BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 - Full 10 điểm

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4
DOI: 10.15625/vap.2020.00083

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri LÊN CÁC
CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)
Trần Thị Phương Dung*, Nguyễn Hồ Phương Uyên
Tóm tắt: Đề tài được thực hiện với mục tiêu đánh giá sự biến động về huyết học
và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh trên cá Tra giống (45-50 g) khi nhiễm vi
khuẩn Edwarsiella ictaluri sau 2-4 tuần. Vi khuẩn Edwarsiella ictaluri là tác nhân
gây chết cá Tra giống chiếm tỉ lệ 51,2%. Kết quả phân tích các chỉ tiêu huyết học
cho thấy số lượng hồng cầu giảm mạnh ở cá bị bệnh mủ gan (p < 0,05), đồng thời
có sự xuất hiện của hồng cầu khơng nhân và hồng cầu thối hóa. Các loại bạch
cầu lympho, bạch cầu mono hay bạch cầu trung tính đều biến động theo hướng
giảm ở thời điểm sau hai tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn nhưng tăng trở lại
sau bốn tuần có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Khả năng diệt khuẩn của huyết
thanh cá bệnh cao hơn cá khỏe.
Từ khóa: Edwardsiella ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus, huyết học, miễn dịch.

1. MỞ ĐẦU
Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là mợt trong những lồi cá da trơn nước
ngọt có giá trị kinh tế cao được ni phổ biến ở Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL)
(Phan và nnk., 2009). Theo thống kê từ Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt
Nam (VASEP), trong 9 tháng đầu năm 2018 kim ngạch xuất khẩu cá Tra đến 127 quốc gia
trên thế giới đạt 1,6 tỉ USD, tăng 24% so với cùng kỳ năm 2017. Tuy nhiên, trong những
năm gần đây, việc sản xuất và tiêu thụ cá Tra đang phải đối mặt với nhiều khó khăn và
thách thức do giá cả bấp bênh, thị trường xuất khẩu khơng ổn định và việc thâm canh hóa
với mật đợ nuôi cao đã làm cho bệnh trên cá xảy ra thường xuyên hơn (Le & Cheong,
2010). Bệnh phổ biến và nguy hiểm trên cá Tra giống ở ĐBSCL từ năm 2007 là bệnh mủ
gan (chiếm 51,2%) (Lý Thị Thanh Loan, 2008). Hiện nay, các nghiên cứu về vaccine
nhằm tăng cường khả năng đề kháng cao, góp phần thúc đẩy nghề nuôi thủy sản bền vững
và hiệu quả hơn về kinh tế cũng như mơi trường. Nhiều cơng trình nghiên cứu về đặc điểm

sinh lí, sinh hóa, khả năng gây bệnh, độc lực của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cũng như
sự biến đổi mô học do vi khuẩn này gây ra đã được công bố trên các đối tượng cá Tra với
các kích cỡ khác nhau làm nền tảng cho việc tạo vaccine. Tuy nhiên, thông tin về sự biến
đổi các chỉ số huyết học và khả năng miễn dịch của cá Tra bị nhiễm vi khuẩn E. ictaluri
giai đoạn cá giống (45-50 g) rất ít và rời rạc. Nghiên cứu này nhằm đánh giá tổng quát sự
biến động các tế bào máu và kháng thể đặc hiệu bảo vệ cá Tra (Pangasianodon
hypophthalmus) chống lại vi khuẩn E. ictaluri khi nhiễm bệnh ngồi tự nhiên. Vì vậy,
nghiên cứu về ảnh hưởng của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri lên các chỉ tiêu huyết học và
khả năng tiêu diệt vi khuẩn huyết thanh của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai
Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh
*Email:


PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI

671

đoạn cá giống từ 45-50 g trong thời gian mắc bệnh dài từ 2-4 t̀n được thực hiện góp
phần cung cấp thêm thơng tin làm cơ sở cho việc chẩn đốn và phịng bệnh bệnh mủ gan
một cách đầy đủ hơn.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Cá Tra giống (Pangasianodon hypophthalmus) có kích cỡ khoảng 45-50 g/con. Cá
được ni ổn định 3 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm để cho cá quen với điều kiện sống
trong bể. Cá được nuôi trong mơi trường nước pH=7-7,5, nhiệt đợ duy trì ở mức nhiệt đợ
phịng tương ứng nhiệt đợ nước 27-28 oC. Cá được cho ăn thức ăn công nghiệp 3 lần/ngày
vào lúc 7 h, 12 h, 17 h. Chọn cá bố trí thí nghiệm có kích thước tương đối đồng đều, khỏe
mạnh, linh hoạt và da sáng bóng. Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm với 3 nghiệm thức (NT): (i)
NT1 cá tiêm nước muối sinh lí; (ii) NT2 cá tiêm vi khuẩn nồng độ 104 CFU/mL; (iii) NT3
cá tiêm vi khuẩn nồng độ 105 CFU/mL. Mỗi NT 15 con (lặp lại 3 lần). Thu mẫu máu 15 cá

thể/NT qua 3 thời điểm: (i) Lần 1: trước cảm nhiễm; (ii) Lần 2: sau khi tiêm cá với vi
khuẩn hay nước muối sinh lí 2 tuần; (iii) Lần 3: sau khi tiêm cá với vi khuẩn hay nước
muối sinh lí 4 tuần.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nhuộm vi khuẩn gram âm mẫu phết mô
Phương pháp được mô tả bởi Lưu Thị Thanh Trúc (2014): phết mẫu mô chứa vi
khuẩn lên lam, cố định bằng đèn cồn, sau đó cho lần lượt các dung dịch Crustal violet (30
giây), lugon (60 giây), ethanol (15-30 giây), safranin (60-80 giây). Tại mỗi bước đều rửa
bằng nước cất 5 giây. Sau đó đưa lam lên kính quan sát ở vật kính (X40).
Phương pháp nhuộm HE mẫu mơ
Phương pháp được mô tả bởi Lưu Thị Thanh Trúc (2014): cố định mẫu bằng
formalin 10%. Sau đó cắt tỉa mẫu, khử nước, làm trong mẫu và ngấm paraffin. Sau đó tiến
hành đúc khối mẫu, cắt mẫu. Nhuộm mẫu bằng Mayer’s Hematoxylin và Eosin (HE). Sau
đó đưa lam lên kính quan sát ở vật kính (X40).
Phương pháp định lượng số lượng hồng cầu
Phương pháp được mô tả bởi Natt & Herrick (1952) có hiệu chỉnh: lấy máu cá từ
đợng mạch chủ đuôi bằng kim tiêm 1 mL tiệt trùng. Dùng ống hút pha loãng hồng cầu hút
máu lên đúng vạch 0,5. Đưa đầu ống pha loãng vào dung dịch pha loãng hồng cầu
(Hayems), hút từ từ đến vạch 101, vừa hút vừa xoay nhẹ ống pha loãng. Ngừng hút khi
đến vạch 101, rút ống pha loãng ra khỏi dung dịch pha lỗng, đặt ngón trỏ vào đầu của
ống pha lỗng, tháo dây hút ra. Lắc ống pha loãng trong 3 phút. Bỏ 3-4 giọt đầu, lau khơ
đầu ống pha lỗng, Cho hỗn hợp dung dịch lan tỏa vào đầy buồng đếm, để yên trong 2
phút. Đếm hồng cầu 4 ô lớn (1 ơ lớn có 16 ơ nhỏ) ở 4 góc của buồng đếm và 1 ô ở trung
tâm buồng đếm. Cơng thức tính mật đợ hồng cầu: N1 = A x (4000 : 80) x 200 = A x 10000
(số hồng cầu đếm được trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ) là A).


BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM

672

Phương pháp định lượng số lượng bạch cầu tổng
Phương pháp được mô tả bởi Hrubec et al., (2000) như sau: nhỏ một giọt máu cách
đầu lam kính 1 cm. Mợt tay giữ lam kính, tay cịn lại cầm lam kéo, nghiêng 45 o tiếp xúc
cạnh ngắn vào giọt máu để cho máu lan tỏa theo cạnh này, khi giọt máu đã được chia đều,
đẩy nhanh và đều lam kéo theo chiều dài của lam nằm ngang. Cố định tiêu bản bằng cách
tay trái cầm tiêu bản nghiêng 30o, tay phải cầm pipet nhỏ 3 - 4 giọt cồn tuyệt đối lên phần
đầu của tiêu bản, nghiêng tiêu bản cho cồn chảy hết về đuôi của tiêu bản máu. Nhỏ giọt
dung dịch thuốc nḥm Giemsa phủ kín diện tích máu, để 15 - 20 phút sau đó rửa tiêu
bản. Đếm tổng số 1.500 tế bào hồng cầu và bạch cầu trên mẫu nhuộm. TBC = (Số bạch
cầu trong 1.500 tế bào × R) / Số hồng cầu trong 1.500 tế bào (TBC là số lượng bạch cầu
trong 1 mm3 máu. R là số lượng hồng cầu trong 1 mm3 máu.
Phương pháp định lượng số lượng từng loại bạch cầu
Phương pháp được mô tả bởi Hrubec et al., (2000): đếm tổng số bạch cầu bằng 100 tế
bào. Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm3) = (số lượng mỗi loại BC × mật đợ TBC)/100
Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn của huyết thanh
Phương pháp được mô tả bởi Từ Thanh Dung và nnk. (2013) như sau: Dùng kim tiêm
1 mL để lấy máu và cho vào ống eppendorf 1,5 mL, để yên và giữ lạnh ở 4 oC trong vòng
2 - 3 giờ. Tiến hành li tâm 6.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau khi li tâm, lấy phần huyết
thanh cho vào ống eppendorf sạch và tiến hành xác định hiệu giá kháng thể hoặc trữ lạnh
(-20 oC). Vi khuẩn E. ictaluri được bất hoạt bằng formol 2% và giữ trong ngăn mát tủ lạnh
24 giờ. Sau đó, dung dịch vi khuẩn được li tâm 3500 vòng/phút trong 15 phút để rửa sạch
formol bằng nước muối sinh lí tiệt trùng, thao tác được lặp lại 2 - 3 lần. Hiệu giá kháng thể
trong huyết thanh được xác định bằng phản ứng vi ngưng kết kháng nguyên - kháng thể
trên các đĩa nhựa (microplate) 96 giếng. Cho 25 µL huyết thanh vào giếng số 1 và 2. Từ
giếng số 2 trở đi cho vào mỗi giếng 25 µL nước muối sinh lí. Trợn đều huyết thanh với
nước muối sinh lí ở giếng 1, hút 25 µL chuyển sang giếng số 2 rồi trợn đều, tiếp tục hút 25
µL ở giếng số 2 chuyển sang giếng 3 rồi trộn đều. Tiếp tục làm như vậy cho đến giếng
cuối cùng (ở giếng 12 lấy ra 25 µL bỏ đi). Cho 25 µL kháng nguyên (vi khuẩn E. ictaluri
bị bất hoạt) vào mỗi giếng rồi trộn đều. Để yên 4 - 5 giờ ở nhiệt đợ phịng rồi đọc kết quả.

Dương tính (+): đáy giếng tạo thành một lớp ngưng kết trải rợng. Âm tính (-): ở đáy giếng
chỉ có mợt chấm trịn nhỏ màu trắng.
2.3. Xử lí số liệu
Số liệu được xử lí dựa trên mợt nhân tố bằng cách sử dụng phần mềm MS Excel
nhập và xử lí số liệu. Các số liệu trung bình được trình bày ở dạng TB ± SD. Phân tích
thống kê bằng phương sai mợt yếu tố mẫu đo lường có lặp lại (ONE WAY ANOVA). Sử
dụng kiểm định so sánh đối chiếu Duncan được dùng để so sánh sự khác biệt giữa các mức
của yếu tố thí nghiệm. Mức xác suất p < 0,05 được chấp nhận như tiêu chuẩn đánh giá sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê. Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm
IBM SPSS Statistics version 22.0.


PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI

673

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri đến hình thái nội quan và mơ học của cá Tra
Các đặc điểm về hình thái nợi quan và mơ học cá Tra nhiễm vi khuẩn E. ictaluri qua
nghiên cứu này trên cá Tra giống giai đoạn 45 - 50 g cho thấy vi khuẩn xâm nhập vào các
nội quan sau 12 h cảm nhiễm; khi bị xâm bởi nhiễm vi khuẩn E. ictaluri thì các cơ quan
như gan, thận và tỳ tạng xuất hiện các biểu hiện đặc trưng cho bệnh mủ gan như xung
huyết, xuất huyết, xuất hiện đốm trắng mủ từ 1 - 3 mm sau 3 ngày gây nhiễm và hoại tử
các nội quan khi quan sát mơ học khi nḥm HE dưới kính hiển vi (Hình 1). Kết quả này
phù hợp với nghiên cứu của Suanyuk et al., (2013) và Soto (2012) với các bệnh tích điển
hình do vi khuẩn Edwarsiella ictaluri.

b

a

d

c

Hình 1. a. Nội quan cá với nhiều đốm trắng; b. Vi khuẩn xâm nhập vào mô cá sau 12 h (nhuộm
Gram âm vệt phết mẫu mô); c. Tổn thương xuất huyết và nghẽn cầu thận trên mô thận sau 72 h
(nhuộm HE); d. Tổn thương xuất huyết trên mô gan sau 72 h (X40) (nhuộm HE)

3.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri đến số lượng hồng cầu của cá Tra
Bên cạnh hồng cầu trưởng thành với hình dạng bình thường với cấu trúc hình cầu, ở
những bể cá được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trong đợt thu mẫu lần 2 và 3 còn ghi
nhận được sự xuất hiện của nhiều dạng hồng cầu bất thường như hồng cầu không nhân và
hồng cầu bị thối hóa (Hình 2).

a

b

c

Hình 2. a. Vi khuẩn bao quanh HC sau 6 h cảm nhiễm; b. HC mất nhân sau 2 tuần cảm nhiễm;
c. HC thối hóa sau 2 tuần cảm nhiễm (X40)


BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM

674

Trong những nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Liễu và nnk. (2011) cũng ghi nhận

được sự xuất hiện của các dạng hồng cầu bất thường ở đối tượng cá Tra bị nhiễm bệnh.
Bảng 1. Sự biến động số lượng hồng cầu (x106 TB/mm3) của cá Tra qua các lần thu mẫu
ở các mật độ vi khuẩn E. ictaluri khảo sát
Thời gian
Lần 1
Lần 2
Lần 3

Đối chứng
2,071 ± 0,134xa
2,103 ± 0,124xa
2,131 ± 0,129xa

NT1 (104 CFU/ml)
2,057 ± 0,113xa
1,279 ± 0,089yb
1,310 ± 0,068yb

NT2 (105 CFU/ml)
2,099 ± 0,123xa
1,284 ± 0,090yb
1,301 ± 0,075yb

Các chữ cái x, y trong cùng một cột chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05.
Các chữ cái a, b trong cùng một hàng chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05.

Từ kết quả định lượng hồng cầu ở Bảng 1 có thể nhận thấy: (1) số lượng hồng cầu ở
NT đối chứng qua các lần thu mẫu khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
chứng tỏ trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm khơng có sự ảnh hưởng của các tác
nhân ngoại cảnh làm thay đổi các chỉ số huyết học; (2) cá sau khi cảm nhiễm vi khuẩn E.

ictaluri ở cả hai NT 104 và 105 CFU/m đều có số lượng hồng cầu thu ở lần 2, lần 3 giảm
có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với lần 1 trước khi cảm nhiễm và so với NT đối chứng.
Nguyên nhân là do vi khuẩn xâm nhập vào xung quanh hồng cầu và gây vỡ hồng cầu sau
24 giờ sau gây nhiễm (Quách Văn Cao Thi, 2017). Sự biến động số lượng hồng cầu theo
chiều hướng giảm ở lần thu mẫu thứ 2 và 3 ở NT 2 và NT3 cũng phù hợp với một số
nghiên cứu khác, như Nguyễn Thị Thúy Liễu và nnk. (2011) khi phân tích các thơng số
huyết học ở cá Tra nuôi bị bệnh mủ gan đã xác định số lượng hồng cầu ở cá bệnh chỉ còn
0,75x106 TB/mm3, giảm 63,4% so với cá khỏe.
3.3. Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri đến tổng số lượng bạch cầu của cá Tra
Bảng 2. Sự biến động số lượng tổng bạch cầu (x104 TB/mm3) của cá Tra qua các lần thu mẫu
ở các mật độ vi khuẩn E. ictaluri khảo sát
Thời gian
Lần 1
Lần 2
Lần 3

Đối chứng
13,773 ± 2,815xa
13,146 ± 2,780xa
13,040 ± 2,508xa

NT1 (104 CFU/ml)
13,046 ± 2,350xa
4,889 ± 1,091yb
8,138 ± 1,175zb

NT2 (105 CFU/ml)
12,633 ± 2,431xa
4,855 ± 1,021yb
7,835 ± 1,218zb

Các chữ cái x, y, z trong cùng một cột chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05.
Các chữ cái a, b trong cùng một hàng chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05.

Từ Bảng 2 cho thấy: (i) kết quả định lượng tổng BC của cá khỏe trước khi thí
nghiệm của các NT khơng có sự khác biệt (p > 0,05) và đạt giá trị trung bình là (13,773 ±
2,815)x104 TB/mm3 đối với NT đối chứng, NT1 và NT2 lần lượt là (13,046 ± 2,350)x104
TB/mm3 và (12,633 ± 2,431)x104 TB/mm3; (ii) số lượng tổng BC ở NT đối chứng qua cả
3 lần thu mẫu đều khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) chứng tỏ trong
suốt thời gian tiến hành thí nghiệm, sự biến đợng của số lượng tổng bạch cầu không chịu
ảnh hưởng của các tác nhân ngoại cảnh; (iii) ở các NT được cảm nhiễm vi khuẩn, lượng


PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI

675

tổng bạch cầu đều giảm ở lần 2 và bắt đầu tăng trở lại vào lần 3 với sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê (p < 0,05) và tổng BC ở NT2 và NT3 qua lần lấy mẫu 2 và 3 đều thấp hơn
NT1 đối chứng. Kết quả này phù hợp nghiên cứu Benli & Yildiz (2004) khi cảm nhiễm vi
khuẩn trên cá đã kết luận rằng khoảng vài ngày đầu sau khi được cảm nhiễm vi khuẩn,
tổng lượng bạch cầu của cá sẽ tăng cao để chống lại sự xâm nhập và tấn cơng của vi
khuẩn. Bên cạnh đó, mợt số nghiên cứu gần đây cũng đã ghi nhận rằng số lượng tổng bạch
cầu ở cá bệnh khi thu mẫu ở những giai đoạn khác nhau sẽ có sự biến đợng khác nhau.
Ngoài ra, nghiên cứu của Từ Thanh Dung (2010) kết luận rằng mật đợ tổng bạch cầu của
cá Tra có sự thay đổi rõ rệt tùy thuộc vào mức độ nhiễm bệnh của cá. Dựa trên những cơ
sở và nghiên cứu trên, có thể dự đốn số lượng tổng bạch cầu của cá Tra ngay sau khi
được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri có tăng so với cá khỏe để chống lại sự xâm nhiễm và
tấn công của vi khuẩn, nhằm bảo vệ cơ thể. Tuy nhiên ở thời điểm thu mẫu lần 2, số lượng
tổng bạch cầu có sự suy giảm mạnh có thể giải thích do chính sự tác động của vi khuẩn E.

ictaluri lên cấu trúc mô của một số cơ quan, đặc biệt là thận trước và tỳ tạng trong mợt
thời gian dài từ đó làm biến đổi cấu trúc và suy giảm chức năng tạo máu của những cơ
quan này (Brason, 1993). Theo nghiên cứu về đặc điểm mô bệnh học của cá Tra bị bệnh
mủ gan của Quách Văn Cao Thi (2017), ở ngày thứ 2 sau khi cảm nhiễm quan sát mô thận
của cá thấy đã bắt đầu xuất hiện hiện tượng xung huyết, xuất huyết dẫn đến thận mất đi
những chức năng quan trọng và làm suy giảm chức năng tạo hồng cầu, bạch cầu, khơng
cịn khả năng tạo kháng thể và thực bào. Đây chính là những nguyên nhân làm cho số
lượng hồng cầu và tổng bạch cầu trong hai NT được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri đều
giảm đáng kể ở lần thu mẫu sau hai tuần cảm nhiễm. Tuy nhiên, ở lần thu mẫu sau bốn
tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn, số lượng hồng cầu và bạch cầu đều có sự tăng nhẹ so
với lần thu mẫu trước có thể giải thích do vai trị đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể nguyên
phát (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007).
3.4. Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri đến số lượng các loại bạch cầu của cá Tra
Trong q trình phân tích định loại và định lượng tế bào bạch cầu, đã ghi nhận được
sự xuất hiện của các loại bạch cầu như: bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu
trung tính, khơng quan sát được bạch cầu ưa bazơ, bạch cầu ưa axit rất hiếm gặp nên
khơng thể định lượng (Hình 3).

a

b

c

Hình 3. a. BC Lympho; b. BC mono; c. BC trung tính (mũi tên) (X40)


BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM

676

Nghiên cứu về sự biến động của các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá Tra
nuôi nhiễm vi khuẩn E. ictaluri của Nguyễn Thị Thúy Liễu và nnk. (2011) cũng cho kết
quả không quan sát được bạch cầu ưa axit và bạch cầu ưa bazơ.
3.5. Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri đến tỉ lệ các loại bạch cầu của cá Tra
Bảng 3. Sự biến động tỉ lệ các lọai bạch cầu (x106 TB/mm3) của cá Tra qua các lần thu mẫu ở
các mật độ vi khuẩn E. ictaluri khảo sát
NT
Bạch
cầu
Lympho

Neutro

Mono

ĐỐI CHỨNG
Lần 1
Lần 2
Lần 3

NT1 (104 CFU/ml)
Lần 1
Lần 2
Lần 3

NT2 (105 CFU/ml)
Lần 1
Lần 2
Lần 3

11,164
±
2,322xa
1,253
±
0,435xa
1,323
±
0,370xa

10,539
±
1,829xa
1,145
±
0,480xa
1,365
±
0,357xa

10,394
±
2,208xa
1,043
±
0,387xa
1,189
±
0,248xa

10,799
±
2,633xa
1,079
±
0,286xa
1,269
±
0,348xa

10,619
±
2,135xa
1,048
±
0,338xa
1,331
±
0,291xa

3,181
±
0,775yb
0,748
±
0,261yb
0,958
±
0,217yb

5,399
±
0,721zb
1,157
±
0,491xa
1,581
±
0,290xb

3,511
±
0,684yb
0,586
±
0,231yb
0,755
±
0,199yb

5,670
±
0,926zb
0,964
±
0,246xa
1,201
±
0,188xa

Các chữ cái a, b,c, trong cùng một hàng chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05.
Các chữ cái x,y trong cùng một cột chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05.

Dựa vào kết quả số lượng từng loại BC phân tích ở Bảng 3, nhìn chung các loại BC
lympho, BC mono hay BC trung tính đều biến đợng theo hướng giảm ở thời điểm sau hai
tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn nhưng tăng trở lại sau bốn tuần. Trong 2 NT được cảm
nhiễm vi khuẩn so với NT đối chứng, tỉ lệ các loại BC lại có sự biến đợng giảm sau 2 tuần
và vào thời điểm bốn tuần có sự bắt đầu tăng lại của các loại bạch cầu. Sự thay đổi tỉ lệ
các loại BC trước và sau khi được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri có thể được giải thích
do BC neutro có vai trị trong phản ứng viêm, là loại BC đầu tiên đến vị trí vi khuẩn xâm
nhập với số lượng lớn, ngồi ra cịn có khả năng thực bào. Do đó sự tăng nhẹ tỉ lệ BC
trung tính cho thấy tại thời điểm thu mẫu sau hai tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn hoạt
động của hệ bạch huyết đang được gia tăng để tiêu diệt các vi sinh vật lạ xâm nhập vào cơ
thể. BC mono là tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch khơng đặc hiệu với vai trị thực
bào tiêu diệt vi khuẩn và đặc biệt là khả năng trình diện kháng nguyên để thực hiện bước
khởi đầu của quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Sau hai tuần cảm nhiễm vi khuẩn, tỉ lệ
BC mono có gia tăng nhẹ nhằm giúp hệ thống miễn dịch nhận biết được kháng nguyên,
sản xuất kháng thể chuyên biệt. Mặt khác, BC lympho có vai trị quan trọng trong miễn
dịch dịch thể và miễn dịch tế bào nên sự giảm nhẹ tỉ lệ BC lympho có thể do sự xâm
nhiễm của vi khuẩn E. ictaluri vào cơ thể cá làm suy giảm hệ miễn dịch và tình trạng này
kéo dài trong hai tuần gây ra hiện tượng đó. Sau 4 tuần vi khuẩn bị suy yếu nên các loại
bạch cầu tăng để sản xuất kháng thể tham gia đáp ứng miễn dịch. Kết quả này phù hợp với
hàm lượng kháng thể tăng lên mãnh liệt để đạt cực đại khoảng ngày thứ 20 - 30 sau khi
tiêm kháng nguyên (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007).


PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI

677

3.6. Xác định hiệu giá kháng thể của cá Tra sau bốn tuần cảm nhiễm vi khuẩn
E. ictaluri
Kháng thể huyết thanh thường xuất hiện ngay trước thời điểm số lượng tương bào
đạt cực đại khoảng ngày thứ 10-15 và hàm lượng kháng thể tăng lên mãnh liệt để đạt cực
đại khoảng ngày thứ 20-30 sau khi tiêm kháng nguyên (Đặng Hoàng Oanh và Đoàn Nhật
Phương, 2007). Dựa trên cơ sở đó thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch cho cá Tra được thực
hiện ở thời điểm sau bốn tuần kể từ ngày cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri cho cá để đảm
bảo hiệu giá kháng thể thu được đạt cực đại.
Hiệu giá kháng thể

Hiệu giá kháng thể

3
2.47

2.5
1.8

2
1.5
1
0.5

0.27

0

Đối chứng

NT1

Mật độ vi khuẩn E.ictaluri (CFU/ml) khảo sát

NT2

Hình 4. Biến động hiệu giá kháng thể của cá Tra qua các lần thu mẫu
ở các mật độ vi khuẩn E. ictaluri (CFU/ml) khảo sát

Kết quả phân tích hiệu giá kháng thể cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p
< 0,05) giữa các NT sau bốn tuần cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. Cụ thể, hiệu giá kháng
thể trung bình của cá ở NT đối chứng có giá trị là 0,27 ± 0,57, chứng tỏ hệ thống miễn
dịch ở nhóm cá đối chứng chưa được kích thích nên lượng kháng thể rất thấp. Ở các NT
được cảm nhiễm vi khuẩn thì hiệu giá kháng thể trung bình tăng rõ rệt so với NT đối
chứng, cụ thể, ở NT1 cá được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri mật đợ 104 CFU/mL thì hiệu
giá kháng thể trung bình ghi nhận được là 1,8 ± 0,83, cao gấp 6,7 lần so với NT đối chứng.
Ở NT2 cá được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri mật độ 105 CFU/mL thì hiệu giá kháng
thể trung bình ghi nhận được là 2,47 ± 0,72, cao gấp 1,4 lần so với NT1 và gấp 9,15 lần so
với NT đối chứng và sự sai khác hiệu giá kháng thể ở cả ba NT đều có ý nghĩa thống kê (p
< 0,05). Kết quả trên cịn cho thấy hiệu giá kháng thể trung bình tăng tỉ lệ theo mật độ vi
khuẩn cảm nhiễm cho cá. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Bùi Quang Tề
(2004), mức độ sản xuất kháng thể trong đáp ứng miễn dịch nguyên phát có tương quan
thuận với liều lượng kháng nguyên đưa vào cơ thể. Vì vậy, trên cá Tra trong 3 NT khảo
sát thì NT tiêm vi khuẩn mật đợ 105 CFU/mL thì tạo kháng thể tốt nhất cho việc đáp ứng
miễn dịch trong 4 tuần trên cá giai đoạn 45 - 50 g.
4. KẾT LUẬN
Kết quả phân tích các chỉ tiêu huyết học cho thấy số lượng hồng cầu giảm mạnh ở cá
bị bệnh mủ gan (p< 0,05), đồng thời có sự xuất hiện của hồng cầu không nhân và hồng cầu

678

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM

thối hóa. Các loại BC lympho, BC mono hay BC trung tính đều biến đợng theo hướng
giảm ở thời điểm sau hai tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn nhưng tăng trở lại sau bốn tuần
có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh cá bệnh cao hơn cá
khỏe. Nghiên cứu này là cơ sở cho các nghiên cứu khác khi tiêm vaccine cho cá ở dải nồng
độ rộng hơn và khảo sát trong khoảng thời gian dưới 2 tuần vì qua hai tuần các tế bào bạch
cầu bắt đầu giảm làm giảm khả năng miển dịch trên cá Tra giai đoạn 46 - 50 g. Tuy nhiên,
việc tạo và duy trì kháng thể trong 4 tuần khi cá được tiêm vi khuẩn rất có ý nghĩa trong việc
tạo vaccine giúp cho việc tăng khả năng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cho cá.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Benli A. C. K., H. Y. Yildiz, 2004. Blood parameters in Nile tilapia (Oreochromis niloticus L.)
spontaneously infected with Ewardsiella tarda. Short communication, Aquaculture Research,
pp. 1388-1390.
Branson E., 1993. Basic anatomy and physiology. Abbott Laboratories, North Chicago, USA,
447pp.
Từ Thanh Dung, Trần Hoa Cúc, Nguyễn Hoàng Nhật Uyên, Mã Lê Diễm Trang, 2013. Khả năng
đáp ứng miễn dịch của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) chống lại Edwardsiella
ictaluri. Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, 26 (2013): 269-276.
Từ Thanh Dung, Nguyễn Thị Tiên và Nguyễn Anh Tuấn, 2012. Nghiên cứu tác nhân gây bệnh
trắng đuôi trên cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) và giải pháp phịng trị. Tạp chí khoa
học Đại học Cần Thơ, trang 136-145.
Ferguson H.W., J.F. Turnbull, A. Shin, K. Thompson, T.T. Dung, M. Crumlish, 2001. Bacillary
necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage), from the Mekong Delta, Vietnam.
Journal of Fish Diseases, 24: 509-513.
Hrubec T. C., J. L. Cardinale, S. A.Smith, 2000. Hematology and plasma chemistry reference
intervals for cultured Tilapia (Oreochromis hybrid ). Vet. Clin. Pathol., 29:7-12
Le T. C., Cheong F., 2010. Perceptions of risk and risk management in Vietnamese catfish

farming: An empirical study. Aquaculture Economics and Management, 14: 282-314.
Nguyễn Thị Thúy Liễu, Bùi Thị Bích Hằng, Đặng Thị Hồng Oanh, 2011. Đánh giá các yếu tố
miễn dịch không đặc hiệu trên cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi trong ao bị bệnh
mũ gan. Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ, 17a: 20-29.
Lí Thị Thanh Loan, 2008. Báo cáo tổng kết nhiệm vụ thường xuyên “Quan trắc, cảnh báo môi
trường và dịch bệnh thủy sản một số vùng nuôi thủy sản các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long
và miền Đông Nam Bộ”. Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2.
Natt M. P., Herrick C. A., 1952. A new blood diluent for counting erythrocytes and leukocytes of
the chicken. Poult Sci., 31: 735-738.
Đặng Thị Hồng Oanh, Đồn Nhật Phương, 2007. Giáo trình Miễn dịch học động vật thủy sản.
Nxb. Trường Đại học Cần Thơ.
Phan L. T., Tam B. M., Thuy N. T. T., Gooley G. J., Ingram B. A. , Hao N. V. , Phuong N. T., De
Silva S. S., 2009. Current status of farming practices of striped catifish, Pangasianodon
hypophthalmus in the Mekong Delta, Vietnam. Aquaculture, 296: 227-236.
Soto E., 2012. Edwardsiella ictaluri as the Causative Agent of Mortality in Cultured Nile Tilapia.
Journal of Aquatic Animal Health, 24(2): 81-90.


PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI

679

Suanyuk N., Rogge M., Thune R., Watthanaphiromsakul M., Champhat N., Wiangkum, W.,
2013. Mortality and pathology of hybrid catfish, Clarias macrocephalus (Günther) × Clarias
gariepinus (Burchell), associated with Edwardsiella ictaluri infection in southern Thailand. J.
Fish Dis., 37(4): 385-95.
Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học thủy sản. Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I.
Quách Văn Cao Thi, 2017. Nghiên cứu đặc điểm bệnh học và cơ chế đa kháng thuốc của hai loài
vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá Tra
(Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở đồng bằng sông Cửu Long. Luận án tiến

sĩ Chuyên ngành vi sinh vật, Đại Học Cần Thơ.
Lưu Thị Thanh Trúc, 2014. Thực hành chẩn đốn bệnh trên đợng vật thủy sản. Nxb. Nông nghiệp.

STUDYING THE EFFECTIVENESS OF Edwardsiella ictaluri Bacteria
ON HEMATOLOGICAL INDICATORS OF STRIPED CATFISH
(Pangasianodon hypophthalmus)
Tran Thi Phuong Dung*, Nguyen Ho Phuong Uyen
Abtracts: This study aimed to evaluate the differences in haematological
parameters and ability to kill bacteria using serum from fish (45-50 g) infected
by Edwardsiella ictaluri bacteria at 2-3 weeks. Edwarsiella ictaluri bacteria
accounts for 51.2% of Tra catfish deaths. Results from haematological analysis
revealed a significant reduction (p < 0.05) in the total number of red blood cells,
the presence of non-nuclear red cells and degraded red blood cells in infected
fish. Both mono and neutral lymphocytes fluctuated for two weeks after the fish
became infected, but generally trended downward. However, lymphocyte levels
significantly increased again after 4 weeks. The ability to kill bacteria in the
serum of diseased fish was higher than in healthy fish.
Keywords: Edwardsiella ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus, haematology,
immune response.

Ho Chi Minh City University of Education
*Email: