Nested pcr bệnh đốm trắng virus ở tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
Khoa Công nghệ Nông nghiệp - Trường Đại học Công nghệ

TIỂU LUẬN HỌC PHẦN SINH HỌC PHÂN TỬ
CHẨN ĐỐN BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TƠM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NESTED PCR

Sinh viên thực hiện:

Nghiêm Thị Huế

MSSV:

19021558

Lớp:

K64-AG

Giảng viên hướng dẫn:

TS Lê Thị Hiên

Hà Nội, tháng 10, năm 2022

1


Mục lục
I Kỹ thuật ứng dụng..............................................................................................3
II Bệnh đốm trắng ở tôm (White Spot Disease in shrimp)...................................3

1 Nguyên nhân gây bệnh đốm trắng ở tôm........................................................3
2 Biểu hiện bệnh đốm trắng ở tơm....................................................................4
3 Biện pháp chẩn đốn.......................................................................................4
III Phương pháp Nested PCR...............................................................................5
1 Ngun lý của kỹ thuật Nested PCR..............................................................5
2 Kết quả............................................................................................................6
3. Ưu điểm khi sử dụng Nested PCR xác định bệnh đốm trắng ở tôm.................7
IV Tài liệu tham khảo...........................................................................................8

2


I Kỹ thuật ứng dụng
- Kỹ thuật: Nested PCR (Polymerase chain reaction).
- Đối tượng ứng dụng: Tôm.
- Lĩnh vực: Chẩn đốn bệnh đốm trắng trên tơm.
II Bệnh đốm trắng ở tôm (White Spot Disease in shrimp)
Nghề nuôi tôm tại Việt Nam hiện đang phát triển mạnh, góp phần quan
trọng trong việc tạo việc làm, nâng cao thu nhập cho người dân, đảm bảo an
ninh lương thực, và xuất khẩu thu được nguồn ngoại tệ lớn. Tuy nhiên ô nhiễm
môi trường, dịch bệnh đã đe dọa đến sự phát triển bền vững, gây tổn hại nghiêm
trọng về mặt kinh tế. Bệnh đốm trắng (WSD) là một trong những bệnh phổ biến
trên tôm hiện nay. Đặc biệt virus gây bệnh đốm trắng (WSSV), là một trong
những nhóm tác nhân virus gây tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi tôm.
1 Nguyên nhân gây bệnh đốm trắng ở tơm
Có ba ngun nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm: bệnh do virus, do vi
khuẩn hoặc do môi trường [3].
+ Do vi khuẩn: Liên quan đến một số vi khuẩn thuộc nhóm Bacillaceae,
vi khuẩn gây hội chứng đốm trắng (Bacterial White spot syndrome - BWSS).
+ Do môi trường: Do độ cứng của nước cao, tôm hấp thụ quá nhiều Ca 2+,

Mg2+ làm xuất hiện trên vỏ nhứng đốm trắng. Nước ao cứng có thể do dùng quá
nhiều vôi trong khâu cải tạo ao.
+ Do virus: Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus WSSV) thuộc họ virus mới có tên gọi Nimaviridae, chi Whispovirus [4]. Virus
hình trứng, hay ovan, đường kính 80-120nm, dài khoảng 250-380nm, có đi,
vật chất di truyền là DNA [4]. Virus ký sinh chủ yếu trên mang, chân bơi, đuôi,
giáp đầu ngực, máu và cơ bụng của tôm [4]. Bệnh xảy ra trên các lồi tơm thuộc
họ tơm he (Penaeidae): tơm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng
(P.vannamel), tôm rảo (P.merguensis) [4]. Ngồi ra các lồi tơm càng xanh, tơm
đất, cua, ghẹ, một số loài giáp xác phù du như Artemia, Copepoda cũng có thể
mang bệnh. Bệnh xảy trên cả tơm nước mặn, nước lợ, trên hầu hết các giai đoạn
phát triển của tôm, đặc biệt khi thời tiết biến đổi nhiều như thay đổi độ mặn,
thay đổi nhiệt trong ngày quá lớn gây sốc cho tơm. Virus có thể lây lan theo
chiều ngang từ cá thể khỏe sang cá thể bị nhiễm trong cùng ao hoặc do tơm có
3


