nghiên cứu chọn lọc và đƣợc phát triển rộng rãi trong sản xuất. Ở nƣớc
ta đến nay đã có trên 600.000 ha rừng Keo lai đã đƣợc trồng, trong đó nhu cầu
diện tích trồng rừng hàng năm của Keo lai đƣợc dự đoán từ 20.000 - 30.000
ha. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân mà cho đến nay mới chỉ có khoảng 10
dịng Keo lai tự nhiên đã đƣợc phát triển rộng rãi trong sản xuất. Mặt khác,
rừng trồng các loài Keo nhiệt đới (bao gồm Keo lai và Keo tai tƣợng) gần đây
đƣợc ghi nhận là bị ảnh hƣởng nặng nề bởi nấm bệnh cũng nhƣ điều kiện bất
lợi của mơi trƣờng và biến đổi khí hậu. Vì vậy, cơng tác chọn giống Keo lai
cần đƣợc liên tục tiến hành để vừa chọn tạo đƣợc các giống mới có năng suất,
chất lƣợng cao vừa đảm bảo đƣợc tính an tồn sinh học cho rừng trồng.
Kết quả khảo nghiệm dịng vơ tính Keo lai gần đây đã chọn đƣợc các
dòng Keo lai BV376, BV586 và BB055 là những dịng triển vọng và đã đƣợc
cơng nhận là giống Tiến bộ kỹ thuật nhằm đƣa các giống này vào sản xuất.
Để phát triển các giống này vào sản xuất thì việc nghiên cứu nhân giống bằng
phƣơng pháp ni cấy mô là hƣớng đi hiệu quả nhất. Mặc dù vậy, quy trình
nhân giống bằng ni cấy mơ cho Keo lai trƣớc đây mặc dù đã đƣợc áp dụng
rộng rãi, nhƣng lại khơng thể áp dụng hồn tồn cho các giống mới chọn lọc
này do cây rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, phản ứng của các
kiểu gen rất khác nhau đối với cùng một điều kiện mơi trƣờng nên trong cùng
một lồi, với các dịng khác nhau thì hiệu quả nhân giống cũng rất khác nhau
cho dù là cùng loài (do đặc điểm về mặt di truyền khơng đồng nhất), mặt khác
các cơng trình nghiên cứu về ni cấy mơ tế bào cho các dịng Keo lai mới
chọn tạo chƣa có. Do đó, xác định và tối ƣu hóa phƣơng pháp nhân giống cho
3 dịng Keo lai BV376, BV586 và BB055 bằng phƣơng pháp nuôi cấy mơ là
cần thiết và có ý nghĩa trong việc phát triển nhanh các giống có năng suất cao
này vào trồng rừng sản xuất.

Luận văn thạc sỹ Sinh học

5

Trên cở sở đó đề tài: ―Nghiên cứu nhân giống các dòng Keo lai năng
suất cao BV376, BV586 và BB055 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào‖
đã đƣợc tiến hành nhằm đáp ứng yêu cầu thiết yếu của thực tiễn sản xuất.

Luận văn thạc sỹ Sinh học


6

1. CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ỨNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN
GIỐNG CÂY RỪNG
1.1.1. Trên thế giới
Nuôi cấy mô tế bào là phƣơng pháp nhân giống đƣợc thực hiện bằng
nuôi cấy cơ quan, mô (thậm chí là tế bào) trong mơi trƣờng dinh dƣỡng đặc
biệt hồn tồn vơ trùng và đƣợc kiểm sốt. Vì vật liệu nuôi cấy thƣờng rất nhỏ
và thực hiện trong môi trƣờng nhân tạo nên phƣơng pháp nhân giống này còn
đƣợc gọi là vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân giống in vitro. Nuôi
cấy mô tế bào thực vật gồm: nuôi cấy callus, nuôi cấy dịch huyền phù tế bào,
nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy phôi, nuôi cấy các cơ quan (đỉnh sinh trƣởng, rễ,
lá, bao phấn, ...) [1].
Nuôi cấy in vitro đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất
thƣơng mại ở nhiều nƣớc trên thế giới (Thụy Điển, Braxin, Australia,Trung
Quốc, Malaysia, Thái Lan, Ấn Độ, ...) và đã thu đƣợc những thành công đáng
kể, đây là khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên thế giới

trong những năm gần đây. Trong đó phải kể đến công nghệ nhân giống nuôi
cấy mô cây Tếch, các dòng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung Quốc, các
lồi Bạch đàn lai ở Brazin, Cơng Gơ, Australia, cây Vân sam (Picea abies),
Thông Radiata (Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribê (Pinus
caribaea) và Thông lai (P. caribaea x P. elliottii) ở Australia… [2].
Ở Thụy Điển vào cuối năm 1980 công ty Hilleshoge đã nhân giống cây
Vân sam (Picea abies) với số lƣợng 3 triệu cây/năm. Số lƣợng các loài Bạch
đàn đã đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ngày càng tăng,
đến năm 1987 đã có trên 20 lồi Bạch đàn khác nhau đƣợc ni cấy thành
cơng. Các nhà khoa học ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây
trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E.
torelliana. Cây mơ có nguồn gốc từ cây ƣu việt sinh trƣởng nhanh gấp 3 lần
và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ [3].

