Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus awamori và ứng dụng trong quá trình thủy phân nội tạng cá basa dùng chế biến thức ăn gia súc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG




ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ NẤM
MỐC ASP.AWAMORI VÀ ỨNG DỤNG TRONG
QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ
BASA DÙNG CHẾ BIẾN THỨC ĂN GIA SÚC





GVHD : CN ĐỖ THỊ TUYẾN
SVTH: VŨ THỊ LÊ HOÀNG
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2006-2010








Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2010
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, ngoài sự cố gắng của bản thân, em xin chân thành
gửi lời cảm ơn tới quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học Trường đại học Kỹ
Thuật Công Nghệ TP.HCM đã hết lòng truyền đạt cho em những kiến thức quý
báu trong quá trình em học tại trường.
Xin cảm ơn các thầy cô Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã giúp đỡ em trong lúc
làm đồ án tại Viện
Em cũng xin cảm ơn những người bạn đã giúp em khi em cần trợ giúp.
Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:
Thầy PGS Nguyễn Tiến Thắng đã truyền đạt cho em những kiến thức và sự
hiểu biết đầu tiên về enzyme.
Cử nhân Đỗ Thị Tuyến đã tận tâm giải thích và hướng dẫn cho em hoàn
thành đồ án tốt nghiệp.
Cuối cùng con Lời cảm ơn sâu sắc nhất xin được gửi đến ba, mẹ người đã
nuôi dưỡng và dạy bảo con, cho con được đi học đến ngày nay. Ba mẹ luôn là
chỗ dựa vững chắc nhất của con, là nguồn động viên, để con tiếp tục phấn đấu
hơn nữa trong cuộc sống.
Tp.HCM, tháng 7 năm 2010.
SVTH: Vũ Thị Lê Hoàng

MỤC LUC
Trang Bìa
Lời Cảm ơn
Danh Mục Các Chữ Viết Tắt
Danh Mục Các Hình
Danh Mục Các Bảng
Danh Mục Các Đồ Thị

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
U: Unit, đơn vị hoạt tính
HT: Hoạt tính.

h Giờ (thời gian)
Asp: Aspergillus
TCA: Tricloacetic acid
SSF: Solid State Fermentation (lên men bán rắn).
VSV: Vi Sinh Vật.
Stt: Số thứ tự
a
w
Chỉ số hoạt độ nước (activity water)

Daltons Trọng lượng phân tử
CP Chế phẩm enzyme

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Cá Basa 14
Hình 3.1 : Nấm mốc Asp.awamori 18
Hình 3.2 : Hệ thống sắc ký 28
Hình 3.3: Nội tạng cá trước khi sấy 35
Hình 4.1: Kết quả chạy điện di của mẫu protein 59
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4.1 : Chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá Basa 50
Bảng 4.2: Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết
enzyme thô của nấm mốc Asp.awamori 50
Bảng 4.3: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của pH 51

Bảng 4.4: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của nhiệt độ 52
Bảng 4.5: Độ biến thiên hoạt tính enzyme của độ bền nhiệt 53
Bảng 4.7: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính sau khi tinh sạch 56
Bảng 4.6: Tổng hoạt tính và tỏng hàm lượng enzyme của hãng Amano
57

Bảng 4.8: Tổng hàm lượng và tổng hoạt tính của enzyme 57
Bảng 4.9: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein trong thang chuẩn
60
Bảng 4.10: Giá trị Rf từng vạch của của mỗi peak trong mẫu 61
Bảng 4.11: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Hãng Amano
61
Bảng 4.12: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Peak 2 61
Bảng 4.13: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở Peak 3 62
Bảng 4.14: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein ở mẫu thô 62
Bảng 4.15: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 40
0
C 63
Bảng 4.16: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 40
0
C 65
Bảng 4.17: Hàm lượng NH
3
ở nhiệt độ 40
0
C 66
Bảng 4.18 : Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở nhiệt độ 50
0
C
Bảng 4.19: Hàm lượng đạm amin ở 50
0
C 70
Bảng 4.20: Hàm lượng NH
3
ở nhiệt độ 50
0

