Báo cáo thực hành công nghệ lên men đh nông lâm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐẠO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HĨA HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CƠNG NGHỆ LÊN MEN
GVHD: TS.
Nhóm thực hiện: Nhóm 1 (Ngày 05/12, 12/11 và 13/12)

Thành phố Hồ Chí Minh, 01/2021
1


DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM 1

2


MỤC LỤC

MỤC LỤC.................................................................................................................................... 3
Bài 1: Chuẩn bị môi trường, phân lập và định lượng nấm men.....................................................1
1. Mục đích............................................................................................................................. 1
2. Nguyên liệu, trang thiết bị, dụng cụ....................................................................................1
3. Nội dung thực hành.............................................................................................................1
4. Kết quả và nhận xét............................................................................................................. 6
5. Trả lời câu hỏi:.................................................................................................................... 9
Bài 2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên động học sinh trưởng của nấm men trong q
trình ni cấy mẻ......................................................................................................................... 10
1. Mục đích........................................................................................................................... 10

2. Nguyên liệu, dụng cụ, trang thiết bị..................................................................................10
3. Nội dung thực hành...........................................................................................................11
4. Kết quả và nhận xét:..........................................................................................................12
5. Trả lời câu hỏi................................................................................................................... 24

3


Mục lục hình ảnh

Hình 1: Đo OD mẫu trắng cho men 0h.......................................................................................14
Hình 2: Đo OD mẫu trắng khơng cho men 4h............................................................................15
Hình 3 Đo OD mẫu trắng khơng cho men 6h.........................................................................15
Hình 4 Đo OD mẫu trắng khơng cho men 23h.......................................................................16
Hình 5 Đo OD mẫu trắng không cho men 25h...........................................................................16

4


Bài 1: Chuẩn bị môi trường, phân lập và định lượng nấm men
1. Mục đích
-

Chuẩn bị mơi trường thạch đĩa để phân lập và môi trường thạch nghiêng để giữ giống

-

Phân lập giống vi sinh vật thuần khiết (nấm men)

-

Định lượng mẫu vi sinh vật thuần khiết

-

Bảo quản mẫu vi sinh vật thuần khiết

2. Nguyên liệu, trang thiết bị, dụng cụ
Nấm men bánh mì

Nồi hấp (autoclave)

Glucose

Tủ (buồng) cấy vơ trùng

Peptone

Tủ ấm (incubator)

NaCl

Cân 4 số lẻ

KH2PO4

Máy đo pH

MgSO4.7H2O

Kính hiển vi

Cồn 95, 70

Buồng đếm tế bào

HCl 0.1N

Que trang (que trải)

Agar, nước cất

Đĩa petri

Methylen blue

Micropipette (100-1000l) + tip

Bút marker

Micropipette (20-200l) + tip

Ống nghiệm

Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer)
1


Cốc thủy tinh 100 ml

Bình tam giác 250 ml

Bình định mức 100 ml

Đèn cồn, giấy vệ sinh, giấy nhôm, bao tay, bút

marker

3. Nội dung thực hành


Mỗi buổi thực hành chia làm 2 nhóm, mỗi nhóm khoảng 12-13 SV.



Dụng cụ mỗi nhóm: 1 cốc thủy tinh 250 ml, 1 bình tam giác 250 ml, 2 ống

nghiệm nút bông, 6 ống nghiệm pha loãng, 3 đĩa petri, 1 cá từ, 2 nút bông cho 2 ống nghiệm.


Chuẩn bị giống vsv và môi trường

Mỗi nhóm cân 2 mẫu nấm men bánh mì, mỗi mẫu 0.02 g, 1 mẫu pha loãng phân lập nấm
men, 1 mẫu pha lỗng đếm trực tiếp trên kính hiển vi.
Nhóm 1 pha 100 ml dung dịch HCl 0.1N dùng chung cho vào chai đựng bằng thủy tinh và
600 ml cồn 70 cho vào bình phun sương và bình vịi. Nhóm 2 pha 100 ml nước muối peptone
dùng chung (SPW, saline peptone water)(8.5 g/l NaCl, 1.0 g/l peptone, 100 ml nước cất cho
vào cốc thủy tinh 250 ml và khuấy đều bằng cá từ trong 15 phút, sau đó cho vào 3 ống nghiệm
đem đi hấp khử trùng đánh số 1, 2, 3 theo thứ tự 4.98 ml (ứng với độ pha loãng 10-2), 4.95 ml
(ứng với độ pha loãng 10-4), 4.5 ml (ứng với độ pha loãng 10-5 và 3 ống nghiệm không đem đi