Luận văn thạc sỹ Sinh học


7

Tại Australia, nhân giống in vitro đã đƣợc áp dụng để nhân nhanh cho
các cây đƣợc chọn lọc cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc đƣa vào sản
xuất trên quy mơ lớn cho lồi Bạch đàn trắng (E. camandulensis).
Các nhà khoa học Ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây
trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. tereticornis, E. globulus, E.
torelliana. Tại Australia, nhân giống nuôi cấy mô đã đƣợc áp dụng để nhân
nhanh cho các cây đƣợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc sản
xuất với quy mơ lớn cho lồi E. camandulensis [3].
Trung Quốc là nƣớc có nhiều thành cơng trong việc tạo cây ni cấy mơ
cho các lồi cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 lồi cây thân gỗ đƣợc nuôi cấy
nhƣ Dƣơng, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng (Hông). Đến năm 1991 ở vùng Nam

Trung Quốc, ngƣời ta đã tạo ra trên 1 triệu cây mô của các cây và các dịng lai
của một số lồi cây trồng rừng chủ yếu đã đƣợc chọn lọc qua khảo nghiệm.
Những cây mô này đƣợc dùng nhƣ là những cây đầu dòng để tạo cây hom tại các
vƣờn ƣơm địa phƣơng hoặc dùng thẳng vào trồng rừng [3].
Cho tới năm 1991, Thái Lan đã nhân giống in vitro thành công cho 55
loài trong tổng số 67 loài tre trúc thử nghiệm. Cơng nghệ này cho phép nhân
nhanh lồi Tre mạnh tơng Dendrocalamus asper với số lƣợng khoảng 1 triệu
cây mỗi năm đáp ứng đƣợc nhu cầu cây con phục vụ cho trồng rừng (dẫn theo
Đoàn Thị Mai và Lê Sơn, 2011) [4].
Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào cũng là một biện pháp nhân giống đƣợc
áp dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chƣơng trình trồng
rừng dịng vơ tính. Một số lồi Thơng đã đƣợc ni cấy thành cơng đó là:
Pinus nigra, P. caribaea, P. pinaster… Có tới 30 lồi cây lá kim đƣợc nghiên
cứu nuôi cấy mô và đã đạt đƣợc những thành công bƣớc đầu, trong đó phải kể
đến các lồi Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách
xanh… Trong số 30 loài cây lá kim đã đƣợc ni cấy mơ, có 4 lồi đƣợc đƣa
vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempvirens) ở Pháp,
Thông ra-đi-a-ta (P. radiate) ở Viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan;
Thông P. taera và P. seudotsuga menziesii ở Mỹ [3].

Luận văn thạc sỹ Sinh học


8

Gupta và các cộng sự đã mơ tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của
cây non và từ mầm cây Tếch 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo đƣợc 500 cây nuôi
cấy mô từ một chồi ở cây trƣởng thành và 3.000 cây từ 1 cây non trong một
năm. Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm 1986
cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm [5].

Nhiều loài cây lá rộng Châu Âu đã đƣợc thử nghiệm nhân giống thành
công bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô nhƣ: Acer, Beluta, Fagus, Quercus,
Carpinus... Các cây mô đã đƣợc trồng ra thực địa để so sánh và đã cho thấy
chúng có kiểu hình tƣơng đối giống nhau, tỷ lệ sống ở rừng trồng sau khi cây
đƣợc huấn luyện là khá cao có thể đạt 90% đến 100% cho một số loài (Dẫn
theo Đoàn Thị Mai và Lê Sơn) [4].
Nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống đƣợc áp dụng
nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chƣơng trình trồng rừng
dịng vơ tính. Một số lồi Thơng đã đƣợc ni cấy thành cơng đó là Pinus
nigra, P. caribaea, P. pinaster… Có tới 30 loài trong số các loài cây lá kim
đƣợc nghiên cứu nuôi cấy mô đã đạt đƣợc những thành cơng bƣớc đầu, trong
đó phải kể đến các lồi Bách tán (Araucaria) Liễu sam (Cryptomeria
japonica) Bách xanh. Trong số 30 lồi cây lá kim đã đƣợc ni cấy mơ, có
bốn lồi đƣợc đƣa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia
sempevirens) ở Pháp; Thông P. radiate ở Viện nghiên cứu Lâm nghiệp New
Dilân; Thông P. taeda và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ [3].
Ngƣời ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi
cấy mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang
đƣợc áp dụng để tạo cây mô Phi lao sinh trƣởng nhanh, kháng bệnh và cố
định đạm cao cho trồng rừng [3].
Số lƣợng các loài Bạch đàn đã đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp
nuôi cấy in vitro ngày càng tăng, báo cáo của McComb và Bennett (1986) cho
biết đã có trên 38 lồi Bạch đàn khác nhau đƣợc nuôi cấy mô thành công từ
năm 1963, tiêu biểu là các cơng trình của Cresswell và Fossard (1974),
Cresswell và Nitsch (1975), Durnad – Cresswell và Nitsch (1977), Furze và
Cresswell (1985), Rao và Venkateswara (1985), Lakshmi Sita (1986), Warrag

