Thiết lập quy trình cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn phục vụ nghiên cứu chuyển gen và chỉnh sửa hệ gen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

NGUYỄN THỊ HUYỀN

THIẾT LẬP QUY TRÌNH CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ
BẠCH ĐÀN PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀ
CHỈNH SỬA HỆ GEN

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. ĐỖ TIẾN PHÁT
2. TS. NGUYỄN THỊ HỒNG GẤM

Hà Nội, 2023


i
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tư do - Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn với các số liệu và kết
quả đạt được là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng

trình nghiên cứu nào khác.
Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ cơng trình nghiên
cứu nào đã cơng bố, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm và tn thủ kết luận
đánh giá luận văn của Hội đồng khoa học.
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
NGƯỜI CAM ĐOAN

Nguyễn Thị Huyền


ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô giáo của Viện Công
nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã trang bị kiến thức
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt q trình học tập tại trường.
Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo cùng Tập thể cán bộ
Bộ môn Sinh học phân tử Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Viện Khoa học Lâm nghiệp và Tập thể cán bộ phịng Cơng nghệ tế bào thực
vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt
Nam đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài luận văn này.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn TS. Đỗ Tiến
Phát (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam), Cô hướng dẫn TS. Nguyễn Thị Hồng Gấm (Viện Công nghệ sinh học
Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp) và Nghiên cứu sinh Bùi Phương
Thảo (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam) đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực
hiện luận văn này.
Đề tài nghiên cứu đã nhận được sự trợ giúp về vật liệu, hóa chất và học
thuật từ Đề tài “Hỗ trợ hoạt động nghiên cứu khoa học cho nghiên cứu viên
cao cấp năm 2022-2023", mã số NCVCC08.01/22-23 do GS.TS. Chu Hồng

Hà làm Chủ nhiệm.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã giúp
đỡ, động viên và khích lệ tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện luận
văn thạc sĩ.
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
TÁC GIẢ

Nguyễn Thị Huyền


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. ix
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................. 2
3. Ý nghĩa khoa học của đề tài ...................................................................... 2
Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .................................................... 3
1.1. Tổng quan về Bạch đàn lai ..................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về cây bạch đàn và một số giống sản xuất ........... 3
1.1.2. Tình hình trồng và khảo nghiệm bạch đàn lai ở Việt Nam .............. 4
1.1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống bạch đàn lai ở Việt Nam ............ 6
1.2. Nghiên cứu chuyển gen và chỉnh sửa gen trên bạch đàn........................ 7
1.2.1. Nghiên cứu về chuyển gen ................................................................ 7

1.2.2. Nghiên cứu về chỉnh sửa gen ............................................................ 9
1.3. Phương pháp đánh giá hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa gen ............ 10
1.3.1. Hệ thống biểu hiện tạm thời ........................................................... 10
1.3.2. Hệ thống tế bào trần ....................................................................... 10
1.3.3. Hệ thống cảm ứng rễ tơ .................................................................. 11
1.4. Vi khuẩn Rhizobium Rhizogenes .......................................................... 12
1.4.1. Giới thiệu về vi khuẩn R. rhizogenes .............................................. 12
1.4.2. Cơ chế chuyển gen .......................................................................... 15
1.4.3. Các nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ trên bạch đàn...................... 17


iv
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 19
2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................. 19
2.1.2. Chủng vi khuẩn ............................................................................... 19
2.2. Địa điểm thực hiện ................................................................................ 19
2.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................. 19
2.3.1. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, ánh sáng và chủng
vi khuẩn đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn thông qua vi khuẩn R.
rhizogenes ................................................................................................. 19
2.3.2. Đánh giá tác động của các yếu tố trong quá trình lây nhiễm tới cảm
ứng tạo rễ tơ bạch đàn thông qua vi khuẩn R. rhizogenes ....................... 19
2.3.3. Kiểm tra và đánh giá hiệu quả chuyển gen của quy trình tạo rễ tơ
đã được thiết lập ....................................................................................... 20
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 20
2.4.1. Phương pháp tiến hành .................................................................. 20
2.4.2. Các công thức thí nghiệm ............................................................... 25
2.4.3. Thu thập và xử lý số liệu ................................................................. 28
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 29

3.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, ánh sang và
chủng vi khuẩn đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn thông qua vi khuẩn R.

