Nghiên Ứu Ảnh Hưởng Ủa Á Hạt Nano Kim Loại (Coban, Bạ, Sắt Và Đồng) Đến Quá Trình Huyển Gen Vào Giống Đậu Tương Việt Nam.pdf
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.96 MB, 69 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------
Nguyễn Trung Anh
“Nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano kim loại
(coban, bạc, sắt và đồng) đến quá trình chuyển gen
vào giống đậu tương Việt Nam”
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng
PGS.TS. Đỗ Thị Hoa Viên
Hà Nội – Năm 2017
1708330013030b52cb41d-e3f1-4cd3-a6a2-39363c25564e
1708330013030f9f7fda7-4290-4b2c-a7b4-acb3b448a31e
17083300130302e5e4999-eace-4d0f-9769-26fc1ab7a287
LỜI CAM ĐOAN
u ca riêng tôi, các kt qu nghiên
cc trình bày trong lu bo
v mt hc v nào.
ng mi s cho vic thc hin lu c
n trong luc ch rõ ngun gc.
Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017
Tác giả luận văn
Nguyễn Trung Anh
1
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Nguyễn Văn
Đồng, Giám đốc Phịng Thí nghiệm Trọng điểm quốc gia Cơng nghệ Tế bào thực vật,
Viện Di truyền Nông nghiệp – người thầy ln kiên nhẫn và hết lịng hướng dẫn, giúp
đỡ tơi trong suốt q trình tơi thực hiện luận văn.
Tơi xin gửi tới PGS.TS. Đỗ Thị Hoa Viên, Viện Công nghệ Sinh học & Công
nghệ Thực phẩm lời cảm ơn chân thành, người đã luôn hỗ trợ và giúp đỡ để tơi hồn
thành luận văn.
Tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình, những ý
kiến đóng góp quý báu cũng như sự chỉ dẫn tận tình của TS. Hà Văn Chiến trong
suốt quá trình tơi thực hiện và hồn thành luận văn cùng tập thể cán bộ Phịng Thí
nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông Nghiệp về sự
nhiệt tình giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tơi có thể thực hiện được đề tài
này một cách suôn sẻ và thuận lợi.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Công nghệ
Môi trường đã hỗ trợ và giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn
Cuối cùng, tơi xin gửi tới bố mẹ, anh chị, người thân cùng bạn bè lời cảm ơn
thân thương nhất - những người đã ln sát cánh, quan tâm và dành cho tơi tình cảm
chân thành trong suốt thời gian tôi học tập và hồn thành luận văn này cũng như đã
ln ln bên cạnh và ủng hộ tôi trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Học viên cao học
Nguyễn Trung Anh
2
MỤC LỤC
................................................................................................................ 1
............................................................................................................................. 9
............................................................................................. 11
1.1.
cây ......................................................................... 11
1.1.1.
........................................................ 11
1.1.2.
....................................................... 14
1.1.3.
................................................................... 15
1.2.
............................. 17
1.2.1.
........................................................................... 17
1.2.2.
................................................... 17
1.3.
Gen bar .................................................................................................................... 20
1.4.
..................................... 21
1.5.
............................................... 23
1.6.
nano ................ 25
- ............................................................. 27
2.1.
........................................................................... 27
2.2.