Luận văn thạc sỹ Sinh học

9

và cộng sự (1987), (Warrag, và cộng sự, 1990). Các nhà khoa học Ấn Độ
thành công trong việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn Eucalyptus
camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E. torelliana và cả từ các cây trội
có hàm lƣợng tinh dầu cao của bạch đàn chanh E. Citriodora [3]. Cây mơ có
nguồn gốc từ cây ƣu việt sinh trƣởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây
mọc từ hạt của cùng cây mẹ. Tại Autralia, nhân giống in vitro đã đƣợc áp
dụng để nhân nhanh cho các cây đƣợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và
đang đƣợc đƣa vào sản xuất trên quy mô lớn cho loài E. camaldulensis [6].
Năm 1983, Gupta và cộng sự đã báo cáo rằng các chồi E. torelliana và
E. camaldulensis đƣợc ni cấy trong mơi trƣờng MS có bổ sung Kn, BAP,
Cal.Pan và Biotin. NAA ảnh hƣởng đến khả năng ra rễ của E. torelliana trong
khi, với E. camaldulensis, IAA, IBA, IPA và NAA đều cho hiệu quả ra rễ.
Tác giả cũng đề cập đến vai trò thúc đẩy q trình ra rễ in vitro của than hoạt
tính đối với 2 loài cây này. Kết quả là từ 1 đoạn chồi của cây trƣởng thành,
sau 1 năm đã tạo ra đƣợc 50.000 cây con in vitro E. torelliana và 20.000 cây
con đối với E. camaldulensis [6, 7].
Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của ánh sáng đến kết quả nuôi cấy mơ bạch
đàn Eucalyptus tereticornis của nhóm tác giả Das và Mitra (1990) cho thấy
khơng có chồi ra rễ trừ khi các chồi in vitro Eucalyptus tereticornis đƣợc
chuyển ra ngoài ánh sáng sau giai đoạn ủ tối [7]. Nghiên cứu của Warrag và
cộng sự (1990) đã chỉ ra khoảng thời gian ủ tối 4 tuần đã thúc đẩy sự hình
thành mơ sẹo ở Bạch đàn lai [8].
Mullin và cộng sự (1997) đã thành công trong việc tái sinh chồi từ lá
cây Bạch đàn E. camaldulensis, môi trƣờng đƣợc tác giả sử dụng là môi
trƣờng cải tiến từ môi trƣờng của Muralidharan và Mascarenhas (1987) có bổ
sung 1,0 g/l Casein, 16,2 µmol/l NAA, 0,44 µmol/l BAP, 50g/l đƣờng và
0,5% Phytagar (dẫn theo Roberson Dibax và cộng sự, 2005) [9].. Theo Ho và
cộng sự (1998), mơi trƣờng MS bổ sung 16,2 µmol/l NAA và 4,44 µmol/l 6BAP có thể kích thích tạo mơ sẹo và tái sinh chồi ở Bạch đàn E.

camaldulensis [10]