rhizogenes ................................................................................................... 29
3.2. Kết quả đánh giá tác động của các yếu tố trong quá trình lây nhiễm tới
cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn thông qua vi khuẩn R. rhizogenes ................... 34
3.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến hiệu quả chuyển gen................... 34
3.2.2. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen ............ 38
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen ...... 41
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến cảm ứng tạo rễ tơ ... 43
3.3. Kiểm tra và đánh giá hiệu quả chuyển gen của quy trình tạo rễ tơ đã
được thiết lập................................................................................................ 45


v
3.3.1. Kiểm tra và đánh giá biểu hiện của gen chỉ thị bằng phương pháp
nhuộm X-Gluc ........................................................................................... 45
3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phương pháp phân tử ... 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 49
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .......................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61
PHỤ LỤC


vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Viết đầy đủ

Từ viết tắt

A. tumefaciens
ABT
AS
BAP
Bộ NN & PTNN
bp
CRISPR

Agrobacterium tumefaciens
Transplantone (chất kích thích ra rễ)
Acetonsyringone
6-Benzyl Amino Purine
Bộ Nơng nghiệp và Phát triển Nông thôn
Base pair (cặp bazơ nitơ)
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats

CTAB

Cetyltrimethylammonium bromide

DNA

Deoxyribonucleic Acid

IAA

Indole-3-acetic acid

IBA

Indole-3-Butyric Acid

LB

Left border (bờ trái)

MS

Môi trường nuôi cấy Murashige & Skoog

NAA

1-Naphthyl Acetic Acid

NST

Nhiễm sắc thể

OD

Optical Density (mật độ quang học)

PCR

Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi
polymerase)

PCR

Polymerase Chain Reaction

PCR-RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

R. rhizogenes

Rhizobium rhizogenes

RB

Right border (bờ phải)

Ri-plasmid
RNA
Rol
SgRNA
Ss T-DNA
TB

Root induction plasmid (plasmid cảm ứng rễ)
Ribonucleic Acid
Root locus
Single guied RNA
Single stranded T-DNA (sợi đơn T-DNA)
Trung bình


vii

Viết đầy đủ

Từ viết tắt
UP

Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita

Vir

Virulence genes (gen độc)

X-Gluc

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid

YEP

Yeast Extract Peptone

YMB

Yeast Manitol Broth


viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các nghiên cứu chuyển gen trên đối tượng bạch đàn....................... 8
Bảng 2.1. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ bạch đàn lai 20
Bảng 2.2. Trình tự mồi đặc hiệu được sử dụng trong nghiên cứu .................. 25

Bảng 3.1. Kết quả ảnh hưởng của điều kiện cơ bản đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch
đàn lai ............................................................................................................. 33
Bảng 3.2. Kết quả tối ưu các loại vật liệu đến hiệu quả chuyển gen .............. 35
Bảng 3.3. Kết quả ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen39
Bảng 3.4. Kết quả tối ưu thời gian lây nhiễm đến quá trình chuyển gen ở bạch
đàn lai .............................................................................................................. 41
Bảng 3.5. Kết quả ảnh hưởng của thời gian đồng ni cấy đến q trình
chuyển gen ở bạch đàn lai ............................................................................... 43
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá quy trình cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn lai in vitro
với các điều kiện tối ưu đã được thiết lập ....................................................... 45


ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
Sơ đồ 2.1. Tóm tắt quy trình cảm ứng tạo rễ tơ ở bạch đàn lai UP………….22
Hình 3.1. Kết quả ảnh hưởng của môi trường đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn . 30
Hình 3.2. Kết quả ảnh hưởng của ánh sáng đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn in
vitro sau 21 ngày ..................................................................................................... 31
Hình 3.3. Kết quả ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch
đàn. ........................................................................................................................... 33
Hình 3.4. Vị trí lấy mẫu sử dụng để biến nạp của bạch đàn lai UP54 in vitro.... 35
Hình 3.5. Kết quả cảm ứng tạo rễ tơ của các loại vật liệu ở bạch đàn lai ......36
Hình 3.6. Kết quả nhuộm X-Gluc của các loại vật liệu được lây nhiễm............. 37
Hình 3.7. Kết quả ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến cảm ứng tạo rễ tơ bạch
đàn in vitro............................................................................................................... 40
Hình 3.8. Kết quả ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến cảm ứng mẫu tạo rễ tơ
bạch đàn in vitro ...................................................................................................... 42
Hình 3.9. Kết quả ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến cảm ứng tạo rễ tơ
bạch đàn in vitro ...................................................................................................... 44

