Định lượng vi khuẩn escherichia coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN

ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN

ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

TP HỒ CHÍ MINH, 2022

TP HỒ CHÍ MINH, 2022


MỤC LỤC

CHƯƠNG 1.
MỤC LỤC
i
DANH MỤC HÌNH ẢNH
ii
DANH MỤC BẢNG BIỂU
iii

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ THÍ NGHIỆM
1
1.1. Khái niệm về E.coli............................................................................................1
1.2. Phạm vi áp dụng.................................................................................................1
1.3. Ngun tắc..........................................................................................................1
1.4. Mơi trường và hố chất.......................................................................................2
1.4.1. Mơi trường SPW
2
1.4.2. Mơi trường TBX
2
CHƯƠNG 2. QUY TRÌNH TIẾN HÀNH
4
2.1. Thiết bị và dụng cụ.............................................................................................4
2.2. Quy trình phân tích.............................................................................................6
2.3. Các bước tiến hành.............................................................................................7
2.4. Màu của khuẩn lạc trong môi trường TBX.........................................................7
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ
9
3.1. Kết quả...............................................................................................................9
3.2. Biểu thị kết quả...................................................................................................9

CHƯƠNG 2.

1


CHƯƠNG 3.

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1:Vi khuẩn E.coli

1

Hình 2:Đĩa petri

3

Hình 3:Bộ đếm khuẩn lạc

3

Hình 4:Máy votrex

4

Hình 5:Nồi hấp tiệt trùng

4

Hình 6:Máy dập mẫu

4

Hình 7: Màu khuẩn lạc E.coli

7

2

CHƯƠNG 4.

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1:Mơi trường và hố chất

1

Bảng 2:Bảng số khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng

8

3


CHƯƠNG 5.

CHƯƠNG 6.

TỔNG QUAN VỀ THÍ NGHIỆM

6.1.

Khái niệm về E.coli

6.2.Escherichia coli là một trong những vi sinh vật thường gặp trong môi trường.
E.coli là dạng trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, khơng sinh bào tử, khá phổ biến
trong tự nhiên và đặc biệt trong đường tiêu hóa của người và động vật. Chúng thuộc
loại glucose và lactose dương tính, indol và methyl red dương tính song có phản ứng

VP và citrate âm tính.
6.3.Nhiều người khơng E.coli là vi sinh vật gây bệnh do thực phẩm song những nghiên
cứu đây cho thấy một số chủng của chúng thực sự có khả năng gây bệnh lây lan qua
thực phẩm rất nghiêm trọng. Chúng có trong các loại thực phẩm như cá hồi, pho – mai,
thịt sữa,… Ngồi ra, E.coli có mặt trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu
cơ
6.4.Độc tố của chúng rất nhạy với nhiệt, có khả năng tạo ra loại độc bền nhiệt. E.coli
có nguy cơ rất lớn đối với trẻ em, đặc biệt là những bệnh liên quan đến hội chứng dung
huyết hoặc phân có máu.

Hình 1:Vi khuẩn E.coli

6.5.

Phạm vi áp dụng

Phương pháp này được tham chiếu theo ISO 16649-2:2001
6.6.

Nguyên tắc

Cấy một lượng mẫu xác định trên mơi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch TBX) có
chứa lactose và một chất chỉ thị pH. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau
1


khi ủ môi trường ở 440C trong 24 giờ. Đếm các khuẩn lạc E.coli điển hình trên mơi
trường TBX. Kết quả được biểu thị bằng số E.coli trên 1g mẫu pha lỗng.
6.7.

Mơi trường và hố chất

Mơi trường- Hố chất
Saline Pepton Water (SPW)
TBX
HCl 10%
NaOH 10%

Mục đích
Pha lỗng mẫu
Ni cấy E.coli
Chỉnh pH

Bảng 1:Mơi trường và hố chất

6.7.1. Mơi trường SPW
Dung dịch pha loãng được tham chiếu theo TCVN 6507-1:2005 (ISO 68871:2003)
Thành phần:
● NaCl: 8,5g
● Pepton: 1g
● Nước cất: 1 lít
Chuẩn bị: Hịa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần. Phân phối 90ml
dịch pha lỗng vào các bình (hoặc lọ có nắp vặn) và 9ml vào các ống nghiệm. Đậy nắp
bình và ống nghiệm, hấp khử trùng.
Mục đích: Dùng để pha lỗng mẫu
6.7.2. Mơi trường TBX
Tham chiếu theo TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649:2001)
Thành phần:
● Sản phẩm thủy phân casein bằng enzyme 20,0g
● Muối mật 1,5g

● Acid 5-bromo-4-clo-3-indolyl-Dglucuronid (BCIG)
● Thạch: 9g đến 18g
● Nước: 1000ml
Chuẩn bị:
Hòa tan BCIG trong dimety sulfoxit hoặc trong dung dịch loãng theo khuyến cáo của
nhà sản xuất. Hòa tan tất cả các thành phần trên trong nước và đun đến sôi.
Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần.

2


Khử trùng môi trường 15 phút ở nhiệt độ 121°C trong nồi hấp áp lực. Làm nguội ngay
môi trường trên nồi cách thủy đến khoảng từ 44°C đến 47°C.
Mục đích:Dùng làm môi trường nuôi cấy E.coli

3


CHƯƠNG 7.

QUY TRÌNH TIẾN HÀNH

7.1.

Thiết bị và dụng cụ

Hình 2: Đĩa petri

\
Hình 3: Bộ đếm khuẩn lạc

4


Hình 4: Máy votrex

Hình 5: Nồi hấp tiệt trùng

Hình 6: Máy dập mẫu

5


7.2.

Quy trình phân tích

10g/25g đối với mẫu rắn hoặc 10ml/25ml đối với mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone
Water
Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60 giây
Pha loãng

Dịch mẫu 10-1

15 ml

02 dĩa

Dịch mẫu 10-2

15 ml

TBX

02 dĩa

(TBX đã đun chảy và
làm nguội đến 47°C)
Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông
đặc, lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 44°C trong 24 giờ

Đọc kết quả
Chọn các đĩa mọc ≤ 150 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả

6


7.3.

Các bước tiến hành

Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml/25ml đối với
mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ± 5%, cho vào túi nhựa vơ
trùng (bình tam giác).
Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml ( sai số cho phép ± 5%) vơ trùng vào túi
nhựa (bình tam giác chứa mẫu).
Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều

bình tam giác có mẫu và dịch pha lỗng trong 2÷3 phút.
Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không
để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha lỗng
thích hợp.
Bước 2. Pha lỗng mẫu
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ±5% cho vào một ống
nghiệm có chứa 9 ml dịch pha lỗng SPW vơ trùng ở nhiệt đọ thích hợp.
Trộn kĩ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dịch pha loãng 10 -2 (đối với các
loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1). Nếu cần, lặp lại
thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,… cho đến khi thu được
lượng vi khuẩn nhất định.
Bước 3. Cấy và ủ mẫu
Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu đối
với sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa hai đĩa petri. Sử dụng 2 nồng độ pha loãng
liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa khoảng 15 ml mơi trường TBX. Lật
úp đĩa và ủ ở 44°C trong 24 giờ.
Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định
Đếm các đĩa có số khuần lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc E.coli đặc trưng
trên môi trường TBX có màu xanh. Đếm các khuẩn lạc E.coli đặc trưng trên mỗi đĩa
có số đếm phù hợp. Tính giá trị trung bình từ các độ pha lỗng để qui về số E.coli
trong 1g mẫu.
7.4.

Màu của khuẩn lạc trong môi trường TBX

Đối với môi trường TBX (Tryptone Bile X-glucuronide) thì trong thành phần của mơi
trường này có Acid 5-bromo-4chloro-3-indolyl-D-beta- glucuronide, đây là thành phần

7

quan trọng để quyết định màu của khuẩn lạc E.Coli trong qua trình sinh trưởng và
đếm.
Giải thích cho màu của khuẩn lạc E.coli được hiểu đơn giản như sau:
Sự có mặt của enzyme β-D-glucuronidase giúp phân biệt hầu hết E.coli với các vi
khuẩn Coliform khác. E.coli hấp thụ cơ chất sinh màu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- βD-glucuronide (X- β-D-glucuronide). Enzym β-glucuronidase chia đôi liên kết giữa cơ
chất sinh màu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl và β-D-glucuronide. Các khuẩn lạc E.coli
sau đó sẽ có màu từ màu xanh lam đến màu xanh lam lá cây. Nhưng màu thể hiện rõ
nhất là màu xanh lam. Bên cạnh một số chủng E.coli có màu thì đối với 1 số chủng âm
tính với enzyme Beta-D sẽ biểu hiện là các khuẩn lạc khơng màu.

7.5.

Hình 7: Màu khuẩn lạc E.coli

8


CHƯƠNG 8.

KẾT QUẢ

8.1.

Kết quả

Tổng số E.coli trong 1g mẫu (X) được tính theo cơng thức:

(CFU/g hay

CFU/ml)

C: Tổng số khuẩn lạc E.coli đếm được trên 4 đĩa của hai độ pha lỗng liên tiếp
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
8.2.

Biểu thị kết quả

Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa.
Sau khi tính kết quả, nếu chữ số thứ 3 nhỏ hơn 5 thì khơng thay đổi chữ số đứng trước
nó, nếu chữ số thứ 3 lớn hơn hoặc bằng 5 thì tăng chữ số đứng trước lên 1 đơn vị
tương ứng của 10, hoặc làm trịn số với 2 chữ số có nghĩa.
Lấy kết quả là số thích hợp giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10x, trong đó x là lũy thừa tương
ứng của 10, hoặc làm trịn số với 2 chữ số có nghĩa.
Ví dụ: Tính kết quả của vi vật E.coli trong sản phẩm thịt đơng lạnh tiệt trùng
Độ pha lỗng

10-3

10-4

Số khuẩn lạc

113

27

127

11

Bảng 2:Bảng số khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng
113+ 27+127+11
N= 1× [ 2+ ( 0,1× 2 ) ] × 10−3 = 126363

9


Làm trịn kết quả là 1,3×105CFU/g (hoặc CFU/ml)
Kết quả 1,3×105 CFU/g (hoặc CFU/ml) cho biết
Tổng số E.coli trong 1g mẫu thịt đơng lạnh là 1,3×105CFU/g
Giới hạn cho phép: 102 (theo quyết định 46/2007 của Bộ Y tế)
X = 1,3×105> 102
Kết luận: Mẫu thực phẩm không đạt yêu cầu

10


TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Bộ môn khoa học thực phẩm, Giáo trình Phân tích vi sinh thực phẩm, Trường Đại
học Công nghiệp Thực phẩm TP HCM, 2016
[2]. TCVN 7924-2:2008, Vi sinh vật thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp
định lượng E.coli, phần 2: kĩ thuật đếm khuẩn lạc ở 44oC sử dụng 5-bromo-4-chloro-3indolyl và β-D-glucuronide.

11

CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM
Vi khuẩn E.Coli là vi khuẩn?
Gram dươnng
Gram âm
Hiếu khí
Tất cả đáp án trên
Đáp án: A
Vi khuẩn E.coli có kích thước?
2-3 μmm
2-3 nm
5-8 μmm
5-8 mm
Đáp án: A
Mơi trường được sử dụng cho việc định lượng khuẩn lạc E.coli?
TBX
SPW
A và B đều đúng
A và B đều sai
Đáp án: C
Hóa chất nào dùng trong nuôi cấy khuẩn lạc E.coli?
H 2SO4 10%, NaOH 10%
HCl 10%, NaOH 10%
KOH 10%, HCl 10%
HNO 3 10%, NaOH 10%
Đáp án: B
Vai trị của mơi trường SPW cho việc sử dụng định lượng E.Coli?
Phát triển và sinh trưởng E.coli
Pha lỗng mẫu
Ni cấy E.coli
Tất cả đáp án trên

Đáp án: B
Vai trị của mơi trường TBX cho việc sử dụng định lượng E.Coli?
Phát triển và sinh trưởng E.coli
Pha loãng mẫu
Nuôi cấy E.coli
Tất cả đáp án trên
12


Đáp án: C
Vai trị của hóa chất NaOH 10%, HCl 10% trong việc định lượng khuẩn lạc E.coli?
Dùng để xác định khuẩn lạc E.Coli
Dùng làm cơ chất hấp thu
Chỉnh pH
Dùng để phát triển khuẩn lạc E.coli
Đáp án: C
Thành phần của môi trường SPW?
Nước cất
NaCl
Pepton
Tất cả đáp án trên
Đáp án: D
Thành phần của môi trường TBX?
Pepton, muối mật
Muối mật, BCIG, pepton
Nước, Thạch, BCIG
Pepton, Muối mật, BCIG, Nước, Thạch
Đáp án: Câu D
Môi trường SPW, TBX được ủ ở bao nhiêu độ?
44 0C

48 0C
550 C
600 C
Đáp án: A
Môi trường SPW,TBX được ủ trong thời gian bao lâu?
1 ngày
2 ngày
3 ngày
4 ngày
Đáp án: A
Sau khi khử trùng mơi trường TBX thì cần chỉnh pH đạt bao nhiêu?
7,2 ± 0,2 ở 20oC
7,2 ± 0,2 ở 25oC
8,2 ± 0,2 ở 25oC
8,2 ± 0,2 ở 20oC
Đáp án: B
Vi khuẩn E. Coli tồn tại ở đâu?
Trong tự nhiên
Con người và động vật
Trong các thực phẩm như cá hồi, phô mai, thịt sữa,..
13


Tất cả đáp án trên
Đáp án: D
Tại sao dịch pha lỗng trong q trình thao tác phải giữ xấp xỉ ở nhiệt độ phòng?
Để vi sinh vật thuận lợi phát triển
Để vi sinh vật không bị tổn thương
Để ức chế vi sinh vật
Để tiêu diệt vi sinh vật

Đáp án: B
Phạm vi áp dụng?
Theo ISO 9001:2015
Theo ISO 9001:2008
Theo ISO 16649-2-2001
Theo ISO 16645-2-2001
Đáp án: C
Trong quá trình chuẩn bị mẫu thử do các bào tử trong mơi trường lắng nhanh trong
pipet vì thể nên để pipet ở tư thế?
Thẳng đứng
Nằm ngang
Nghiêng 45 độ
Nghiêng 60 độ
Đáp án: B
Quy trình tiến hành định lượng E.Coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc?
Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu →Pha loãng mẫu→Cấy và ủ mẫu→
Đếm và chọn khuẩn lạc để khẳng định.
Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu →Cấy và mẫu→Pha loãng mẫu→Đếm
và chọn khuẩn lạc để khẳng định
Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu → Đếm và chọn khuẩn lạc để khẳng
định→ Pha loãng mẫu→Cấy và ủ mẫu.
Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu → Đếm và chọn khuẩn lạc để khẳng
định→ Cấy và ủ mẫu→Pha loãng mẫu.
Đáp án: A
Mục đích của việc chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu?
Hịa tan mơi trường
Đo mơi trường
Hịa tan mơi trường và đo mơi trường ở 10-1
Hịa tan môi trường và đo môi trường ở 10-2
Đáp án: C

Mục đích của bước pha lỗng mẫu?
Tạo mơi trường cho vsv phát triển trên mặt đĩa
Hịa tan mơi trường
Làm giảm mật độ VSV (để đếm được VSV chính xác hơn)
14


Để dễ dàng tính được số khuẩn lạc
Đáp án: C
Mục đích của việc cấy và ủ mẫu?
Tạo mơi trường cho vsv phát triển trên mặt đĩa
Hịa tan mơi trường
Làm giảm mật độ VSV (để đếm được VSV chính xác hơn)
Để dễ dàng tính được số khuẩn lạc
Đáp án: A
Mỗi đĩa petri được rót bao nhiêu mơi trường TBX?
10ml
15ml
20ml
25ml
Đáp án: B
Màu của khuẩn lạc trên mơi trường TBX có màu?
Màu xanh
Màu vàng
Màu nâu
Màu trắng
Đáp án: A
BCIG có trong mơi trường TBX dùng để?
Xác định tính di động và ni dưỡng vi sinh vật
Kích thích sự phát triển của vi sinh vật

Dùng để pha chế môi trường
Dùng để phát hiện E.Coli ( đổi màu xanh )
Đáp án: D
Thành phần quan trọng quyết định đến màu của khuẩn lạc E.Coli?
Muối mật
BCIG
Enzyme β-D-glucuronidase
Pepton
Đáp án: B
Cách chọn khuẩn lạc để đếm?
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 120 sau 24 giờ ni cấy
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 48 giờ ni cấy
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 120 sau 48 giờ nuôi cấy
Đáp án: A
Các khuẩn lạc E.Coli âm tính với enzyme β-D-glucuronidase sẽ biểu hiện màu gì?
Màu xanh
Màu vàng
Màu trắng
15