Bài giảng Phân tích gen và sản phẩm của gen một số kỹ thuật

SINH HỌC PHÂN TỬ & DI TRUYỀN HỌC

Phân tích gen và
sản phẩm của gen
(Một số kỹ thuật SHPT
ứng dụng trong y học)


Phân tích gen và sản phẩm của gen
CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC

Tách chiết và tinh sạch ADN
Sử dụng quang phổ để xác định nồng độ ADN và ARN
Điện di phân tích axit nucleic

Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADN
Các phương pháp lai axit nucleic và mẫu dị
Tổng hợp hóa học và sử dụng các đoạn oligonucleotide
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
Giải trình tự ADN
Xác định vai trị và chức năng gen
Đinh Đồn Long

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ


Chương 12. Phân tích gen và sản phẩm của gen
CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH PROTEIN
Chuẩn bị tế bào để tinh sạch protein
Sử dụng sắc ký cột để tinh sạch protein
Phân tích protein trên gel polyacrylamide

Giải trình tự protein
Phân tích tương tác protein - protein
Về hệ protein học (proteomics)

Đinh Đoàn Long

Bộ môn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ


CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC

Tách chiết và tinh sch ADN
ADN và ARN
trong n-ớc
Bổ sung
Phenol

ADN, ARN và
protein trong
pha n-ớc

Lắc
mạnh

Phenol

Ly t©m

Protein
trong

phenol

Dùng phenol loại protein khỏi dịch chiết ADN và ARN
Đinh Đồn Long

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ


CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC

Sử dụng quang phổ để xác định nồng độ ADN và ARN

Định lỵng ADN v ARN dựa trên phơng pháp đo quang
phổ ở các bíc sãng 260 vµ 280 nm.
 1,0 A260nm  50 g / ml dsADN
 1,0 A260nm  40 g / ml ssADN / ARN
 1,0 A260nm  33 g / ml dNTP / oligonucleotide

Đinh Đồn Long

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ


CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC

Điện di phân tích axit nucleic
Điện cực
Gradient biến tính

70%

Các giếng tra mẫu

ADN
kiểu dại

Thể đột biến 2
khó biến tính hơn

DGGE vuông góc

K thut in di xung trường
(Pulse-field electrophoresis)
Đinh Đồn Long

Gradient biÕn tÝnh

ThĨ ®ét biÕn 1
dƠ biến tính hơn

70%

Chiều dịch chuyển của ADN

40%

0%

DGGE song song

K thut điện di biến tính gradient DGGE
(Denaturing gradient gel electrophoresis)
Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ


CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC

Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADN
a) Enzym cắt đầu bằng (vd: RsaI)

b) Enzym cắt đầu dính – lệch về phía đầu 5’ (vd: EcoRI)

Phần đầu 5’ nhô ra

c) Enzym cắt đầu dính – lệch về phía đầu 3’ (vd: KpnI)
Phần đầu 3’ nhơ ra

Đinh Đồn Long

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ


CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC

Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADN

Cách tính kích thước đoạn giới hạn trung bình
1. Xác suất một vị trí giới hạn gồm 4 bp được tìm

thấy trong một hệ gen là

1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 = 1/256

2. Xác suất một vị trí giới hạn gồm 6 bp được tìm
thấy trong một hệ gen là

1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 = 1/4096
Đinh Đồn Long

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ


CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC

Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADN

Ví dụ về các vị trí giới hạn trong hệ gen người
4 bp

6 bp

8 bp

Đinh Đoàn Long

Bộ môn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ


CÂU HỎI VẬN DỤNG
Nếu các nucleotit phân bố ngẫu nhiên trên một
phân tử ARN dài 106 nucleotit, chứa 20% A,

25% C, 25% U và 30% G. Số lần trình tự 5’-GUUA-3’
trung bình xuất hiện trong đoạn phân tử ARN nêu
trên là bao nhiêu?
A. từ 1 đến 2 lần
B. từ 3 đến 4 lần
C. từ 4 đến 5 lần
D. nhiều hơn 5 lần

Đinh Đồn Long

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ


Điện di trên gel agarose

Làm nguội về ~50oC
rồi đổ vào khn

Lược tạo
giếng

Gel sau khi
hồn thành

Các giếng

Đun chảy gel
bằng lị vi sóng

Cho agarose vào

dung dịch đệm

Đinh Đồn Long

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ

/>

Điện di trên gel agarose
Các phân tử ADN
khác nhau về kích
thước sẽ phân
tách khỏi nhau.
Các phân tử càng
ngắn di chuyển
càng nhanh trên
trường điện di.

Đinh Đồn Long

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ

/>

Gel được nhuộm với ethidium bromide
HSE-SP6

X

W C100

lCI

D

M

3 kb
2 kb

0.7 kb

Log kích thước của ADN tỉ lệ nghịch với khoảng cách di chuyển (X).

Khoảng cách di chuyển và mức độ phân tách phụ thuộc vào nồng độ agarose.


Kích thước phân tử tính theo bp

Mối quan hệ giữa kích thước phân tử ADN và
khoảng cách di chuyển trên trường điện di

Khoảng cách di chuyển tính theo cm
/>

CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC
Hỗn hợp ADN
(ADNts, cADN mẫu,…)

Nhân dịng
(DNA cloning)

Nhân dịng
bằng
tế bào

Nhân dịng
invitro
(PCR)

1) Chọn tế bào chủ
thích hợp.

1) Sử dụng ADN
polymerase bền nhiệt.

2) Tạo véctơ nhân
dòng phù hợp.

2) Thơng tin về trình
tự ADN cho phép tổng
hợp các đoạn mồi đặc
hiệu để nhân dịng
các đoạn ADN đích.

3) Gắn ADN ngoại lai
vào véctơ, rồi chuyển
vào tế bào chủ.

Đinh Đoàn Long

Phương pháp chung
dùng để nghiên cứu các
trình tự ADN đặc hiệu

Phương pháp

Các yêu cầu tối thiểu

Phát hiện
đặc hiệu

Các kỹ thuật lai
axit nucleic

1) Sử dụng các mẫu
dò ADN/ARN được
đánh dấu.
2) Phát hiện các phân
đoạn liên kết mẫu dị.

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ

/>

CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC

Các phương pháp lai axit nucleic và mẫu dị

ADN đích

Mẫu dị ADN

(Hỗn hợp gồm nhiều phân
đoạn ADN khác nhau)

(Thường là đồng nhất và
được đánh dấu)

Biến tính

Trộn để các phân tử bắt cặp

Mẫu dị bắt cặp trở lại
Các phân tử bắt cặp trở lại
Đinh Đoàn Long

Các mẫu dị bắt cặp kép với trình tự đích
Bộ môn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ

/>

CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC

Các phương pháp lai axit nucleic
Các loại
mẫu dò

Các loại
mẫu dò
Loại

ARN

Oligonucleotide

Nguồn gốc ADN được nhân dịng
bằng tế bào hoặc PCR

Phiên mã từ
đoạn ADN cài

Tổng hợp
hóa học

Thường dạng sợi kép:
Đặc điểm
của vật liệu 0,1 – vài trăm kb với mẫu dò
nhân dòng tế bào; 0,1 – 20 kb
khởi đầu
với mẫu dò nhân dòng PCR

Mạch đơn

Mạch đơn

(thường dài vài
nghìn nucleotide)

(thường dài 10 – 50
nucleotide)

Phiên mã từ ADN
được nhân dòng

Đánh dấu đầu cuối
(vd: dùng kinase)

Kỹ thuật
đánh dấu

ADN

Dùng phản ứng tổng hợp
ADN nhờ ADN polymerase

Đinh Đồn Long

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ

/>

CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC

Các phương pháp
lai axit nucleic

Ổn định

Ổn định

Ổn định nếu
điều kiện lai
khơng khắt khe
Đinh Đồn Long

Mẫu dị
oligonucleotide

Mẫu dị
truyền thống

Bắt cặp
hồn tồn

Bắt cặp sai đơn
nucleotide
(vd: các alen)

Ổn định

Không ổn định
nếu điều kiện lai
khắt khe

Bắt cặp sai 20%
(vd: lai giữa gen
người và chuột)

Bộ môn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ

/>

Ví dụ về Technical Notes

Đinh Đồn Long

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ

/>

Ví dụ về Technical Notes

Đinh Đồn Long

Bộ mơn Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ

/>