Hình 3.10. Các bước trong quy trình cảm ứng tạo rễ tơ in vitro trên bạch đàn lai
UP thông qua vi khuẩn R. rihzogenes ATCC ....................................................... 46
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển ở
bạch đàn lai UP với chủng R. rihzogenes ATCC 15834 ...................................... 48


1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Bạch đàn (Eucalyptus) là một trong các cây rừng được trồng phổ biến
nhất hiện nay do có khả năng thích nghi cao với nhiều điều kiện khí hậu và
nhiều loại lập địa khác nhau. Diện tích trồng bạch đàn ước khoảng hơn 22,57
triệu ha trên toàn thế giới, đặc biệt là ở Trung Quốc, Ấn Độ, Brazil và các
nước Đông Nam Á. Ở Việt Nam, bạch đàn là cây lâm nghiệp quan trọng và
được trồng rộng rãi tại các tỉnh thuộc vùng Tây Bắc, Đông Bắc, đồng bằng
sông Hồng, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Hiện nay, việc ứng dụng công
nghệ sinh học vào trong nghiên cứu chọn giống và tạo giống cây trồng đã
mang lại một số thành công đáng kể trên nhiều đối tượng cây lâm nghiệp,
trong đó có bạch đàn.
Gần đây, công nghệ chỉnh sửa hệ gen thông qua hệ thống
CRISPR/Cas9 đã được phát triển với tiềm năng to lớn trong q trình chọn
tạo giống cây trồng trong đó có cây lâm nghiệp. Trên đối tượng bạch đàn,
công nghệ này đã được triển khai và thu được những thành công bước đầu ở
một số loài bạch đàn khác nhau như E. grandis, E. grandis x E.urophylla.
Nhìn chung, việc phát triển và ứng dụng của công nghệ sinh học vào nghiên
cứu cải tạo các giống bạch đàn tại Việt Nam là rất cần thiết, với mục đích gây
tạo giống cây trồng mới có năng suất cao, chất lượng tốt góp phần nâng cao
hiệu quả kinh tế lâm nghiệp.
Bước quan trọng hàng đầu quyết định đến sự thành công của phương
pháp chuyển gen cũng như chỉnh sửa hệ gen ở thực vật là việc kiểm tra hoạt

động của hệ thống vector chuyển gen cũng như cấu trúc chỉnh sửa hệ gen.
Bạch đàn là cây trồng lâm nghiệp có hiệu suất chuyển gen rất thấp, cần thời
gian dài và chi phí lớn tạo được các dịng chuyển gen. Do đó, cần một phương
pháp nhanh và hiệu quả để đánh giá hoạt động của cấu trúc biểu hiện gen


2
cũng như chỉnh sửa gen trước khi tiến hành chuyển gen ổn định vào cây bạch
đàn. Gần đây, một số nghiên cứu đã sử dụng thành công hệ thống cảm ứng
tạo rễ tơ để kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen cũng như chỉnh sửa
hệ gen ở một số giống bạch đàn thông qua vi khuẩn Rhizobium rhizogenes
như bạch đàn E. Camaldulensis, bạch đàn E. grandis. Tuy nhiên, khả năng
cảm ứng tạo rễ tơ và hiệu suất chuyển gen thơng qua rễ tơ ở các lồi bạch đàn
được sử dụng là không giống nhau. Hiện tại, chưa ghi nhận nghiên cứu
chuyển gen thông qua rễ tơ trên các giống bạch đàn nói chung và bạch đàn lai
UP (E. urophylla x E. pellita) nói riêng tại Việt Nam.
Xuất phát từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành đề tài “Thiết lập quy
trình cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn phục vụ nghiên cứu chuyển gen và
chỉnh sửa hệ gen” nhằm tạo tiền đề cho việc tiếp cận và phát triển hướng
nghiên cứu chỉnh sửa gen trong cải thiện giống bạch đàn cũng như các cây
lâm nghiệp khác tại Việt Nam.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng được quy trình cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn thơng qua vi
khuẩn R. rhizogenes.
- Kiểm tra và đánh giá hiệu quả chuyển gen chỉ thị sử dụng quy trình
cảm ứng tạo rễ tơ bạch đàn đã thiết lập.
3. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy khả năng chuyển gen vào cây
bạch đàn lai UP cảm ứng tạo rễ tơ, đồng thời thiết lập được quy trình chuyển
gen làm cơ sở cho việc chuyển gen cũng như chỉnh sửa các gen mong muốn ở

bạch đàn lai UP nói riêng và bạch đàn nói chung tại Việt Nam.