Luận văn thạc sỹ Sinh học


10

Đến năm 2000, cũng nghiên cứu trên cùng đối tƣợng là cây Eucalyptus
tereticornis, Sharma và cộng sự [11] lại thu đƣợc kết quả đối lập với kết quả của
Das và Mitra (1990) khi quan sát thấy xuất hiện sự hình thành rễ từ các chồi khi
ủ mẫu trong thời gian dài từ 8-10 ngày. Cùng thời gian này, Arezki và cộng sự
đã tiến hành nuôi cấy mô phân sinh của Bạch đàn Caman trong mơi trƣờng
MS bổ sung 5 µmol/l IBA, 30 g/l đƣờng, 0,5% agar và 0,2% than hoạt tính.
(dẫn theo Roberson Dibax và cộng sự, 2005) [9]. Báo cáo của González và
cộng sự (2002) đã nhấn mạnh tỷ lệ mơ sẹo hình thành từ lá mầm của Bạch
đàn lai E. grandis x E. urophylla là cao nhất khi ở chế độ ủ tối 30 ngày [12].
Joshi và cộng sự (2003) đã nuôi cấy mô từ chồi nách của cây mẹ trƣởng
thành dòng FRI-6 Bạch đàn lai E. tereticornis x E. grandis. Môi trƣờng nhân
chồi MS bổ sung 1,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA sau 150 ngày nuôi cấy, từ 1
chồi ban đầu có thể nhân ra đƣợc 20 - 25 chồi. 1/2MS là môi trƣờng tạo chồi
đủ tiêu chuẩn ra rễ mà nhóm tác giả đã xác định đƣợc, môi trƣờng này tạo
đƣợc 30 - 35 chồi/cụm, chiều dài chồi từ 1,5 - 2,0 cm, chồi xanh, sinh trƣởng,
phát triển tốt. Báo cáo cũng ghi nhận, có 75% chồi ra rễ trong môi trƣờng
1/2MS bổ sung 1,0 mg/l IBA [13].
Roberson Dibax và cộng sự (2005) [12] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của
ánh sáng đến sự hình thành mô sẹo và tái sinh chồi Bạch đàn E. camaldulensis,
kết quả cho thấy, các công thức phối hợp chất điều hịa sinh trƣởng đƣợc thí
nghiệm có tỷ lệ phần trăm chồi hình thành từ mơ sẹo là đạt cao nhất (90,2%)
với tất cả các nồng độ NAA khi ủ mẫu trong tối 30 ngày. Cũng theo tác giả, ở
chế độ này tỷ lệ mẫu bị hoại tử đã giảm đi đáng kể. Kết quả này cũng trùng lặp

với kết quả nghiên cứu trên Bạch đàn E. grandis của tác giả Laine và David
(1994) [14]. Trong báo cáo, Roberson Dibax và cộng sự cũng đƣa ra môi
trƣờng nhân nhanh chồi cho Bạch đàn Caman là MS bổ sung 2,7µmol/l NAA
và 4,44 µmol/l BAP, sau 30 ngày nuôi cấy thu đƣợc 11,8 chồi/cụm. Môi trƣờng
nâng cao chất lƣợng chồi và ra rễ là 1/2MS bổ sung 0,2% than hoạt tính sẽ tạo
ra các chồi non cao 1 - 8 cm, lá xanh thẫm; sau 10 - 15 ngày tỷ lệ ra rễ là 80%,
có 8 rễ/cây, cây cao từ 2 - 4 cm [15].

Luận văn thạc sỹ Sinh học


11

Năm 2007, Sotelo M và Monza J đã nuôi cấy mô cho E. maidenii từ
các đoạn chồi 50 x 3 cm, mẫu vật đƣợc khử trùng bề mặt bằng xà phòng và
dung dịch Benlate (2g/l ) và dung dịch Captan (2g/l) trong thời gian 60 phút
và dung dịch Sodium hypochlorite (NaOCl2) 0,1% trong 5 phút sau đó tráng
sạch 3 lần với nƣớc và ngâm trong Polyvinil pirrilidona (PVP) 1,5 g/l trong
vịng 60 phút ở 40C. Tác giả ghi nhận mơi trƣờng nhân nhanh chồi cho E.
maidenii là QL (môi trƣờng do Quoirin và Lepoivre, 1977) đƣợc bổ sung 0,2
mg/l BAP và 0,02 mg/l IBA. Để nâng cao chất lƣợng chồi, nhóm tác giả đã
nghiên cứu hiệu quả của Cytokinin và Auxin khi kết hợp cùng nhau trong môi
trƣờng nuôi cấy, đồng thời nghiên cứu hiệu quả tăng chiều cao chồi nhờ GA3.
Kết quả cho thấy, môi trƣờng phù hợp là QL bổ sung 0,1 mg/l BA và 0,5 mg/l
IBA cho 4 chồi/cụm, chiều cao chồi trung bình trên 2 cm. Đặc biệt, tác giả
còn nghiên cứu ảnh hƣởng của auxin và chế độ ánh sáng đến khả năng ra rễ
của các dịng Bạch đàn, kết quả chỉ ra rằng mơi trƣờng 1/4QL bổ sung 10mg/l
Thiamine và 2mg/l IB, ủ tối 7 ngày là công thức ra rễ tốt nhất [16].
Trong báo cáo về ra rễ in vitro cho Bạch đàn lai E. urophylla x E.
grandis, Sophie Nourissier và cộng sự (2008) cũng đƣa ra nhận định, chế độ