................................................................................................. 27
.................................................................................................................... 27
.......................................................................................... 28
.................................................................................................. 29
............................. 29
3
........................................................................................... 30
grobacterium tumefaciens ........... 30
......................................................................... 32
2.3 ..................................................... 32
...................................... 33
.................................................................................................. 34
...................................................................... 35
.................................................................... 36
g
................................................................................................................. 36
..................................... 36
grobecterium tumefaciens ............................................. 44
3.2. Phân tích h
......................................................... 52
..................................................................... 56
....................................................................................................................... 56
.................................................................................................................... 56
................................................................................................. 57
.......................................................................................................................... 64
4
DANH MỤC BẢNG
..................................................................................................12
..............13
............................................. 29
....................................................................... 33
..................................................................................................................36
......................................................... 39
................................................ 42
.......................................................................................... 45
............................................................... 47
................................................ 50
......................... 53
5
DANH MỤC HÌNH
....................... 19
Hình 2.1 .................................................................. 28
... 37
................................................................................................. 40
................... 41
.............................. 42
Hình 3.5:
.................................................................................... 43
Hình 3.6: trong quá trình
................................................................................................................ 44
............................................................... 46
................................................................................................. 48
.... 49
.................................................................................... 50
Hình 3.11:
................................................................................................................ 51
................................................................................................................................... 52
6
Hình 3.13:
gen T0 ........................................................................................................................ 53
7
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
A.tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
ADN
Axit deoxyribonucleic
AS
Acetosyringone
BAP
6 benzylaminopurine
Bar
Gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase
Bii gen
Bp
Base pair
CCM
Cocultivation medium ng nuôi cy
Cs
Cng s
dNTP
Deoxynucleoside triphosphate
Gi
Gi
DT84
Gi
Gi
EDTA
Ethylene Diamine Tetra Acetic
GA3
Gibberelic acid
GM
Germination medium ng ny mm ht
IBA
Indole-3-butyric acid
Kb
Kilo base
OD
Optical density
PCR
Polymerase chain reaction phn ng chui polymerase
RM
Rooting medium ng ra r
SDS
Sodium dodecysulfat
SEM
Shoot elongation medium ng kéo dài chi
SIM
T0
Shoot induction medium ng to i
Cây chuyn gen
TAE
Tris acetate EDTA
v/p
vòng/phút
YEP
Yeast extract peptone
GSO
Tng cc Thng kê Vit Nam
MỞ ĐẦU
(Glycine max L. Merr)
[2]
[26].
(http://worldvegetableoil
Ngày nay, công ngh c trin khai nghiên cu rng rãi trên phm vi
toàn cu, trong nhi u to ra nhng sn phc
ng di sng ca con nguc bic nông nghip. Mt s
nhng nghiên cu ng dng các h x lý ht ging nhm ci thin t
ny mng, cht thu hoch ca nông sn [20]. Công
ngh c ng dng trong phân bón lá bao gm các nguyên t ng cn
thit trong tn phát trin ca cây trng. Vic s dng các công c h tr
m bin, công ngh phát hin và chng
bnh do vi sinh vt gây ra cho cây trng. Trong các nghiên cu ng dng ca các ht
nano trong nông nghi c s dng nhiu là x lý ht ging cây
trng vi hc khi trng Roghayyeh và cng s u
và thy rng các ht nano st (Fe) có ng m sinh hc u
[49]. Ngoài ra, các ht nano sng (Cu) cho hiu
qu ln khi x lý ht ging cây tr u.
Hin nay, vic to ra cây trng bii gen bng k thut chuy ng
dng vào thc tin nht cây trng
i li ích cho nn nông nghip là vô cùng quan trng. Tuy nhiên, hiu sut
chuyn gen vào ging ph bin ti Vit Nam hin nay ch
i 1% [13]. quy trình chuyo cm
chi thơng qua nuôi cy in vitro nt lá mm ca mt vài gi u
c trin khai mt s phịng thí nghiu
cho kt qu. Tuy nhiên các git khó
trng ph bin ti các mùa v Vic biêt ti các tnh thuc min Bc Vit
9
Nam t l u qu ca các ging u còn rt hn chi
mong mun nâng cao hiu sut chuy Vit Nam, chúng tơi tin
hành nghiên cu tìm hiu ng ca các ht nano kim loi lên quá trình chuyn
gen vào gi thông qua vi khun Agrobacterium tumefaciens. Xut
phát t yêu cu thc tin và các nghiên cn hành, chúng tôi thc hi tài:
“Nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano kim loại (coban, bạc, sắt và đồng) đến
quá trình chuyển gen vào giống đậu tương Việt Nam”.