3

Chương 1.
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về Bạch đàn lai
1.1.1. Giới thiệu chung về cây bạch đàn và một số giống sản xuất
Bạch đàn (Eucalyptus) là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae),
được du nhập vào Việt Nam từ những năm 1930 [1] và hiện là một trong các
cây trồng rừng chủ lực với khả năng sinh trưởng nhanh, thích nghi cao với
nhiều điều kiện khí hậu và nhiều loại lập địa khác nhau, năng suất cao.
Gỗ bạch đàn được sử dụng với nhiều công dụng và đem lại lợi ích kinh
tế như sử dụng cho ngành xây dựng, đóng đồ nội thất, cung cấp nguyên liệu
cho ngành công nghiệp giấy và bột giấy, nguyên liệu cho chế biến ván ép…
Cùng với keo, bạch đàn chiếm trên 70% diện tích rừng trồng cả nước, góp
phần trong q trình nâng cao giá trị xuất khẩu gỗ và các sản phẩm từ gỗ.
Trong những năm trở lại đây, các nghiên cứu về lai giống giữa các lồi
bạch đàn urơ (E. urophylla) với bạch đàn pellita (E. pellita) đã được thực hiện
tại nước ta và kết quả đã tạo ra những tổ hợp lai có ưu thế về sinh trưởng rất
rõ rệt so với bố mẹ [2]. Các tổ hợp lai giữa các loài bạch đàn khác nhau được
đánh giá là những dịng bạch đàn lai có sinh trưởng tốt, vượt trội so với đối
chứng và giống sản xuất đại trà [16]. Những kết quả đạt được đã góp phần cải
thiện giống bạch đàn và nâng cao năng suất, chất lượng rừng trồng ở nước ta.
Trong khuôn khổ dự án Sida – SAREC (giai đoạn 2005-2006) về
nghiên cứu cải thiện giống cây trồng, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng
(nay là Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học lâm nghiệp) đã nghiên
cứu lai giống giữa bạch đàn urô và bạch đàn pellita. Kết quả đã tạo ra được
hơn 60 tổ hợp lai UP và PU (chủ yếu là UP) và một số khảo nghiệm hậu thế

giống lai đã được xây dựng tại Hà Nội, Nghệ An, Quảng Trị và Bình Dương.
Kết quả đánh giá ở giai đoạn 30 tháng tuổi cũng chỉ ra rằng giống bạch đàn lai
UP này có triển vọng cho trồng rừng ở miền Bắc và Bắc Trung Bộ, với nhiều


4
tổ hợp lai có sinh trưởng tốt hơn rõ rệt so với đối chứng (U6 và PN14), tốt
nhất tại Ba Vì và Đơng Hà có độ vượt trung bình về thể tích từ 20 – 50% [9].
Đặc biệt, nhiều tổ hợp lai UP vẫn được duy trì được sức sống mạnh mẽ
với tán lá khỏe mạnh trong điều kiện mùa đơng lạnh và khơ ở Ba Vì, có thể là
do khả năng chịu hạn tốt nhờ bộ rễ ăn sâu của E. pellita [16]. Từ các kết quả
đánh giá các tổ hợp lai tại Ba Vì (Việt Nam) đã chọn lọc được các cá thể lai
có sinh trưởng nhanh, hình dạng thân đẹp để tiến hành nhân giống và xây
dựng các khảo nghiệm dịng vơ tính cùng với một số dịng bạch đàn lai UP
mới được chọn lọc có triển vọng. Đây là nguồn vật liệu mới cho trồng rừng
kinh tế ở nước ta.
Một giống bạch đàn lai cụ thể là giống bạch đàn lai UP (UP54, UP35,
UP72, UP95, UP99, UP164, UP233, UP171…) do Viện Nghiên cứu Giống và
Công nghệ sinh học Lâm nghiệp (Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam)
chọn tạo đã được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật [17, 18]. Đây là các
giống bạch đàn lai mới có sinh trưởng nhanh, có năng suất cao, có khả năng
chống chịu sâu bệnh và hạn hán, biên độ sinh thái rộng trên cả nước đang
được sử dụng chủ yếu trong trồng rừng sản xuất ở nước ta.
1.1.2. Tình hình trồng và khảo nghiệm bạch đàn lai ở Việt Nam
Diện tích trồng bạch đàn trên tồn thế giới ước tính khoảng hơn 22,57
triệu ha, đặc biệt là ở các nước Trung Quốc, Ấn Độ, Brazil và các nước Đông
Nam Á trong đó có Việt Nam [66]. Tại Việt Nam, bạch đàn được trồng rộng
rãi tại các tỉnh thuộc vùng Tây Bắc, Đông Bắc, vùng trung du và đồng bằng
sông Hồng, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên [7]. Tính đến năm 2011, tổng diện
tích rừng trồng bạch đàn ở Việt Nam là 353.000 ha và chiếm 32% diện tích

trồng rừng cả nước.
Trong các giai đoạn nghiên cứu lai tạo nhiều giống bạch đàn lai mới đã
được chọn lọc, nhân giống và khảo nghiệm ở một số vùng sinh thái hay lập
địa cụ thể. Việc khảo nghiệm mở rộng nhằm đánh giá lại năng suất và chất
lượng các giống lai đã được công nhận, đồng thời công nhận mở rộng vùng
trồng cho các giống lai mới này. Trong số đó, một số nghiên cứu đã đánh giá


5
kết quả sinh trưởng của các giống bạch đàn lai UP tại một số vùng ở nước ta
trong những năm trở lại đây.
Các giống có năng suất và chất lượng cho một số loài cây trồng rừng
chủ lực giai đoạn 2011-2015 được nghiên cứu chọn tạo. Kết quả cho thấy,
dòng vơ tính bạch đàn lai UP tại n Thế, Bắc Giang cho thấy có sự sai khác
rõ rệt về sinh trưởng và chất lượng. Các dòng bạch đàn lai được chọn lọc có
sinh trưởng vượt trội so với giống đối chứng đã được Bộ NN&PTNN công
nhận là giống mới cho các dòng UP164, UP223, UP171, UP138, UP180,
UP190, UP236 [15].
Giống bạch đàn lai UP68BB, UP69BB, UP75BB trồng ở Hàm Thuận
Nam, Bình Thuận được đánh giá là có sinh trưởng nhanh đồng thời có khả
năng thích nghi cao trên dạng lập địa đất cát pha và được Bộ NN&PTNN
công nhận giống mới [8]. Với 5 dòng đàn lai UP (UP54, UP35, UP72, UP95,
UP99) trồng tại vùng Bắc Trung Bộ (Đông Hà, Quảng Trị) và Tây Bắc Bộ
(Yên Bình, Yên Bái) sau 36 tháng khảo nghiệm thì tỷ lệ sống đạt 80,5% 86,2% và có sự sai khác về sinh trưởng giữa các giống, có sinh trưởng vượt
trội với năng suất đạt từ 16,4 – 26,8 m3/ha/năm. Kết quả nghiên cứu đã khẳng
định lợi ích khi sử dụng các dịng bạch đàn lai UP cho trồng rừng gỗ lớn trên
lập địa sau khai thác ít nhất hai chu kỳ cho hai vùng trên [13]. Trên cơ sở kết
quả đánh giá khảo nghiệm mở rộng, Bộ NN&PTNN đã công nhận mở rộng
vùng trồng cho các giống bạch đàn lai UP54, UP72, UP95, UP99 [5].
Bên cạnh đó, 9 dịng bạch đàn lai UP gồm UP54, UP35, UP72, UP95,

UP99, UP97, UP171, UP223, UP164 đã được khảo nghiệm mở rộng tại một
số vùng sinh thái khác (Yên Bình, Yên Bái và Hữu Lũng, Lạng Sơn) và tiến
hành đánh giá sinh trưởng. Kết quả sau 24 tháng trồng, bạch đàn khảo nghiệm
tại n Bình, n Bái có tỷ lệ sống đạt 92,86% và các giống bạch đàn lai UP
có sinh trưởng nhanh, năng suất cao nhất và phù hợp với vùng này là UP164,
UP95, UP99, UP171, UP233 với năng suất trung bình đạt 10,00 m3/ha/năm và
vượt từ 10,91% đến 30,56% so với trung bình khảo nghiệm. Sau 36 tháng trồng
tại Hữu Lũng, Lạng Sơn, có tỷ lệ sống đạt 72% và các giống bạch đàn lai có


6
sinh trưởng nhanh, năng suất cao nhất và phù hợp tại vùng này là UP223,
UP35, UP54, UP164, UP171, UP97 với năng suất trung bình đạt 22,74
m3/ha/năm, vượt từ 2,11% - 38,47% so với trung bình khảo nghiệm [19].
Như vậy, các giống bạch đàn lai UP mới được chọn lựa có khả năng
thích ứng cao, sinh trưởng nhanh và trồng được trên nhiều vùng lập địa, vùng
sinh thái khác nhau ở nước ta.
1.1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống bạch đàn lai ở Việt Nam
Hiện nay, các giống bạch đàn lai chủ yếu được nhân giống vơ tính bằng
ni cấy mơ tế bào hoặc giâm hom nhằm giữ nguyên đặc tính ưu việt của
giống. Đặc biệt, phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào cho các
giống bạch đàn lai mới được chọn tạo có ý nghĩa vơ cùng to lớn góp phần
nâng cao năng suất, chất lượng di truyền và đảm bảo tính an tồn sinh học của
hệ sinh thái rừng trồng tại Việt Nam.
Nghiên cứu nhân giống các dòng bạch đàn lai UP59, UP58 và UP35
bằng phương pháp nuôi cấy mô, kết quả cho tỷ lệ bật chồi hữu hiệu từ 9,78%
đến 11,1% và tỷ lệ mẫu nhiễm chỉ là 34,87% đến 44,61% khi sử dụng HgCl2
nồng độ 0,05% trong 4-6 phút để khử trùng. Hệ số nhân chồi đạt tới 2,19 lần
và tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt 25,84% khi kết hợp sử dụng BAP, NAA và Kinetin.
Với môi trường bổ sung IBA và ABT cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt tới 81,48% và

đạt 3 rễ/cây [20].
Hai dòng bạch đàn lai UP54 và UP99 đã được nhân giống bằng phương
pháp nuôi cấy mô, kết quả thu được tỷ lệ bật chồi hữu hiệu lên tới 11,2% khi
sử dụng HgCl2 0,1% khử trùng trong 7 phút. Môi trường nâng cao chất lượng
chồi thích hợp cho hệ số nhân chồi đạt tới 2,22 lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt
tới 26,14% khi có sự kết hợp của BAP, Kinetin và NAA. Bên cạnh đó, mơi
trường ra rễ thích hợp cho cả hai dịng bạch đàn khi có sự kết hợp của IBA và
ABT1 với tỷ lệ chồi ra rễ đạt tới 91,25% và 3,21 rễ/cây [12].
Năm 2015, quy trình nhân giống bằng phương pháp ni cấy mơ tế bào
cho các giống Bạch đàn lai UP mới chọn tạo (UP35, UP58, UP59, UP72,
UP99) được hoàn thiện với mục tiêu cung cấp đủ giống với chất lượng di


7
truyền ổn định. Kết quả thu được cho tỷ lệ mẫu nảy chồi đạt tới 23,11% và tỷ
lệ mẫu nhiễm chỉ là 37,56% khi khử trùng mẫu vật bằng HgCl2 0,05% trong 7
phút. Hệ số nhân chồi đạt tới 3,13 lần và khi cải thiện chất lượng chồi thu
được tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt tới 72,33% và hệ số nhân chồi là 2,87 lần. Tỷ lệ
ra rễ đạt tới 92,36% trong môi trường 1/2 MS cải tiến bổ sung 1,0 mg/l IBA
[4]. Kết quả này cho thấy quy trình nhân giống có hiệu quả cao hơn và được ứng
dụng vào trong sản xuất so với các nghiên cứu nhân giống trước đây trên cùng
đối tượng bạch đàn lai.
Gần đây nhất, nhân giống các dòng bạch đàn lai UP233, UP171, UP164
bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã được tiến hành. Kết quả thu được
cho tỷ lệ mẫu bật chồi hữu hiệu lên đến 34,4% thấy sử dụng HgCl2 0,05%
trong 6 phút và môi trường nhân chồi tốt nhất cho 3 dòng bạch đàn lai UP kết
hợp 0,5 mg/l BAP với 0,5 mg/l Kinetin. Mơi trường ra rễ thích hợp nhất có sự
kết hợp của IBA, ABT và than hoạt tính cho tỷ lệ ra rễ đạt 90% với 3,91
rễ/cây [10].
1.2. Nghiên cứu chuyển gen và chỉnh sửa gen trên bạch đàn

