Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh care, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus care phân lập được tại một số tỉnh phía bắc việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

àn

h

KT

TRẦN VĂN NÊN

n

sĩ

ng

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH
CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC
PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC

Lu

ận

án

tiế

TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

HÀ NỘI – 2017

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Trần Văn Nên

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH

KT

CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC

àn

h

PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC

n

sĩ

ng

TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

tiế

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi

ận

án

Mã số: 62.64.01.02

Lu

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. NGUYỄN THỊ LAN
PGS. TS. NGUYỄN VĂN THANH

HÀ NỘI, NĂM 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả
nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng
dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc
cám ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày… tháng… năm…

àn

h

KT

Tác giả luận án

Lu

ận

án

tiế

n

sĩ

ng

Trần Văn Nên

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận án, tơi đã nhận
đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên
của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận án, cho phép tơi đƣợc bày tỏ lịng kính trọng và
biết ơn sâu sắc PGS. TS. Nguyễn Thị Lan và PGS. TS. Nguyễn Văn Thanh đã
tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian và tạo điều kiện cho tơi trong
suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

KT

Bộ môn Bệnh lý thú y, Bệnh viện thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt

àn

h

Nam đã tận tình giúp đỡ tơi trong q trình học tập, thực hiện đề tài và hồn thành
luận án.

sĩ

ng

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phịng thí
nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học thú y và phịng thí nghiệm bộ mơn bệnh lý
đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

n

Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi

án

tiế

điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn
thành luận án./.

ận

Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 20...

Lu

Tác giả luận án

Trần Văn Nên

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................... ix
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN ................................................................................................ xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1

KT

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ............................................................................. 1

h

1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ............................................................... 2

àn

1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU......................................................................................... 2

ng

1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI ............................................................... 3
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ........................................ 3

sĩ

1.5.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................... 3

tiế

n

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................... 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................... 4

án

2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGỒI NƢỚC ............. 4

ận

2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nƣớc .......................................................... 4
2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngồi nƣớc .......................................................... 5

Lu

2.2. MỘT SỐ THƠNG TIN VỀ VIRUT CARE............................................................... 7
2.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care ................................................................................ 7
2.2.2. Hình thái của virus Care ......................................................................................... 8
2.2.3. Cấu trúc của virus Care ........................................................................................... 8
2.2.4. Sức đề kháng của virus Care................................................................................... 9
2.2.5. Cơ chế sinh bệnh ..................................................................................................... 9
2.2.6. Đặc tính sinh học của virus Care .......................................................................... 11
2.2.7. Đặc tính sinh học phân tử của virus Care ............................................................. 13
2.3. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE .............................................................. 18
2.3.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care ........................................................................... 18
2.3.2. Triệu chứng bệnh tích ........................................................................................... 20

iii


2.3.3. Chẩn đốn bệnh Care ............................................................................................ 22
2.3.4. Phịng và điều trị bệnh .......................................................................................... 27
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 31
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 31
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ................................................................................... 31
3.3. ĐỐI TƢỢNG VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .............................................................. 31
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................................... 33
3.4.1. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care ........................... 33
3.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của những chủng virus Care phân lập đƣợc ........... 33
3.4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của những chủng virus Care phân

KT

lập đƣợc .......................................................................................................................... 34
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 34

h

3.5.1. Phƣơng pháp khám lâm sàng ................................................................................ 34

àn

3.5.2. Phƣơng pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể .............................................. 34

ng

3.5.3. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản ................... 35

sĩ

3.5.4. Phƣơng pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch ............................................................... 38

n

3.5.5. Phƣơng pháp xét nghiệm các chỉ tiêu máu ........................................................... 39

tiế

3.5.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ................................................................................ 39
3.5.7. Phƣơng pháp phân lập virus Care trên môi trƣờng tế bào Vero-DST .................. 40

án

3.5.8. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) ............................................... 41

ận

3.5.9. Phƣơng pháp xác định đƣờng biểu biễn sự nhân lên của virus............................. 41

Lu

3.5.10. Phƣơng pháp xác định tính kháng nguyên của virus Care.................................. 41
3.5.11. Phƣơng pháp ELISA ........................................................................................... 42
3.5.12. Phƣơng pháp RT-PCR và PCR ........................................................................... 42
3.5.13. Phƣơng pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene .................... 45
3.5.14. Xử lý số liệu ........................................................................................................ 48
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 49
4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA CHÓ MẮC
BỆNH CARE .................................................................................................................. 49
4.1.1. Kết quả chẩn đốn chó mắc bệnh Care bằng phƣơng pháp RT-PCR ................... 49
4.1.2. Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care ..................................................... 50
4.1.3. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu lâm sàng của các giống chó mắc bệnh Care 52
4.1.4. Kết quả nghiên cứu sự thay đổi về chỉ tiêu máu của các giống chó mắc bệnh Care ................55

iv


4.1.5. Biến đổi bệnh lý đại thể của chó mắc bệnh Care .................................................. 60
4.1.6. Biến đổi bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh Care ................................................. 62
4.1.7. Kết quả ứng dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch để xác định sự phân bố virus Care
trên các cơ quan tổ chức của chó bệnh ........................................................................... 67
4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NHỮNG
CHỦNG VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƢỢC................................................................. 70

4.2.1. Thông tin của những chủng virus Care phân lập đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ............ 70
4.2.2. Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của những chủng virus Care phân lập đƣợc ...........70
4.2.3. Hiệu giá của những chủng virus Care phân lập đƣợc ........................................... 73
4.2.4. Nghiên cứu xác định biểu đồ tăng trƣởng của những chủng virus Care phân lập đƣợc . 74

KT

4.2.5. Nghiên cứu về tính kháng nguyên của chủng virus Care phân lập đƣợc.............. 79
4.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA

àn

h

NHỮNG CHỦNG VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƢỢC ................................................. 84

ng

4.3.1. Kết quả giải trình tự gene của những chủng virus nghiên cứu ............................. 84
4.3.2. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của những chủng virus nghiên cứu .............. 85

sĩ

4.3.3. Kết quả so sánh trình tự amino acid của những chủng virus nghiên cứu ............... 90

n

4.3.4. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide giữa những chủng virus nghiên cứu 98

tiế

4.3.5. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid giữa những chủng virus

án

nghiên cứu ....................................................................................................................... 99
4.3.6. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử .............................................................. 101

ận

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 106

Lu

5.1. KẾT LUẬN............................................................................................................ 106
5.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 107
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN . 108
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 109
PHỤ LỤC..................................................................................................................... 119

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Nghĩa tiếng Việt

Từ viết tắt

Canine distemper virus (Virus gây bệnh Care ở chó)

CPE

Cytophathogenic Effect (khả năng gây bệnh tích tế bào)

CPV

Canine Parvovirus (Virus gây bệnh Parvo ở chó)

RNA

Ribonucleic acid (Axít ribonucleic)

DAB

3,3-diaminobenzidine

DNA

Deoxyribonucleic acid (Axít deoxyribonucleic)