ánh sáng ảnh hƣởng tới việc kéo dài chồi và ra rễ. Tỷ lệ ra rễ của Bạch đàn lai
E. urophylla x E. grandis đạt tới 81% khi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng
1/2MS có bổ sung 5 μM IBA và 12.5 μM NAA [17].
Năm 2012, Girijashankar đã lấy các đoạn chồi từ cây mẹ 18 tháng tuổi
Bạch đàn E. camaldulensis để khử trùng. Mẫu vật đƣợc khử trùng bề mặt với
3 công thức: công thức 1 - dùng cồn 70% trong thời gian 1 phút; công thức 2 ngâm trong NaOCl2 1% có bổ sung 1 vài giọt Tween trong thời gian 15 phút,
sau đó tráng với 3 lần nƣớc sạch; cơng thức 3 - ngâm mẫu trong HgCl2 0,1%.
Kết quả cho thấy, sử dụng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 – 15 phút làm mẫu
bị hóa nâu, bị hoại tử và thậm chí bị chết. Sử dụng NaOCl2 trong thời gian 15
– 17 phút giúp giảm số lƣợng mẫu nhiễm tƣơng tự nhƣ khi sử dụng HgCl 2
0,1% nhƣng phƣơng pháp này lại không làm tổn thƣơng mẫu. Môi trƣờng
nhân nhanh chồi đƣợc xác định là MS bổ sung 2,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l
NAA cho 6,3 chồi/cụm. Môi trƣờng 1/2MS bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số

Luận văn thạc sỹ Sinh học


12

lƣợng chồi tăng lên 3 lần, chiều dài chồi trên 2 cm. Môi trƣờng 1/2MS bổ
sung 1 mg/l IBA cho 60% chồi ra rễ, có 2 - 8 rễ/cây, rễ dài 2 - 7 cm [6].
Khi nghiên cứu nuôi cấy mô cho Bạch đàn lai HFRI-5 (E.
camaldulensis Dehn x E. tereticornis Sm), Natasha Mahajan và cộng sự
(2012) đã thực hiện trên chồi đỉnh, chồi cành và lá cây mẹ 4 - 8 tuổi. Vật liệu
đƣợc rửa dƣới vòi nƣớc chảy từ 1 – 2 h với một vài giọt Tween 20, sau đó
đƣợc khử trùng bề mặt bằng cách lắc trong cồn 70% trong thời gian 30 giây,
tiếp theo vật liệu đƣợc ngâm trong HgCl2 trong 2 phút. Kết quả cho thấy việc
bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau vào môi trƣờng nuôi cấy MS với 10%
nƣớc dừa và 500 mg/l PVP có ảnh hƣởng lớn tới khả năng nhân chồi Bạch
đàn lai. Nồng độ 3,0 mg/l BAP là nồng độ thích hợp để nhân nhanh lƣợng

chồi bạch đàn, trong khi đó, khơng có chồi nào đƣợc tạo thành khi ở nồng độ
BAP nhỏ hơn 3,0 mg/l và ở nồng độ lớn hơn 5,0 mg/l. Tác giả cũng khẳng
định chế độ ánh sáng là nhân tố vô cùng quan trọng đối với sự tái sinh chồi ở
Bạch đàn [18].
Có thể nói nhân giống bằng phƣơng pháp ni cấy in vitro cho các lồi
cây nơng lâm nghiệp đang đƣợc áp dụng trên quy mô lớn ở nhiều nƣớc trên
thế giới. Đối với ngành lâm nghiệp nƣớc ta, đây là phƣơng pháp tối ƣu để đƣa
nhanh các giống mới chọn lọc vào trồng rừng sản xuất.
1.1.2. Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô cho các giống
cây rừng ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nuôi cấy mô đƣợc phát triển từ những năm 70 và đã đƣợc
một số đơn vị nhƣ: Trƣờng Đại học Nông Nghiệp, Viện CNSH, Viện KHKT
NN, Viện di truyền Nông nghiệp, Viện lúa ĐBSCL, Trung tâm Nghiên cứu
Giống cây rừng (nay là Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm
nghiệp), ... nghiên cứu ứng dụng thành cơng cho nhiều lồi cây trồng nơng
lâm nghiệp. Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy
mô lớn trong lâm nghiệp nƣớc ta là Công ty Giống lâm nghiệp Trung ƣơng,
Trung tâm Khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng Ninh, Xí nghiệp giống
Thành Phố Hồ Chí Minh, Cơng ty CP Giống cây trồng Nguyên Hạnh, Công