Vi mong mun phát triu qu ca quy trình chuyn gen vào ging
i Vit Nam
Mục tiêu của đề tài
Chuyn thành công gen ch th kháng thuc dit c (bar) vào gi
ca Vit Nam và nh ng ca ht nano kim lo n quá trình
chuyn gen.
Nội dung nghiên cứu
Agrobacterium tumefaciens.
thông qua
Agrobacterium tumefaciens.
3:
quy trình.
10
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.
Giới thiệu chung về cây đậu tương
1.1.1. Nguồn gốc và tình hình sản xuất đậu tương
Nguồn gốc đậu tương
Fabaceae, có tên khoa
(Glycine max L. Merr)
và gia súc [18]
g
Châu Á
Châu Á.
Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương
Trên thế giới
cây trng có kh ng r c phân b
khp các châu lc trng nhic trên th gii, tp trung c có
B Nam. a ISAAA, các loi cây
trng chuy
2016, cây trng bii gen c trng rng rãi các c vi tng din tích
khong 185,1 tri
triu ha so vc gia, gm 19 qun
c công nghi c
trng ti các qun và 46% din tích tc công nghip. Các
quc gia du trong vic canh tác cây trM, Brazil, Argentina, Canada
và . Din tích canh tác cây tri 5 quc gia này chim ti 91% tng
din tích canh tác tồn cu. u trong vic trng cây tr là M (72,9
triu ha) ti n là Brazil (49,1 triu ha), Argentina (23,8 triu ha), Canada (11,6
triu ha), (10,8 triu ha). Trong s các cây trng bi
11
c nghiên cu, trng th nghii hóa vi quy mơ và din tích
ln. Trong tng s 181,1 triu ha cây trng n tích trng các ging u
m 50% din tích canh tác cây trng bi i gen trên toàn th gii
(ISAAA, 2016 n ca các nhà chn to gi
gii góp phn vào s phát trin ca ngành nơng nghip tồn cu. Theo thng kê ca
T chc Quc t v tip thu các ng dng công ngh sinh hc trong Nơng nghip
(ISAAA 2016), din tích canh tác cây trng bip 110 ln sau 21
i hố
6 din tích sinh hc chim 50% tng s
din tích cây trng trong công ngh sinh hc trên th gii gim 1% so v
in tích trng chc thuc tr c
23,4 tring 82% so v. Hin nay, có 3 quc gia sn xuu
n nht th gii là M, Brazil, Argentina c
sn xut, tiêu th và xut khn nht c th bng 2.
Bảng 1.1: Tình hình sản xuất đậu tương của 4 quốc gia đứng đầu thế giới trong
những năm gần đây
2015
Năm
Quốc
2016
Diện tích
Diện tích gieo
Sản lượng
trồng (triệu ha)
(triệu tấn)
Mỹ
32,39
57,2
31,84
106,9
Brazil
30,3
96,2
32,7
101
Argentina
21,1
61,4
18,7
58,5
Gia
gieo trồng
(triệu ha)
Sản lượng
(triệu tấn)
(Ngun FAOSTAT, 2016)
Trên th gii có 28 t c
công ngh sinh hc có kh c thuc dit cc phát trin ln nht
, Braxin, Argentina có khu vc trng ging chu thuc dit
c lt : M (31,84 triu ha) gim nh so v,
Braxin (12,43 triu ha) và Argentina (18,6 triu ha) ( Báo cáo
ISAAA 2016). Có nhiu nguyên nhân gây ra s không nh v t và sn
12
u , mt trong nhng nguyên nhân là do di u
mt s c gim nh ch n tích tr u
i khí hu và hn hán là yu t có ng
ln nht gii.
Ở Việt Nam
Theo báo cáo ca B Nông nghip và phát trin nông thôn, cc trng tr
2016 cho thy: N
c ng cu kin khí hu t
sut ca cây trng trên c là yu t quan trng
nhng giá tr v m giá tr v mt công nghip c u
t ln nên ht Nam nhp khu mt ng l các quc
gia khác trên th gii ( din tích tr t khong 98 ngàn ha,
gim 2 ngàn ha so v ng t 145 ngàn tn gim kho
nghìn tn so v. D t Nam s nhp 5,2 triu tn
c nhp khu nht th gii).
