Tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của hoa dạ yến thảo petunia hybrid

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP - TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

TÁI SINH CHỒI IN VITRO TỪ ĐOẠN THÂN MANG
MẮT NGỦ CỦA HOA DẠ YẾN THẢO
(Petunia hybrid)

PHẠM KIM LUÔNG

AN GIANG, THÁNG 05 NĂM 2023


ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP - TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

TÁI SINH CHỒI IN VITRO TỪ ĐOẠN THÂN MANG
MẮT NGỦ CỦA HOA DẠ YẾN THẢO
(Petunia hybrid)
PHẠM KIM LUÔNG
DSH192931
LỚP: DH20SH

GIẢNG VIÊN HƢỚNG DẪN

DIỆP NHỰT THANH HẰNG

AN GIANG, THÁNG 05 NĂM 2023

ii


CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG
Chuyên đề “Tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của hoa Dạ yến
thảo Petunia hybrid” do sinh viên Phạm Kim Luông thực hiện dƣới sự hƣớng
dẫn của giảng viên Diệp Nhựt Thanh Hằng.

Phản biện 1

Phản biện 2

Nguyễn Thị Mỹ Duyên

Trƣơng Ánh Phƣơng

Cán bộ hƣớng dẫn

Diệp Nhựt Thanh Hằng


MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................ iv
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................. viii
CHƢƠNG 1 ....................................................................................................... 1

GIỚI THIỆU ...................................................................................................... 1
1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ............................................................... 1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................ 1
1.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................................... 1
1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 2
1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA NGHIÊN CỨU.............................................. 2
CHƢƠNG 2 ....................................................................................................... 3
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .......................................................... 3
2.1 GIỚI THIỆU VỀ DẠ YẾN THẢO ............................................................. 3
2.2 LƢỢC KHẢO VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .................................................... 3
2.2.1 Giới thiệu về cây Dạ yến thảo .................................................................. 3
2.2.1.1 Phân loại khoa học ................................................................................. 3
2.2.1.2 Đặc điểm hình thái ................................................................................. 4
2.2.1.3 Đặc điểm phân bố .................................................................................. 4
2.2.2 Kỹ thuật vi nhân giống ............................................................................. 5
2.2.2.1 Những ƣu điểm và nhƣợc điểm của kỹ thuật vi nhân giống (in vitro) .. 5
2.2.2.2 Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................................ 6
2.2.2.3 Quy trình vi nhân giống ......................................................................... 7
2.2.2.4. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy .......................................................... 7
2.2.2.5 Điều kiện nuôi cấy ............................................................................... 13
2.2.3 Những nghiên cứu liên quan về cây Dạ yến thảo ................................... 15
2.2.3.1 Ngoài nƣớc........................................................................................... 15
2.2.3.2 Trong nƣớc........................................................................................... 17
CHƢƠNG 3 ..................................................................................................... 18
iv


PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 18
3.1 MẪU NGHIÊN CỨU ................................................................................ 18
3.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 18

3.2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................... 18
3.2.2 Môi trƣờng nuôi cấy ............................................................................... 18
3.2.3 Điều kiện ni cấy .................................................................................. 18
3.3 CƠNG CỤ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 18
3.3.1 Trang thiết bị ........................................................................................... 18
3.3.2 Hóa chất .................................................................................................. 19
3.4 TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU ................................................................... 19
3.4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ javel và thời gian khử trùng đến
sự tạo nguồn vật liệu khởi đầu ......................................................................... 19
3.4.2 Thí nghiệm 2: Tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ
yến thảo. ........................................................................................................... 21
3.5 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU ............................................................................. 22
CHƢƠNG 4 ..................................................................................................... 24
KẾT QUẢ DỰ KIẾN ...................................................................................... 24
4.1 THÍ NGHIỆM 1: ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ JAVEL VÀ THỜI
GIAN KHỬ TRÙNG ĐẾN SỰ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU ..... 24
4.2 THÍ NGHIỆM 2: TÁI SINH CHỒI IN VITRO TỪ ĐOẠN THÂN MANG
MẮT NGỦ CỦA DẠ YẾN THẢO. ................................................................ 31
TÀI LIỆU KHAM KHẢO ............................................................................... 41
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 43


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1 . Thành phần môi trƣờng nuôi cấy ........................................................ 7
Bảng 2 . Các nguyên tố khoáng ......................................................................... 9
Bảng 3 . Bố trí thí nghiệm khử mẫu ................................................................ 20
Bảng 4 . Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng đến sự
tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ yến thảo ................. 22
Bảng 5 . Tỷ lệ mẫu nhiễm của đoạn thân Dạ yến thảo sau 14 ngày SKC (%) 24
Bảng 6 . Tỷ lệ mẫu chết của đoạn thân Dạ yến thảo sau 14 ngày SKC (%) ... 27