Luận văn thạc sỹ Sinh học


13

ty Lâm nghiệp Quy Nhơn, Công ty Lâm nghiệp Tiền Phong… [4]. Hiện nay
một số tỉnh và địa phƣơng đã thành lập phịng ni cấy mơ để phục vụ cho
cơng tác giống cây trồng và đã đạt đƣợc những thành cơng đáng kể, góp phần
khơng nhỏ trong việc phát triển trồng rừng dịng vơ tính ở nƣớc ta.
Trồng rừng bằng cây từ nuôi cấy mô hoặc cây hom lấy từ dịng mẹ vơ

tính tốt nhất của cây lai đời F1 (đã qua chọn lọc và đánh giá) thì rừng trồng
vừa sinh trƣởng nhanh vừa khá đồng đều. Chính vì thế trong công văn số 268
BNN- KHCN ngày 13/01/1998, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã
khuyến cáo các đơn vị không dùng hạt Keo lai để gây trồng rừng sản xuất mà
nên dùng dịng vơ tính Keo lai đã đƣợc khảo nghiệm và đánh giá để gây trồng
rừng [19].
Dƣơng Mộng Hùng (1993) nghiên cứu bằng nuôi cấy mô cho 2 loài
Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) và bạch đàn nâu (E. urophylla) từ cây trội
của 2 loài này đã tạo đƣợc một số cây mô Bạch đàn với hệ số nhân chồi là 1-2
lần [20].
Nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cho giống lai của Bạch đàn trắng đã
đƣợc Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự (1997) thực hiện thành công từ năm 1993
thấy rằng dùng BAP thêm vào môi trƣờng MS có thể tạo đƣợc 20-30 chồi/mẫu.
Mơi trƣờng MS + IBA có thể đạt tỉ lệ ra rễ 80%. Tuy nhiên chất lƣợng các chồi
thu đƣợc chƣa cao, tỷ lệ sống cây con ngoài vƣờn ƣơm chƣa đáp ứng đƣợc yêu
cầu sản xuất (Dẫn theo Đoàn Thị Mai và Lê Sơn, 2011) [4].
Thơng qua chƣơng trình hợp tác với Trung Quốc một số dịng Bạch đàn
có năng suất cao: U6, U16 và công nghệ nhân giống đã đƣợc chuyển giao cho
các đơn vị trong nƣớc nhƣ: Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy, Trung tâm
Nghiên cứu Giống cây rừng, Trung tâm ứng dụng KHSX nơng lâm nghiệp
Quảng Ninh, Xí nghiệp giống lâm nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, sau đó các
nghiên cứu nhân giống cho cây lâm nghiệp đã đƣợc nhiều đơn vị tiến hành.
Mai Đình Hồng (1995) đã đƣa ra mơi trƣờng ni cấy mơ cho cây Bạch đàn
dịng U6 là: môi trƣờng nhân chồi (MS + 3% đƣờng + 4,5 g/l agar + 0,5 mg/l
BAP + 0,25 mg/l NAA), môi trƣờng tạo rễ (1/4 MS + 1,5 % đƣờng + 5g/l agar

Luận văn thạc sỹ Sinh học


14

+ 1mg/l IBA) (Dẫn theo Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2000) [21].
Kết quả nghiên cứu nhân giống thông qua hệ thống tái sinh mơ sẹo phơi
hóa và nhân chồi in vitro cho Bạch đàn của Chu Bá Phúc, Đỗ Năng Vịnh,
Phạm Thị Kim Hạnh và cộng sự (2003) cho thấy mơi trƣờng thích hợp để tạo
callus từ lá non của cây nuôi cấy mô đối với Bạch đàn là MS + 0,5mg/l BAP +
1,5mg/l 2,4-D, callus có chất lƣợng tốt, thích hợp cho tái sinh phơi, tỷ lệ callus
đạt 87,50%. Callus tạo ra từ đoạn thân cây non nuôi cấy mơ của cây Bạch đàn
đều có tỷ lệ % thấp hơn so với tỷ lệ callus tạo ra từ mô lá non. Khả năng nhân
chồi Bạch đàn 5,20 lần ở môi trƣờng MS + 1,0mg/l BAP + 0,2mg/l Kinetin sau
20 ngày cấy chuyển.
Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000, 2011) đã nghiên cứu nuôi cấy mô
thành công cho giống Bạch đàn lai U29C3. Kết quả cho thấy thời kỳ mẫu bị
nhiễm ít nhất và có tỷ lệ bật chồi cao nhất là từ tháng 5-8. Mơi trƣờng MS có
bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số chồi trung bình trong mỗi cụm cao nhất (16,6
chồi/cụm). Mơi trƣờng ra rễ thích hợp là môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l
IBA cho tỷ lệ ra rễ tới 83,8 % [21,4].
Nghiên cứu nhân giống cho một số giống cây rừng nhƣ Trầm dó, Tre
tàu và Tre mạnh tông cũng đã đƣợc thực hiện và cho kết quả khích lệ [22,23].
Đồn Thị Nga, Mai Đình Hồng thuộc Viện nghiên cứu Cây nguyên liệu
giấy Phù Ninh - Phú Thọ nghiên cứu nuôi cấy mô cây Bạch đàn dịng U6 và
PN2. Tác giả cho rằng, mơi trƣờng thích hợp nhân nhanh là MS + 0,5mg/l
BAP + 0,25 mg/l NAA. Môi trƣờng ra rễ tối ƣu là 1/4 MS + 1mg/l IBA (Dãn
theo Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2003) [22].
Đoàn Thị Mai, Lê Sơn và các cộng sự đã đƣa ra môi trƣờng nuôi cấy
mô cho cây Bạch đàn dịng UE35 hố chất khử trùng thích hợp là chất kháng
sinh với nồng độ 4,5mg/l trong thời gian 25 phút, tỷ lệ bật chồi đạt 17,5% và
PN3D là mẫu bật chồi đạt 17,5% HgCl2 nồng độ 0,5% trong khoảng thời gian
là 12 phút. Môi trƣờng nhân chồi thích hợp là mơi trƣờng MS cải tiến (kí hiệu
MS*) + BAP 0,5mg/l + NAA 0,3mg/l + các phụ gia khác [4].