KT

CDV

h

àn

sĩ

ELISA

Ethylene diamine tetra acetic acid (axít etylen diamin
tetraaxetic)
Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Phƣơng pháp miễn
dịch gắn enzyme)

ng

EDTA

Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò)

FCS

Fetal Calf Serum (Huyết thanh thai bê)

MOI

Multiplicity Of Infection (Bội số gây nhiễm)

PBS

Phosphate Buffered Saline (Dung dịch muối đệm phosphat)

án

ận

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase)

Lu

PCR

tiế

n

FBS

RT-PCR

Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng
tổng hợp chuỗi phiên mã ngƣợc)

SLS

Sample loading solution (Dung dịch pha mẫu)

TCID50

Tissue Culture Infective fifty percent Dose (Liều gây nhiễm
50% trên môi trƣờng nuôi cấy mô)

vi


DANH MỤC BẢNG
TT

Tên bảng
Trang
2.1. Các virus thuộc giống Morbillivirus và bệnh do chúng gây ra .................................. 7
2.2. Danh sách các loại vacxin phòng bệnh Care đƣợc lƣu hành ở Việt Nam ............... 29
3.1. Mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR và giải trình tự gene P và H .......................... 33
3.2. Chó mắc bệnh Care theo giống chó khác nhau ........................................................ 31
3.3. Chó mắc bệnh Care theo các địa phƣơng nghiên cứu khác nhau ............................ 32
3.4. Các chủng tham chiếu sử dụng để xây dựng cây sinh học phân tử ......................... 46
4.1. Kết quả chẩn đoán bằng phƣơng pháp RT-PCR và PCR ........................................ 49

KT

4.2. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care ........................................... 50
4.3. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care .............................. 52

àn

h

4.4. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó H’Mơng Cộc mắc bệnh Care ........................ 53
4.5. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Bắc Hà mắc bệnh Care .................................. 53

ng

4.6. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó lai Becgie mắc bệnh Care ............................. 53

sĩ

4.7. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Fox mắc bệnh Care ....................................... 53

n

4.8. Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Rottweiler mắc bệnh Care ............................. 53

tiế

4.9. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care ................................ 55

án

4.10. Một số chỉ tiêu máu của giống chó H’Mơng Cộc mắc bệnh Care ......................... 55
4.11. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Bắc Hà mắc bệnh Care .................................. 56

ận

4.12. Một số chỉ tiêu máu của giống chó lai Becgie mắc bệnh Care .............................. 56

Lu

4.13. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Fox mắc bệnh Care ........................................ 57
4.14. Một số chỉ tiêu máu của giống chó Rottweiler mắc bệnh Care ............................. 57
4.15. Các tổn thƣơng đại thể ở chó mắc Care ................................................................. 60
4.16. Biến đổi vi thể ở một số cơ quan của chó mắc bệnh Care ..................................... 63
4.17. Kết quả nhuộm hóa mơ miễn dịch ......................................................................... 67
4.18. Thơng tin của các chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu............................. 70
4.19. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của 5 chủng virus Care và
chủng virus vacxin Onderstepoort .................................................................................. 71
4.20. Hiệu giá của những chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu .......................... 73
4.21. Kết quả kiểm tra hàm lƣợng kháng thể của 6 chó thí nghiệm trƣớc khi tiêm vacxin
Care vô hoạt .................................................................................................................... 80

vii


4.22. Các triệu chứng lâm sàng của các chó thí nghiệm sau khi công cƣờng độc .......... 83
4.23. Kết quả phân lập virus CDV ở các lơ chó thí nghiệm ........................................... 84
4.24. Các vị trí sai khác nucleotide của gene P giữa những chủng virus nghiên cứu với
chủng virus vacxin .......................................................................................................... 87
4.25. Các vị trí sai khác nucleotide của gene H giữa những chủng virus nghiên cứu với
chủng virus vacxin .......................................................................................................... 88
4.26. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene H giữa các chủng virus Care nghiên
cứu và chủng virus vacxin .............................................................................................. 97
4.27. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene P giữa các chủng virus Care nghiên
cứu và chủng virus vacxin .............................................................................................. 97

KT

4.28. Sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gene H giữa những chủng virus Care
nghiên cứu với mẫu virus vacxin Ond-VX (%) .............................................................. 99

àn

h

4.29. Sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gene P giữa những chủng virus Care

ng

nghiên cứu với mẫu virus vacxin Ond-VX (%) .............................................................. 99
4.30. Sự tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene H giữa những chủng virus Care

sĩ

nghiên cứu với chủng virus vacxin (%) ........................................................................ 100

n

4.31. Sự tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene P giữa những chủng virus Care

Lu

ận

án

tiế

nghiên cứu với chủng virus vacxin (%) ........................................................................ 101

viii


DANH MỤC HÌNH
Tên hình

TT

Trang

2.1. Cấu trúc của virus Care .............................................................................................. 8

2.2. Cơ chế sinh bệnh của bệnh Care. ............................................................................. 10
2.3. Bệnh tích tế bào do chủng virus CDV4-H và Onderstepoort gây ra sau 36 và 48 giờ
gây nhiễm trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero-DST .................................................. 12
2.4. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus vacxin Onderstepoort và chủng
007Lm ............................................................................................................................. 13
2.5. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene H của virus Care ................................ 16

KT

2.6. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene P của virus Care ................................. 17

h

2.7. Kết quả nhuộm hóa mơ miễn dịch trên tiêu bản phổi, hạch lympho, não và dạ dày

àn

(IHC. 10X) ...................................................................................................................... 25

ng

4.1. Chó tiêu chảy, phân màu cà phê .............................................................................. 52
4.2. Chó có biểu hiện thần kinh ...................................................................................... 52

sĩ

4.3. Chó mắc bệnh Care có các nốt sài ở vùng da mỏng. ............................................... 52

n

4.4. Chó mắc bệnh Care có gan bàn chân sƣng, cứng .................................................... 52

tiế

4.5. Xuất huyết ở phổi..................................................................................................... 62

án

4.6. Ruột bị sung huyết ................................................................................................... 62
4.7. Hạch dƣới hàm sƣng to ............................................................................................ 62

ận

4.8. Hạch màng treo ruột sƣng to .................................................................................... 62

Lu

4.9. Viêm phế quản phổi (HE. 10X) ............................................................................... 66
4.10. Lông nhung ruột đứt nát (HE. 10X)....................................................................... 66
4.11. Ruột chó xuất huyết và thối hóa tế bào ruột (HE. 40X)....................................... 66
4.12. Nang lympho teo (HE. 10X) .................................................................................. 66
4.13. Hóa miễn dịch dƣơng tính ở phổi (IHC. 10X) ....................................................... 69
4.14. Hóa miễn dịch dƣơng tính tại ruột (IHC. 10X) ..................................................... 69
4.15. Hóa miễn dịch dƣơng tính tại phổi (IHC. 40X) ..................................................... 69
4.16. Hóa miễn dịch dƣơng tính tại hạch lympho (IHC. 10X) ....................................... 69
4.17. CPE do CDV-VNUA-768 gây ra sau 24 giờ gây nhiễm (10X) ............................. 73
4.18. CPE do Onderstepoort (virus vacxin) gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X) ........... 73
4.19. CPE do CDV-VNUA-768 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X) ............................. 73

ix

4.20. Tế bào Vero-DST bình thƣờng (10X) ................................................................... 73
4.21. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-VNUA-768 và chủng virus
vacxin Onderstepoort ...................................................................................................... 77
4.22. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-02H và chủng virus
vacxin Onderstepoort ...................................................................................................... 77
4.23. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-03R và chủng virus
vacxin Onderstepoort ...................................................................................................... 78
4.24. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-04H và chủng virus
vacxin Onderstepoort ...................................................................................................... 78
4.25. Đƣờng biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-05P và chủng virus