Theo tng cc Thng kê Vit Nam (GSO), B Nông nghip và Phát trin Nông
t cây trng và din tích
thu hogic thng kê bng 2.
Bảng 1.2: Sản lượng đậu tương của Việt Nam trong những năm gần đây
Năm
Diện tích gieo
trơng (nghìn ha)
Năng suất (tấn/ha)
Tổng sản lượng
(nghìn tấn)
2013
2014
2015
2016
117,2
110,2
100
98
1,44
1,43
1,46
1,48
168,2
157,9
146
145
Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn, số liệu dự báo cua USDA
c ta, vic ng dng công ngh sinh hc trong to ging cây tr
c trin khai nghiên cu m t vc bin np gen
thuc c
13
trin khai bi nhóm nghiên cu ca TS. Trn Th Cúc Hịa (Vi ng Bng
Sơng Cu Long) [16]. Ngồi ra, Vin Công ngh Sinh h c hin các
nghiên cu c: Nghiên cu và hoàn thin k thut bin np gen
(2005 - 2006); phát trin h thng tái sinh in-vitro ng phc v cho bin np
gen ca Nguyn Th ng và csu chu hi Vin Di truyn
Nông nghip [11]. Tuy nhiên kh ng dng tri tn
i gen Vit Nam vn còn hn ch. Do có nhiu yu t n hiu qu bin
np gen. Tuy nhiên, vic ci tin các yu t nhu qu ca quy trình bin np
gen là cn thi c t l gen chuyn thành công cao vào ging
i Vit Nam.
1.1.2. Giá trị của cây đậu tương đối với con người
*
Giá trị về dinh dưỡng
t trong nhng cây trc trng ph bin nhiu
c trên th gii. H ng cao vi protein chim
khong 35,5 - ng t 12-24%, carbohydrate t 10-
protein ca go ch t 6,2 - 12%; ngô: 9,8 - 13,2%; tht bò: 21%; tht gà: 20%; cá là
17 - 20%; trng là 13 - y, protein cm cht tt nht
trong các protein có ngun gng vt, thc vt khác [8].
Bên c ng ln v protein và lipit, h a nhiu loi
Methionine; Tryptophan; Threonine; Lysine; Phenylalanineu này cho th
loi hy các loi axit amin cn thit. p
du thc vt quan trng nht th gii. Hng du béo cao
u khác. Trong ha nhiu loc bit là
vitamin B1, B2, A, C... (vitamin C có nhi6]. H
14
cha nhiu hp ch ng cht chng oxy hóa tác dng có li cho sc khi.
*
Giá trị về nông nghiệp
-
làm th
2: 6,2%,
P2O5: 0,7%, K2 [6]
-
-60 kg N 2).
2
2 8].
*
Giá trị về công nghiệp
- --18 o
phòng, v.v... [18].
1.1.3. Một số giống đậu tương ở Việt Nam
Giống đậu tương ĐT22
Tác gi: Tr n Th ng, Hoàng Minh Tâm, Quách Ngc
Truyn, Nguyn Th m Hnh, Nguyn Th Chúc, Lê Tun phong, Nguy t
Thun. Trung tâm Nghiên cu và Phát tri, Vic và Cây thc
phm, Vin Khoa hc Nông nghip Vit Nam.
Giu và Phát tri chn to t t
bin ca h c H ng Khoa hc Công ngh (B
15
NN&PTNT) công nhn là ging mi. Quy -KHCN ngày
19/01/2006.
Nhm chính: Thng trung bình t 85-90 ngày. Hoa màu
trng, ht vàng, r chín có màu nâu. Khng 1000 ht khong 155160g. Có kh nh phn trt t 18-27 t/ha, tùy thuc vào
mùa v u kihích hp gieo trng trong c 3 v
Giống đậu tương ĐVN9
Gic ca Vin nghiên cu Ngô lai
to và chn lc t t h
Nhm: v xuân khong 8890 ngày, v hè: t 75 77 ngày, v -80 ngày. Dng, lá hình trng
nhn, hoa tím, v qu t vàng, rn ht nâu nht. Chiu cao cây
trung bình 27,3 - 56,5 cm; phân cành mnh khong 1,7 3,1 cành cp 1 trên mt cây;
sai qu khong 22,9 49,5 qu trên mt cây. Kh ng 1000 ht khong 148,5
t trung bình v t 17 t/ha, v t 21 t/ha.
Giống đậu tương ĐT26
Tác gi: Tr n Th ng, Nguyn Th Loan, Nguyn Th
Chinh, Nguyn ng, Trn Thanh Bình và CTV. Trung tâm Nghiên cu và Phát
tri, Vic và Cây thc phm, Vin Khoa hc Nông nghip
Vit Nam.
Gi c chn t t h c công
nhn cho sn xut th theo Quyt nh s -TT-
Nhm chính: Th ng trung bình t 90-95 ngày. Chiu
cao cây 45-60 cm, hoa màu trng, ht vàng, rm, qu chính có màu nâu, phân
cành khá nhiu t 2-3 cành/cây, có 30-35 qu chc/cây, t l qu 3 ht 20-40%. Khi
ng 1000 ht 180-t 21-29 t/ha, tùy thuc vào mùa v u kin
thâm canh. Ging thích hp trong v xuân và v
Giống đậu tương DT84
Gi n Di truyn Nông nghip chn to bng
pháp x t bin dịng 33-3 (t hc cơng nhn ging Quc
o nghim, sn xut t
16
Nhm chính: Thng 85 90 ngày. Chiu cao cây t 50
ng khe, ít phân cành. Ht to, màu vàng sáng, hoa màu tím,
khng 1000 ht 160 180 ht 15 20 t/ha. Gic trng c 3
vp trng thâm canh.
tài nghiên cu kh p nhn gen vào các gi a
Vit Nam c nh ti Phịng thí nghim trm Cơng ngh T
bào Thc vt, Vin Di truyn Nông Nghi ra trong các gia
Vit Nam bao gm giy gi
có kh h cm chi cao và có ti p nhn gen tt nht trong 4
giu [3]. Do vy, chúng tôi chn giu
tài nghiên cu.
1.2.
Hạt nano kim loại và vai trò của các hạt kim loại lên cây trồng
1.2.1. Định nghĩa về vật liệu hạt nano
Ht nano kim loi là mt khái ni ch các hc trên
quy mô nanomet (nm, 1nm = 10-9 c to thành t các kim loi. Ht nano là vt
lit có mt chic nm. V trng thái ca vt liu nano,
ni ta phân chia thành ba trng thái, rn, lng và khí. Vt lic tp trung
nghiên cu hin nay, ch yu là vt liu r n cht lng và khí. V hình
dáng ca hi ta chia thành các loi sau:
Vt liu nano không chiu: Là c ba chic nano, khơng cịn
chiu t n t. Ví d
Vt liu nano mt chiu: Là vt lic nano,
n t c t do trên mt chiu. Ví d; dây nano,
Vt liu nano hai chiu: Là vt lit chic nano, hai
chiu t do. Ví d: màng m
Ngồi ra cịn có vt liu có c có
mt phn ca vt lic nm, hoc cu trúc ca nó có nano khơng chiu,
mt chiu hoc hai chin.
1.2.2.
Ảnh hưởng của hạt kim loại nano tới cây trồng
17
- 10% tr
0,01 - -
ít ()
dùng.
và làm .
i vi các kim loi dng tinh th có c 40 100 nm) là nhng ht nano
c bin là trng thái siêu phân tán thì các ht nano kim loi d c hp
th bi t bào thc vt trong q trình ni cy. Ht nano kim loi có kh to sc
mt ln có tác di cht.