hấp khử trùng để pha loãng đếm nấm men đánh dấu 1b, 2b, 3b theo thứ tự 4.98 ml (ứng với
độ pha loãng 10-2), 4.95 ml (ứng với độ pha loãng 10-4), 4.5 ml (ứng với độ pha lỗng 10-5). Phần
nước muối peptone cịn lại cho vào chai nhựa đựng nước muối đã rửa sạch. Bọc đầu mỗi ống
nghiệm đem đi hấp bằng 2 lớp giấy nhôm và bọc đầu mỗi ống nghiệm không đem đi hấp bằng 1
lớp giấy nhôm. Cho 12 ml nước cất vào các ống nghiệm đổ thạch nghiêng, dùng bút marker
đánh dấu mực nước trên ống nghiệm để đổ môi trường thạch nghiêng xong rồi đổ nước đi, gắn
nút bông vào, bọc đầu ống nghiệm có nút bơng bằng hai lớp giấy nhơm.
Pha 150 ml mơi trường thạch Hansen (nhóm 1 và nhóm 2): 50 g/l glucose, 10 g/l peptone,
3.0 g/l KH2PO4, 2.0 g/l MgSO4.7H2O, 24 g/l agar và 140 ml nước cất cho vào bình tam giác 250
2


ml. Khuấy đều bằng cá từ ít nhất 15 phút, điều chỉnh pH 5 ở nhiệt độ phòng bằng HCl 0.1N.
Cho nước cất vừa đủ 150 ml, bọc đầu bình tam giác chứa môi trường bằng hai lớp giấy nhôm.

 Tiệt trùng môi trường
Cho vào nồi hấp tiệt trùng 2 bình tam giác chứa mơi trường thạch Hansen bọc đầu bằng giấy
nhôm, 6 ống nghiệm chứa SPW bọc đầu bằng giấy nhơm, 4 ống nghiệm có nút bơng bọc đầu
bằng giấy nhôm, 6 đĩa petri bọc bằng giấy nhôm, 1 hộp chứa pipet tip màu xanh (100-1000 l)
bọc bằng giấy nhôm, 1 hộp chứa pipet tip màu vàng (20-200 l) bọc bằng giấy nhôm ở 121C
trong 15 phút.

 Chuẩn bị tủ cấy trước khi đổ môi trường và cấy vsv
Xịt cồn 70 vào trong buồng cấy và lau sạch buồng cấy, sau đó thắp hai đèn cồn (chứa cồn
96) để khử trùng buồng cấy ít nhất 30 phút.



Chuẩn bị mơi trường thạch nghiêng và thạch hộp petri

Ghi tên nhóm và ngày làm TN lên ống nghiệm có nút bơng và hộp petri, ghi đĩa đối
chứng và đĩa tỉ lệ pha loãng 10-4, 10-5 lên hộp petri. Lắc nhẹ và đổ mơi trường cịn ấm trong
bình tam giác vào ống nghiệm có nút bơng đã tiệt trùng bên ngọn lửa đèn cồn, đậy nút bông lại
rồi để đầu ống nghiệm nằm trên mép khay melanin để nguội tạo môi trường thạch nghiêng. Đổ
môi trường thạch hộp petri: hé nắp hộp petri, đổ nhanh mơi trường thạch cịn ấm vào với độ dày
môi trường khoảng 3 mm, đậy nắp hộp lại và để yên đến khi môi trường nguội và đông đặc lại.



Pha loãng và phân lập nấm men

Cho 0.02 g nấm men vào ống nghiệm 1 chứa 4.98 ml SPW (tỉ lệ pha loãng 10-2) rồi lắc
đều bằng máy lắc ống nghiệm. Cho 50 l dung dịch trong ống nghiệm 1 vào ống nghiệm 2 chứa
3


4.95 ml SPW rồi lắc đều (tỉ lệ pha loãng 10 -4). Cho 500 l dung dịch trong ống nghiệm 2 vào
ống nghiệm 3 chứa 4.5 ml SPW rồi lắc đều (tỉ lệ pha loãng 10 -5). Nhúng đầu que trải vào cốc
100 ml chứa cồn 95, hơ qua ngọn lửa để khử trùng, để đầu que trải nguội trong không gian vô
trùng của ngọn lửa đèn cồn. Cho 15 l các dung dịch sau khi pha loãng (10-4 và 10-5) vào các
hộp môi trường thạch, dùng que trải xoay sang phải kết hợp xoay đĩa sang trái để trải đều dung
dịch lên bề mặt thạch. Mỗi nhóm trải 1 đĩa petri 10-4, 1 đĩa petri 10-5, và một đĩa không trải
để đối chứng. Bao đĩa petri bằng màng bọc thực phẩm. Úp ngược các hộp petri để ở nhiệt độ
phòng trong 18-48 h. Sau khi quan sát thấy các khuẩn lạc mọc trên thạch hộp petri, chọn 1
khuẩn lạc đơn có hình thái giống như nấm men để cấy chuyền sang các ống thạch nghiêng, ủ ở
nhiệt độ phòng (28-30C) trong 18-48 h cho lên các khuẩn lạc và giữ giống trong tủ mát ở 4C.

 Định lượng nấm men
+ Đếm trực tiếp (tế bào/g hoặc tế bào/ml): mật độ vsv đơn bào có kích thước lớn như nấm
men có thể xác định trực tiếp bằng buồng đếm trên kính hiển vi.

Đếm ở vùng
giữa buồng đếm
có 25 ơ lớn x 16

4


Nguyên tắc đếm trực tiếp bằng buồng đếm neubauer thủy tinh tráng bạc:


Pha loãng huyền phù tế bào vsv (10-4, 10-5

hoặc 10-6)
sao cho trong mỗi ô lớn 16 ô nhỏ chỉ từ 10 - 50
tế bào.
Nhỏ 2 giọt xanh methylen vào dung dịch đã pha lỗng.


Một buồng đếm hình vng diện tích 1 mm2 có 25 ơ vng lớn, mỗi ô vuông lớn

chia thành 16 ô vuông nhỏ, như vậy buồng đếm có tổng cộng có 400 ơ vng nhỏ. Độ sâu
của buồng đếm 0,1 mm. Diện tích một ơ lớn 0,04 mm2, thể tích ơ lớn 0,004 mm3.


Rửa sạch buồng đếm và lá kính bằng cồn 70 và nước cất rồi thấm khô bằng khăn

giấy hoặc giấy vệ sinh. Lắc mạnh dịch huyền phù đã pha loãng, dùng micropipet để hút 20 l
dịch huyền phù đã pha loãng nhỏ vào buồng đếm, đậy lá kính để dịch huyền phù tràn đầy
các khoang đếm, sau đó đưa lên kính hiển vi để đếm (dùng vật kính 4 để tìm buồng đếm

sau đó chuyển sang vật kính 40 để đếm).


Đếm số lượng tế bào trong các ô theo đường chéo hoặc theo các góc và trung tâm.

Với các tế bào ở ranh giới giữa 2 ơ lớn thì quy ước đếm các tế bào ở cạnh trên và bên trái ơ
đó. Đếm 5 ơ lớn rồi lấy số lượng trung bình. Chụp ảnh nấm men có trong buồng đếm
bằng camera. Đếm số lượng tế bào chết là tế bào thấm màu xanh đậm của thuốc
nhuộm.

5


Đếm số tế bào trong 5 ơ khoanh trịn
nằm trong ô này: a + b + c + d + e



Số tế bào: N = A  25 : V : n (tế bào/ml), trong đó
N: số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù
A: số tế bào trung bình trong 1 ơ lớn
V: thể tích buồng đếm (0,1  10-6 ml)
25: số ô lớn trong buồng đếm
n: độ pha lỗng mẫu

Từ đó tính ra tổng số tế bào và tỉ lệ tế bào sống/chết có trong 1 g mẫu men bánh mì (tế bào/g
mẫu) ban đầu.
+ Đếm khuẩn lạc (Colony Forming Unit-CFU): đếm tất cả số các khuẩn lạc xuất hiện trên
các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 đến 250 để tính kết quả. Tính số lượng tế bào
(đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 g hay 1 ml cơ chất ban đầu tạo dịch huyền phù:

N = A : V : Df (CFU/ml)
A: số CFU trung bình trên mỗi đĩa petri ở độ pha loãng nhất định
6


V: thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa petri
Df: độ pha lỗng mẫu
Từ đó tính ra số tế bào có trong 1 g mẫu men bánh mì (tế bào/g mẫu) ban đầu.
Ví dụ: Phân lập 0,05 ml dịch huyền phù đất ở độ pha loãng 10 -6, ta đếm được trung bình có
45 CFU/đĩa petri. N = (45/0,05)/10-6 = 9  108 (CFU/ml)
Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa >250, ví dụ ở nồng độ 10 -5 số
đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi >2,5 × 107 CFU/g.
Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa <25, ví dụ ở nồng độ 10 -1 số
đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi <2,5 × 102 CFU/g.

4. Kết quả và nhận xét
Ống thạch nghiêng và đĩa petri sau khi phân lập và ủ cho mọc khuẩn lạc:
Hình ảnh ống thạch nghiêng và đĩa petri sau khi phân lập và ủ cho mọc khuẩn lạc

Hình. Đĩa petri trước khi phân lập và ủ cho mọc khuẩn lạc

7


Hình. Đĩa petri sau khi phân lập và ủ cho mọc khuẩn lạc với độ pha lỗng 10-4

Hình. Đĩa petri sau khi phân lập và ủ cho mọc khuẩn lạc với độ pha loãng 10-5

8

Hình Ống thạch nghiêng sau khi phân lập và ủ cho mọc khuẩn lạc
Mơ tả hình thái của khuẩn lạc nấm men bánh mì phân lập được và xác định tên chủng
nấm men.


Mơ tả hình thái:

Saccharomyces cerevisiae là một lồi nấm
men được biết đến nhiều nhất có trong bánh
mì nên thường gọi là men bánh mì là một loại
vi sinh vật thuộc chi Saccharomyces lớp
Ascomycetes ngành nấm. Saccharomyces
cerevisiae là một trong những loài sinh vật
nhân chuẩn được khoa học dùng nhiều nhất.
9


Tế bào nấm men có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thuớc nhỏ, từ 5-6 đến 10-14
µm, sinh sản bằng cách nảy chồi và bào tử. Nguồn dinh dưỡng chủ yếu là sử dụng
glucose, galactose, saccharose, maltose như nguồn cacbon, chúng sử dụng axit amin và
muối amon như nguồn nitơ. Nhiệt độ hoạt động: từ 28 – 30oC. pH hoạt động của chủng
Saccharomyces Cerevisiae này: 4.5 – 5.5.


Xác định tên chủng nấm men:

Phân loại khoa học
Giới (regnum)

Fungi

Ngành (phylum)

Ascomycota

Phân ngành(subphylum)

Saccharomycotina

Lớp (class)

Saccharomycetes

Bộ (ordo)

Saccharomycetales

Họ (familia)

Saccharomycetaceae

Chi (genus)

Saccharomyces

Loài (species)

S. cerevisiae

5. Trả lời câu hỏi:
-

Nêu ưu, nhược điểm của phương pháp đếm tế bào vsv bằng cách dùng buồng đếm trên
kính hiển vi và phương pháp đếm khuẩn lạc:
10


Ưu, nhược điểm của phương pháp đếm tế bào vsv bằng cách dùng buồng đếm trên kính
hiển vi
Ưu điểm
 Đếm được vi sinh vật có kích thước lớn,
như nấm men, tảo
 Đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính
hiển vi nhờ buồng đếm hồng cầu
 Xác định nhanh chóng mật độ vi sinh
vật chứa trong mẫu

Nhược điểm
 Không phân biệt tế bào sống chết.
 Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các
cá thể khác trong mẫu, khó đạt được độ
chính xác cao
 Khơng phù hợp với huyền phù vi sinh
vật mật độ thấp

Ưu, nhược điểm của phương pháp đếm tế bào vsv bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Ưu điểm
 Cho phép xác định số tế bào sống
 Định lượng chọn lọc vi sinh vật

Nhược điểm
 Không định lượng được những vi sinh
vật quá nhạy nhiệt
 Không xát định được hình dạng khuẩn
lạc nhất định
 Khó làm thuần một dịng vi sinh vật

Bài 2: Ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng lên động học sinh
trưởng của nấm men trong q trình ni cấy mẻ
1. Mục đích
-

Vẽ đồ thị động học sinh trưởng của nấm men theo thời gian nuôi cấy mẻ ở các môi

trường dinh dưỡng khác nhau.
-

Xác định tỉ lệ tăng trưởng của nấm men trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau.

-

Đo độ đục OD (optical density) và đếm tổng số tế bào trong môi trường nuôi cấy, lập mối

liên hệ giữa OD và tổng số tế bào đếm được.

11


Hình 2.1 Đường cong sinh trưởng của nấm men

6. Nguyên liệu, dụng cụ, trang thiết bị
Đĩa petri chứa khuẩn lạc nấm men

Máy đo quang phổ, máy đo pH

Giá đậu (200g)

Micropipet 100-1000 l + tip

Glucose

Tủ (buồng) cấy vô trùng

Đường cát

Buồng đếm tế bào

Peptone

Que cấy có đầu cấy vịng

NaCl

Máy lắc bình tam giác

KH2PO4

Bình tam giác 250 ml

MgSO4.7H2O

Cốc thủy tinh 250 ml, 1000 ml

HCl 0.1N

Cuvet nhựa 1,5 ml

Nước cất

Rây lọc, vải lọc, giấy vệ sinh, bao tay

latex
12


Cồn 95, 70

Đèn cồn

7. Nội dung thực hành
 Dụng cụ cho mỗi nhóm: 1 cốc thủy tinh 250 ml, 2 bình tam giác 250 ml có nút bơng, 1 cá
từ, 2 cuvet bằng nhựa
 Chuẩn bị môi trường lỏng để nhân giống nấm men
Nhóm 1: Pha 100 ml mơi trường Hansen lỏng: 50 g/l glucose, 10 g/l peptone, 3.0 g/l
KH2PO4, 2.0 g/l MgSO4.7H2O và 90 ml nước cất cho vào cốc thủy tinh 250 ml. Khuấy đều
bằng cá từ, điều chỉnh pH 5 ớ nhiệt độ phòng bằng HCl 0.1N. Cho nước cất vừa đủ 100 ml
rồi chia vào 2 bình tam giác 250 ml mỗi bình 50 ml. Gắn nút bơng và bọc đầu bình tam
giác chứa mơi trường bằng giấy nhơm, tiệt trùng ở 121C trong 15 phút.
Nhóm 2: Pha nước chiết giá đậu. Cân 100 g giá đậu, cắt nhỏ, cho 150 ml nước vào đun

sôi nhỏ lửa 30 phút. Lọc lấy dịch trong, để nguội, điều chỉnh pH 5, bổ sung nước cất đến
1000 ml. Pha 100ml nước chiết giá đậu có bổ sung đường cát (saccharose) 160 g/l, chia vào
2 bình tam giác 250 ml mỗi bình 50 ml. Gắn nút bơng và bọc đầu bình tam giác chứa mơi
trường bằng giấy nhơm, tiệt trùng ở 121C trong 15 phút.

 Cấy nấm men giống vào môi trường và nhân giống cấp 1
Rửa sạch que cấy có đầu cấy vịng, nhúng đầu que cấy vào cốc chứa cồn 95 rồi tiệt
trùng đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội đầu que cấy trong vùng vô trùng trong tủ
cấy, dùng đầu que cấy lấy 1~2 khuẩn lạc nấm men phân lập trên đĩa petri hoặc 0.005 g nấm
men cho vào 50 ml môi trường lỏng tiệt trùng (môi trường Hansen, môi trường dịch chiết giá
đậu) trong bình tam giác, lắc đều.

13


 Khảo sát động học sinh trưởng của nấm men
Nhân giống nấm men trong các bình tam giác ở nhiệt độ phòng kết hợp với lắc khoảng 1
phút với chu kỳ 5 phút lắc 1 lần. Chụp ảnh môi trường trong hai bình tam giác trước khi
lấy mơi trường đo OD và đếm nấm men. Dùng micropipet hút 1.4 ml mơi trường trong 2
bình tam giác trước khi cấy nấm men và sau khi cấy nấm men 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 23 h, 25
h cho vào cuvet, đo OD (optical density) ở bước sóng 600 nm rồi đổ môi trường trong
cuvet vào ống nghiệm, cho 1 giọt xanh methylen vào rồi đếm số lượng nấm men có trong
mơi trường bằng buồng đếm trên kính hiển vi. Nếu số lượng nấm men trong mẫu trên
buồng đếm quá nhiều có thể pha lỗng mẫu với tỉ lệ thích hợp rồi đếm lại.

8. Kết quả và nhận xét:
a. Khảo sát động học sinh trường của nấm men:
Nhân giống nấm men trong các bình tam giác lắc ở nhiệt dộ phịng (30oC). Dùng
micropipette hút 1ml mơi trường trong 1 bình tam giác trước khi cấy nấm men (0h) và sau khi
cấy nấm men 0h, 2h, 4h, 6h, 23h, 25h cho vào cuvet, đo OD (optical density) ở bước song 600

nm rồi đếm trực tiếp số lượng nấm men có trong mơi trường bằng buồng đếm trên kính hiển vi.

THỜI GIAN
(giờ)
0
2
4
6
23
25

MT HANSEN
(Abs)
0.156
0.161
0.287
0.522
1.141
1.127
14

MT GIÁ (Abs)

TRUNG BÌNH

0.099
0.117
0.205
0.679
1.229

2.234

0.1275
0.139
0.246
0.6005
1.185
1.6805


 Đồ thị động học sinh trưởng của nấm men theo thời gian nuôi cấy mẻ:

MT HANSEN (Abs)

MT GIÁ (Abs)

TRUNG BÌNH

b.

2.5000

2.0000

Abs

1.5000

1.0000

0.5000

0.0000

0

5

10

15

20

25

30

THỜI GIAN

Thiết lập mối liên hệ giữa OD và số lượng tế bào nấm men theo thời gian nhân
giống
Môi trường Giá:

Thời gian (giờ)

Số lượng tế bào

OD

đếm

Số lượng tế
bào đếm thực
tế

Mẫu trắng

0.097

0

0

0

0.099

10

10

2

0.117

32

32

4

0.205

49

49

6 (pha loãng 2 lần)

0.679

77

154

23 (pha loãng 4 lần)

1.229

131

524

15


25 (pha loãng 6 lần)

2.234

156

936

Bảng 1 : Bảng số liệu của mẫu môi trường Giá đỗ

 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa OD và số lượng tế bào nấm men theo thời gian
Đồ thị môi trường Giá

Bảng 2: Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa OD và số lượng tế bào nấm men theo thời gian(MT
giá)
Môi trường hasen
Thời gian (h)
Mẫu trắng
0
2
4
6 (pha loãng 2 lần)
23 (pha loãng 4 lần)
25 (pha loãng 6 lần)

OD
Số lượng tế bào
số lượng tế bào đếm thực tế
0.137
0
0
0.156
12

12
0.161
35
35
0.287
53
53
0.522
82
164
1.141
138
552
1.127
166
996
Bảng 3: Bảng số liệu của mẫu môi trường Hasen

Đồ thị môi trường Hasen

16