KT

vacxin Onderstepoort ...................................................................................................... 79
4.26. Biến động dƣơng tính huyết thanh học ở chó đƣợc tiêm vacxin Care vô hoạt so với

àn

h

lô đối chứng không tiêm vacxin ..................................................................................... 80

ng

4.27. So sánh giá trị OD giữa hai lơ chó thí nghiệm sau khi cơng cƣờng độc................ 82
4.28. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene H của các chủng virus Care

sĩ

nghiên cứu ....................................................................................................................... 94

n

4.29. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene P của các chủng virus Care

tiế

nghiên cứu ....................................................................................................................... 96

án

4.30. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene P của những chủng virus
Care nghiên cứu ............................................................................................................ 102

ận

4.31. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene H của những chủng virus

Lu

Care nghiên cứu ............................................................................................................ 103

x


TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Lu

ận

án

tiế

n

sĩ

ng

àn

h

KT

Tên tác giả:
Trần Văn Nên
Tên Luận án: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care, đặc điểm
sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập đƣợc tại một số tỉnh phía Bắc Việt
Nam.
Chuyên ngành:
Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
Mã số: 62.64.01.02
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Xác định đƣợc một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care. Xác

định đƣợc đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập đƣợc tại một
số tỉnh phía Bắc Việt Nam.
Phƣơng pháp nghiên cứu
Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care. Nghiên cứu đặc
điểm sinh học của các chủng virus Care phân lập đƣợc tại một số tỉnh phía Bắc Việt
Nam. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus Care phân lập đƣợc tại
một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Các chó mắc bệnh Care và mẫu virus Care phân lập
đƣợc từ các chó mắc bệnh đƣợc thu thập từ 5 tỉnh ở phía Bắc Việt Nam gồm: Hà Nội,
Hƣng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định. Bể ổn nhiệt, máy đúc chuyển mẫu tự
động, máy cắt tổ chức Microtom, máy làm khơ tiêu bản, kính hiển vi quang học, máy
xét nghiệm huyết học tự động CELL-DYN 3700, tủ ấm nuôi cấy tế bào (5% CO2), kính
hiển vi soi nổi, máy ly tâm, máy gia nhiệt PCR, máy giải trình tự gene tự động
Beckman Coulter CEQ 8000. Formol 10%, parafin, xylen, thuốc nhuộm Hematoxilin –
Eosin, dòng tế bào Vero-DST; DMEM, 10% FBS, dung dịch đệm EDTA, kháng sinh;
kit tách chiết RNA tổng số, cặp mồi gene H và P, kit phản ứng RT-PCR và PCR, đệm
TBE hoặc TAE, agarose, hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR sequence và kit chạy giải
trình tự gene. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care bằng các
phƣơng pháp thƣờng quy nhƣ: phƣơng pháp khám lâm sàng; phƣơng pháp mổ khám,
quan sát bệnh tích đại thể; phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên
tiêu bản; phƣơng pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch; phƣơng pháp xét nghiệm các chỉ tiêu
sinh lý máu. Số liệu nghiên cứu đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê phân tích
phƣơng sai (ANOVA/One Way) với phƣơng pháp Tukey. Nghiên cứu đặc điểm sinh
học của các chủng virus Care phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp nuôi cấy tế bào VeroDST, phƣơng pháp phân lập virus Care trên môi trƣờng tế bào Vero-DST; phƣơng pháp
xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) (Lan et al., 2005a); phƣơng pháp xác định đƣờng
biểu diễn sự nhân lên của virus; phƣơng pháp xác định tính kháng nguyên của virus.
Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus Care phân lập đƣợc thực
hiện bằng phƣơng pháp RT-PCR; phƣơng pháp giải trình tự gene. Cây sinh học phân tử
thể hiện nguồn gốc phát sinh của các chủng virus nghiên cứu đƣợc xây dựng bằng phần
mềm MEGA6.0. Sử dụng phƣơng pháp test Maximum likehood với giá trị bootstrap là
1000 đơn vị.

xi


Lu

ận

án

tiế

n

sĩ

ng

àn

h

KT

Kết quả chính và kết luận
68 chó ở độ tuổi 3-6 tháng mắc bệnh Care thuộc 6 giống khác nhau đƣợc thu thập
từ 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam gồm Hà Nội, Hƣng Yên, Thái Bình, Bắc Giang và Nam
Định có biểu hiện bệnh lý điển hình của bệnh. Triệu chứng lâm sàng: sốt (100,0%),
biếng ăn, ủ rũ (100,0%), có dử mắt (100,0%), nôn mửa (97,06%), dử mũi (79,41%), ho
(79,41%), tiêu chảy phân màu cà phê (76,47%), sừng hóa gan bàn chân (41,18%), có

