Luận văn thạc sĩ sinh học nghiên cứu sản xuất, tinh sạch pfu dna polymerase tái tổ hợp từ escherichia coli

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN HÀ XUYÊN

ai

Th
N

ye

gu

Nghiên cứu sản xuấ t, tinh sa ̣ch Pfu DNA polymerase

n

tái tổ hơ ̣p từ Escherichia coli

ity

rs

ve

ni

U
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố
trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả

Nguyễn Hà Xuyên

ai

Th
n

ye

gu

N
ity

rs

ve

ni

U
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

ii


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS. Lê Quang
Hịa, trưởng phịng Kỹ thuật Gen, Viện Cơng nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người thầy đã luôn hướng dẫn, định hướng
và giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trường Đại học Thái Nguyên cũng
như các thầy cô thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, các thầy cô Viện Công
nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy
và truyền thụ cho tôi kiến thức chuyên môn để thực hiện luận văn này.

Th

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cô chị, các bạn đồng nghiệp và các em sinh

ai

viên phịng Kỹ thuật Gen đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi trong qua trình làm

gu

N

việc tại phịng thí nghiệm.

Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ những người sinh thành, nuôi dưỡng tôi là

ye

chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn

n

ve

ni

Một lần nữa tôi vô cùng cảm ơn.

U

tới anh chị, bạn bè tôi đã cổ vũ động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2015

ity

rs

Học viên

Nguyễn Hà Xuyên

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

iii


Tên viết tắt

Tên đầy đủ

a.a

Amino acid

APS

Amonium persulphate

Bp

Base pair

CBB

Coomassie brilliant blue

DNA Pol

Deoxyribonucleic acid Polymerase

Dntp

Deoxynucleoside triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide
Ethanol

ai

IPTG

Th

EtOH

Isopropyl-thio-β-D-galactoside

N

Kilo base

KDa

Kilo Dalton

KLPT

Khối lượng phân tử

LB

Luria – Bertani

OD

Mật độ quang học (optical density)

PCR

Polymerase chain reaction

PLysS

plasmid plysS mã hóa cho T7 lysozyme

PMSF

Phenyl methyl sulphonyl fluoride

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulphate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis

ssDNA

Sợi đơn DNA (single stranded DNA)

TAE

Tris-acetate-EDTA

TEMED

N, N, N’, N’-tetramethyl ethylendiamine

n

ye

gu

Kb

ity

rs

ve

ni

U

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................................................... i

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

iv


LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................................. iii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................................................... iii
MỤC LỤC................................................................................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ................................................................ vii
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................................................... 2
1.1.

Tổng quan về DNA polymerase.................................................................................................... 2

1.1.1.

DNA polymerase ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn ............................................... 3

1.1.2.

Tổng quan về DNA polymerase bền nhiệt ............................................................................ 4

1.2.

Tổng quan về Pfu DNA polymerase ............................................................................................. 6
Cấu trúc của Pfu DNA polymerase ....................................................................................... 6

1.2.2.

Cơ chế hoạt động sửa sai của Pfu DNA polymerase ............................................................ 8

1.2.3.

Một số tính chất của Pfu DNA polymerase ........................................................................ 10

1.2.4.

Ứng dụng của Pfu DNA polymerase .................................................................................. 13

1.2.5.

Tình hình nghiên cứu Pfu DNA polymerase tái tổ hợp ...................................................... 15

ai

Th

1.2.1.

gu

N

Vật liệu, hóa chất, thiết bị ........................................................................................................... 18

n

2.1.

ye

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 18
Vật liệu ................................................................................................................................ 18

2.1.2.

Hóa chất và thiết bị ............................................................................................................. 20

ni

Phương pháp ............................................................................................................................... 21

ve

2.2.

U

2.1.1.

Tách chiết plasmid .............................................................................................................. 21

2.2.2.

Nhân đoạn gen mã hóa cho Pfu DNA pol bằng phản ứng PCR .......................................... 21

2.2.3.

Điện di DNA trên gel agarose ............................................................................................. 23

2.2.4.

Tinh sạch bằng kit Wizard SV Gel ..................................................................................... 23

2.2.5.

Ghép nối gen ...................................................................................................................... 23

2.2.6.

Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ................................................ 24

2.2.7.

Xác định trình tự DNA........................................................................................................ 25

2.2.8.

Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol .................................................... 26

2.2.9.

Biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol ............................................................................. 26

2.2.10.

Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE ........................................................... 26

2.2.11.

Sắc ký ái lực qua cột amylose ............................................................................................. 27

2.2.12.

Tinh sạch protein đuôi Histag bằng Ni-charged Magbeads ................................................ 28

2.2.13.

Kiểm tra hoạt độ tổng hợp DNA của Pfu DNA pol tái tổ hợp ............................................ 28

ity

rs

2.2.1.

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

v


PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................................. 29
3.1.

Xác định trình tự gen mã hóa cho Pfu DNA pol từ tế bào mang vector pET 11a ...................... 29

3.2.

Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol ............................................................ 36

3.3.

Xây dựng quy trình tạo vector biểu hiện ..................................................................................... 38

3.4.

Lựa chọn chủng biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol........................................................... 42

3.5.

Tinh sạch protein Pfu DNA pol tái tổ hợp .................................................................................. 44

3.6.

Thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp ........................................................................................ 47

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................. 49
PHỤ LỤC………………………………………………………………………………………………...51
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………………………… 55

ai

Th
n

ye

gu

N
ity

rs

ve

ni

U
DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Bảng

Tiêu đề

Bảng 1.1

So sánh độ chính xác của các DNA polymerase bền nhiệt trong 11

Trang

PCR
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

vi


Bảng 2.1

Trình tự các cặp mồi sử dụng trong luận văn

Bảng 2.2

Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen mã hóa Pfu DNA pol 22

Bảng 2.3

Thành phần phản ứng nối ghép

24

Bảng 2.4

Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

25

Bảng 2.5

Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE

27

Bảng 2.6

Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp 29

19

ai

Th
n

ye

gu

N
ity

rs

ve

ni

U
DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Hình

Tiêu đề

Trang

Hình1.1

Cấu trúc tổng thể của Pfu DNA polymerase

8

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

vii


Hình 1.2

So sánh trình tự acid amin và cấu trúc của motif β –hairpin (vùng

9

exonulcease) và motif Y-GG/A (vùng ngón tay cái)
Hình 1.3

Cơ chế hoạt động và sửa sai của Pfu DNA polymerase

11

Hình 3.1

Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid mang đoạn gen Pfu

32

Hình 3.2

Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn gen mã hóa

31

cho Pfu DNA pol trong vector pET11a trên gel agarose 1%.
Hình 3.3

Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa Pfu

32

DNA pol bằng 2 cặp mồi T7- F/ Pfu - R1 và Pfu – F1/ T7- R
Hình 3.4

Kết quả giải trình tự đoạn gen mã hóa Pfu DNA pol từ vector pET11a tái 36
tổ hợp

Th

Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa Pfu DNA pol

Hình 3.6

Kết quả điện di sản phẩm cắt Pfu và vector pMAL - c5X bằng enzyme

38

ai

Hình 3.5

39

N

giới hạn trên gel agarose 1%

gu

Hình 3.7

Kết quả PCR sàng lọc và tách chiết plasmid các dòng khuẩn lạc mang

41

ye

plasmid pMAL c5X –Pfu điện di trên gel agarose 1%

n

Kết quả biểu hiện protein Pfu DNA pol trong tế bào E. coli BL21(DE3)

43

U

Hình 3.8

Hình 3.9

ve

ni

và E. coli BL21(DE3) pLysS điện di trên gel polyacrylamide 8%
Kết quả tinh sạch protein MBP – Pfu bằng xử lý nhiệt điện di trên gel

ity

rs

polyacrylamide 8%

45

Hình 3.10

Kết quả tinh sạch Pfu DNA pol tái tổ hợp điện di trên gel polycrylamide

46

Hình 3.11

Kết quả điện di sản phẩm PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp trên

47

gel agarose 1%

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

viii


MỞ ĐẦU
Hiện nay PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một đoạn
DNA trong ống nghiệm lên hàng triệu bản sao. Kỹ thuật này có ứng dụng rất nhiều trong
các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như: chẩn đoán bệnh
di truyền, bệnh nhiễm trùng, tách dịng gen và xác định huyết thống… Do tính chất lặp lại
nhiều chu kỳ phản ứng ở các nhiệt độ khác nhau, đặc biệt là sự biến tính DNA ở 95oC nên
PCR địi hỏi phải có các enzyme DNA polymerase bền nhiệt để đảm bảo việc xúc tác quá
trình nhân bản DNA được thực hiện dễ dàng và đặc hiệu.
Pfu DNA polymerase được tách từ vi khuẩn cổ siêu ưa nhiệt Pyrococcus furiosus sinh

Th

trưởng tối ưu ở 100°C. Pfu DNA polymerase cực kỳ bền nhiệt, vẫn giữ được hơn 95% hoạt

ai

độ ban đầu ở 95°C trong một giờ. Ngoài hoạt tính tổng hợp mạch Pfu DNA polymerase

gu

N

cịn có hoạt tính đọc sửa 3’- 5’ exonuclease làm tăng độ chính xác của quá trình tổng hợp
DNA. Hiện nay Pfu DNA polymerase thương mại có xác suất gắn sai một nucleotide

ye

khoảng 1,3.10-6. Độ chính xác trong q trình tổng hợp DNA của Pfu DNA polymerase cao

n

U

hơn nhiều so với Taq DNA polymerase và được xem là một trong số ít enzyme có tốc độ

ni

tổng hợp ít lỗi nhất trong tất cả các DNA polymerase bền nhiệt đã được nghiên cứu. Chính

ve

vì vậy, Pfu DNA polymerase được sử dụng phổ biến để khuyếch đại các sản phẩm dùng

[25].

ity

rs

cho mục đích nhân dịng, biểu hiện hay nghiên cứu các đột biến cũng như tổng hợp gen

Pfu DNA polymerase đóng vai trị quan trọng trong phản ứng PCR nên việc thu nhận
enzyme này từ vi khuẩn ưa nhiệt trở thành một nhu cầu cấp thiết. Tuy vậy, việc thu nhận
chế phẩm enzyme trực tiếp từ các vi khuẩn ưa nhiệt là khơng đơn giản vì các vi khuẩn này
thường yêu cầu môi trường sinh trưởng đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao và enzyme quan
tâm chỉ được sản xuất ở một lượng rất thấp. Trên thế giới đã có nhiều các cơng trình khoa
học nghiên cứu và tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp nhưng vẫn gặp khó khăn do
sử dụng các biện pháp tinh sạch chưa tối ưu như Heparin có giá thành đắt [22], cột P11
phosphocellulose và cột mono Q qui trình sử dụng phức tạp [12]…. Ở Việt Nam cho đến
nay chỉ có cơng trình nghiên cứu sản xuất Pfu DNA pol từ E. coli của Giáo sư Phan Tuấn
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

1


Nghĩa được thực hiện vào năm 2005 với qui trình tinh sạch qua sắc ký ái lực với Ni2+ và
Heparin Sepharose [1, 2]. Tuy nhiên Pfu DNA pol tạo ra lại ở dạng dung hợp với 20 a.a
của vector nên có thể ảnh hưởng đến khả năng kéo dài DNA trong phản ứng PCR và hơn
nữa qui tình tinh sạch bằng Heparin khá tốn kém mà lại không đặc hiệu. Trước những
nhược điểm và khó khăn trong việc tinh sạch để thu được Pfu DNA pol tinh khiết, hiện nay
có rất nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm cải thiện khả năng hòa tan của protein tái tổ hợp
trong tế bào E. coli, cũng như khả năng tinh sạch cao khi sử dụng hệ biểu hiện tạo
hexahistidine-tagged maltose-binding protein qua việc sử dụng hệ vector biểu hiện pMAL

[5, 39]. PMAL là hệ vector biểu hiện cho phép protein tạo ra ở trạng thái tan do được dung
hợp với maltose - binding proein (MBP). Ngoài khả năng tạo dạng tan của protein, MBP có

Th

ái lực với amylose nên có thể dễ dàng tinh sạch protein dung hợp qua viêc sử dụng cột

ai

amylose. Điểm cắt của Factor Xa ngay trước Pfu DNA pol giúp hồn ngun Pfu DNA

N

pol. Bên cạnh đó việc sử dụng Histag để tinh sạch bằng Ni2+ ở đầu N lại khơng ảnh hưởng

gu

đến hoạt tính của Pfu DNA tái tổ hợp [15]. Với những ưu điểm trên, chúng tôi sử dụng hệ

ye

n

vector biểu hiện pMAL kết hợp đuôi His để thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuấ t, tinh

U

sa ̣ch Pfu DNA polymerase tái tổ hơ ̣p từ Escherichia coli’’ với mục tiêu sản xuất Pfu
sinh học phân tử trong nước.

ity

rs

ve

ni

DNA polymerase chất lượng cao góp phần tích cực trong việc phục vụ các nghiên cứu về

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về DNA polymerase

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

2


DNA polymerase là nhóm enzyme xúc tác cho sự tổng hợp chuỗi
polydeoxyribonucleotide từ các cơ chất là DNA sợi đơn làm khuôn, cặp mồi, các
deoxyribonucleoside triphosphat (dNTPs) và trong môi trường có ion Mg2+. Mồi là một
đoạn oligonucleotide dài từ 5 đến vài chục nucleotide có bản chất DNA hoặc RNA. Trong
điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp, DNA polymerase kéo dài mồi theo hướng 5’→ 3’ bằng
cách nối các nucleotide qua liên kết phosphodiester theo trình tự bổ sung với sợi làm khuôn
tạo nên chuỗi DNA mạch kép. Ngồi hoạt tính kéo dài chuỗi oligonucleotide hay cịn được
gọi là hoạt tính DNA polymerase, một số DNA polymerase cịn có hoạt tính của nuclease
với vai trị sửa chữa hoặc giúp cho quá trình tổng hợp DNA được thực hiện chính xác.
Trên thực tế để đảm bảo tính chuẩn xác cho quá trình sao chép DNA tế bào phải sử dụng

Th

không chỉ một loại DNA polymerase [8, 20, 25].

ai

1.1.1. DNA polymerase ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn

N

Cho đến nay, rất nhiều loại DNA polymerase (DNA pol) khác nhau ở cả sinh vật

gu

nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn đã được phát hiện và nghiên cứu kỹ về tính chất, cấu trúc

ye

cũng như chức năng. Ở sinh vật nhân sơ điển hình là E. coli có tới 5 DNA pol khác nhau và

n

U

được ký hiệu là DNA pol I, II, III, IV và V. Ở sinh vật nhân chuẩn các DNA pol được phát

ve

ni

hiện sớm nhất là DNA pol α, β, δ, ε và γ. Trong những năm gần đây, một loạt các DNA pol
mới cũng được phát hiện ở sinh vật nhân chuẩn, đó là các DNA pol có khả năng sửa chữa

rs

các vị trí hỏng như DNA pol ξ, DNA pol η, DNA pol ι, DNA pol κ, Revl và một nhóm các

ity

DNA pol khác được gọi là DNA pol θ, DNA pol λ, DNA pol μ, DNA pol σ, DNA pol Ф
thực hiện các chức năng khác. Việc phát hiện và nghiên cứu tính chất của các DNA pol
khác nhau đã khẳng định rằng một loại DNA pol có thể khơng chỉ có một chức năng và quá
trình tổng hợp DNA trong các cơ thể có thể cần đến khơng chỉ một DNA pol, mà tế bào có
thể sử dụng đồng thời một số DNA pol khác nhau cùng thực hiện một chức năng [14].
Phần lớn các DNA pol ở dạng phức hệ gồm nhiều chuỗi polypeptide chứa các tiểu
đơn vị chức năng khác nhau, trong đó khơng thể thiếu tiểu đơn vị polymer hoá. Các tiểu
đơn vị khác chịu trách nhiệm cho hoạt tính xúc tác khác ví dụ họat tính đọc sửa 3 ’-5’
exonuclease, 5’-3’ exonuclease, hoạt tính tổng hợp các mồi RNA (primase) hay tương tác
với yếu tố sao chép, phối hợp với kháng nguyên nhân tế bào đang phân hóa (proliferating
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

3


cell nuclear antigen - PCNA) với mục đích cuối cùng là làm cho quá trình tổng hợp DNA
diễn ra nhanh chóng và chính xác [20].
Dựa vào tính tương đồng về trình tự và sự giống nhau về cấu trúc, các DNA pol
được chia thành 7 họ khác nhau là: A, B, C, D, X, Y và RT [40]. Mặc dù các DNA pol ở
các họ khác nhau có sự sai khác về mặt cấu trúc nhưng chúng cũng có một vài đặc điểm

chung, chúng cuộn gấp thành hình dạng giống với bàn tay phải của người bao gồm 3 vùng
khác biệt: “lịng bàn tay” (palm), “ngón tay cái” (thumb) và “các ngón tay” (fingers).
Trên cơ sở trình tự của DNA pol α, người ta đã phát hiện có 6 trình tự (I-VI) mang
tính bảo thủ cao trên các DNA pol ở cả sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus với
trật tự trên chuỗi polypeptide là IV-II-VI-III-I-V, còn khoảng cách giữa các trình tự bảo thủ

Th

là khác nhau ở các lồi khác nhau. Trình tự I nằm ở vùng “lịng bàn tay” gần với vùng

ai

“ngón tay cái” và chứa một trong các gốc axit aspartic bảo thủ tạo thành trung tâm xúc tác

N

của tất cả các DNA pol họ B đã biết (với motif YGDTDS). Axit aspartic khác thuộc trình

gu

tự II có dạng DxxSLYPS nằm ở đầu của lá gấp β cũng thuộc vùng “lòng bàn tay”. Thuộc

ye

vùng này cịn có SLYP-II mang tính bảo thủ cao, giữ vai trị quan trọng cho q trình liên

n

U

kết dNTP. Mặc dù các motif này là tuyệt đối bảo thủ ở các dưới họ DNA pol α và DNA pol

ve

ni

δ nhưng ở DNA pol ε lại có sự khác nhau đáng kể, motif trình tự I của DNA pol ε là
ELDTDG cịn trình tự II là DxxAMYPN. Các gốc khác có vai trị trong q trình liên kết

rs

dNTP nằm ở trình tự III và chúng cuộn gấp thành xoắn α nằm ở dưới vùng “các ngón tay”.

ity

Trình tự IV nằm ở đầu N thuộc vùng có hoạt tính 3’- 5’ exonuclease. Hai trình tự bảo thủ
khác V và VI tương ứng nằm ở các dưới vùng “ngón tay cái” và “các ngón tay” [20, 24].
Mức độ bảo thủ cao về trình tự và cấu trúc của các vùng giữa các DNA pol sinh vật
nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus chứng tỏ các DNA pol này xuất phát từ một gen tổ
tiên chung. Cấu trúc của chúng đã được tối ưu hố qua q trình tiến hố để thích hợp với
các chức năng chuyên hoá mà mỗi DNA pol thực hiện trong tế bào. Các vùng bảo thủ nhất
chịu trách nhiệm cho các chức năng xúc tác cơ bản và cần thiết, trái lại các phần khác nhau
giữa các DNA pol tiến hóa một cách độc lập để thực hiện các vai trò chuyên biệt [14,20].
1.1.2. Tổng quan về DNA polymerase bền nhiệt

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

4

Việc ra đời và ứng dụng của kỹ thuật PCR để nhân bản gen in vitro đã tạo ra sự
quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu đến các DNA pol bền nhiệt. Hàng loạt DNA pol
bền nhiệt từ các vi khuẩn ưa nhiệt đã được phát hiện, nghiên cứu và sử dụng cho PCR cũng
như các nghiên cứu khác của sinh học phân tử. Hầu hết các DNA pol này đều hoạt động tốt
ở nhiệt độ cao và bền với nhiệt. Chúng có khả năng xúc tác cho q trình tổng hợp DNA ở
nhiệt độ thậm chí trên 70°C, cần thiết cho sự nhân bản đặc hiệu các đoạn DNA, cũng như
chịu được nhiệt độ thậm chí trên 90°C, thích hợp cho việc biến tính DNA (tách các chuỗi
DNA thành các sợi đơn).
Các loại DNA polymerase bền nhiệt
 Vent DNA pol được phân lập đầu tiên từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt Thermococcus

Th

litoralis được tìm thấy ở đáy đại dương với nhiệt độ khoảng 98°C. Vent DNA pol là một

ai

DNA pol thuộc họ B, có trình tự giống với DNA pol α của người và DNA pol II của E. coli

N

hơn là DNA polymerase I của E. coli [9]. Enzyme này là một protein có KLPT 90 - 93

gu

kDa, enzyme kéo dài mồi với tốc độ 67 nucleotide/giây. Vent™ DNA polymerase bền

ye

nhiệt hơn so với Taq DNA polymerase và có khả năng kéo dài mồi để thu được các sản

n

U

phẩm có độ dài 8-13 kb. Vent™ DNA pol có hoạt tính 3’-5’ exonuclease đảm bảo độ chính

ve

ni

xác cao hơn 5-15 lần so với Taq DNA polymerase. Vent™ DNA polymerase cũng tạo ra
trên 90% các đoạn DNA đầu bằng nhờ đó làm đơn giản hóa q trình nhân dịng trực tiếp

ity

rs

các sản phẩm PCR.

Tma DNA polymerase là một protein có 893 a.a với KLPT 103 kDa, được tách ra từ
khuẩn Gram âm Thermotoga maritima siêu ưa nhiệt, sống kỵ khí ở suối nước nóng, sinh
trưởng ở nhiệt độ trên 90°C. Tma DNA polymerase giống DNA polymerase I ở E. coli ở
chỗ có cả hoạt tính 3’- 5’ exonuclease và 5’- 3’exonuclease. Khi Tma DNA polymerase bị
cắt đi một phần đầu thì tạo thành dạng enzyme thiếu hoạt tính 5’- 3’ exonuclease, giống
như mảnh Klenow và Stoffel, protein này vẫn cịn hoạt tính polymerase cũng như hoạt tính
3’- 5’ exonuclease. Các nghiên cứu bước đầu cho thấy độ chính xác trong PCR của enzyme
này gần như 100% nhờ có hoạt tính đọc sửa [6].
 Pfu DNA polymerase được tách từ vi khuẩn cổ siêu ưa nhiệt Pyrococcus furiosus
(Pfu) chiếm ưu thế trong các chất lắng đọng của biển nóng ở Italia, sinh trưởng tối ưu ở

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

5


100°C. Pfu DNA pol thuộc họ B, là một protein có 775 a.a với KLPT khoảng 91 kDa.
Trình tự a.a của Pfu DNA pol tương đồng với DNA pol α. DNA polymerase này cực kỳ
bền nhiệt, vẫn giữ được hơn 95% hoạt độ ban đầu ở 95°C trong một giờ. Hoạt tính đọc sửa
3’- 5’ exonuclease của Pfu DNA pol làm tăng độ chính xác của q trình tổng hợp DNA.
Xác suất gắn sai một nucleotide của Pfu DNA pol khoảng 1,3.10-6. Độ chính xác trong q
trình tổng hợp DNA của Pfu DNA pol cao hơn 8 lần so với Taq DNA pol và được xem là
enzyme có tốc độ tổng hợp ít lỗi nhất trong tất cả các DNA polymerase bền nhiệt đã được
nghiên cứu. Chính vì vậy, Pfu DNA pol được sử dụng phổ biến để khuyếch đại các sản
phẩm dùng cho mục đích nhân dịng biểu hiện hay nghiên cứu các đột biến. Pfu DNA pol
cũng có thể phối hợp cùng với Taq DNA pol để khuyếch đại các đoạn DNA có kích thước

Th

lớn với độ chính xác lớn hơn nhiều so với khi sử dụng Taq DNA pol đơn lẻ [1,38].

ai

1.2.

Tổng quan về Pfu DNA polymerase

N

1.2.1. Cấu trúc của Pfu DNA polymerase

gu

Pfu DNA pol là một phân tử có hình donut với tổng kích thước khoảng 50A˚×

ye

80A˚×100 A˚. Cấu trúc của Pfu DNA pol cũng gần giống với cấu trúc kinh điển của các

n

U

DNA pol họ B. Pfu pol là một chuỗi đơn polypeptide của 775 a.a được phân thành 5 vùng

ve

ni

cấu trúc riêng biệt: vùng N - terminal (1 - 130, 327 - 368), vùng 3’- 5’ exonuclease (131 326), vùng lòng bàn tay (369 - 450 và 501 - 588), vùng các ngón tay (451 - 500) và vùng

rs

ngón tay cái (589 - 775) (Hình 1.1). Vùng các ngón tay và ngón tay cái được xoay ra ngồi

ity

33˚ và 24˚, vì vậy cấu hình tổng thể của Pfu DNA pol tương tự như cấu trúc của KOD1
DNA polymerase [17].

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

6


ai

Th
N

Hình1.1: Cấu trúc tổng thể của Pfu DNA polymerase [41]

gu

Trong đó có 5 vùng riêng biệt: màu xanh da trời - vùng exonuclease, màu tím - vùng

n

vùng ngón tay cái.

ye

N - terminal, màu cam - vùng lòng bàn tay, màu xanh lá cây - vùng ngón tay, màu đỏ -

ni

U

Mặc dù cấu trúc của một vài DNA pol cổ đã được xác định nhưng những tìm hiểu

ve

chi tiết về độ trung thực và hoạt tính tổng hợp vẫn chưa được biết đến một cách đầy đủ.

rs

Gần đây nghiên cứu về cấu trúc và đột biến của Pfu DNA pol đã chỉ ra rằng cơ chế phối

ity

hợp giữa hoạt tính đọc sửa và hoạt tính tổng hợp liên quan đến sự tương tác giữa vùng loop
của miền exonuclease và phần gờ tích điện dương của vùng ngón tay cái. Tuy nhiên sự
phá vỡ liên kết giữa hai vùng này cho phép Pfu DNA pol có một cấu hình mở phù hợp với
chức năng sửa chữa hơn là chức năng tổng hợp. Phần gờ của miền các ngón tay có vị trí
tương đương với phần loop của exonuclease trong cấu trúc tinh thể của Pfu DNA pol.
Nhưng trong cấu hình mở tự nhiên lại khơng có bất kỳ sự tương tác trực tiếp nào giữa các
vùng này.
 Cấu trúc của Pfu DNA pol khi liên kết với DNA
Cấu hình đóng (khi liên kết với DNA) của Pfu DNA pol được mơ hình hóa dựa trên
cấu trúc của protein Gp43 có hoạt tính gắn DNA [7].

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

7


Từ mơ hình cấu tạo đóng, vịng loop của miền exonuclease và phần gờ của miền
ngón tay cái nằm trong khoảng cách liên kết hydro. Trong mơ hình cấu tạo đóng, motif hairpin (phần dư 243-248) của miền exonuclease được cho là nằm gần và cho phép tiếp
xúc trực tiếp với miền ngón tay cái [37]. Trình tự a.a của các motif β -hairpin cũng là duy
nhất được tìm thấy trong DNA polymerase cổ (Hình 1.2). Các motif -hairpin nằm ở khe nối
của vùng liên kết DNA khuôn và vùng chỉnh sửa đóng một vai trị quan trọng trong chuyển

đổi đầu kết thúc 3’ của sợi mồi giữa vị trí trùng hợp và chỉnh sửa đang hoạt động để việc
nhân bản được nhanh chóng và chính xác [17].

ai

Th
ye

gu

N
Hình 1.2: So sánh trình tự a.a và cấu trúc của motif β –hairpin (vùng exonulcease)

n

polymerase;

D.

TOK,

Desulfurococcus

tok

DNA

polymerase;

TGO,

ve

ni

DNA

U

và motif Y-GG/A (vùng ngón tay cái). Trong đó: KOD, Thermococcus kodakaraensis
Thermococcusgorgonarious DNA polymerase; 9◦N-7, Thermococcus sp.DNA polymerase;

ity

rs

PFU, Pyrococcusfuriosus DNA polymerase [41].

Hầu hết các loop của DNA polymerase trong từng vùng từ cổ khuẩn ưa nhiệt được
rút ngắn so với các loài khác sống ở nhiệt độ thấp hơn hoặc trong mơi trường ấm hơn (ví
dụ sinh vật nhân chuẩn), nhưng phần gờ của miền ngón tay cái trong vi khuẩn cổ vẫn giữ
lại một đoạn của vòng loop dài mặc dù gặp phải áp lực tiến hóa về khả năng chịu nhiệt như
thế nào. Các gờ được bảo tồn của miền ngón tay cái cho phép tương tác chặt chẽ với các
khu vực khác nhau của miền exonuclease, hỗ trợ vai trò điều phối quan trọng của việc đọc
sửa và trùng hợp [41].

1.2.2. Cơ chế hoạt động sửa sai của Pfu DNA polymerase
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

8

Mỗi DNA polymerase có thể được phân vào lớp có chức năng nhân bản hay sửa
chữa, cũng như là có lỗi hay dễ bị lỗi dựa trên đặc điểm riêng của từng DNA pol. Các chức
năng khác nhau của DNA pol trong sự tái bản DNA gồm việc polymerase gắn vào khn,
vận chuyển nucleotide, đảm bảo độ chính xác và kéo dài chuỗi đã được đề xuất dựa vào
cấu trúc bậc 2/ bậc 3 của DNA pol trong phức hợp với các khn DNA khác nhau [11].
Vùng các ngón tay và vùng ngón tay cái thay đổi vị trí phụ thuộc vào việc polymerase
được liên kết với DNA khuôn hay không [30]. Những DNA pol không bị ràng buộc tạo
thành những cấu trúc mở của vùng các ngón tay và vùng ngón tay cái, khi khn được gắn
vào 2 vùng này di chuyển xi về phía lịng bàn tay để giữ sợi khuôn/ mồi chặt hơn.
Sự tồn tại của những vùng bổ sung ví dụ như vùng exonuclease là thay đổi giữa các

Th

DNA pol. Trong trường hợp các DNA pol từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt bao gồm Pfu DNA pol,

ai

có 5 vùng gồm: vùng các ngón tay, vùng lịng bàn tay, vùng ngón tay cái, exonuclease và

N

vùng N - terminal [17, 19]. Vùng exonuclease thay đổi cấu trúc của nó tùy thuộc vào trạng

gu

thái của việc DNA pol đang thực hiện tái bản hay sửa chữa DNA. Khi một nucleotide bắt

ye

cặp sai được liên kết vào sợi DNA tổng hợp mới, sợi khuôn/mồi gắn vào polymerase yếu

n

U

hơn hoặc bị lệch với vị trí hoạt động của polymerase. Cuối cùng chuỗi xoắn kép tháo ra và
được cắt bỏ (Hình 1.3) [36].

ity

rs

ve

ni

nucleotide đã bắt cặp nhầm được di chuyển tới vị trí hoạt động của vùng exonuclease và

Hình 1.3: Cơ chế hoạt động và sửa sai của Pfu DNA polymerase [27, 41]

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

9


Tại DNA pol bị ràng buộc, cấu trúc đóng của vùng ngón tay cái làm cho đầu 3’ của
sợi mồi không thể gắn vào vùng exonuclease do trở ngại về không gian chủ yếu gây ra bởi
phần gờ của vùng ngón tay cái. Chỉ có cấu trúc mở của vùng ngón tay cái mới cho phép

việc gắn sợi đơn DNA mồi (ssDNA) vào vị trí hoạt động của exonuclease. Vì vậy cấu trúc
tổng thể của mỗi vùng là sự kết hợp chặt chẽ với các vùng khác để thực hiện q trình sao
chép DNA.
Cấu trúc vịng (loop) của vùng exonuclease là vùng bảo tồn mà chỉ có trong DNA
pol của vi khuẩn cổ ưa nhiệt [27]. Khi gây đột biến điểm vùng exonuclease làm cho vị trí
của vùng này gần hơn với vùng ngón tay cái, sẽ ngăn cản sự liên kết đầu 3’ của ssDNA với
vị trí hoạt động của vùng exonulcease, do vậy làm giảm hoạt tính 3’- 5’ exonuclease. Vì

Th

vậy cấu trúc mở tự nhiên của vùng ngón tay cái là cần thiết cho chức năng sửa chữa của

ai

polymerase [41].

N

1.2.3. Một số tính chất của Pfu DNA polymerase

gu



Độ chính xác và khả năng kéo dài chuỗi của Pfu DNA pol

ye

Pfu DNA polymerase được cho là hữu ích trong việc khuyếch đại gen với độ chính xác

n

U

cao những mục tiêu DNA lên đến 2,5 kb [22]. Nghiên cứu tối ưu hóa bộ đệm với Pfu DNA

ve

ni

pol để đánh giá xem sự chính xác của Pfu DNA pol có thể được tăng cường hơn nữa đã
được nghiên cứu qua tỷ lệ gây lỗi trong PCR được so sánh khi thay đổi nồng độ MgSO4,

rs

dNTP và giá trị pH khác nhau. Kết quả cho thấy rằng, Pfu DNA pol tạo lỗi ít nhất khi phản

ity

ứng PCR được thực hiện với sự có mặt của 2 – 3 mM MgSO4, 100 – 300 µM mỗi loại
dNTP và khoảng pH từ 8,5 – 9,1 ở 25ºC (tương ứng với pH 7,1 – 7,7 ở 72ºC). Những điều
kiện trên cũng là tối ưu để thu được lượng sản phẩm PCR cao. Trong khi đó, với cùng điều
kiện về nồng độ dNTP là 800 µM, sự có mặt của 1 mM MgSO4 lại tạo ra tỷ lệ lỗi cao hơn 3
lần so với 2 – 10 mM MgSO4 [21].
Pfu là DNA pol có độ trung thực cao thường được sử dụng cho PCR và có tỷ lệ lỗi
trung bình là 1,3.10-6 đột biến/bp/phản ứng, chính xác hơn Taq DNA pol 8 lần [21]. Độ
trung thực cao này là do Pfu pol có hoạt tính đọc sửa 3’–5’ exonuclease. Khi loại bỏ hoạt
tính 3’–5’ exnonuclease (exo – Pfu), trong điều kiện PCR có mặt của đệm Pfu PCR (2mM
MgSO4, 200 µM mỗi loại dNTP, pH 8,8) thì exo – Pfu có tỷ lệ lỗi là 4,7.10-5 cao hơn Pfu
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

10


DNA pol 40 lần trong cùng điều kiện phản ứng. Cũng trong điều kiện phản ứng trên nhưng
khi thay đổi pH của đệm từ 8,8 xuống 8,0 thì tỷ lệ lỗi của exo – Pfu DNA pol chỉ cao hơn
Pfu DNA pol 7 lần. Những kết quả trên cho thấy rằng, khi có hoạt tính 3’- 5’ exonuclease
và thực hiện PCR trong những điều kiện thích hợp Pfu DNA pol là một trong số ít các
enzyme DNA pol bền nhiệt cho tỷ lệ lỗi thấp nhất (Bảng 1.1).
Bảng 1.1: So sánh độ chính xác của các DNA polymerase bền nhiệt trong PCR
[21,38]
Tỷ lệ sao chép lỗi

Các DNA
polymerase bền nhiệt

110

8 ± 3,9

16

2,8 ± 0,9

5,6

2,7 ± 0,2

5,4

1,3 ± 0,2

2,6

Th

55 ± 2-e

Taq

n

ye

gu

N

Pfu

ai

Deep Vent

PCR bị đột biến (%)

(×10-6)

UlTma

Vent

Tỷ lệ sản phẩm

U

Khả năng nhân bản các đoạn DNA có kích thước khác nhau là một điểm đáng lưu ý đối

ve

ni

với các DNA polymerase. Mặc dù Taq DNA pol là enzyme được sử dụng rộng rãi nhất
trong PCR nhưng lại bị hạn chế bởi thiếu hoạt tính đọc sửa. Pfu DNA pol có hoạt tính đọc

rs

ity

sửa 3’–5’ exonuclease nhưng lại có hiệu quả thấp trong việc khuếch đại DNA do khả năng
kéo dài thấp. Khi sử dụng Pfu DNA pol lẻ để nhân đoạn gen 5 kb khơng cho kết quả dương
tính. Taq DNA pol có khả năng tổng hợp đoạn 5 kb nhưng lại không tổng hợp được đoạn
7,4 kb. Khi kết hợp hai enzyme trên với tỷ lệ 4 Taq: 1 Pfu cho phép tổng hợp được cả 2
đoạn 5 và 7,4 kb [2]. Hiện tượng này liên quan đến hoạt tính 3’- 5’ exonuclease của Pfu
DNA pol, khi có mặt cùng với Taq DNA pol trong phản ứng th Pfu DNA pol đã giúp loại
bỏ những nucleotide bị đưa nhầm vào và làm cho q trình kéo dài chuỗi được tiếp tục,
nhờ đó nâng cao khả năng kéo dài chuỗi. Tuy nhiên khi kết hợp Taq DNA pol và Pfu DNA
pol theo tỷ lệ 16 Taq: 1 Pfu để khuếch đại đoạn 30 kb, hỗn hợp 2 enzyme này cho tỷ lệ lỗi
5,6.10-6 (sử dụng Taq PCR buffer). Tỷ lệ lỗi trên cao hơn tỷ lệ của Pfu pol 6 lần nhưng lại
thấp hơn tỷ lệ lỗi của Taq DNA pol đơn lẻ 30% trong cùng một điều kiện PCR [21].

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

11


 Ảnh hưởng của một số chất khác nhau lên hoạt động tổng hợp DNA của Pfu DNA
pol
Sự có mặt của các chất có trong phản ứng PCR có ảnh hưởng rất quan trọng đến hoạt
tính tổng hợp của Pfu DNA pol.
Nồng độ dNTP thường được sử dụng trong phản ứng PCR là 20 – 200 μM. Nồng độ
cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu. Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành
phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Sự mất cân bằng trong thành phần các
dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. Tuy nhiên Pfu DNA pol hoạt
động tốt khi có mặt của 100 – 250 µM mỗi loại dNTP [26].
Nồng độ MgCl2 là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Mg2+ rất cần cho

Th

quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Pfu DNA pol, làm tăng Tm của DNA

ai

mạch kép. Mg2+ là Co – factor của Pfu DNA pol nên nếu lượng Mg2+ q thấp thì Pfu

N

DNA pol sẽ khơng thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài, hạn chế quá trình

gu

kéo dài. Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định sợi đôi DNA và ngăn ngừa sự biến

ye

tính hồn tồn của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời,

n

U

nồng độ Mg2+ cao có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra nhiều hơn và cho ra những

ve

ni

sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ chuyên biệt thấp. Pfu DNA pol
hoạt động tối ưu trong mơi trường có 2 mM Mg2+ [33, 44].

rs

NaN3 từ lâu được biết đến là một chất kháng khuẩn tốt với nồng độ hiệu quả là 0,02%

ity

(w/v) tức 3 mM, trong khi đó với phản ứng PCR có 0,1 – 3 mM NaN3 không làm ức chế
hoạt động của Pfu DNA pol. Điều này cho phép bổ sung NaN3 ở nồng độ 3 mM vào chế
phẩm Pfu DNA pol để chống nhiễm khuẩn khi cần thiết mà không làm ảnh hưởng đến hoạt
tính xúc tác của enzyme [1,3].
Tương tự như vậy thì NaF ở nồng độ 1-50 mM, monocaprin ở nồng độ 2-50 mM,

heptyl paraben ở nồng độ 10- 80 mM đều không ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp DNA
của Pfu DNA pol. Ngược lại, kẽm sunphat (ZnSO4) ở nồng độ 0,5 mM và EDTA ở nồng
độ 2 mM trở lên đã ức chế mạnh hoạt động của Pfu DNA pol. Tác dụng ức chế của EDTA
liên quan đến hoạt tính tạo phức của EDTA với ion Mg2+ vốn rất cần cho hoạt động tổng
hợp DNAcủa Pfu DNA pol cũng như các DNA pol khác [1].
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

12


 Độ bền nhiệt của Pfu DNA pol
Pfu DNA pol được phân lập từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt có độ bền nhiệt rất cao vì vậy khi
sản xuất Pfu DNA pol tái tổ hợp, độ bền nhiệt là một chỉ tiêu vơ cùng quan trọng để Pfu
DNA pol có thể ứng dụng được trong PCR với các điều kiện gia nhiệt biến tính DNA ở
nhiệt độ cao cũng như thời gian kéo dài. Với một Pfu DNA pol tái tổ hợp có gắn thêm đi
6His ở đầu N - terminal vẫn giữ được hoạt tính tổng hợp sau 1 giờ để ở nhiệt độ phòng (25
- 30°C) hay xử lý nhiệt ở 100ºC. Tương tự, việc giữ enzyme ở nhiệt độ phịng trong vịng 4
ngày sau đó thử hoạt độ qua khả năng nhân bản DNA bằng PCR cho thấy Pfu DNA pol tái
tổ hợp vẫn duy trì hoạt tính nhân bản tốt như giữ ở -20°C [2].
 Một số tính chất khác của Pfu pol

Th

Như đã biết, Taq DNA pol có hoạt tính terminal transferase cho phép gắn thêm gốc

ai

adenosine monophosphat (A) vào đầu 3’ của đoạn DNA sợi kép [13]. Chính vì đặc điểm

N

này mà các sản phẩm nhân bản PCR dùng Taq DNA pol có thể được đưa vào vector hở có

gu

gốc T ở hai đầu 3’, dựa trên sự ghép cặp đặc hiệu gữa A và T. Trong khi đó sản phẩm nhân

ye

bản bằng PCR dùng Pfu DNA pol lại có đầu bằng. Việc tạo ra sản phẩm có đầu bằng tạo

n

ve

ni

một loại enzyme cắt giới hạn nào cả.

U

thuận lợi cho việc nối gen vào những vector cũng có đầu tù mà khơng cần phải dùng đến
1.2.4. Ứng dụng của Pfu DNA polymerase

rs

Chức năng chủ yếu của các DNA pol là tổng hợp chuỗi polynucleotide và sửa lỗi

ity

bằng cách loại bỏ các nucleotide không bổ sung với sợi khn, đảm bảo cho q trình tự
nhân đơi của DNA được diễn ra một cách chính xác. Phần lớn các DNA pol dùng DNA để
làm khuôn cho sự tổng hợp. Tuy vậy, cũng có DNA pol đặc biệt có khả năng phiên mã
ngược sử dụng khn là ARN để tổng hợp DNA (Tth DNA polymerase) [12]. Ngoài ra,
cũng phải kể đến một hoạt tính terminal transferase của một số DNA pol cho phép gắn
nuleotide vào đầu phân tử DNA có sẵn. Nhờ những tính chất này mà các DNA pol được
ứng dụng rộng rãi trong sinh học phân tử.
Ứng dụng phổ biến nhất của DNA polymerase chính là dùng trong việc xác định
trình tự nucleotide các gen. Bằng việc dựa trên DNA khuôn để tổng hợp các đoạn sợi
DNA mới chỉ khác nhau một nucleotide mà người ta có thể dễ dàng giải được trình tự của
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

13


DNA. Điều này chỉ đảm bảo chính xác khi DNA pol dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới
tuân thủ nguyên tắc bổ sung một cách nghiêm ngặt.
Nhân bản các gen hay DNA bằng kỹ thuật PCR là ứng dụng phổ biến thứ hai của
các DNA pol. Cho đến nay, kỹ thuật PCR trở thành một phương pháp thường ngày và
khơng thể thiếu trong các phịng thí nghiệm sinh học phân tử hay kỹ thuật gen. Điều này
cũng nói lên rằng, các DNA pol, mà cụ thể là các DNA pol bền nhiệt luôn luôn được cần
đến.
Ứng dụng Pfu DNA pol trong PCR cần độ chính xác cao: Trong nhiều ứng dụng
sinh học phân tử bao gồm nhân bản, các đột biến có hướng và dịch mã DNA là rất quan
trọng để bảo tồn các chuỗi DNA chính xác trong việc nhân bản PCR. Một nucleotide kết

Th

hợp khơng chính xác có thể thay đổi codon tương ứng và kết quả là việc bổ sung các a.a sai

ai

trong quá trình dịch mã. Điều này có thể ảnh hưởng đến tính gấp và chức năng của protein.

N

Ngồi ra, việc xóa một nucleotide có thể phá hủy các khung đọc đúng. Pfu DNA pol có độ

gu

trung thực cao nhất trong các polymerase chịu nhiệt. Tỷ lệ lỗi của Pfu DNA pol thấp hơn

ye

khoảng 8 lần so với polymerase Taq DNA pol. Vì vậy Pfu DNA polymerase có ứng dụng

n

U

quan trọng trong PCR cần độ chính xác cao [38].

ve

ni

Sử dụng Pfu DNA pol trong PCR tạo các gen tổng hợp: sử dụng phương pháp PCR
2 giai đoạn (two step – PCR) để tạo nhanh các đoạn gen tổng hợp dựa trên cơ sở những

rs

nucleotide chồng lên nhau (overlapping) có thể tạo ra đoạn cần tổng hợp thông qua nhiều

ity

chu kỳ khuếch đại PCR [29]. Người ta có thể thiết kế một gen tổng hợp có chứa codon tối
ưu được dùng để biểu hiện protein trong cơ thể sinh vật hoặc gen tổng hợp được thiết kế để
thêm vị trí cắt hạn chế tạo điều kiện thuận lợi cho các thí nghiệm về sau. Nguyên tắc của
PCR 2 giai đoạn là hai phản ứng PCR xảy ra liền nhau, phản ứng thứ nhất tạo ra khn
tương ứng với gen tổng hợp và sau đó được khuếch đại trong phản ứng PCR thứ hai. Để
tạo độ chính xác cho đoạn gen tổng hợp và các đoạn oligo có thể overlap lên nhau tạo ra
đoạn gen hồn chỉnh thì enzyme thực hiện phản ứng kéo dài khơng được tạo đầu lồi (có dư
nucleotide A) như Taq DNA pol. Vì vậy Pfu DNA pol là enzyme phù hợp nhất cho mục
tiêu tổng hợp gen.

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

14


Việc sử dụng PCR trong phân tích các mẫu DNA chất lượng kém và nhiễm bẩn ví
dụ như mẫu máu được di truyền pháp y ứng dụng triệt để. Trong phản ứng với nồng độ
Mg2+ cao, Pfu DNA pol có khả năng nhân một đoạn gen từ DNA genome trong môi trường
chứa đến 14% máu. Với khả năng khuếch đại cao và hoạt động tốt trong điều kiện mẫu
máu khác nhau, Pfu DNA pol được ứng dụng trong các phòng thí nghiệm lâm sàng để phân
tích tính đa hình của các sợi đơn DNA (SNPs) trong các mẫu máu [19, 32].
Nhân đoạn gen có % GC cao: đối với các gen mục tiêu có tỷ lệ GC cao việc thiết kế
chương trình nhiệt để khuếch đại các đoạn gen này cũng phải được chú ý để không xảy ra
hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu khi nhiệt độ gắn mồi thấp. Do Pfu DNA pol vẫn giữ
được 94 – 95% hoạt tính sau 1 giờ ở 100ºC nên việc nhân các đoạn gen trên ở nhiệt độ cao

Th

trở nên vô cùng dễ dàng mà khơng phải lo việc enzyme có bị mất hoạt tính hay khơng [32].

ai

1.2.5. Tình hình nghiên cứu Pfu DNA polymerase tái tổ hợp

N

Pfu DNA polymerase đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR nên việc thu nhận

gu

enzyme này từ vi khuẩn ưa nhiệt trở thành một nhu cầu cấp thiết. Tuy vậy, việc thu nhận

ye

chế phẩm enzyme trực tiếp từ các vi khuẩn ưa nhiệt là khơng đơn giản vì các vi khuẩn này

n

U

thường u cầu môi trường sinh trường đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao và enzyme quan

ve

ni

tâm chỉ được sản xuất ở một lượng rất thấp. Vì vậy sản xuất enzyme này bằng công nghệ
protein tái tổ hợp hiện đang là giải pháp ưu việt nhất và đã có nhiều cơng trình khoa học
Trên thế giới

ity



rs

nghiên cứu sản xuất Pfu DNA pol.

Có rất nhiều các nghiên cứu với mục đích tạo ra các DNA pol bền nhiệt có hoạt tính
cao để ứng dụng trong PCR. Cho đến năm 1991, Marthur và cộng sự đã nhân dịng gen mã
hố Pfu DNA polymerase từ Pyrococcus furiosus.
Đến năm 1997, Lu và Erickson đã biểu hiện thành công Pfu DNA pol trên tế bào E. coli
BL21 DE3 (pLysS). Trong nghiên cứu của Lu và Erickson đã sử dụng vector pET11 để tạo
Pfu tái tổ hợp và tiến hành tinh sạch bằng cách gia nhiệt ở 70 ºC tiếp đó sử dụng cột P11
phosphocellulose và cột mono Q. Với phương pháp trên nhóm tác giả đã thu được 3,7 mg
Pfu DNA pol tinh sạch từ 1 lít dịch nuôi tế bào cùng độ tinh sạch là 97% và hoạt độ 22.500
unit/mg. Một đơn vị hoạt độ của enzyme (unit) được tính bằng lượng enzyme xúc tác cho
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

15


sự kết hợp của 10 nmol deoxyribonucleotides vào một đoạn polynucleotide trong 30 phút
ở 72 °C. Kết quả tuy thấp hơn việc thu Pfu DNA pol trực tiếp từ chủng Pyrococcus
furiosus (31.713 unit/mg) và biểu hiện qua baculovirus (26.000 unit/mg) nhưng tốc độ kéo

dài chuỗi của Pfu DNA pol tái tổ hợp lại cao hơn so với Pfu DNA pol có nguồn gốc từ tự
nhiên [31, 33]. Ưu điểm của phương pháp này là protein tạo ra mang đúng trình tự a.a mã
hóa cho Pfu DNA pol mà khơng chứa thêm bất kỳ một a.a nào của vector biểu hiện, điều
này tạo ra Pfu DNA pol cuộn xoắn theo đúng cấu trúc tự nhiên và khơng ảnh hưởng đến
hoạt tính xúc tác của Pfu DNA pol tái tổ hợp. Tuy nhiên việc tinh sạch Pfu DNA pol tái tổ
hợp gặp khó khăn và đắt tiền do phải sử dụng hệ thống tự động để thu các phân đoạn khi
tinh sạch bằng P11 phosphocellulose và cột mono Q và làm mất mát một lượng lớn

Th

enzyme trong quá trình thực hiện các bước tinh sạch [13].

ai

Để đơn giản hóa q trình tinh sạch Pfu DNA pol tái tổ hợp, năm 1998 Dabrowski và

N

Kur đã nghiên cứu biểu hiện 6Histag – Pfu trong tế bào E. coli qua vector biểu hiện

gu

pET30LIC. Vì protein tạo ra có 6His ở đầu N- terminal nên việc tinh sạch chỉ tiến hành qua

ye

bước gia nhiệt và sử dụng duy nhất cột Ni2+ - TED Sepharose. Kết quả sau biểu hiện và

n

U

tinh sạch theo phương pháp này cho phép thu được một lượng Pfu DNA pol nhiều hơn 6

ve

ni

lần (24 mg/ 1 lít dịch ni) so với nghiên cứu của Lu và cộng sự ở trên và hoạt độ enzyme
thu được tương đương với Pfu DNA pol từ P. furiosus (31.000 unit/mg). Các kết quả cũng

rs

cho thấy rằng khi có thêm đi 6His ở đầu N – terminal, Pfu DNA pol vẫn có hoạt tính

ity

tổng hợp chuỗi như Pfu DNA pol tự nhiên và vẫn giữ được hoạt tính tổng hợp sau 8 giờ gia
nhiệt ở 98ºC [15,38]. Bên cạnh những nghiên cứu về Pfu DNA pol, nhóm tác giả cũng đã
chứng minh phương pháp trên cho kết quả tương tự khi áp dụng với Pwo – một DNA pol
có độ tương đồng về nucleotide gần như 100% với Pfu DNA pol [4, 15]. Qui trình tinh
sạch thu được lượng protein nhiều, tuy nhiên việc chỉ tinh sạch bằng gia nhiệt và ái lực với
Ni2+ vẫn chưa đủ tinh khiết để phục vụ các thí nghiệm về sinh học phân tử.
Năm 2013, Ji Hye Heo và cộng sự đã sử dụng semi – nested PCR để nhân đoạn gen mã
hóa cho Pfu DNA pol từ chính DNA có lẫn trong hỗn hợp Pfu DNA pol thương mại và
biểu hiện thành công trên E. coil BL21 DE3 với hệ vector pET21(b). Pfu DNA pol tái tổ
hợp được thu bằng cách gia nhiệt ở 100 ºC trong 10 phút để ly giải và biến tính các protein
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

16

của E.coli sau đó tinh sạch bằng sắc ký qua cột heparin. Ưu điểm của phương pháp này là
chỉ cần 1 - 2 giờ để có thể tinh sạch Pfu DNA pol khi sử dụng một loại đệm, nhưng hóa
chất Heparin sử dụng cho tinh sạch có giá thành cao mà lại liên kết đặc hiệu không chỉ với
với Pfu DNA pol mà còn DNA pol của tế bào vi khuẩn, do vậy enzyme thu được vẫn còn
lẫn tạp do chỉ sủ dụng một bước sắc ký ái lực [23].
 Tại Việt Nam
Mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều các cơng trình khoa học nghiên cứu sản xuất Pfu
DNA pol tái tổ hợp nhưng tại Việt Nam cho đến nay mới chỉ có 1 cơng trình nghiên cứu
sản xuất Pfu DNA pol tái tổ hợp trên Escherichia coli của Giáo sư Phan Tuấn Nghĩa và
cộng sự được thực hiện vào năm 2005.

Th

Trong nghiên cứu của nhóm tác giả đã sử dụng vector pET28a để biểu hiện và kết hợp

ai

trình tự 6His vào đầu N của Pfu DNA pol, tạo điều kiện cho việc tinh sạch enzym qua cột

N

sắc ký ái lực Ni - Agarose. Việc phát hiện ra khả năng bám của Pfu DNA pol vào gel

gu

Heparin -Sepharose và bổ sung thêm bước sắc ký ái lực qua cột này một lần nữa loại trừ

ye

khả năng lẫn các protein không mong muốn trong chế phẩm Pfu DNA pol. Qui trình tinh

n

U

sạch được thiết lập đã thu được 25-26 mg Pfu DNA pol tinh khiết từ 1 lit dịch tế bào E. coli

ve

ni

nuôi cấy với tổng hoạt độ khoảng 40.000 unit, tương tự như hiệu suất mà Dabrowski và
Kur (1998) thu được khi dùng với hệ thống vector pET30LIC. Mặc dù qui trình thu được

rs

lượng lớn Pfu DNA pol trên nhưng thực hiện qua giai đoạn tinh sạch sử dụng Heparin

ity

Sepharose có giá thành cao mà lại khơng đặc hiệu do Heparin có thể liên kết với các DNA
pol của tế bào vi khuẩn chủ [1, 2]. Ngoài ra Pfu DNA pol tạo ra lại mang thêm một đoạn
khoảng 20 a.a của vector pET28a ở đầu N, đoạn a.a này có thể làm ảnh hưởng đến khả
năng cuộn xoắn, tổng hợp chuỗi DNA của enzyme.
Vì vậy các nghiên cứu sản xuất Pfu DNA pol trên thế giới và ở Việt Nam vẫn tồn tại
nhiều nhược điểm và khó khăn trong việc tinh sạch để thu được Pfu DNA pol đảm bảo tinh
khiết. Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu với mục đích làm tăng khả năng
hòa tan và tinh sạch protein tái tổ hợp cho hiệu suất cao và tinh khiết từ tế bào E. coli với

hexahistidine-tagged maltose-binding protein (HistagMBP) khi sử dụng hệ vector pMAL
[5, 39]. Hệ vector biểu hiện pMAL có những ưu điểm như: protein tạo ra ở trạng thái tan
Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

17