Luận văn thạc sỹ Sinh học


15

Đối với các lồi cây thân gỗ, có thể kể đến các cơng trình nhân giống in
vitro cây Cà phê của Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự (1987); cây Điều
Anacardium occidentale L. của Vũ Ngọc Phƣợng và cộng sự (2003); cây Ba
kích Morinda officinalis How của Vũ Hồi Sâm và cộng sự (giai đoạn 2001 2005); cây Tre tàu Sinocalamus latiflorus và Tre mạnh tông Dendrocalamus
asper của Vũ Ngọc Phƣợng và cộng sự (2002); cây Tếch của Trần Văn Minh và
Bùi Thị Tƣờng Thu (2003); Thông Caribe Pinus caribaea của Trần Trung Hiếu
và cộng sự (2002 - 2003); cây Tếch, Trầm, Thông, Hông, Bạch đàn của Chu Bá
Phúc, Đỗ Năng Vịnh và cộng sự (2003); cây Trầm của Đoàn Thị Mai và cộng
sự (2005); cây Hơng Đồn Thị Ái Thuyền và cộng sự (2005); Lát hoa Đoàn
Thị Mai và cộng sự (2006 - 2010) (Dẫn theo Đoàn Thị Mai, Lê Sơn và cộng
sự) [4].
Nhƣ vậy, các kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô cho cây rừng ở nƣớc
ta là tƣơng đối đa dạng. Các kết quả này không những mang ý nghĩa khoa học
mà cịn mang tính thực tiễn rất cao trong việc phát triển các giống cây rừng
mới đƣợc chọn lọc trong sản xuất. Hiện nay, nhu cầu về cây giống từ ni cấy
mơ cho trồng rừng dịng vơ tính ở nƣớc ta lên tới khoảng 50 triệu cây/năm,
theo chƣơng trình phát triển trồng rừng kinh tế của Bộ Nông nghiệp và Phát
triển Nông thôn với mục tiêu sử dụng 10% cây giống vơ tính trong trồng rừng
sản xuất (chủ yếu là ni cấy mơ) thì số lƣợng cây giống cần thiết là khoảng
80 triệu cây/năm thì việc nghiên cứu nhân giống cho các giống cây rừng đã
đƣợc cải thiện về di truyền sẽ là hƣớng đi có ý nghiã lớn trong việc nâng cao
năng suất, chất lƣợng rừng trồng từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế của trồng
rừng, từ đó góp phần cải thiện cuộc sống của ngƣời làm nghề rừng [24].
1.2. KHÁI NIỆM VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƢƠNG PHÁP NUÔI

CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
1.2.1. Khái niệm
Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô (propagation by tissue
culture) hay vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các
phƣơng pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ đƣợc tách khỏi cây đang