1.2.1. Nghiên cứu về chuyển gen
Việc chuyển gen bạch đàn đã được thực hiện từ những năm 1990 cho
nhiều loài bạch đàn như E. gunnii, E. camaldulensis, E. grandis, E. globulus,
E. urophylla, E. urophylla x E. urophylla,…[43]. Phương pháp được sử dụng
phổ biến là chuyển gen thông qua A. tumefaciens [61], bên cạnh đó các
phương pháp khác như chuyển gen qua xung điện, súng bắn gen hay siêu âm
cũng được sử dụng nhưng cịn hạn chế. Các tính trạng được tập trung cải
thiện bao gồm tăng sinh khối, thay đổi tính chất gỗ (thay đổi hàm lượng
lignin, cellulose, kéo dài sợi gỗ), tăng tính chống chịu với các điều kiện ngoại
cảnh (nhiễm mặn, hạn hán, lạnh) và sâu bệnh hại.
Một số các kết quả nghiên cứu chuyển gen nổi bật ở các lồi bạch đàn
đã cơng bố được liệt kê cụ thể ở Bảng 1.1.


8
Bảng 1.1. Các nghiên cứu chuyển gen trên đối tượng bạch đàn
Lồi

E.
camaldulensis

Gen mục tiêu

Tính trạng

Tài liệu tham khảo

uidA, nptII

Biểu hiện βglucurônidase

[21], [44]

Cry3A, bar

Chống chịu sâu ăn lá

[69]

C4H, antisense CAD,
LIM domain transcription Giảm hàm lượng lignin
factor

[31], [47], [63]

Antisense Ntlim1
(transcription factor),
uidA, nptII, hpt

Tăng hàm lượng
cellulose

[56]

CodA

Chống chịu mặn (tới
30%)

[49]

Antisense E. gunni cad,
nptII, uidA

Giảm hàm lượng lignin

[62]

mtCS

Thích ứng với điều
kiện chua

[48]

Tăng tính chống chịu
với bệnh Pseudomonas
solanacearum lên đến
35%

[67]

GS1

Tăng khả năng sinh
trưởng

[14]

GA20

Tăng khả năng sinh
trưởng

[39]

E. urophylla x
E. urophylla

EcHB1

Tăng chiều dài sợi gỗ

[11]

E. urophylla x
E. pellita

EcHB1

Tăng chiều dài sợi gỗ

[3]

E. saligna

P5CSF129A, uidA, nptII

Chống chịu lạnh

[36]

E. gunnii

EgCAD2

Sinh tổng hợp lignin

[51]

E.globulus

CCR và CAD2

Sinh tổng hợp lignin

[59]

E. grandis ×
E. urophylla

Ceceropin D

E. urophylla


9

1.2.2. Nghiên cứu về chỉnh sửa gen
Bên cạnh những nghiên cứu chuyển gen thì các nghiên cứu chỉnh sửa

gen thơng qua hệ thống CRISPR/Cas9 đã được phát triển với tiềm năng to lớn
trong chọn tạo giống cây trồng [47]. Hiện nay, CRISPR/Cas9 là hệ thống
được lựa chọn để gây đột biến mục tiêu trên nhiều đối tượng cây trồng, bao
gồm cả cây thân gỗ như bạch đàn [27].
Ở bạch đàn E. grandis, các nhà nghiên cứu đã xây dựng hệ thống chỉnh
sửa gen hiệu quả (pHDE-Cas9) nhằm xác định chức năng của họ gen
cytokinin oxidase/dehydrogenase (CTX) [52]. Trên cùng đối tượng bạch đàn
E. grandis, Dai và cộng sự (2020) đã thiết kế vector CRISPR/Cas9 mang 2
trình tự định hướng đơn (single guide RNA – sgRNA) để gây đột biến 2 gen
liên quan đến gỗ là EgrCCR1 gen sinh tổng hợp lignin chính và EgrIAA9A
gen ưu tiên trong phát sinh mạch gỗ và phát triển xylem thứ cấp. Kết quả chỉ
ra rằng, hệ thống CRISPR/Cas9 có hiệu quả trong việc tạo đột biến ở cả
CCR1 và IAA9A ở rễ tơ E. grandis nhưng với hiệu quả chỉnh sửa thay đổi
khác nhau, tùy thuộc vào gen mục tiêu [35].
Trên đối tượng bạch đàn lai, phương pháp đánh dấu huỳnh quang
(mCherry/Cas9) kết hợp công nghệ CRISPR/Cas9 đã được thiết lập để sàng
lọc các thế hệ cây con mang đặc tính tốt và nghiên cứu chức năng gen trên
giống lai E. grandis x E. urophylla. Các thế hệ tiếp theo với các tính trạng tốt
dễ dàng được phát hiện từ quần thể biến đổi gen thơng qua sàng lọc huỳnh
quang. Do đó, hệ thống này có thể được sử dụng như một cơng cụ hiệu quả để
cải thiện nguồn gen bạch đàn [65].
Elorriaga và cộng sự (2021) đã sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 làm
mất chức năng của gen LEAFY (LFY) có liên quan đến sự phát triển hoa bạch
đàn để tạo ra cụm hoa bất thụ ở cây phát triển bình thường đến giai đoạn
trưởng thành. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã chỉnh sửa gen tương
đồng của LFY ở bạch đàn (Eucalyptus orthologue LFY - ELFY) với hiệu quả


10
chỉnh sửa lên đến 100%. Đột biến dịch khung gây ra sự thay đổi lớn ở hoa

bao gồm cả sự bất thụ trong quá trình phát triển của hoa và sự vắng mặt của
giao tử đực và cái. Việc làm gián đoạn chức năng ELFY được xem là công cụ
hữu ích để ngăn chặn di truyền mà không cần gây ra tác động bất lợi lớn đối
với sự phát triển sinh dưỡng của cây non hoặc hình thái lá [38].
1.3. Phương pháp đánh giá hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa gen
1.3.1. Hệ thống biểu hiện tạm thời
Trong nghiên cứu chỉnh sửa hệ gen thì việc đánh giá hoạt động của hệ
thống vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 là rất quan trọng. Các nghiên cứu
đầu tiên đã sử dụng hệ thống biểu hiện tạm thời trên lá để đánh giá hoạt động
của hệ thống CRISPR/Cas9 đã được thiết kế.
Ở đối tượng lúa mì, các nhà khoa học đã đột biến có chủ đích đồng thời
ba gen bằng kỹ thuật CRISPR/Cas9 và đã thiết kế một phương pháp phát hiện
nhanh đột biến thông qua sự biểu hiện cùng lúc của gRNA và Cas9 ở phơi lúa
mì non. Sau đó, các dạng đột biến đã được xác định bằng kỹ thuật PCR-RFLP
và được kiểm tra bằng cách giải trình tự các bản sao bộ gen. Với những kết
quả thu được, phương pháp phát hiện nhanh các đột biến đã được chỉnh sửa
này có thể được sử dụng hiệu quả để sàng lọc các trình tự đích hoặc các
vector CRISPR/Cas9 ở lúa mì [46].
Hệ thống biểu hiện tạm thời cũng được xây dựng sử dụng ở cây ca cao
để đánh giá hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9. Sau khi chứng minh hoạt
động của sgRNA trong ống nghiệm, vi khuẩn Agrobacterium mang hệ thống
CRISPR/Cas9 được đưa vào mô lá và xác định được đột biến mất đoạn trên
gen đích với tỷ lệ 27% [40].
1.3.2. Hệ thống tế bào trần
Hiện nay, việc đánh giá hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa hệ gen trên
các đối tượng cây trồng thông qua hệ thống nuôi cấy tế bào trần đã được ứng
dụng nhiều.