ăn thức ăn có mầm bệnh; hoặc qua các vật chủ trung gian như tôm tự nhiên,
cua,ghẹ,động vật phù du mang mầm bệnh [4].
2 Biểu hiện bệnh đốm trắng ở tơm
- Bệnh do mơi trường[3]: Tơm có đốm trắng ở vỏ đầu ngực, vỏ sống lưng.
Tơm khơng có biểu hiện tấp bờ, tơm vẫn khỏe, ăn bình thường, nhưng chu kỳ
lột xác dài hơn bình thường, tơm sinh trưởng chậm hơn.
- Bệnh do vi khuẩn[3]: Tôm lột vỏ chậm, chậm lớn, chết rải rác, hầu hết
tơm bị đóng rong, mang đen. Tơm bệnh có các đốm trắng mờ đục trên khắp cơ
thể, các đốm trắng có thể mất khi lột vỏ. Soi kính hiển vi thấy có đốm trắng
dạng lan tỏa tương tự hình địa y bạc màu ở giữa rỗng. Các đốm trắng chỉ ở vỏ
tôm, không ảnh hưởng đến thịt tôm và các bộ phận bên trong.
- Bệnh do virus[4]: Tôm bệnh giảm ăn rõ rệt, đôi khi tơm cũng tăng cường
bắt mồi hơn bình thường, sau vài thì ngày bỏ ăn; tơm dạt bờ, lờ đờ. Tơm bệnh
xuất hiện các đốm trắng trịn đường kính 0.5-2mm dưới lớp vỏ kitin đặc biệt là

vùng đầu ngực và đốt bụng cuối cùng, những đốm này nằm trong vỏ, và không
thể loại bỏ bằng việc chà xát. Trong trường hợp cấp tính, tơm bệnh chuyển sang
màu hồng đỏ. Tơm bệnh chết nhanh, tỷ lệ chết lên đến 90-100% trong 3-7
ngày.

Hình 2.1: Vỏ giáp đầu ngực của tôm bị đốm trắng nguồn cơng ty cổ phần UV[5]
3 Biện pháp chẩn đốn
Ở Việt Nam bệnh đốm trắng đã bùng phát mạnh, lây lan nhanh, nhất là ở
các vùng nuôi tôm trọng điểm và chưa có phương pháp đặc trị hữu hiệu. Do tỷ
lệ chết của tôm đạt tỷ lệ chết rất cao sau thời gian ngắn khi bắt đầu nhiễm, nên
việc kiểm tra và phát hiện sớm bệnh để kịp thời có các biện pháp nhằm giảm
thiệt hại cho người nuôi tôm. Dựa vào các biểu hiện bệnh như đã nêu ở phần 2,
4


bằng mắt thường có thể dễ dàng nhận biết bệnh do môi trường, tuy nhiên bệnh
đốm trắng do virus và vi khuẩn lại có biểu hiện khá giống nhau. Đốm trắng do
virus dễ nhận ra khi tôm sống, do vi khuẩn khó nhận biết hơn, chỉ quan sát được
khi tơm đã lột. Vấn đề đặt ra là phải có cách để phát hiện tác nhân bệnh trong
thời gian ngắn nhất. Hiện nay các kỹ thuật trong phịng thí nghiệm như kỹ thuật
mô học, phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một trong những biện pháp hữu
hiệu, đáng tin cậy giúp phát hiện mầm bệnh trong giai đoạn sớm nhất. Trong đó
phương pháp Nested PCR xác định chính xác bệnh đốm trắng trên tôm trong
thời gian ngắn.
III Phương pháp Nested PCR
Phương pháp Nested PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương
pháp chẩn đốn nhanh, chính xác bệnh đốm trắng ở tơm do virus trong thời gian
ngắn.
Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR là dựa trên việc sử dụng khả năng của
enzyme Taq DNA polymerase để tổng hợp chuỗi ADN mới từ chuỗi ADN ban

đầu được cung cấp.
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt gồm các bước:
1 - Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94-96oC, các liên kết
hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn.
2 - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 50 - 60 oC, các đoạn mồi
sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.
3 - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ
sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung.
Chu kỳ nhiệt lặp lại liên tục 30 - 35 lần, DNA Polimerase tổng hợp với
tốc độ 1000Nu/p.
1 Nguyên lý của kỹ thuật Nested PCR
Kỹ thuật này cũng dựa trên nguyên lý chung cuả kỹ thuật PCR nhưng
hồn thiện hơn về hoạt tính enzyme được sử dụng và thiết kế 2 cặp đoạn mồi
đặc hiệu hơn[2]. Phương pháp Nested PCR sử dụng cặp mồi 146F1/146R1 và
146F2/146R2 để phát hiện virus đốm trắng [4].
Đặc biệt hơn PCR là nested PCR bao gồm liên tiếp 2 phản ứng PCR, sử
dụng 2 cặp đoạn mồi đặc hiệu cho 2 phản ứng liên tiếp này [4]. Giai đoạn 1 thực
hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 146F1/146R1 để khuếch đại 1 vùng DNA,
trong đó có chứa DNA mong muốn, tăng số lượng DNA chứa trình tự đích [4].
5


Giai đoạn 2 thực hiện phản ứng Nested sử dụng cặp mồi 146F2/146R2, sản
phẩm của giai đoạn 1 trên được dùng cho phản ứng PCR với cặp đoạn mồi thứ
hai đặc hiệu cho đoạn DNA mong muốn, để phát hiện trình tự đích [4]. Kỹ thuật
này ưu tiên sử dụng khi trình tự đích có độ nhạy kém.
Lưu ý trước khi chạy phản ứng Nested PCR cần chuẩn bị mẫu phân tích,
tách chiết DNA. Lượng mẫu cần chuẩn bị là khoảng 30mg, nếu mẫu là tơm
giống, ấu trùng thì sử dụng nguyên con, nếu mẫu là tôm bố mẹ, tôm thịt thì lấy
phần mang, chân bơi, đi, giáp đầu ngực, máu, cơ bụng được nghiền nhuyễn

với tỷ lệ 1 thẻ tích mẫu trong 9 thể tích dung dịch muối đệm[4]. Sau khi tiến hành
phản ứng Nested PCR sẽ cho chạy điện di ở hiệu điện thế 100V, trong thời gian
không quá 25 phút, sau đó đọc kết quả [4].
2 Kết quả
Sau khi điện di, ta đọc kết quả trên máy đọc gel:
- Kết quả mẫu thử dương tính với WSSV khi tại thang mẫu thử xuất hiện
vạch sáng có kích thước 941bp, thang chuẩn DNA phân vạch rõ ràng[4].
Nếu kết quả dương tính với MSSV, tơm mắc bệnh đốm trắng do virus.
Hiện nay vẫn chưa có thuốc điều trị bệnh do virus gây ra. Với ao tôm bệnh, vớt
tôm chết ra khỏi ao nuôi, đem đi tiêu hủy, dùng Chlorin 30ppm (30kg/1000m 3)
phun xuống toàn bộ ao, giữ nước ao trong 7-10 ngày rồi xả nước [1]. Khi phát
hiện tôm bệnh do virus tốt nhất nên thu hoạch ngay. Biện pháp phịng bệnh chủ
yếu phải xét nghiệm tơm giống bố mẹ sạch bệnh, chọn vụ ni thích hợp, hạn
chế thả vào mùa lạnh, nguồn nước phải qua lắng lọc trước khi đưa vào ao nuôi,
quản lý chặt môi trường ao ni.
- Kết quả mẫu thử âm tính khi tại giếng mẫu thử khơng xuất hiện vạch
sáng do khơng có sản phẩm khuyếch đại, thang chuẩn DNA phân vạch rõ
ràng[4].
Nếu kết quả phân tích là âm tính với MSSV có thể tôm mắc bệnh do vi
khuẩn hoặc môi trường. Nếu tôm mắc bệnh do mơi trường thì cần tránh bón vơi
q nhiều khi vệ sinh ao, thay nước cuối vụ, bổ sung khống chất, cho ăn đủ
dinh dưỡng để kích thích lột xác tránh việc tôm bị đốm trắng [1]. Nếu tơm mắc
bệnh do vi khuẩn, cần kiểm sốt kỹ mơi trường ao nuôi, cải thiện môi trường ao
nuôi, xử lý nước, chất thải, giảm tảo, tăng cường bổ sung vitamin C, khống
chất, thuốc bổ gan vào thức ăn cho tơm để nâng cao sức đề kháng[4].

6


3. Ưu điểm khi sử dụng Nested PCR xác định bệnh đốm trắng ở tơm

Hiện nay có nhiều phương pháp để xác định bệnh đốm trắng ở tôm như
kit test nhanh, PCR, ELISA,… Phương pháp dùng kit test nhanh có thể dùng cả
trên tôm giống và tôm thương phẩm; tuy nhiên lượng tơm mẫu dùng kiểm tra
nhỏ nên có thể khơng đại diện được tình trạng bệnh trong ao [2]. PCR cho phép
xác định mầm bệnh gây ra trong thời gian ngắn, giúp người ni có thể đưa ra
các biện pháp can thiệp kịp thời nhằm hạn chế thấp nhất thiệt hại do bệnh gây
ra, đặc biệt là bệnh do WSSV. Tuy nhiên kỹ thuật PCR đòi hỏi người làm có kỹ
thuật chun mơn cao, dễ bị tạp nhiễm gây dương tính giả, độ nhạy cịn thấp,
chưa xác định được mật độ cảm nhiễm của mầm bệnh.Vì vậy các nhà nghiên
cứu đã không ngừng cải tiến kỹ thuật, đưa ra quy trình hồn thiện hơn, điển
hình như Nested PCR.
Nested PCR là 1 kỹ thuật PCR đã được cải tiến cho phép xác định được
sự hiện diện của mầm bệnh, dù số lượng rất nhỏ [2][4]. Nested PCR làm giảm sai
lệch kết quả PCR trong trường hợp mồi không gắn vào DNA khi có sự tạp
nhiễm[2]. Do kỹ thuật này có sự hồn thiện hơn về hoạt tính của enzyme; sử
dụng 2 bộ mồi đặc hiệu hơn, mồi 1 sẽ bắt cặp DNA tổng hợp thành mạch mới,
mồi 2 sẽ bắt cặp với mạch mới vừa tổng hợp (sản phẩm PCR đầu tiên) để tổng
hợp mạch mới đúng như ý muốn[4]. Nested PCR thường thành công hơn phản
ứng PCR thông thường đặc biệt trong trường hợp khuyếch đại các DNA dài[2].

7


IV Tài liệu tham khảo
[1] “Bệnh đốm trắng gây ra do virus, truy cập ngày 10/10/2022.
[2] Duy Hồ, 18/11/2020, Chẩn đoán nhanh, hiệu quả bệnh đốm trắng bằng
phương pháp Nested PCR , Tepbac, />truy cập ngày 10/10/2022.
[3] Lê Cung, ‘Tác nhân gây đốm trắng trên tôm nuôi, 06/07/2020, truy cập ngày
10/10/2022, />%A9ng%20%C4%91%E1%BB%91m,t%E1%BA%BF%20b%C3%A0o%20bi
%E1%BB%83u%20m%C3%B4%20da, truy cập ngày 10/10/2022.

[4] TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 8710-3:2019 Bệnh thủy sản - Quy trình
chẩn đốn - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm, truy cập ngày 10/10/2022.
[5] Trần Việt Tiên, 03/06/2019, UV-Vietnam, Phân biệt bệnh đốm trắng trên
tôm do virus, vi khuẩn và môi trường, />truy
cập
ngày
10/10/2022.

8