các nốt sài ở vùng da mỏng (32,35%) và xuất hiện các triệu chứng thần kinh (11,76%).
Các chỉ tiêu cận lâm sàng: thân nhiệt (40,230C – 40,590C), tần số hô hấp (71,83 – 78,94
lần/phút), tần số tim (118,88 – 130,75 lần/phút) tăng so với chó khỏe. Xét nghiệm máu
ở chó mắc bệnh Care: số lƣợng hồng cầu (3,80 – 4,26 x 106/µl), hàm lƣợng huyết sắc tố
(110,81 – 123,81 g/l), tỷ khối hồng cầu (32,59% - 34,18%), thể tích trung bình hồng cầu
(46,20 – 47,74 fl), lƣợng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (17,88 – 18,65 pg), số lƣợng
bạch cầu (4,67 – 4,87 x 103/ml). Công thức bạch cầu có sự thay đổi, trong đó tỷ lệ bạch
cầu đa nhân trung tính (62,65% - 63,29%) tăng so với chó khỏe. Bệnh tích ở phổi: phổi
xuất huyết (85,29%), viêm phổi thùy (79,41%), viêm phế quản phổi (79,41%). Bệnh tích
ở ruột: ruột viêm, xuất huyết (91,18%) và sung huyết ở ruột non (88,24%). Hạch lympho
vùng đầu, cổ, dƣới hàm, màng treo ruột sƣng to, rìa tù, xuất huyết (100%). Bệnh tích vi
thể ở phổi, ruột, hạch lympho là sung huyết, xuất huyết, hoại tử tế bào, thối hóa tế bào,
thâm nhiễm tế bào viêm. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch chỉ ra virus tập trung nhiều tại
phổi, ruột và hạch lympho.
Một số đặc tính sinh học của 5 chủng virus Care phân lập đƣợc từ chó mắc bệnh
Care là virus phân lập đƣợc thích ứng tốt trên môi trƣờng tế bào Vero-DST. Virus phá
hủy tế bào Vero-DST từ 24 giờ đến 48 giờ sau khi gây nhiễm và phá hủy hoàn toàn tế
bào sau 60 giờ đến 72 giờ. Hiệu giá virus biến động cao từ 3,16 x 104 tới 6,25 x 105
(TCID50/25µl). Ở các thời điểm thu hoạch virus khác nhau thì lƣợng virus tập trung
trong tế bào luôn cao hơn so với lƣợng virus ở ngoài tế bào. Chủng virus Care CDVVNUA-768 phân lập đƣợc, dùng sản xuất vacxin Care vơ hoạt có tính kháng ngun
cao, khi tiêm chó thí nghiệm có khả năng gây đáp ứng miễn dịch tốt, bảo hộ đƣợc chó
trƣớc sự tấn cơng của virus cơng cƣờng độc. Có thể sử dụng chủng virus này nghiên
cứu vacxin phịng bệnh.
Đặc tính sinh học phân tử của 5 chủng virus Care phân lập đƣợc dựa trên kết quả
giải trình tự gene H và P. Đoạn gene H và P có độ dài lần lƣợt là 1824 bp và 402 bp.
Mức độ tƣơng đồng về nucleotide ở gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu
đạt tỷ lệ lần lƣợt là 90,05%-99,61% và 94,81%-99,75%. Mức độ tƣơng đồng về
nucleotide về nucleotide ở gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu với chủng
virus vacxin đạt tỷ lệ lần lƣợt là 89,99%-99,34% và 94,81%-99,50%. Mức độ tƣơng
đồng về amino acid mã hóa từ gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu đạt tỷ lệ

lần lƣợt là 89,38%-99,5% và 92,47%-100,0%. Mức độ tƣơng đồng về amino acid mã
hóa từ gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin đạt tỷ lệ
lần lƣợt là 89,39%-99,17% và 92,47%-100,0%. 5 chủng virus Care phân lập đƣợc nằm
trong 3 nhánh phát sinh khác nhau thuộc 3 genotype lần lƣợt là Asia 1, Asia 2 và
Classic.

xii


THESIS ABSTRACT

Lu

ận

án

tiế

n

sĩ

ng

àn

h

KT

Author: Tran Van Nen
Thesis Title: Study on mainly pathological characteristics of dogs infected with Canine
Distemper virus, biological and molecular characteristics of the Canine Distemper virus
isolated in some Northern provinces in Vietnam.
Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals
Code: 62.64.01.02
Training Institution: Vietnam National University of Agriculture
Research purposes
To identify some mainly pathological features of dogs infected with Canine
Distemper virus (CDV). To determine biological and molecular characteristics of the
CDV isolated in some Northern provinces in Vietnam.
Research Methods
This study was conducted to identify some mainly pathological features of CDV
infection in dogs. Biological characteristics of the CDV strains isolated in some
northern provinces in Vietnam were investigated. Molecular biological characteristics
of the CDV strains isolated in some northern provinces in Vietnam were investigated.
Dogs infected with CDV and samples of CDV isolated from infected dogs were
collected from 5 northern provinces in Vietnam include Hanoi, Hung Yen, Thai Binh,
Bac Giang, and Nam Dinh. To realize this study, the following materials were used:
waterbath, automatic paraffin dispenser embedding, automatic microtome, slide dryer,
microscopes, CELL-DYN 3700 automatic hematology analyzer, cell-culture incubator
(5% CO2), stereoscopic microscopes, centrifuges, PCR machines, Beckman Coulter
Formol 8000 automatic sequencing machine, 10% formalin, paraffin, xylene,
Haematoxylin - Eosin dyes, Vero-DST cell line; DMEM, 10% FBS, EDTA buffer,
antibiotics; total RNA extraction Kit, primers of H and P gene, RT-PCR and PCR Kit,
TBE or TAE buffer, agarose, chemical for purification and Kit for sequencing of PCR
products. Main pathological features of dogs infected with CDV were studied using
routine methods: clinical examination; post-mortem necropsy, macroscopic lesions
observation; prepare microscopic slides and examination of microscopic lesions;

immunohistochemistry staining; assays of physiological indicators of blood. Data was
analyzed using statistical analysis of variance (ANOVA/One Way), and Tukey method.
Research on biological characteristics of the CDV strains isolated was carried out using
Vero-DST cell culture, CDV isolation methods on Vero-DST cell environment; virus
titration (TCID50 / ml) (Lan et al., 2005a); determination the viral replication. Molecular
biological characteristics of the CDV strains isolated were demonstrated by RT-PCR
and sequencing methods. Phylogenetic tree illustrating the origin of viral strains was
established by MEGA6.0 software and Maximum likehood test with the bootstrap value
of 1000 units.

xiii


Lu

ận

án

tiế

n

sĩ

ng

àn

h

KT

Main results and conclusion
Determination of some mainly pathological features of 68 dogs of 3 – 6 months
old, from 6 different breeds collected from 5 northern provinces in Vietnam include
Hanoi, Hung Yen, Thai Binh, Bac Giang, and Nam Dinh. Dogs infected with CDV has
mainly clinical symptoms such as fever (100.0%), anorexia, depression (100.0%),
rheum (100.0%), vomiting (97.06%), scratchy nose (79.41%), coughing (79.41%),
diarrhea with stool of coffee color (76.47%), keratosis in sole of the feet (41.18%),
pitches in the thin skin (32.35%) and neurological sign (11.76%). The subclinical
indicators of infected dogs such as body temperature (40.23°C – 40.59°C), respiratory
rate (71.83 – 78.94 times/minute), heart frequency (118.88 – 130.75 beat/minute).
Hematological test revealed that infected dogs have RBC (3.80 – 4.26 x 106/µl), Hb
(110.81 – 123.81 g/l), HCT (32.59% - 34.18%), MCV (46,20 – 47,74 fl), MCH (17,88 –
18,65 pg), WBC (4,67 – 4,87 x 103/ml). White blood cell formula has been changed, in
which neutrophil rate (62.65% - 63.29%) increases in infected dogs. Mainly gross
lesions were found in lung, include pulmonary hemorrhage (85.29%), lobular
pneumonia (79.41%), bronchopneumonia (79.41%). Gross lesions in digestive tracts
were hemorrhage (91.18%) and small intestinal congestion (88.24%). Lymph notes are
swelling, hemorrhagic (100%) in heard, under the jaw, and mesentery. Mainly microlesions found in lung, intestine, and lymph notes of infected dogs were congestion,
hemorrhage, necrosis,
cell
degeneration
and infiltration. Results
of
immunohistochemistry staining indicated lung, intestines, organs and lymph nodes are
infiltrated with much CDV.
Results of the study on biological characteristics of the 5 strains CDV isolated
showed that they had the following features: viruses start destroying cells from 24 hours