Nano kim loi bc (Ag): Bc (Ag) và các hp cht ca bc th u sut
quang hy quá trình tng hng giúp cây trng nhanh, khe
m ng chu bnh tc bii vi ht nano bc (Ag) khi
gp các vi khun, virus s i lp protein trên b mt vi khun, virus ri
t y màng t bào làm c ch phát trin.
Do có din tích b mt ln nên ht nano bc có kh n t
vi các vt liu khi do kh i phóng nhiu ion Ag+
c tính kháng khun ca bc bt ngun t tính cht hóa hc ca các ion Ag+.
Ion này có kh t mnh vi peptidoglican, thành phn cu to nên thành t
bào ca vi khun và c ch kh n chuyn oxy vào bên trong t bào dn
làm tê lit vi khun. Nu các ion bc ly ra khi t bào ngay sau
hong ca vi khun li có th c phc hng vt khơng có thành t bào,
vì vy chúng ta khơng b tp xúc vi các ion này.
Có m ng ca các ion bc lên vi khuc mô t
sau: Sau khi Ag+ ng lên lp màng bo v ca t bào vi khun gây bnh nó s
vào bên trong t bào và phn ng vi nhóm sunfuahydrin SH ca phân t enzym
chuyn hóa oxy và vơ hiu hóa men này dn c ch q trình hơ hp ca t bào vi
khun.
-SH
-SAg+
18
Men hot hóa
+ 2 Ag+
Men th ng + 2H+
-SH
- SAg+
Hình 1.1: Ion bạc vơ hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn
Ngồi ra các ion bc cịn có kh t vi các base ca DNA và trung hịa
in tích ca gn quá trình sao chép DNA.
Các ht nano bc có hing cng plasmon b mt. Hing này to
nên màu sc t vàng nh n cho các dung dch có cha ht nano bc vi các
màu sc ph thuc vào n và c ht nano [9].
Nano kim loi st (Fe): St là mt yu t n s phát trin ca thc vt.
i vi cây trng st (Fe) tham gia h tr và xây dng enzyme trong dây truyn tng
hp sc t dip lc, photphoryl hóa quang hóa và
là thành phn bt buc trng h enzyme oxy-hóa kh (cytocrom). Kim loi st (Fe)
tn ti nhi ng st có trong cây trng li rt thp. D
vic thiu st trong nơng nghip là mt v khá ph bin.
Thc vt có th hp thu st dng Fe2+ và Fe3+ hu ht st trên lp v trái
t tn ti hình thc Fe3+. Trong cây trng sc hp th và tn ti nhii
hình thc Fe2+ do trng thái Fe 2+ d i d dàng b oxy hóa thành Fe 3+
và sa b kt ta. Trng thái Fe3+ ng trung tính cao. Vì
vng st là rt ít trong cây trng t kit có
cha nhiu canxi. a, trong các lo t, st d dàng kt hp vi phosphat,
carbonat, magiê, canxi và các ion hydroxit.
St là mt nguyên t cn thit cho h th thc hin phn ng
oxy hóa kh và chui vn chuyn t trong cây, tng hp cht dip lc, duy trì cu
trúc ca lc lp. Su hịa hơ hp, quang hp, kh nitrat và sulfat nhng phn ng cn thi thc vt phát trin và sinh sn [31]. Hin nay, trong nuôi
cy mô t bào thc vt, st ch yc s di dng chelate (Fe-EDTA). FeEDTA cho phép gii phóng t t và liên tc ion st vng ni cy và hn
ch s kt ta ca st thành dng oxide [51]. Mt s nghiên c c tin hành
u ca Zhu et al. (2008) v s hp thu, vn chuya nano
Fe3 O4 trên cây bí ngơ [60]; nghiên cu v c tính ca nano st/st oxide và
ng oxide trên cây rau dip [54] hay nghiên cu ca Racuciu và Creagna
19