Bảng 7 . Tỷ lệ mẫu sạch in vitro của đoạn thân Dạ yến thảo ở 14 ngày SKC
(%)................................................................................................................ 29
Bảng 8 . Số chồi của các đoạn thân Dạ yến thảo sau 5 tuần SKC (chồi) ........ 32
Bảng 9 . Chiều cao chồi của các đoạn thân Dạ yến thảo ở 5 tuần SKC (cm) 34
Bảng 10 . Đƣờng kính cụm chồi của các đoạn thân Dạ yến thảo sau 5 tuần
SKC (cm) .................................................................................................. 36
Bảng 11 . Số lá của các đoạn thân Dạ yến thảo sau 5 tuần SKC (lá) .............. 38

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Hoa Dạ yến thảo ................................................................................... 3
Hình 2. Tủ cấy đã đƣợc chuẩn bị và chiếu tia UV........................................... 20
Hình 3. Đoạn thân Dạ yến thảo bị nhiễm khuẩn và nhiễm nấm sau 14 ngày
cấy.... ......................................................................................................... 26
Hình 4. Đoạn thân Dạ yến thảo sau 7 ngày sau khi cấy .................................. 28
Hình 5. Đoạn thân Dạ yến thảo sau 14 ngày sau khi cấy. ............................... 28
Hình 6 . Mơ sẹo hình thành dƣới đáy chồi ở 5 tuần SKC................................ 33
Hình 7. Sự phát triển chiều cao chồi ở nghiệm thức P0 và P4 sau 3 tuần sau
khi cấy ...................................................................................................... 34
Hình 8. Sự phát triển mẫu cấy Dạ yến thảo sau 5 tuần SKC ........................... 39


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
NAA

Alpha-naphthaleneacetic acid

BA

Benzylamino purine

TDZ

Thidiazuron

MS

Murashige và Skong

Mg/L

Milligram/lit

SKC

Sau khi cấy

viii


CHƢƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Dạ yến thảo (Petunia hybrida L.) cịn có tên gọi khác là Yến thảo hoa hay Dã
yên thảo, là loài thực vật có hoa thuộc họ Cà (Solanaceae), có nguồn gốc từ
các nƣớc miền Nam châu Mỹ. Đây là loại cây chịu nhiệt, hoa có màu sắc đa
dạng nhƣ trắng, hồng, đỏ, tím… và dáng cây phong phú. Dạ yến thảo thƣờng

đƣợc trồng trong các chậu trang trí, chậu hoa treo trong nhà, trong vƣờn, làm
viền cho khu vƣờn và tô điểm cho góc vƣờn hay căn nhà thêm thêm rực rỡ,
nếu chăm sóc tốt cây có thể ra hoa quanh năm (Phạm Hoàng Hộ, 2000).
Hiện nay, Dạ yến thảo đƣợc trồng chủ yếu từ hạt, tuy nhiên giá bán hạt giống
Dạ yến thảo khá cao, từ 1.000 - 3.000 đ/hạt tùy loại hoa đơn, kép hay khảm.
Mặt khác, Dạ yến thảo có hạt rất nhỏ, tỷ lệ nảy mầm của hạt tƣơng đối thấp
chỉ khoảng 60%, cây con có tỷ lệ chết cao, do đó mà giá bán cây giống Dạ yến
thảo hiên nay khá cao. Ngoài ra, Dạ yến thảo cịn có thể nhân giống bằng
phƣơng pháp giâm cành, tuy nhiên phƣơng pháp nhân giống này cịn có hệ số
nhân thấp, cây giâm cành có sức sống yếu hơn cây gieo bằng hạt và nhanh tàn
hơn.
Phƣơng pháp nhân giống bằng cây nuôi cấy mô tế bào thực vật đang đƣợc áp
dụng khá phổ biến trên nhiều đối tƣợng cây trồng. Một trong số những ƣu
điểm nổi bật của nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô là hệ số nhân cao,
trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lƣợng lớn cây giống tƣơng đối
đồng nhất, cây giống sạch bệnh, giá thành thấp. Do đó đề tài “Tái sinh chồi in
vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của hoa Dạ yến thảo Petunia hybrid”
đƣợc tiến hành nhằm phân tích sự thay đổi hình thái trong q trình phát sinh
chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ Dạ yến thảo, góp phần hồn thiện q
trình vi nhân giống cây Dạ yến thảo.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tìm ra thời gian và nồng độ chất khử trùng thích hợp cho việc tạo nguồn vật
liệu khởi đầu.
Tìm ra đƣợc nồng độ chất điều hịa sinh trƣởng thích hợp cho việc tái sinh
chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ yến thảo.
1.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Thí nghiệm đƣợc nghiên cứu từ đoạn thân mang mắt ngủ của cây Dạ yến thảo
Petunia hybrid khỏe mạnh, không sâu bệnh đƣợc mua từ nhà vƣờn Sa Đéc.

1


1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Khảo sát thời gian và nồng độ chất khử trùng đến sự tạo nguồn vật liệu khởi
đầu.
Khảo sát các chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tái sinh chồi in vitro từ
đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ yến thảo.
1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA NGHIÊN CỨU

Kết quả của đề tài nghiên cứu sẽ cung cấp những thơng tin cần thiết nhằm góp
phần hồn thiện giai đoạn khử trùng và tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt
ngủ Dạ yến thảo.
Nghiên cứu giúp chọn đƣợc nồng độ chất điều hịa sinh trƣởng có hệ số tái
sinh chồi tối ƣu nhất dành cho Dạ yến thảo.

2


CHƢƠNG 2
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1 GIỚI THIỆU VỀ DẠ YẾN THẢO

Dạ yến thảo (Petunia sp.) là cây thân cỏ mềm, loại cây dễ trồng, nở nhiều hoa
và rất phong phú về màu sắc. Cây phù hợp trồng trong chậu treo trang trí trƣớc
thềm nhà hoặc trồng trong các bồn hoa trong vƣờn. Thuộc lồi thực vật có hoa
thuộc họ Cà (Solanaceae), có nguồn gốc từ các nƣớc miền Nam Châu Mỹ,
hiện nay Dạ yến thảo đã đƣợc phổ biến khắp thế giới với hàng trăm giống lai
F1. Phần lớn dã yên thảo đƣợc trồng ngày nay là dã yên thảo đã đƣợc lai tạo từ

Petunia axillaris, Pentunia violacea và Pentunia inflata (Thanh Truyền, 2014).
Là loài cây chịu nhiệt, ƣa sáng, hoa này sẽ điểm tô cho ban công nhà thêm
tƣơi tắn, đặc sắc nhất là thân cây và hoa có một lớp lơng tơ bao phủ thật mềm
mại, ấn tƣợng và tao nhã (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2020).
Dã yên thảo đƣợc chia thành 2 kiểu cây:
+ Dã yên thảo kép: cây thân leo, hoa lớn với nhiều cánh (grandiflora), đƣờng
kính của hoa có thể lên tới 13cm.
+ Dã yên thảo đơn: cây bụi, có rất nhiều hoa nhƣng hoa chỉ có một lớp cánh
(mulitflora), đƣờng kính của hoa khoảng 5-7,5cm, dễ trồng và ít bị ảnh hƣởng
bởi sâu bọ.
+ Dã yên thảo khảm: cây thân leo, hình dạng giống nhƣ dã yên thảo kép, cánh
hoa có 2 màu (Thanh Truyền, 2014).
2.2 LƢỢC KHẢO VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.2.1 Giới thiệu về cây Dạ yến thảo
2.2.1.1 Phân loại khoa học

Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Solanales
Họ: Solanaceae
Chi: Petunia
Lồi: P. hybrida

Hình 1. Hoa Dạ yến thảo

(Nguyễn Thị Thu Thủy, 2020)
3

2.2.1.2 Đặc điểm hình thái

Dạ yến thảo là cây thân cỏ, sống hằng năm, cây cao 15 – 30cm. Thân mềm
phủ đầy lơng dính, nhánh cây đƣợc phân ra từ các nách lá, một nách lá có thể
phân ra thành nhiều nhánh. Lá đơn, mọc cách mặt trên và mặt dƣới của lá có
lớp lơng phủ mịn, mép ngun khơng răng cƣa, màu xanh bóng. Hoa nhỏ, đơn
độc mọc ở nách lá, trên một cọng dài 2 – 3 cm, đài hoa cao 1 – 2,5 cm. Hoa
lƣỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dƣới của ống vành. Cánh đài hợp ở gốc,
còn lải ở quả, cánh trành hợp thành ống loe rộng ở đỉnh, nổi rõ các gân thùy.
Quả nang hai mảnh, nhiều hạt (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2020).
Tốc độ sinh trƣởng của hoa Dạ yến thảo nhanh. Hoa có dạng hình phễu, nhƣng
các dạng hoa Dạ yến thảo lai có hình dáng đa dạng và phong phú hơn nhiều.
Ví dụ nhƣ hoa cánh đơn, hoa kép với mép có viền quanh cánh với nhiều màu
sắc khác nhau nhƣ đỏ tía, màu hoa cà, màu oải hƣơng, hồng, đỏ, trắng, vàng
cam. Dạ yến thảo rũ hồng đậm có mùi thơm dịu dàng (Nguyễn Thị Thu Thủy,
2020).
Là lồi cây nhất niên thƣờng nở hoa vào mùa hè. Dạ yến thảo ƣa sáng, sẽ trở
nên mảnh khảnh và ít hoa nếu trồng trong tối. Cây thích hợp với điều kiện
ngập úng. Cây thích hợp với khí hậu nóng và ẩm, khơng chịu đƣợc nhiệt độ
q lạnh hay q nóng. Dạ yến thảo trồng đƣợc trên hầu hết các loại đất,
nhƣng tốt nhất là đất màu mỡ, đất có pH từ 6,0 – 7,0 (Nguyễn Thị Thu Thủy,
2020).
Dạ yến thảo thƣờng bị chết vì úng nƣớc, vì vậy cần tƣới nƣớc đúng liều lƣợng,
không tƣới nƣớc lên lá và nụ tránh làm thối lá và nụ, cải thiện điều kiện vệ
sinh và duy trì ẩm độ thích hợp. Ngồi ra, Dạ yến thảo thƣờng bị héo rũ do
nấm, bị thối nhũn do vi khuẩn cũng nhƣ sâu, sên, rệp cắn phá. Một số bệnh
virus cũng ảnh hƣởng nhiều đến cây nhƣ làm biến dạng lá, cây chậm phát triển,
hoa không có màu và hình dạng thay đổi, thân tàn lụi liên tục, thối đỉnh, lá có
những sọc xanh sáng, bị lốm đốm và héo, có khi kết dính thành cụm (Nguyễn
Thị Thu Thủy, 2020).

2.2.1.3 Đặc điểm phân bố

Hoa Dạ yến thảo thuộc chi 35 của một lồi thực vật có hoa, liên quan chặt chẽ
với cây thuốc lá, cà chua, khoai tây và ớt thuộc họ cà (Solanaceae). Cây hoa
Dạ yến thảo có nguồn gốc từ các miền Nam Châu Mỹ, hiện nay đƣợc trồng
rộng rãi ở các bãi cỏ, các khu đất rộng, vƣờn hoa khắp nƣớc ta. Ờ miền Bắc,
hoa nở vào dịp hè thu, còn ở miền Nam, hoa nở vào dịp Tết. Cây có nhiều tên
gọi khác nhau nhƣ là Dã yến thảo, Hoa cà,.... Đây là một loại cây lai mà tổ tiên
có từ nhiều lồi khác của chi Petunia, ví dụ nhƣ P. axillaris BSP (Large White
4


Petunia) hoa dạng ống dẹp, màu trắng hoặc P. virolace Lindl. (Vilolet –
flowered Petunia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím. Ngày nay, các nhà
vƣờn từ loại lai này còn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa xịe ngón rất
đẹp (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2020).
2.2.2 Kỹ thuật vi nhân giống

Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây của một kiểu gen đƣợc tuyển chọn
bằng cách sử dụng các bộ phận trên cây giống dùng làm mẫu cấy dựa trên cơ
sở tính tồn năng của tế bào và bằng kỹ thuật in vitro (Nguyễn Bảo Toàn,
2010). Vi nhân giống đƣợc bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mơ phân sinh từ
các cây định nhân sau đó khử trùng và đƣa vào ni cấy mơ trên mơi trƣờng
thích hợp. Ngồi ra, vi nhân giống có thể đƣợc thực hiện thông qua tạo phôi
hoặc tái sinh cây trực tiếp từ mô sẹo (Nguyễn Đức Thành, 2000).
2.2.2.1 Những ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật vi nhân giống (in vitro)

 Ƣu điểm
Hiện nay hàng loạt cây giống nhƣ cây lƣơng thực, cây thực phẩm, cây dƣợc
liệu, cây hoa, cây ăn trái, cây rừng,... đang đƣợc sản xuất theo quy mô công

nghiệp bằng công nghệ vi nhân giống. Công nghệ vi nhân giống có ý nghĩa
kinh tế cao, nhất là đối với các cây sinh sản chậm (cây rừng, cây gỗ, cây ăn
trái, cây dƣợc liệu), hoặc đối với cây cần cung cấp số lƣợng cây giống rất
nhiều trong thời gian ngắn nhƣ cây hoa (hoa hồng, phong lan) (Nguyễn Nhƣ
Hiền, 2007). Một số ƣu điểm có thể kể ra nhƣ sau:
Thực hiện trong phịng thí nghiệm với các chuẩn mực ổn định, không chịu ảnh
hƣởng dao động thất thƣờng của thời tiết và không phụ thuộc vào mùa vụ. Có
thể chủ động sản xuất giống đón đầu vụ.
Hệ số nhân giống cao, tốc độ tăng trƣởng nhanh và rút ngắn thời gian ra hoa
quả với những cây lâu năm (Phạm Thành Hổ, 2008).
Có thể tạo đƣợc một số lồi thực vật mà không thể tiến hành in vivo do nhân
giống in vivo có thể cảm ứng đƣợc sự trẻ hóa của mơ.
Trong ni cấy in vivo chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên có
thể chọn lọc kỹ lƣỡng và dễ dàng (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên,
2003).
Nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản
xuất nông nghiệp và lâm nghiệp. Đây thực sự đã và đang là cuộc cách mạng
xanh trong ngành trồng trọt. Hiện nay, phƣơng pháp nhân giống vơ tính đã trở
thành kỹ thuật nông nghiệp phổ biến, ngƣời ta đã sử dụng phƣơng pháp này
5


trong công tác chọn giống cây trồng (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy
Tiên, 2003).
 Nhƣợc điểm
Theo Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên (2003), việc nhân giống vơ
tính in vivo có những nhƣợc điểm sau:
- Kiểu gen thực vật không đƣợc ổn định trong một số hệ thống ni cấy.
- Tạo ra những cây khơng hồn tồn đúng nhƣ mong muốn.
- Đối với một loài cây thân gỗ việc cảm ứng rất rễ rất khó thực hiện.

- Việc chuyển cây từ trong ống ngiệm ra vƣờn ƣơm rất khó đối với một số cây.
- Phải xử lý mơi trƣờng và giá thể sống của cây nuôi cấy mô in vivo thật cẩn
thận.
- Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do việc cấy truyền mô sẹo và huyền phù tế
bào đƣợc lặp lại nhiều lần.
- Đối với một số mô, việc khử trùng trƣớc khi đƣa vào cấy rất khó thực hiện.
- Tốn nhiều cơng lao động khiến giá thành của cây tăng lên.
Trong một số trƣờng hợp nuôi cấy mô tạo ra những biến dị soma. Tần số biến
dị cũng hồn tồn khác nhau và khơng lặp lại. Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào
mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với ni cấy mô chồi đỉnh (Nguyễn Quang
Thạch và Nguyễn Thị Lý Anh, 2005).
Cây in vivo có sức sống yếu hơn cây trồng bên ngồi trong giai đoạn đầu để
cây thích nghi (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Để tồn tại trong in vivo, cây cần nhiều năng lƣợng để cung cấp từ bên ngoài
nhƣ đƣờng. Cây không tự quang hợp đƣợc, mặc dù gần đây vài tác giả đề nghị
nuôi cấy in vivo tự dƣỡng (Kozai và Smith, 1995).
2.2.2.2 Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật

 Định nghĩa
Nuôi cấy mô tế bảo thực vật đƣợc tiến hành thành cơng trên cơ sở tính
năng và khả năng biệt hóa của tế bào thực vật.
 Tính tồn năng của tế bào thực vật
Theo Haberlandt (1902), tính tồn năng có ở mọi tế bào, mỗi tế bào đều mang
tồn bộ lƣợng thơng tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành
một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Điều này đƣợc chứng minh

6


qua nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trƣờng ở rễ cây hòa thảo trong 12 ngày của

Kotte và Robbins (Vũ Văn Vụ và cs., 2000).
 Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào
Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phải cho đến khi thể hiện
một chức năng nào đó. Các tế bào khi ni cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và
chức năng. Ngoài ra, những tế bào này cũng có thể trở lại trạng thái của tế bào
phơi khi điều kiện thích hợp, q trình này gọi là phản biệt hóa. Tất cả các tế
bào trong cùng một cơ thể đều có khả năng biệt hóa và phân biệt hóa. Theo
Galson (1986) và Murasshige (1974), khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể
của tế bào thực vật giảm theo chiều từ ngọn xuống gốc. Điều này giúp việc lựa
chọn mẫu cấy đạt hiệu quả hơn. Đã có nhiều kết luận cho rằng những tế bào
càng gần hoặc khơng xa với trạng thái phơi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy
càng dễ thành công bấy nhiêu (Vũ Văn Vụ và cs., 2000).
2.2.2.3 Quy trình vi nhân giống

Vi nhân giống đã đƣợc Debergh (2006) chia thành 4 giai đoạn khác nhau
(khơng kể giai đoạn 0). Mỗi giai đoạn có một chức năng riêng. Sự thành công
của việc vi nhân giống tùy thuộc vào tất cả các giai đoạn trong ống nghiệm và
ngoài ống nghiệm.
Theo Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2016) các giai đoạn vi nhân giống gồm 4 giai
đoạn:
In vivo

Giai đoạn 0 : Sự chuẩn bị của cây mẹ

In vitro

Giai đoạn 1 : Vô trùng mẫu cấy
Giai đoạn 2 : Nhân – cấy chuyển
Giai đoạn 3a : Kéo dài
Giai đoạn 3b : Tạo rễ và tiền thuần dƣỡng

In vivo

Giai đoạn 4 : Thuần dƣỡng

2.2.2.4. Thành phần môi trường nuôi cấy

Thành phần nuôi cấy bao gồm rất nhiều chất. Thông thƣờng đƣợc chia thành
hai thành phần: thành phần cơ bản là thành phần ln ln có trong mơi
trƣờng và thành phần tự chọn là thành phần có thể thêm hoặc khơng thêm vào
môi trƣờng ở Bảng 1.
Bảng 1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy
Các thành phần cơ bản

Các thành phần tự chọn

7


Nƣớc

Chelates

Các nguyên tố khoáng đa, vi lƣợng

Chất thẩm thấu

Nguồn carbohydrate

Than hoạt tính

Vitamins

Amino acid

Chất tạo gel

Đạm hữu cơ

Chất điều hồ sinh trƣởng
(Nguồn: Nguyễn Bảo Tồn, 2010)
Thành phần cơ bản gồm có:
 Nƣớc
Nƣớc là thành phần quan trọng trong môi trƣờng nuôi cấy, vì nƣớc chiếm 95%
mơi trƣờng dinh dƣỡng (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009).
Nƣớc sử dụng trong nuôi cấy mô thƣờng là nƣớc cất một lần, không nên sử
dụng nƣớc máy.Trong một số trƣờng hợp ngƣời ta sử dụng nƣớc cất hai lần
hoặc nƣớc khử ion (khử khoáng).
Nƣớc khử ion đƣợc tạo ra bằng cách cho nguồn nƣớc tiếp xúc với các loại
nhựa mang điện tích. Các loại nhựa này sẽ hút và liên kết với các muối, loại
bỏ chúng ra khỏi nƣớc. Tuy đã loại bỏ hết các ion, nhƣng trong nguồn nƣớc
vẫn còn chứa đựng các loại vi khuẩn và virus mà các loại nhựa mang điện tích
khơng thể loại bỏ (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021).
 Các ngun tố khống
Có nhiều ngun tố khóang đƣợc sử dụng trong mơi trƣờng ni cấy mỗi
ngun tố có một vai trị riêng. Các ngun tố khóang đƣợc chia thành hai
nhóm: đa lƣợng và vi lƣợng (Bảng 2).

8

Bảng 2. Các nguyên tố khoáng
Các nguyên tố khoáng đa lƣợng

Các nguyên tố khoáng vi lƣợng

Nitrogen (dạng ammonium và nitrare)

Chlorine (Cl)

Potassium (K)

Sắt (Fe)

Calcium (Ca)

Bor (B)

Magnesium (Mg)

Mangan (Mn)

Phosphorus (P)

Sodium (Na)

Sulphur (S)

Kẽm (Zn)
Đồng (Cu)

Nickel (Ni)
Aluminium (Al)
Molybdenum (Mo)
Cobalt (Co)
Iodine (I)
(Nguồn: Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

 Nguồn carbohydrate
Đƣờng là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi
cấy mô thực vật. Đƣờng cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của mơ hay
cây ni cấy, vì q trình quang hợp của chúng trong điều kiện in vitro là
không đủ.
Đƣờng đƣợc sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô là đƣờng saccharose nồng
độ khoảng 1 - 5%, thƣờng sử dụng 2 - 3%. Đƣờng saccharose là dạng đƣờng
đƣợc tổng hợp và vận chuyển tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mơ
ni cấy. Cũng có thể sử dụng đƣờng glucose hoặc fructose. Nồng độ đƣờng
sử dụng phụ thuộc rất nhiều vào loại và tuổi mẫu cây (Nguyễn Quang Thạch
và cs., 2009).
Luu ý, đƣờng có thể bị caramel hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu (sẫm màu)
và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất amino (phản ứng Millard), ức chế sự
phát triển của tế bào (Dƣơng Công Kiên, 2003). Khi hàm lƣợng đƣờng cao,
mơ ni cấy khó hút nƣớc. Hàm lƣợng đƣờng quá thấp là một trong những
nguyên nhân gây ra hiện tƣợng mọng nƣớc (thủy tinh thể, vitrification) ở mẫu
ni cấy. Đây là trở ngại chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vƣờn
ƣơm (Debergh, 2006).
9


 Vitamin
Thông thƣờng thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trƣởng và

phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến
dƣỡng khác nhau (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Vitamin
đƣợc sử dụng nhƣ là coenzyme với một lƣợng rất nhỏ (Nguyến Bảo Toàn,
2010).
Vitamin thƣờng đƣợc sử dụng nhất là nicotinic acid (PP), thiamine (vitamin
B1), riboflavin (vitamin B2), pyridoxine (vitamin B6), biotin (vitamin H), acid
folic (vitamin M), acid ascorbic (vitamin C, thƣờng sử dụng nhƣ là chất chống
oxy hoá).
Myo-inositol thƣờng sử dụng với hàm lƣợng 100mg/L môi trƣờng. Myoinositol có tác dụng thúc đẩy sinh trƣởng và phát triển giống nhƣ các vitamin,
trong nhiều trƣờng hợp có vai trị nhƣ nguồn carbon của môi trƣờng nuôi cấy.
Hiện nay, trong q trình pha chế mơi trƣờng, ngƣời ta thƣờng thêm các dung
dịch vitamin vào môi trƣờng trƣớc khi hấp khử trùng.
Tuy nhiên, trong các nghiên cứu về vitamin, ngƣời ta nhận thấy tốt nhất là nên
lọc khử trùng các dung dịch vitamin và sau đó thêm vào mơi trƣờng đã đƣợc
hấp khử trùng (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021).
 Chất tạo gel
Có 2 chất tạo mơi trƣờng nuôi cấy rắn hoặc bán rắn là agar và gelrite.
Gelrite: một gellan gum (hetero-polysaccharide) đuợc tạo ra bởi vi khuẩn
Pseudomonas elodea.
Agar (thạch): sản phẩm tự nhiên đƣợc trích từ tảo, là một polysaccharide.
Hàm lƣợng sử dụng 0,5-10% tùy theo chất lƣợng của chúng và loại môi
trƣờng đƣợc sử dụng. Trong đó, agar thƣờng đƣợc sử dụng nhất để tạo môi
trƣờng rắn hoặc bán rắn để nuôi cấy mô thực vật. Agar đƣợc hòa tan với nƣớc
tạo ra dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60-100°C, và đặc lại khi nhiệt độ giảm
xuống cịn 45°C. Agar và đặc tính gel tuỳ thuộc vào thƣơng hiệu của nhà sản
xuất trong đó cần lƣu ý đến: độ tinh khiết, hàm lƣợng ẩm độ chứa trong agar,
sự sinh trƣởng của mẫu cấy trong mơi trƣờng có agar.
Mơi trƣờng lỏng khơng chứa ít chất tạo gel. Trong q trình sử dụng mơi
trƣờng lỏng để nuôi cấy mô thực vật thƣờng phải lắc nhẹ các bình ni cấy
trên máy lắc. Ngồi ra, có thể sử dụng các thành phần hỗ trợ nhƣ cầu giấy lọc,

tấm polyethylene. Cầu giấy lọc có một đầu nhúng vào môi trƣờng, đầu kia
chứa mẫu. Tấm polyethylene nổi trên môi trƣờng lỏng và cho các chất dinh
dƣỡng thấm qua (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021).
10


 Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật
Các chất điều hịa sinh trƣởng là thành phần khơng thể thiếu trong mơi trƣờng
ni cấy, có vai trị quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu
quả tác động của chất điều hòa sinh trƣởng phụ thuộc vào nồng độ sử dụng,
hoạt tính của chất điều hịa sinh trƣởng, mẫu ni cấy.
Chất điều hịa sinh trƣởng gồm: chất kích thích sinh trƣởng và chất ức chế sinh
trƣởng (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021).
Nhóm auxin
Đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trƣởng và giãn nở
của tế bào, tăng cƣờng các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích
hình thành rễ và tham gia vào cảm ứmg phát sinh phơi vơ tính. Do đó, nó đƣợc
áp dụng trong vi nhân giống và tạo rễ của cành giâm (Nguyễn Thị Mỹ Duyên
và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021).
Auxin tự nhiên đƣợc tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA). Nó
hiện diện ở nồng độ cao ở vùng mô phân sinh của thực vật và đƣợc chứng
minh là có liên quan đến nhiều đáp ứng sinh lý. IAA đƣợc bổ sung vào môi
trƣờng nghiên cứu thƣờng ở nồng độ khá cao (0,1 - 30 mg/L). Trong lĩnh vực
nuôi cấy mô, hiệu quả chính của nó là trên sự phân chia tế bào và quá trình
giảm phân. Một trong những tác dụng chính của auxin là kích thích q trình
tạo rễ. Do đó, chúng thƣờng đƣợc ứng dụng trong vi nhân giống và tạo rễ của
cành giâm (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Auxin tổng hợp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất là: IBA (indole-3-butyric acid),
NAA (Alpha-naphthaleneacetic acid), 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid).
Các auxin này thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với cytokinine. Chúng ổn định

với nhiệt độ và ánh sáng hơn IAA. Do đó, chúng có thể đƣợc hấp khử trùng.
Chúng có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, hàm lƣợng đƣợc sử dụng phổ biến
từ 0,1 - 2 mg/L. Tùy theo loại auxin, hàm lƣợng sử dụng và đối tƣợng nuôi
cấy... mà tác động sinh lý của auxin là tác động kích thích sinh trƣởng của mơ,
hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn
đến hình thành mơ sẹo (callus).
Chất ngăn cản auxin
TIBA (2,3,5-Tri-iodobenzoic acid) đƣợc sử dụng nhƣ chất cản auxin do tính
chất ngăn cản con đƣờng vận chuyển auxin ở một số vùng tế bào trong cây.
Nhóm cytokinin
Cytokinin là adenine đƣợc thay thế N-6 kết hợp với auxin gây ra sự phân chia
tế bào ở thực vật. Kinetin và benzyl adenine (BA) đƣợc tổng hợp đầu tiên,
nhƣng gần đây ngƣời ta chứng minh là chúng có thể đƣợc tạo ra tự nhiên ở vài
loại cây. Ngày nay, cả hai đƣợc sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô. Cytokinin
11


đƣợc tổng hợp ở rễ, từ đó vận chuyển lên chồi. Chúng đóng vai trị chính trong
sự thành lập chồi và cơ quan trong nuôi cây mô.
Các loại cytokinin thƣờng đƣợc dùng trong nuôi cấy bao gồm: Zeatin (6-[4hydroxy-3 -metyl-but-2-eny lamino] purine), Kinetin (6 furfurylamino purine),
BAP (bezy lamino purine), TDZ (thidiazuron đƣợc sử dụng rộng rãi trong
nuôi cấy mô hiện nay (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng,
2021).
Ngoài ra cịn có DPU (diphenylurea) đƣợc trích từ nƣớc dừa, đƣợc sử dụng
nhƣ là thành phần thêm vào trong vi nhân giống. DPU này đƣợc chứng minh
là cytokinin chính trong nƣớc dừa. Sự khám phá tình cờ dẫn đến sự phát triển
một nhóm chất điều hồ sinh trƣởng mới giống cytokinin là thidiazuron.
Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh trƣởng của mơ sẹo,
nhƣng có ảnh hƣởng rõ rệt đến phát sinh phơi vơ tính của mẫu nuôi cấy.
Cytokinin thƣờng đƣợc sử dụng với mục đích kích thích sự sinh trƣởng chồi

trong ni cấy mơ. Hàm lƣợng sử dụng của các loại cytokinin dao động từ 0,12mg/L. Ở những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến
sự hình thành chồi bất định (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh
Hằng, 2021).
Trong ni cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần cả
hai, đa số các trƣờng hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở
những tổ hợp tỷ lệ khác nhau (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh
Hằng, 2021).
Tƣơng tác auxin/cytokinin
Theo các nghiên cứu của nhiều tác giả đã cho thấy tỷ lệ auxin và cytokinin
trong môi trƣờng nuôi cấy ảnh hƣởng đến sự thành lập tạo chồi và rễ. Một tỷ
lệ cao cytokinin và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi. Trong khi tỷ lệ cao
auxin và cytokinin thấp thích hợp cho sự tạo rễ, mức độ trung gian giữa hai tỷ
lệ này thích hợp tạo callus (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng,
2021)..
 Tính thẩm thấu của mơi trƣờng
Sự hấp thu nƣớc của tế bào và mô thực vật trong môi trƣờng nuôi cấy bị chi
phối bởi thế năng của nƣớc trong dịch bào và trong môi trƣờng dinh dƣỡng.
Các thành phần chính có ảnh hƣởng đến thế năng của nƣớc trong môi trƣờng
bao gồm: hàm lƣợng đƣờng (thông thƣờng đƣờng 2% đƣợc cho là có hiệu quả
thẩm thấu), hàm lƣợng agar, một số thành phần muối khoáng. Do đó, tính
thẩm thấu của mơi trƣờng sẽ liên quan đến sự hấp thu dinh dƣỡng từ môi
trƣờng nuôi cấy đến tế bào thực vật. Nếu tính thẩm thấu tốt, tế bào thực vật
hấp thu đủ lƣợng nƣớc và dinh dƣỡng giúp mẫu nuôi cấy sẽ phát triển tốt
(Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021).
12