C 72
Bảng 4.21 : Hàm lượng protein ở nhiệt độ 60
0
C 73
Bảng 4.22: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 60
0
C……………….75
Bảng 4.23: Hàm lượng NH
3
ở nhiệt độ 60
0
C 76


DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme 51
Đồ thị 4.2 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme 52
Đồ thị 4.3 : Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme 54
Đồ thị 4.4 : Sắc ký của hãng Amano 55
Đồ thị 4.5 : Đồ thị sắc ký lọc gel 56
Đồ thị 4.6 : Độ tinh sạch trước và sau sắc ký 58
Đồ thị 4.7: Sự tương quan giữa log của trọng lượng phân tử và giá trị Rf
60
Đồ thị 4.8: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 40
0
64
Đồ thị 4.9: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 40
0
C 65
Đồ thị 4.10: Hàm lượng NH

3
ở nhiệt độ 40
0
C 67
Đồ thị 4.11: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 50
0
C 69
Đồ thị 4.12: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 50
0
C 71
Đồ thị 4.13: Hàm lượng NH
3
ở nhiệt độ 50
0
C 72
Đồ thị 4.14: Hàm lượng protein theo phương pháp Biure ở 60
0
C 74
Đồ thị 4.15: Hàm lượng đạm amin ở nhiệt độ 60
0
C 75
Đồ thị 4.16: Hàm lượng NH
3
ở nhiệt độ 60
0
C 77

MỤC LỤC
CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về enzyme 3
2.1.1 Khái quát chung về enzyme 3
2.1.2 Lịch sử phát triển 4
2.1.3 Tính chất của enzyme 5
2.1.3.1 Bản chất sinh học 5
2.1.3.2 Bản chất hóa học 5
2.1.4 Nguồn thu nhận enzyme 5
2.1.4.1 Nguồn enzyme động vật 6
2.1.4.2 Nguồn enzyme thực vật 6
2.1.4.3 Nguồn enzyme vi sinh vật 6
2.2 Khái quát chung về enzyme protease 7
2.2.1 Định nghĩa 7
2.2.2 Phân loại protease 8
2.2.3 Ứng dụng của protease 9
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân của enzyme 11
2.2.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 11
2.2.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 12
2.2.4.3 Ảnh hưởng của chât kiềm hãm và chất hoạt hóa 12
2.2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 12
2.2.4.5 Ảnh hưởng của pH môi trường 13
2.2.4.6 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 13
2.2.4.7 Ảnh hưởng của lượng nước 14
2.3 Cá Basa và phế liệu trong quá trình chế biến 14
2.3.1 Đặc điểm sinh học của cá Basa 14
2.3.1.1 Phân loại khoa học 14
2.3.1.2 Hình thái 15

2.3.1.3 Phân bố 15
2.3.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng 15
2.3.1.5 Đặc điểm sinh trưởng 15
2.3.1.6 Đặc điểm sinh sản 16
2.3.1.7 Mỡ cá Basa 16
2.4 Tình hình sản xuất cá Basa ở Việt Nam 16
2.5 Phế liệu cá 17
CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu 18
3.1.1 Khái quát chung về nấm mốc Asp awamori 18
3.1.2 Phương pháp nuối cấy nấm mốc Asp awamori 18
3.1.2.1 Phương pháp giữ giống cấp 1 18
3.1.2.2 Làm môi trường thạch nghiêng 18
3.1.2.3 Cấy truyền giống 19
3.1.2.4 Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn 19
3.1.2.5 Nuôi nấm mốc trong bình tam giác 20
3.2 Phương pháp thu nhận enzyme protease 20
3.2.1 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Braford 20
3.2.1.1 Nguyên tắc 20
3.3.1.2 Tiến hành thí nghiệm 21
3.3.1.3 Tính kết quả 22
3.2.2 Phương pháp xác định enzyme protease 22
3.2.2.1 Nguyên tắc 22
3.2.2.2 Tiến hành thí nghiệm 22
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme 25
3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme 26
3.2.5 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính của enzyme 27
3.2.6 Tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel 27
3.2.6.1 Bản chất phương pháp 28
3.2.6.2 Hóa chất và dụng cụ 29

3.2.6.3 Tiến hành chạy sắc ký 29
3.2.7 Phương pháp điện di 31
3.2.7.1 Thiết bị và dụng cụ 31
3.2.7.2 Hóa chất 32
3.2.7.3 Chuẩn bị mẫu và chạy điện di 34
3.2.7.4 Xác định trọng lượng phân tử rotein 35
3.3 Thủy phân nội tạng cá 35
3.3.1 Xác định độ ẩm 35
3.3.1.1 Nguyên tắc 35
3.3.1.2 Dụng cụ và vật liệu 35
3.3.1.3 Cách tiến hành 36
3.3.1.4 Tính kết quả 36
3.3.2 Xác định hàm lượng tro 36
3.3.2.1 Nguyên tắc 36
3.3.2.2 Dụng cụ và vật liệu 36
3.3.2.3 Tiến hành 37
3.3.2.4 Tính kết quả 37
3.3.3 Xác định hàm lượng Canxi 37
3.3.4 Xác định hàm lượng Photpho 39
3.3.5 Xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl 42
3.3.5.1 Nguyên tắc 42
3.3.5.2 Hóa chất và dụng cụ 43
3.3.5.3 Tiến hành 43
3.3.6 Xác định hàm lượng acid amin theo phương pháp chuẩn độ formol để
đánh giá mức độ thủy phân protein 44
3.3.6.1 Nguyên tắc 44
3.3.6.2 Hóa chất 45
3.3.6.3 Dụng cụ 45
3.3.6.4 Tiến hành 46
3.3.6.5 Tính kết quả 46

3.3.7 Xác định protein bằng phương pháp Biure 46
3.3.7.1 Nguyên tắc 46
3.3.7.2 Thực hành 46
3.3.7.3 Tính kết quả 47
3.3.8 Xác định lượng NH
3
bằng chưng cất hơi nước 47
3.3.8.1 Nguyên tắc 47
3.3.8.2 Dụng cụ và hóa chất 48
3.3.8.3 Tiến hành 48
3.3.8.4 Cách tính kết quả 48
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
4.1 Kết quả các chỉ tiêu sinh hóa nội tạng cá basa chưa thủy phân (nguyên liệu
ban đầu 50
4.2 Thu nhận enzyme trước tinh sạch 50
4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 50
4.3.1 Ảnh hưởng của pH 50
4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 52
4.3.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt 53
4.4 Kết quả tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel 55
4.4.1 Kết quả tinh sạch enzyme của hãng Amano 55
4.4.2 Kết quả tinh sạch enzyme của mẫu 56
4.5 Kết quả tinh sạch enzyme bằng phương pháp điện di 59
4.6 Kết quả thủy phân nội tạng cá 63
4.6.1 Thủy phân ở 40
0
C 63
4.6.1.1 Hàm lượng protein theo phương pháp Biure 63
4.6.1.2 Hàm lượng đạm amin 65
4.6.1.3 Hàm lượng NH

3
66
4.6.2 Thủy phân ở 50
0
C 68
4.6.2.1 Hàm lượng protein theo phương pháp Biure 68
4.6.2.2 Hàm lượng đạm amin 70
4.6.2.3 Hàm lượng NH
3
72
4.6.3 Thủy phân ở 60
0
C 73
4.6.3.1 Hàm lượng protein theo phương pháp Biure 73
4.6.3.2 Hàm lượng đạm amin 75
4.6.3.3 Hàm lượng NH
3
76
CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU



Chương I: Mở đầu
1

Trong cơ thể con người và tất cả các sinh vật, mỗi phút mỗi giây đều đang
diễn ra hàng loạt các phản ứng để duy trì sự sống. Trong một loạt các phản ứng
đó, có những phản ứng rất phức tạp, đòi hỏi cơ thể phải cung cấp một nguồn
năng lượng hoạt hóa rất lớn với những điều kiện rất nghiêm ngặt. Để đáp ứng
những yêu cầu đó, cơ thể phải tạo ra chất xúc tác sinh học giúp làm giảm tối đa
năng lượng hoạt hóa, đồng thời cũng giúp cho các phản ứng xảy ra dễ dàng
hơn trong những điều kiện hoàn toàn êm dịu với cơ thể sống. Chất xúc tác đó
gọi là enzyme.Enzyme có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cơ chất, đặc
hiệu phản ứng rất là nghiêm ngặt. Nó không chỉ có thể thực hiện khả năng xúc
tác bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện cả những phản ứng bên ngoài cơ
thể, khi tạo cho chúng những điều kiện thích hợp để hoạt động. Điều này đã
mở ra một trong những ngành công nghiệp hiện đại và phát triển nhất hiện nay:
ngành công nghệ sản xuất enzyme đưa vào phục vụ cho đời sống. Các vi sinh
vật là nguồn nguyên liệu rất cần thiết cho ngành công nghiệp này. Vi sinh vật
có tốc độ sinh sản và phát triển rất nhanh nên có khả năng tạo ra một lượng
enzyme vô cùng lớn trong khoảng thời gian rất ngắn.
Đồng thời enzyme do vi sinh vật tạo ra cũng có hoạt lực rất cao, chúng ta
có thể tận dụng các phế thải của các ngành khác để làm môi trường nuôi cấy vi
sinh vật nhằm thu nhận enzyme. Như chúng ta đã biết nền kinh tế của đất nước
Việt Nam ngày càng phát triển. Các ngành nông nghiệp,công nghiệp, dịch vụ,
không ngừng nổ lực phấn đấu học hỏi kiến thức để phát triển hội nhập với thế
giới để thu về ngoại tệ làm giàu cho đất nước.

Bên cạnh đó các ngành này cũng góp phần gây ô nhiễm môi trường đặc biệt
là nông nghiệp và chế biến thủy sản (trấu, ruột cá…) đã gây ảnh hưởng trực
tiếp đến đời sống người dân trong khu vực đó.
Tận dụng nguồn phế liệu này làm nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme
protease bằng cách nuôi cấy nấm sợi trên môi trường lên men bán rắn và sử
dụng enzyme này thủy phân ruột cá basa một mặt làm giảm ô nhiễm môi
Chương I: Mở đầu
2

trường, mặt khác ta thu lượng đạm để tận dụng làm thực phẩm cho gia súc là
điều khả thi
Nhiệm vụ:
Thu nhận enzyme từ nấm mốc Asp. Awamori
Khảo sát các ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme
Thủy phân nội tạng cá Basa
Mục đích:
Tránh gây ô nhiễm môi trường
Bổ sung lượng đạm vào thức ăn gia súc

CHƯƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU



Chương II: Tổng quan tài liệu

3

2.1 Sơ lược về enzyme
2.1.1 Khái quát chung về enzyme
Enzyme theo tiếng Hi Lạp là chất trong nấm men, là một chất xúc tác sinh
học chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật.
Enzyme đóng một vai trò rất quan trọng trong việc tham gia xúc tác cho các
phản ứng sinh hóa của tế bào cơ thể trong điều kiện đẳng nhiệt, đẳng áp“sự
sống có thể được định nghĩa là được điều phối của các phản ứng enzyme”
Enzyme tham gia xúc tác cho các phản ứng trong hoặc ngoài tế bào, với đặc
điểm này đã được con người chúng ta ứng dụng enzyme vào cuộc sống.
Mỗi enzyme có tính đặc hiệu riêng biệt với một phản ứng nhất định.
Dưới tác dụng của enzyme các phản ứng sinh hóa xảy ra đạt hiệu quả cao,
nhiều phản ứng xảy ra đồng thời theo dây chuyền, ít tiêu tốn năng lượng.
Enzyme là protein có tính đặc hiệu cao và có hiệu quả hơn gấp nhiều lần so
với các chất xúc tác vô cơ.
Enzyme là chất rất khó chế biến bằng phương pháp tổng hợp hóa học mà nó
được thu từ các nguồn vi sinh vật, thực vật, động vật vì vậy việc sử dụng chúng
an toàn.
Enzyme được thu từ nhiều nguồn khác nhau nhưng chỉ có nguồn enzyme từ
vi sinh vật mới đáp ứng được nhu cầu và sản xuất trên quy mô công nghiệp.
Các enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính cao, đa dạng, dễ thu nhận. Đặc biệt
là nguyên liệu sản xuất enzyme từ nguồn vi sinh vật đa dạng, phong phú, dễ