Luận văn thạc sỹ Sinh học


16

đƣợc dùng phổ biến để nhân giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các
bộ phận đƣợc dùng để ni cấy có thể là chồi bất định, chồi bên, chồi đỉnh,
bao phấn, phôi và các bộ phận khác nhƣ vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl)
... [1].
Phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế bào thƣờng dùng gồm các phƣơng pháp
sau: nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù tế bào,
nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần, ni cấy
phơi hữu tính và vơ tính. Trong đó, ni cấy mô cho chồi bên và chồi bất định
[2] là những phƣơng pháp chính đƣợc dùng trong nhân giống cây rừng.
Ni cấy mơ thƣờng đƣợc trẻ hố cao độ và có rễ giống nhƣ cây mọc từ
hạt, thậm chí khơng có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Ví dụ: cây
mơ Keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng nhƣ các loài cây bố mẹ là Keo tai
tƣợng và Keo lá tràm) cũng có đủ các loại lá kép một lần, kép hai lần và lá
giả, lại có rễ theo kiểu rễ cọc nhƣ những cây mọc từ hạt điển hình, thì cây
hom cũng của giống này lại chỉ có lá giả của cây trƣởng thành và khơng có rễ
cọc (nghĩa là tính trẻ hố bị hạn chế, cịn tính bảo lƣu cục bộ thì biểu hiện rõ
rệt) [24]. Tuy vậy, tính trẻ hố của cây nuôi cấy mô vẫn kém hơn cây mọc từ
hạt, Brand và Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hố của cây
mơ, cây hom lấy từ cành của cây trƣởng thành và cây ghép của cây Bulô

(Betula sp.). Kết quả cho thấy, sau 1 tháng cây nuôi cấy mơ có các băng
protein giống nhƣ cây mọc từ hạt, sau 4-8 tháng lại giống với cây trƣởng
thành, còn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trƣởng thành sau 4-8
tháng đã có một số cây có hoa, trong lúc cây mọc từ hạt nhanh nhất cũng phải
sau 8 năm mới có hoa [25]. Điều đó chứng tỏ cây ni cấy mơ tuy có mức độ
trẻ hố cao hơn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trƣởng thành (chứ
không phải lấy từ chồi của cây đã trẻ hố) song khơng thể trẻ nhƣ cây mọc từ
hạt.

Luận văn thạc sỹ Sinh học


17

1.2.2. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mơ tế bào
1.2.2.1. Tính tồn năng của tế bào thực vật
Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính tồn năng
của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang tồn bộ
lƣợng thơng tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó cịn gọi là bộ
gen (genom). Đặc tính của thực vật đƣợc thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong
từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di
truyền tƣơng ứng trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp,
trong mối tƣơng tác qua lại với điều kiện môi trƣờng, cơ quan, mơ hoặc tế bào
đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di
truyền giống nhƣ cây mẹ [29].
1.2.2.2. Sự phân hố và phản phân hố của tế bào
Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ là kết quả phân hoá và
phản phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống
nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế
bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mơ có đƣợc cấu

trúc chun mơn hố nhất định nhờ vào sự phân hoá.
Phân hoá tế bào là sự chuyển hố các tế bào phơi sinh thành các tế bào
của mơ chun hố, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể.
Q trình phân hố có thể diễn nhƣ sau:
Tế bào phôi sinh

Tế bào giãn

Tế bào phân hoá chức năng

Khi tế bào đã phân hoá thành mơ chức năng, chúng khơng hồn tồn
mất khả năng phân chia của mình. Trong trƣờng hợp cần thiết, ở điều kiện
thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng giống nhƣ tế bào phôi sinh và tiếp tục
thực hiện quá trình phân hố, q trình này gọi là sự phản phân hoá của tế
bào.

Luận văn thạc sỹ Sinh học


18

Phân hóa tế bào
Tế bào phơi sinh

Tế bào giãn

Tế bào chun hóa

Phản phân hóa

Hình 1.1. Q trình phân hố và phản phân hố tế bào

Về bản chất thì sự phân hố và phản phân hố là một q trình hoạt hố
phân hố gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển cá thể, có
một số gen đƣợc hoạt hố để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức
chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa
trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp
điều kiện bất lợi thì các gen đƣợc hoạt hố, q trình phân chia sẽ đƣợc xảy ra
theo một chƣơng trình đã định sẵn trong ADN của tế bào [26].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô- tế bào thực chất là kết
quả của q trình phân hố và phản phân hố tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế
bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào
thực vật (khi ni cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách
định hƣớng dựa vào sự phân hoá và phản phân hố của tế bào trên cơ sở tính
tồn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mơ
ni cấy, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào mơi trƣờng ni cấy hai nhóm chất
điều tiết sinh trƣởng thực vật là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lƣợng hai
nhóm chất này trong mơi trƣờng khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái
khác nhau. Trong mơi trƣờng ni cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA, IBA,
NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh
hình thái của mơ ni cấy theo hƣớng tạo chồi, ngƣợc lại nếu tỷ lệ cao thì mơ
ni cấy sẽ theo hƣớng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hƣớng tạo
mô sẹo (callus) [1].

Luận văn thạc sỹ Sinh học