to 48 hours after inoculation and completely destroyed cells after 60 hours to 72 hours;
high titer (3.16 x 104 to 6.25 x 105 TCID50 / 25μl) and adapt well in Vero- DST cell
culture; Virus concentration in the cell is always higher than the levels of the virus
outside the cell in different collection time. CDV-VNUA-768 strain isolated was used
for attenuated vaccine production with high antigenicity. Experiment in dogs yields a
good immune response, protects dogs from experimental virus infection. It is
recommended to use this strain for further research on vaccine.
The results of the study on the molecular characteristics of the 5 isolated strains
of CDV showed that they had the following features: nucleotide sequence of H and P
gene was sequenced in length 1824 bp and 402 bp, respectively. The nucleotide
similarity in the gene H and gene P of 5 studied strains were at a high rate of 90.05% 99.61% and 94.81% - 99.75%, respectively. The nucleotide similarity in the gene H and
gene P of 5 strains compared to the vaccine strain were 89.99% - 99.34% and 94.81% 99.50%, respectively. The degree of amino acid similarity of the gene H and gene P was
a high rate of 89.38% - 99.5% and 92.47% -100.0%, respectively. The degree of amino
acid similarity of the gene H and gene P 89.39% - 99.17% and 92.47% -100.0%,
respectively. Five studied CDV strains were in 3 different branches belonging to 3
genotypes: Asia 1, 2 and Classic, respectively.

xiv


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Lu

ận

án

tiế

n

sĩ

ng

àn

h

KT

Bệnh Care hay bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy
hiểm thƣờng xảy ra ở chó con, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao. Bệnh Care
đƣợc biết tới là căn bệnh nguy hiểm nhất trên chó trong nửa đầu thế kỷ 19. Bệnh
Care đƣợc báo cáo lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel and Gillespie,
1972). Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã đƣợc mô tả lần đầu
tiên vào năm 1809 bởi Edward Jenner (Appel and Gillespie, 1972; Shell, 1990)
và virus Care đã đƣợc phân lập vào năm 1905. Bệnh Care xảy ra rộng rãi trên
toàn thế giới, xảy ra ở một số nƣớc nhƣ Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi
và nhiều nƣớc ở châu Âu, gần đây nhất là ở các nƣớc châu Á nhƣ Nhật Bản (Lan
et al., 2006a), Thái Lan (Keawcharoen et al., 2005), Hàn Quốc (An et al., 2008)
và Ấn Độ (Latha et al., 2007).
Nguyên nhân gây bệnh Care trên chó là do virus Care (Canine distemper
virus - CDV). CDV là một thành viên của giống Morbillivirus, thuộc họ
Paramixoviridae. Các thành viên khác của giống Morbillivirus nhƣ virus gây
bệnh sởi trên ngƣời (Measles virus - MV), virus dịch tả trâu bò (Rinderpest virus
- RPV), virus gây bệnh trên động vật nhai lại nhỏ (Peste des petits ruminants
virus - PPRV), virus gây bệnh trên động vật có vú dƣới nƣớc (cá heo, hải cẩu)

(Murphy et al., 1999). Virus Care cũng gây bệnh trên động vật hoang dã ăn thịt
và hổ (Appel et al., 1994; Frölich et al., 2000; Martella et al., 2002). Virus Care
có cấu tạo gồm một sợi RNA đơn không phân đoạn gồm khoảng 15.690
nucleotide. Trong cấu trúc bộ gene gồm 6 gene mã hóa cho các protein nhƣ
protein tạo lớp vỏ bọc (M), hai glycoprotein (yếu tố kết dính (H), yếu tố kết hợp
virus với thụ thể trên màng tế bào (F)), hai protein có liên quan tới sự sao chép
RNA (phosphoprotein – P và large protein – L) và nucleocapsid N đóng gói
RNA của virus (Sidhu et al., 1993). Dựa trên trình tự của protein Haemagglutinin
(H), Harder and Osterhaus, (1997) và Martella et al., (2006) đã phân loại virus
Care thành 7 nhóm chính theo ví trí địa lý gồm: Arctic – like, America 1,
America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife.
CDV là virus gây nhiễm hƣớng lympho, niêm mạc và mô thần kinh. Trƣớc
đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân lập CDV trên các mơi trƣờng nhƣ
dịng tế bào biểu mô và nguyên bào sợi, tế bào lympho của chó (Appel et al.,
1992), đại thực bào phế nang của chó (Appel, 1978), đại thực bào màng bụng

1


án

tiế

n

sĩ

ng

àn

h

KT

chồn sƣơng (Poste, 1971), xơ phôi gà (Ezeibe, 2005). Tuy nhiên việc phân lập và
xác định hiệu giá virus Care rất khó khăn do khơng có dịng tế bào nào thích hợp
để virus sinh trƣởng và gây bệnh tích tế bào. Qua nghiên cứu của Seki et al.
(2003) và Lan et al. (2005a) đã chỉ ra Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể
sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus.
Ở Việt Nam, bệnh Care đƣợc phát hiện từ năm 1920. Chó phát bệnh thƣờng
chết với tỷ lệ chết 50-80%, có thể lên đến 100% nếu khơng đƣợc điều trị kịp thời
(Hồ Đình Chúc, 1993). Cho đến nay, bệnh Care xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây
thiệt hại lớn cho đàn chó ni trong nƣớc do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê
Thị Tài, 2006). Nhƣng các nghiên cứu về bệnh lý, đặc tính sinh học và di truyền
của virus Care ở trong nƣớc cịn rất khiêm tốn, bên cạnh đó hiệu quả bảo hộ của
các vacxin phòng bệnh Care đang lƣu hành hiện nay chƣa cao cũng nhƣ chƣa có
nhiều báo cáo cụ thể. Xuất phát từ thực tiễn đó, trong đề tài này chúng tôi tiến
hành nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc Care, đồng thời
nghiên cứu về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập tại
Việt Nam. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa rất quan trọng cung cấp dữ liệu khoa
học hỗ trợ việc chẩn đoán bệnh dựa vào đặc điểm bệnh lý đặc trƣng của bệnh và
lựa chọn đƣợc nguồn mẫu bệnh phẩm phục vụ cho việc chọn chủng virus chế
vacxin phòng bệnh hiệu quả, chế tạo kit chẩn đoán, chế tạo kháng nguyên dùng
trong chẩn đốn góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh Care gây ra cho
đàn chó ni ở trong nƣớc.

ận

1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Lu

Xác định đƣợc một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care
cũng nhƣ đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập đƣợc tại
một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc chẩn đoán
phát hiện bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng. Bên cạnh đó, thơng tin về các đặc
tính sinh học và sinh học phân tử của các virus Care giúp cho việc sàng lọc và
lựa chọn đƣợc chủng virus có tiềm năng trong sản xuất vacxin và các chế phẩm
sinh học phục vụ công tác chẩn đốn, phịng và điều trị bệnh Care.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Đối tƣợng nghiên cứu là chó mắc bệnh Care, mẫu virus Care phân lập
đƣợc từ các chó mắc bệnh Care.
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2014 tới tháng 12/2016
- Địa điểm nghiên cứu:

2


+ Bệnh viện thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
+ Bộ môn bệnh lý thú y, Khoa Thú y, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
+ Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học thú y, Khoa Thú y, Học
viện Nơng nghiệp Việt Nam
1.4. NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đây là cơng trình nghiên cứu hồn chỉnh và có hệ thống về đặc điểm bệnh
lý bệnh Care ở chó và đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của 5 chủng virus
phân lập đƣợc từ 6 giống chó (3-6 tháng tuổi) mắc bệnh Care thu thập từ 5 tỉnh
phía Bắc Việt Nam: Hà Nội, Hƣng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

KT

1.5.1. Ý nghĩa khoa học

h

Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên

ng

àn

cứu về bệnh Care ở chó trong các trƣờng, viện nghiên cứu chuyên ngành thú y.
Đây cũng là tƣ liệu khoa học quý báu và cần thiết cho những ngƣời làm công tác
thú y cơ sở về bệnh Care. Đồng thời, thông tin chi tiết của các chủng giống virus

sĩ

Care phân lập đƣợc có ý nghĩa trong việc xây dựng ngân hàng hồ sơ chủng giống

án

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn

tiế

n

gốc, phục vụ cho các bƣớc đăng ký chủng giống với ngân hàng bảo tồn nguồn
gene quốc gia.

Lu

ận

Đề tài đã thu thập, sàng lọc và đánh giá các đặc tính sinh học và sinh học
phân tử của 5 chủng virus Care đang gây bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt
Nam. 5 chủng virus phân lập đƣợc có tiềm năng cho chọn giống để sản xuất
vacxin hoặc chế tạo kit, làm kháng nguyên cho chẩn đoán hoặc làm giống để
công cƣờng độc đánh giá hiệu quả bảo hộ và kiểm nghiệm vacxin. Kết quả
nghiên cứu tạo tiền đề giúp thúc đẩy các nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin
trong nƣớc từ chính các chủng virus đang lƣu hành tại thực địa, từ đó nâng cao
hiệu quả phòng bệnh.

3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGỒI NƢỚC
2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nƣớc

ng

àn

h

KT

Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện từ năm 1920. Nghiên cứu của Hồ Đình

Chúc (1993) đã chỉ ra thời kỳ ủ bệnh Care thƣờng là 3 - 6 ngày (dài nhất là 17 21 ngày) và có thể kéo dài trong khoảng thời gian trên dƣới 1 tháng. Chó phát
bệnh thƣờng chết với tỷ lệ chết 50 - 80%, thậm chí lên đến 100% nếu khơng điều
trị kịp thời.
Cho đến nay, bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử
vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006). Tất cả các lồi chó đều cảm thụ bệnh,
nhƣng mẫn cảm ở là lồi chó lai, chó cảnh, chó nội ít mẫn cảm hơn (Tô Du và
Xuân Giao, 2006).
Nghiên cứu của Lan et al. (2008) đã phân lập đƣợc chủng virus gây bệnh
trên chó mắc bệnh tại Việt Nam. Virus Care đƣợc phân lập trên dịng tế bào
Vero-DST, sau đó đƣợc kiểm tra bằng phản ứng RT-PCR. Chủng virus CDV-

Lu

ận

án

tiế

n

sĩ

HN1 có hiệu giá virus đạt 3,16 x 105 TCID50/25 l. Kết quả nghiên cứu đã cho
thấy đàn chó ở Hà Nội đã lây nhiễm với virus Care.
Trong nghiên cứu của Lan et al. (2009a), hai chủng virus Care là Vn86 và
Vn99 đã đƣợc phân lập từ chó 4 tháng tuổi có đặc điểm là viêm não khơng mƣng
mủ, viêm phổi, suy giảm tế bào lympho và viêm dạ dày ruột. Kết quả phân tích
sinh học phân tử đã chỉ ra 2 chủng phân lập đƣợc này đều thuộc nhóm cổ điển
(Classic type), khác xa với nhóm Asia 1 và Asia 2.

Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam (2012) đã chỉ ra đặc điểm bệnh lý của
chó Phú Quốc mắc bệnh Care và ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để
chẩn đoán bệnh. Các dấu hiệu lâm sàng đầu tiên khi mắc bệnh Care là sốt cao,
biếng ăn hoặc không ăn, nơn mửa đối với chó con, ho ở chó trƣởng thành, có nốt
sài tại vùng da mỏng ở vùng bụng, tiêu chảy và có triệu chứng thần kinh nhƣ đi
vịng trịn. Bệnh tích đại thể tập trung chủ yếu ở phổi và ruột. Mặt cắt phổi có
nhiều dịch chảy ra; ruột có hiện tƣợng sung huyết, xuất huyết; đại não bị sung
huyết. Các dấu hiệu bệnh tích khác là: lách sƣng, mặt cắt lồi, hạch lympho sƣng,
gan thối hóa, túi mật sƣng to. Các bệnh tích vi thể gồm có xuất hiện nhiều hồng
cầu trong lòng phế nang, vách phế nang đứt nát, thối hóa tế bào nhu mơ, lơng
nhung ruột bị đứt nát, thâm nhiễm tế bào viêm ở não.
Nguyễn Thị Lan và cs. (2015) đã nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của

4


chó đƣợc gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus Care (CDV-768). Kết quả gây
nhiễm chủng virus Care (CDV-768) cho 3 chó lai Becgie 2 tháng tuổi với liều

KT

106 TCID50/25l qua đƣờng mắt, khí dung và miệng cho thấy chó có triệu chứng
ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn, sốt, nôn mửa, tiêu chảy, ỉa ra máu, có nốt sài trên da, sừng
hóa gan bàn chân. Các bệnh tích đại thể chủ yếu ở phổi (mặt cắt phổi có dịch,
phổi nhục hóa), ruột có hiện tƣợng sung huyết, xuất huyết, đại não bị sung huyết,
hạch lympho sƣng, gan thối hóa, túi mật sƣng to. Các bệnh tích vi thể nhƣ xuất
hiện nhiều hồng cầu trong lòng phế nang, vách phế nang đứt nát, thối hóa tế bào
nhu mơ, lơng nhung ruột bị đứt nát, thâm nhiễm tế bào viêm ở não. Virus tập
trung chủ yếu ở các cơ quan nhƣ phổi, hạch lympho, ruột. Các kết quả thí nghiệm
cho thấy chủng virus Care (CDV-768) có độc lực và có khả năng gây bệnh cho

chó.

h

2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngồi nƣớc

Lu

ận

án

tiế

n

sĩ

ng

àn

Bệnh Care hay bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy
hiểm thƣờng xảy ra ở chó non, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao. Đây là một căn
bệnh nguy hiểm nhất trên chó trong nửa đầu thế kỷ XIX. Tỷ lệ mắc bệnh lớn nhất
ở chó con 3 - 6 tháng tuổi, khi miễn dịch chủ động từ mẹ truyền sang đã giảm thì
tỷ lệ mắc bệnh từ 25% tới trên 30% và tỷ lệ chết ở chó mắc bệnh thƣờng cao từ
50% -90%. Chó mắc bệnh này thấy tổn thƣơng lớn ở hệ tiêu hoá đặc biệt ở dạ dày
và ruột, hệ thần kinh trung ƣơng và hệ hô hấp (Woma and Van Vuuren, 2009).
Bệnh Care đƣợc báo cáo lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel and

Gillespie, 1972). Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã đƣợc mô tả
từ năm 1809 bởi EdwardJenner (Shell, 1990). Năm 1905, bác sĩ thú y ngƣời Pháp
Henri Carré đã phân lập đƣợc mầm bệnh từ nƣớc mũi của chó bị bệnh.
Năm 1923, Putoni lần đầu tiên sản xuất đƣợc vacxin nhƣợc độc, tuy
nhiên chủng virus vacxin vẫn còn độc lực. Từ năm 1948 tới nay, với sự phát
triển mạnh mẽ của các nghiên cứu về virus Care nhiều vacxin phòng bệnh
hiệu quả đã ra đời.
Hiện nay bệnh có ở khắp nơi trên thế giới, khơng những xảy ra trên đàn chó
ni mà cịn ở xuất hiện ở nhiều lồi động vật hoang dã. Chó mắc bệnh Care thể
cận lâm sàng trở thành mối đe dọa nghiêm trọng cho việc bảo tồn nhiều lồi thú
ăn thịt và thú có túi. Qua thống kê các nghiên cứu cho thấy, bệnh Care là một
trong các bệnh quan trọng làm tuyệt chủng chồn chân đen, hổ Tasmania và gây
chết theo chu kỳ ở chó hoang dã châu Phi (Assessment, 2005). Năm 1991, bệnh
Care gây chết 20% tổng đàn trên đàn sƣ tử Serengeti ở Tanzania (Woma and Van

5


Lu

ận

án

tiế

n

sĩ

ng

àn

h

KT

Vuuren, 2009). Đặc biệt virus Care cũng có khả năng gây bệnh cho một số động
vật biển (Kennedy et al., 1989). Ở loài cáo tai to lần đầu tiên đƣợc báo cáo mắc
bệnh Care cùng với cầu trùng (Woo et al., 2010).
McCullough et al. (1974) đã nghiên cứu về ảnh hƣởng của chủng virus
R252 đối với hệ thống hạch lympho trên 34 chó thí nghiệm. 21 chó đƣợc gây
nhiễm ngồi đƣờng tiêu hóa, 6 chó đƣợc gây nhiễm bằng cách tiếp xúc trực tiếp
và 7 chó đƣợc ni làm lơ đối chứng. Số lƣợng tế bào lympho của các chó đƣợc
gây nhiễm với chủng virus Care R252 là giảm sau 7 tuần gây nhiễm. Số lƣợng tế
bào lympho sai khác so với sinh lý bình thƣờng ở 7 chó ốm và có biểu hiện triệu
chứng thần kinh sau 7 tới 27 ngày gây nhiễm (nhóm I). Mƣời chín chó theo dõi ở
thời điểm 12 tuần sau khi gây nhiễm có số lƣợng tế bào lympho bình thƣờng sau
8 tuần gây nhiễm. 5 chó (nhóm II) bị tổn thƣơng ở hệ thần kinh trung ƣơng trong
khi 14 chó (nhóm III) khơng có tổn thƣơng ở hệ thần kinh. Tuyến ức của các chó
ở nhóm I bị teo và hạch lympho có sự suy giảm tế bào lympho. Bên cạnh đó, số
lƣợng các tiểu thể Hassall trong các thùy tuyến ức giảm ở nhóm I. Nucleoprotein
của virus đƣợc tìm thấy trong tuyến ức và tế bào lympho bằng kính hiển vi điện
tử. Khơng có tổn thƣơng ở hạch lympho ở chó nhóm II. Một vài tuyến ức của chó
nhóm II có hiện tƣợng sƣng to hơn so với nhóm đối chứng và có sự gia tăng số
lƣợng tiểu thể Hassall trong thùy tuyến ức. Tuyến ức của chó nhóm III xuất hiện
vùng mầm trung tâm.
Miry et al. (1983) đã kiểm tra sự có mặt của virus Care trên 42 ca chó bị
viêm phổi. Bệnh tích vi thể do virus Care gây ra đã đƣợc chứng minh bằng kỹ

thuật hóa mơ miễn dịch. Kỹ thuật này có độ nhạy cao trong việc phát hiện virus
Care trong các mẫu phổi. Các chó mắc bệnh Care cũng mắc Canine adenovirus
và Bordetella bronchiseptica.
Kubo et al. (2007) đã nghiên cứu về sự phân bố của các thể bao hàm trên
các cơ quan khác nhau của 100 chó đƣợc chẩn đốn dƣơng tính với bệnh Care.
Thể bao hàm đƣợc tìm thấy ở các cơ quan nhƣ: phổi (70 chó), não (20 chó), bàng
quang (73 chó), dạ dày (78 chó), lách (77 chó), và hạch lympho (81 chó). Kết
quả nghiên cứu đã chỉ ra hạch amidan là cơ quan phù hợp nhất để phát hiện thể
bao hàm ở bệnh Care.
Del Puerto et al. (2010) đã nghiên cứu cơ chế apoptosis của tế bào lympho và
não bằng cách đánh giá hàm lƣợng mRNA trong máu ngoại vi, hạch lympho và
não của chó mắc bệnh Care và chó khỏe mạnh bằng phƣơng pháp rRT-PCR. Kết
quả nghiên cứu đã chỉ ra cơ chế apoptosis tế bào của virus Care ở não và hạch
lympho của chó mắc bệnh Care là theo các cách thức khác nhau.

6


Tan et al. (2011) đã phân lập một chủng virus Care mới (ZJ7) từ mẫu phổi
của chó mắc bệnh Care trên mơi trƣờng ni cấy tế bào thận chó (Madin–Darby
canine kidney – MDCK). Chủng virus ZJ7 có khả năng gây bệnh tích hợp bào
trên tế bào MDCK sau 6 lần cấy truyền trên môi trƣờng nuôi cấy. Nhằm đánh giá
độc lực của chủng ZJ7, 3 chó có huyết thanh âm tính với Care đƣợc gây nhiễm
với chủng virus trên qua nhỏ mũi. Tất cả chó đƣợc gây nhiễm đều biểu hiện triệu
chứng lâm sàng nhƣ tiêu chảy ra máu, viêm kết mạc, tiết nhiều dịch mắt, dịch
mũi, ho, sốt và giảm cân tại thời điểm 21 ngày sau khi gây nhiễm; trong khi chó
đối chứng khỏe mạnh. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh chủng virus ZJ7 đƣợc
phân lập trên tế bào MDCK là có độc lực và khơng có sự thay đổi về trình tự
nucleotide và amino acid so với chủng virus ban đầu thu đƣợc từ mẫu bệnh

àn

h

KT

phẩm. Kết quả phân tích về sinh học phân tử ở đoạn gene nucleocapsid (N),
phosphoprotein (P) và heamagglutinin (H) của chủng virus ZJ7 phân lập đƣợc
thuộc genotpye Asia 1, genotype này hiện đang lƣu hành tại Trung Quốc.

sĩ

2.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care

ng

2.2. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS CARE

án

tiế

n

Morbillivirus là một virus tƣơng đối lớn (đƣờng kính 150 – 250nm) với cấu
trúc xoắn ốc, chúng có một lớp vỏ lipoprotein (Kennedy et al., 1989).
Bảng 2.1. Các virus thuộc giống Morbillivirus và bệnh do chúng gây ra

Lu

ận

Virus
Measles virus (MV)
Rinderpest virus (RPV)

Peste des petits ruminants virus (PPRV)

Bệnh
Bệnh sởi
Dịch tả trâu bò
Bệnh trên động
vật nhai lại nhỏ

Dolphin morbillivirus (DMV)
Porpoise morbillivirus (PMV)
Canine distemper virus (CDV)
Phocine distemper virus (PDV)

Bệnh Care

Vật chủ tự nhiên
Ngƣời
Ngựa, dê, cừu, lợn
Cá heo mỏ
Cá heo
Chó
Chó biển

Ghi chú: DMV và PMV gần đây được xếp vào nhóm virus Morbillivirus trên động vật biển có vú

(cetacean morbillivirus – CMV).

Nguồn: Greene et al. (1998)

Mặc dù có những sự khác biệt nhỏ về kháng nguyên giữa các chủng CDV
khác nhau nhƣng nó thƣờng đƣợc chấp nhận là chỉ có một serotype. Tuy nhiên,
có sự khác biệt đáng kể trong khả năng gây bệnh của các chủng virus phân lập và
các type ở các khu vực địa lý khác nhau đã đƣợc nói tới. Các type của CDV bao
gồm: Asia 1 (Nhật Bản, Trung Quốc), Asia 2 (chỉ có ở Nhật Bản), Bắc Cực, động

7


vật hoang dã châu Âu, USA 1 và 2, CDV cổ điển (Onderstepoort, Convac,
Rockborne và Snyder Hill) (Haas et al., 1997; Haas et al., 1999). Bên cạnh đó,
dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gene mã hóa cho protein H (Lan et al., 2005c;
2006a) đã chia ra thành 5 type virus lớn đƣợc phân lập từ những vùng địa lý khác
nhau: type Châu Âu, cổ điển (Classic type), Asia 1, Asia 2 và USA.
2.2.2. Hình thái của virus Care
Hình thái virus quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi điện tử có hình vịng trịn,
hình bán nguyệt do các sợi cuộn quanh trịn mà thành. Dạng trịn này có đƣờng
kính đo đƣợc 115nm đến 230nm. Màng cuộn kép có độ dày 75 đến 85Ao với bề
mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy et al., 1989).
2.2.3. Cấu trúc của virus Care

Lu

ận

án

tiế

n

sĩ

ng

àn

h

KT

Virus Care khơng phân đoạn, sợi âm tính, sợi đơn, với bộ gene RNA ƣớc
chừng khoảng 15,7 Kb và có vỏ bọc với đƣờng kính có kích thƣớc từ 150 tới 300
nm (Murphy et al., 1999). Virus Care gồm 1 protein không cấu trúc (C) và 6
protein cấu trúc gồm: large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P),
nucleocapsid protein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M) (Diallo, 1990).

Hình 2.1. Cấu trúc của virus Care
Nguồn: Greene et al. (1998)

8


2.2.4. Sức đề kháng của virus Care
Virus Care là một virus không ổn định và nhạy cảm với nhiệt độ, tia UV,
dung mơi hịa tan lipid, chất tẩy rửa và chất ơxy hóa (Grưne et al., 1998) mặc dù

nó có vỏ bọc protein chống lại sự vô hoạt của các tác nhân bên ngồi.
Năm 1954, Celiker và Gillespie đã ni cấy virus sài sốt chó trên mơi
trƣờng phơi trứng để nghiên cứu sự ảnh hƣởng của nhiệt độ đến tính cảm nhiễm
của virus. Kết quả cho thấy virus Care cực kỳ mẫn cảm với sức nóng. Virus bị
phá hủy ở 500C trong 30 phút nhƣng virus có thể tồn tại trong 48 giờ ở 250C và
14 ngày ở 50C (Shen and Gorham, 1980). Ở điều kiện (0-40C), virus có thể tồn

KT

tại trong điều kiện mơi trƣờng trong vịng một tuần. Trong mơ cơ lập nó tồn tại
đƣợc ít nhất một giờ ở 370C và 3 giờ ở 200C (nhiệt độ phịng). Thời tiết ấm áp
virus khơng thể tồn tại lâu trong chuồng ni chó sau khi chó bị bệnh đƣợc

ng

àn

h

chuyển đi.
Thời gian sống và duy trì độc lực của virus sẽ lớn hơn trong điều kiện nhiệt
độ lạnh. Ở nhiệt độ dƣới 00C, nó có thể tồn tại trong mơi trƣờng vài ngày nếu

sĩ

đƣợc bảo vệ bởi các vật liệu hữu cơ. Dƣới nhiệt độ đóng băng virus đƣợc ổn
định. Virus tồn tại đƣợc ở nhiệt độ -650C ít nhất là 7 năm. Việc bảo quản virus

tiế

n

ở dạng đông khô có ý nghĩa rất lớn trong việc bảo quản giống virus, sản xuất
vacxin và nghiên cứu trong phịng thí nghiệm (Greene et al., 2006).

Lu

ận

án

Độ pH: virus ổn định ở pH = 4,5 – 9. Virus bị ảnh hƣởng với pH trên 10,4
hoặc dƣới 4,4 (Greene et al., 2006).
Vỏ bọc của virus rất mẫn cảm với ete, clorofor, fomalin loãng (<0.5%),
phenol (75%), dung dịch amoni. Do vậy, khi dùng những chất này để tiêu độc
chuồng và bệnh viện mang lại hiệu quả cao (Greene et al., 2006).
2.2.5. Cơ chế sinh bệnh
Theo các kết quả nghiên cứu của Appel (1969), Appel (1978), Appel (1987),
Appel and Summers (1995) đã chỉ ra cơ chế sinh bệnh của virus Care gồm:
Virus gây bệnh Care là virus gây nhiễm hƣớng mô lympho, niêm mạc và mô
thần kinh. Đầu tiên, virus nhân lên ở mô lympho của hệ hơ hấp. Sau đó virus
nhiễm vào các dịch bạch huyết rồi vào máu gây bại huyết. Virus tác động đến nội
mạc mạch máu và gây sốt, sốt kéo dài từ 1 - 2 ngày. Virus theo máu vào hệ hơ hấp,
hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống thần kinh trung ƣơng cũng nhƣ dây thần kinh
thị giác. Do sự suy yếu của hệ bạch huyết, hệ thống phòng vệ quan trọng của cơ
thể đã làm suy giảm miễn dịch và tạo điều kiện cho các vi khuẩn nhƣ:

9