kiếm và rẻ tiền.
Hiện nay người ta khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme
thu được ở dạng tinh thể. Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc
biệt như công nghiệp chế biến thực phẩm (bia, rượu, nước chấm,bánh mỳ…)


Chương II: Tổng quan tài liệu

4

2.1.2 Lịch sử phát triển
stt
năm
Nội dung nghiên cứu, phát triển
1
2
3
4

5

6

7
8

9

10

11

1833
1874
1876
1897

1900

1926

1928
1930 – 1945

1972

1984

1984 - nay

Payen và peoz tách được diatase từ malt.
Hansen là người đầu tiên tách được gen từ bào tử cừu.
Kiihne đầu tiên gọi chất xúc tác sinh học là enzyme.
Hai anh em Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men có thể
chuyển hóa đường glucose thành cồn và CO
2.

Rohm sử dụng protease vào công nghiệp thuộc da và
tẩy rửa.

Samner kết tinh được uerase và Northrop kết tinh được protease.
Fleming phát hiện ra penicilline.
Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo quy mô công nghiệp. Sử dụng
glucoamylase thủy phân tinh bột.
Boyeretal đưa ra kỹ thuật di truyền và được ứng dụng vào công
nghệ enzyme sau này.
Nito xác lập quy trình cơ bản tạo acrylamide và một loạt các
quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme.
Là giai đoạn của việc tạo ra hàng trăm loại enzyme khác nhau.
Enzyme được ứng dụng rộng rãi trong đời sống con người. Kỹ
thuật enzyme cố định ra đời đã đưa công nghệ enzyme lên tầm
cao mới
Bảng 2.1: Lịch sử phát triển

Chương II: Tổng quan tài liệu

5

2.1.3 Tính chất của enzyme
2.1.3.1 Bản chất sinh học
Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen.
Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản
ứng cả trong và ngoài tế bào.
Một gen  một enzyme  một phản ứng
Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ
sinh vật, các enzyme thu nhận từ nguồn sinh vật như rau quả thông dụng không
có tính chất gây độc.
Đa số enzyme hoạt động xúc tác phản ứng trong điều kiện nhiệt độ 20 –
45
0

C, 1atm, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính.
Mỗi enzyme tham gia xúc tác đặc hiệu với một cơ chất nhất định, vận tốc
phản ứng tăng gấp nhiều lần so với chất xúc tác sinh học vì vậy enzyme cần
dùng với lượng rất nhỏ.
Có thể điều chỉnh hay ngừng phản ứng bằng nhiệt độ, pH, thời gian xúc
tác…
2.1.3.2 Bản chất hóa học
Gồm hai nhóm:
+ Nhóm enzyme đơn cấu tử: Enzyme chỉ được cấu tạo bởi một thành phần duy
nhất là protein.
+ Nhóm enzyme đa cấu tử: Là những loại enzyme mà được cấu tạo bởi hai
thành phần gồm:
Một thành phần là protein.
Thành phần không phải protein. Thành phần này là những chất hữu cơ đặc hiệu
có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác
2.1.4 Nguồn thu nhận enzyme
Hiện nay người ta có nhiều cách thu nhận enzyme từ các nguồn sau:

Chương II: Tổng quan tài liệu

6

2.1.4.1 Nguồn enzyme từ động vật
Enzyme có thể lấy từ các tuyến dịch hoặc trên các bộ phận khác trên cơ
quan tiêu hóa như: Tuyến tụy, dạ dày, màng nhầy, tim…chủ yếu cho enzyme
protease.
+ Ưu điểm: Các enzyme lấy từ nguồn động vật có hoạt tính khá cao và ổn định
+ Nhược điểm: Thu nhận khó, hiệu quả thu nhận và hiệu quả kinh tế không
cao.
Có nhiều rủi ro và không ổn định về nguồn nguyên liệu.

Chưa có nghiên cứu nào nhằm tạo ra giống động vật với mục đích thu nhận
enzyme
2.1.4.2 Nguồn enzyme từ thực vật
Trong các bộ phận của thực vật có chứa rất nhiều enzyme và có hoạt tính
rất cao. Phần lớn gồm các loại sau:
+ Enzyme amylase: Từ đại mạch nảy mầm (malt).
+ Enzyme papain: Từ quả đu đủ.
+ Enzyme bromelin: Từ cây dứa.
+ Enzyme ficin: Từ quả sung.
Nhược điểm: Tuy các loài thực vật cho enzyme có hoạt tính cao nhưng
cũng gặp rất nhiều khó khăn do lệ thuộc vào điều kiện thiên nhiên và thời gian
thu hoạch dài, khó đáp ứng nhu cầu sử dụng.
2.1.4.3 Nguồn enzyme từ vi sinh vật
Đây là nguồn enzyme duy nhất được sử dụng để sản xuất enzyme trên quy
mô công nghiệp, nó được quan tâm nhiều để phát triển về khối lượng và số
lượng enzyme.
Khác với nguồn động thực vật, các loài vi sinh vật là động vật đơn bào nên
có những ưu điểm hơn hẳn như: Thời gian thu nhận enzyme tương đối ngắn, số
lượng enzyme lớn…
Chương II: Tổng quan tài liệu

7

Hoạt tính của enzyme từ nguồn vi sinh vật cao hơn các nguồn động vật,
thực vật.
Tốc độ sinh sản của vi sinh vật cao trong thời gian ngắn nên có thể thu
được lượng sinh khối sau nuôi cấy lớn. Từ đó ta có thể chiết xuất ra lượng lớn
enzyme.
Ưu điểm lớn nhất của vi sinh vật là chúng rất nhỏ nên dễ dàng được đưa
vào các thiết bị lên men, từ đó sẽ rất dễ dàng điều khiển và kiểm soát các điều

kiện nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, ánh sáng, lưu thông khí… nên ta có thể
điều khiển được tốc độ sinh tổng hợp enzyme.
Nguyên liệu dùng để nuôi vi sinh vật sản xuất enzyme là nguồn nguyên liệu
rẻ tiền và dễ kiếm, thường là các phế liệu của các ngành công nghiệp.
Có nhiều phương pháp để nuôi cấy và thu nhận enzyme từ vi sinh vật tùy
vào điều kiện khác nhau như: Nuôi cấy trong môi trường lỏng, nuôi trên môi
trường bán rắn, nuôi trên môi trường rắn.
Hiện nay việc nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường bán rắn đang được tập
trung nghiên cứu và được đánh giá là mang lại hiệu quả cao trong việc thu
nhận enzyme
2.2 Khái quát chung về enzyme protease
2.2.1 Định nghĩa:
Protease là enzyme thuộc nhóm enzyme protease (peptid-hidrolase 3.4) xúc
tác quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-)
n
trong phân tử protein,
polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease
cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin
Protease cần thiết cho sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ
vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật
(gan, dạ dày bê…) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có
những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất
Chương II: Tổng quan tài liệu

8

phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình
dạng phân tử rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật

thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng
2.2.2 Phân loại protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân
chia thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide
+ Carboxypeptidase: xúc tác liên kết thủy phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide
*Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH- của gốc serin
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động
xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và
subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi
khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường
hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối
rộng
+ Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH- trong trung tâm hoạt
động. Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain,
bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein
Chương II: Tổng quan tài liệu

9

proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng

+ Aspastic proteinase: hầu hết các aspastic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các aspastic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase lá nhóm proteinase được tìm thấy
ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như vi sinh vật bậc cao. Các metallo proteinase
thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng
của EDTA
Ngoài ra protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
Protease acid: pH 2-4
Protease trung tính: pH 7-8
Protease kiềm: pH 9-11
2.2.3 Ứng dụng của protease
Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông
nghiệp…
Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự
thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm
thích hợp và có vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng
hương vị thịt (ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định-
phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất; Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt
(enzyme, muối, bột ngọt). Tiêm dung dịch enzyme vào thịt: tiêm dung dịch
enzyme vào con vật trước khi giết mổ.
Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được
chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm
từ da, lông vũ. Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin
Chương II: Tổng quan tài liệu

10

chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng
L sang D làm giảm giá trị sinh học của axit amin). Để thuỷ phân sâu sắc và
triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các
protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường
dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ
lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân.
Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin
của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ
phân.
Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm)
thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại
phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên
hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó
sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút
ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm.
Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ.
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt
tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A.
candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát
Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian
trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.
Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm
tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được
dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn
Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân
một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị
cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo
nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để
Chương II: Tổng quan tài liệu

11

làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của
động vật.
Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B.
subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S.
rimosus ) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần
chiếm một vị trí quan trọng
Trong công nghiêp dệt: Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ
tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch casein, gelatin)
để sợi được được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein
serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm,
do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng.
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như:
+ Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị
trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.
+ Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn
hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong
chăn nuôi gia súc và gia cầm.
+ Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine,
kháng sinh
+ Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein,
sản xuất mỹ phẩm,…
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng enzyme
2.2.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Nhưng nếu
tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm

Chương II: Tổng quan tài liệu

12

2.2.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng
độ cơ chất. Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến một mức độ nào đó, nếu tiếp
tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng
Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất,
nồng độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng.
Vì vậy, với từng enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong
những điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của
enzyme
2.2.4.3 Ảnh hưởng của chất kiềm hãm và chất hoạt hóa
Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ
hay hữu cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc làm
giảm (tính kìm hãm) hoạt độ của enzyme. Tác dụng của chúng có thể là đặc
hiệu hay không đặc hiệu và thay đổi theo từng chất, tuy từng enzyme
Chất kìm hãm (chất ức chế) là chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ
làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme.
Các chất này có thể là các ion, các phân tử vô cơ hay hữu cơ, kể cả protein
Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc
làm cho enzyme chuyển thành hoạt động từ dạng không hoạt động. Các chất
này thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim
loại hoặc các chất hữu cơ. Chất hữu cơ làm tăng hay hồi phục họat tính của
enzyme một cách trực tiếp hay gián tiếp
2.2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme và tốc độ phản
ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ
phản ứng chỉ tăng tới một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó,

tốc độ giới hạn đó sẽ giảm và dẫn đến mức bị triệt tiêu
Chương II: Tổng quan tài liệu

13

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bị
giảm, khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi lại hoạt tính
Ngược lại, ở nhiệt đô 0
0
C, enzyme sẽ bị hạn chế rất mạnh nhưng khi đưa
nhiệt độ lên từ từ thì hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp
Ở nhiệt độ thấp (0-50
0
C) vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Sự tăng
vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng
Ở nhiệt độ sau đó (tùy thuộc vào từng loại enzyme, khoảng 55
0
C) vận tốc
phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở
80-100
0
C
Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của
cơ chất, pH, lực ion của môi trường
2.2.4.5 Ảnh hưởng của pH môi trường
pH của môi trường ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân vì nó ảnh
hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein-
enzyme. Đa số enzyme bền trong khoảng pH 5-9, độ bền của enzyme có thể
tăng lên khi có các yếu tố bền như: cơ chất, coenzyme, Ca
2+

mỗi enzyme có
một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác
như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ…
Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng vẫn có
một số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepsin, protease acid của vi sinh
vật…) hoặc khá cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10
2.2.4.6 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài
hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố
Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ
chất tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. Khi cơ chất cần
thủy phân đã hết quá trình thủy phân kết thúc. Thời gian thủy phân phải thích
hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt