Ứng dụng kỹ thuật phân tử trong định lượng vi sinh vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC TẾ HỒNG BÀNG

Chuyên đề:

ỨNG DỤNG
KỸ THUẬT PHÂN TỬ
TRONG ĐỊNH LƯỢNG VI

SINH VẬT

GVHD: TS. Nguyễn Tuấn Anh
Học viên: PGS.TS. Nguyễn Thị Nga
Học phần: Hồ Cao Quốc Thịnh – 2326080032
Nguyễn Đoàn Tường Uyên - 2326080046
Thực hành Y sinh học di truyền

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2024

MỤC LỤC
I. TỔNG QUAN....................................................................................................3

1. Định nghĩa vi sinh vật: ..................................................................................3
2. Kỹ thuật PCR và Real-time PCR: ...............................................................10
3. Ý nghĩa ứng dụng kỹ thuật phân tử trong định lượng vi sinh vật:..............20
II. BỆNH LÝ COVID–19 ...................................................................................22
1. Mức độ lan truyền của COVID-19: ............................................................22
2. Triệu chứng của COVID-19: ......................................................................23
3. Cơ chế sinh bệnh: ........................................................................................24
4. Phương pháp định lượng virus Sar CoV-2: ................................................25
III. VIÊM GAN SIÊU VI B ................................................................................34

1. Phân loại viêm gan siêu vi B:......................................................................35
2. Triệu chứng của bệnh viêm gan B: .............................................................36
3. Các đường lây nhiễm của bệnh Viêm gan siêu vi B:..................................37
4. Cấu trúc Virus Viêm gan B:........................................................................38
5. Cơ chế gây bệnh:.........................................................................................39
6. Một số chỉ số trong xét nghiệm quan trọng trong viêm gan siêu vi B: ......40
7. Phương pháp định lượng Hepatitis B virus (HBV): ...................................40
III. VIÊM GAN SIÊU VI C ................................................................................46
1. Tổng quan: ..................................................................................................46
2. Khả năng gây bệnh:.....................................................................................48
3. Dịch tễ học Viêm Gan C: ............................................................................48
4. Đường lây truyền: .......................................................................................49
5. Một số xét nghiệm quan trọng trong viêm gan siêu vi C: ..........................50
7. Phương pháp định lượng Hepatitis C virus (HCV): ...................................51

2

TỔNG QUAN
1. Định nghĩa vi sinh vật:
Theo GS.TS. Lê Huy Chính1 định nghĩa vi sinh vật là những vi sinh vật nhỏ bé
chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi - đó là những sinh vật đơn bào (protist), bao
gồm: vi khuẩn, động vật nguyên sinh và vi nấm (bacteria, protozoa, fungi).
Vi khuẩn là những đơn bào khơng có màng nhân (procaryote) và cùng với virus
hợp thành môn Vi sinh vật học, tiếng Anh gọi là Microbiology. Vi khuẩn có đầy đủ
các đặc điểm của một sinh vật, nhưng virus thì khơng hồn tồn.
Virus khơng có cấu trúc tế bào (dưới tế bào), genome chỉ chứa một trong hai loại
acid nucleic, ký sinh bắt buộc trong tế bào cảm thụ, sinh sản theo cấp số nhân và di
truyền được nịi giống; kích thước rất bé (từ 10 nm đến 300 nm) và chỉ nhìn được
dưới kính hiển vi điện tử, vị trí phân loại của virus chưa rõ ràng, chúng được nghiên
cứu trong môn Vi sinh vật học.

Prion, một loại mầm bệnh mới đơn giản hơn virus (Virus-like agents: Prions).
Vào những năm 90 của thế kỷ XX, một tác nhân gây bệnh mới đã được phát hiện là
prion. Prion là những protein khơng bình thường, nó để khăng cao với nhiệt độ và
phần lớn các hóa chất sát trùng.
Rickettsia, Chlamydia và Mycoplasma là những vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc
(trước đây xếp loại chúng vào nhóm vi sinh vật trung gian giữa vi khuẩn và virus).
Rickettsia là những vi sinh vật bé hơn vi khuẩn nhưng lớn hơn virus. Chúng cũng ký
sinh nội bào bắt buộc như virus, nhưng chúng có nhiều đặc điểm của vi khuẩn hơn
(có cấu trúc tế bào, có hai loại acid nucleic, nhưng thiếu một số enzym hơ hấp năng
lượng), có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học (kích thước trung bình 0, 25 x1
𝜇𝑚). Chlamydia có những đặc điểm như Rickettsia nhưng bé hơn (khoảng 150 nm),
là một tác nhân gây bệnh quan trọng (mắt hột và nhiễm trùng đường sinh dục tiết
niệu). Mycoplasma chỉ khác Rickettsia là khơng có vách, nên cùng được xếp vào các
vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc.

1.1. Vi khuẩn:
Vi khuẩn là những sinh vật nhân sơ đơn bào có kích thước cực kỳ nhỏ (0,2 – 10
𝜇𝑚) , một số chúng cịn thuộc loại ký sinh trùng. Có bộ khung tế bào và các bào
quan như ty thể và lục lạp. Là nhóm hiện diện đơng đảo nhất trong sinh giới. Vi

1 Theo Sách Vi sinh vật Y học _ Chủ biên GS.TS. Lê Huy Chính _ Nhà xuất bản Y học

3

khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi, trong đất, nước, chất thải phóng xạ và cả bên trong
những sinh vật khác.

Vi khuẩn là những vi sinh vật có chuỗi ADN xoắn kép (ngoại trừ Mycoplasma)
và vách tế bào. Hầu hết vi khuẩn sống ngoại bào, nhưng một số lại ưu tiên cư trú và
nhân lên trong nội bào. Các mầm bệnh nội bào bắt buộc chỉ có thể phát triển, sinh

sản và gây bệnh trong các tế bào của vật chủ. Ví dụ về các mầm bệnh này bao gồm
Chlamydia, các loài Chlamydophila và Rickettsia. Các mầm bệnh nội bào ni cấy
có thể sống và sinh sản bên trong hoặc bên ngồi tế bào vật chủ. Ví dụ về các mầm
bệnh này bao gồm Salmonella typhi, loài Brucella, Francisella tularensis, N.
gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Legionella và loài Listeria, Mycobacterium
tuberculosis.

Nhiều vi khuẩn hiện diện ở người dưới dạng hệ vi sinh vật bình thường, thường
có số lượng lớn và ở nhiều khu vực (ví dụ, trong đường tiêu hóa và da). Chỉ có một
vài lồi vi khuẩn là mầm bệnh của con người.

a) Cấu tạo của vi khuẩn:

Vách tế bào
Tạo nên hình dạng của vi khuẩn và nằm bên ngoài màng sinh chất, được làm bằng
polymer gọi là peptidoglycan. Sự hiện diện của thành tế bào ở vi khuẩn được phát
hiện bằng hiện tượng ly tương, bằng cách nhuộm và bằng phân lập trực tiếp.

4

Thành tế bào vi khuẩn gram dương: Thành phần chủ yếu là mucopeptit gọi là
murein, một chất trùng hợp mà những đơn vị hoá học là những đường amin. N-acetyl
glucosamin và axit N-acetyl muramic và những chuỗi peptit ngắn chứa alanin, axít
glutamic và axit diaminopimelic hoặc lysin. Ngoài ra vách tế bào của một số vi
khuẩn gram dương còn chứa axit teichoic. Ở một vài loại vi khuẩn, axit teichoic
chiếm tới 30% trọng lượng khô của vách tế bào.

Thành tế bào vi khuẩn Gram âm: Lớp mucopeptit mỏng hơn và hai lớp lipoprotein
và lipopolysaccharide ở bên ngoài, lớp lipoprotein chứa tất cả những axit amin thơng
thường. Khơng có axit teichoic, thành tế bào vi khuẩn gram âm chứa một lượng lipit

đáng kể, khoảng 20% trọng lượng khô của vách tế bào.

Chức năng của thành tế bào là duy trì hình dáng của vi khuẩn, quyết định tính bắt
màu Gram của vi khuẩn (do tính thẩm thấu khác nhau của vi khuẩn Gram âm và
Gram dương). Tạo nên kháng nguyên thân O của vi khuẩn đường ruột: Để điều chế
kháng nguyên 0 của vi khuẩn đường ruột xử lý vi khuẩn không di động bằng nhiệt
và cồn. Tạo nên nội độc tố của vi khuẩn đường ruột. Nội độc tố chỉ được giải tỏa lúc
vi khuẩn bị ly giải. Ở vi khuẩn đường ruột, nội độc tố là những phức hợp lipopoly-
saccarit dẫn xuất từ vách tế bào.

Vỏ bao
Là một cấu trúc nhầy bọc quanh vách tế bào của một số vi khuẩn, thường là
polysaccharide, chỉ có vỏ của B.anthracis là một polypeptide acid D-glutamic. Vỏ
có thể phát hiện dễ dàng ở huyền dịch mực tàu, ở đó nó hiện ra như một vùng sáng
giữa mơi trường mờ đục và tế bào vi khuẩn trông rõ hơn.
Cũng có thể phát hiện bằng phản ứng phình vỏ hoặc bằng kỹ thuật nhuộm đặc
biệt. Sự đột biến tạo thành vỏ rất dễ nhận biết vì tế bào có vỏ tạo nên khuẩn lạc bóng
láng hoặc nhầy M trong khi tế bào không vỏ tạo nên khuẩn lạc xù xì R. Nhiệm vụ
duy nhất được biết của vỏ là bảo vệ vi khuẩn chống thực bào và chống virus muốn
gắn vào vách tế bào.
Màng tế bào chất (màng nguyên tương)
Là màng bán thấm dày khoảng 10 nm nằm sát vách tế bào. Người ta có thể chứng
minh sự hiện diện của nó bằng hiện tượng ly tương hoặc nhuộm với xanh Victoria
4R. Nó chứa 60 – 70% lipit, 20 – 30% protein và một lượng nhỏ hydrat cacbon.

5

Màng nguyên tương có chức năng rào cản thẩm thấu của tế bào, ngăn cản không
cho nhiều phẩm vật vào bên trong tế bào nhưng lại xúc tác việc chuyên chở hoạt
động của nhiều phẩm vật khác vào bên trong tế bào.

Hơn nữa màng tế bào chứa nhiều hệ thống enzyme và vì vậy có chức năng giống
như ti lạp thể của động vật và thực vật. Màng nguyên tương cho thấy những chỗ lõm
vào gọi là mạc thể. Ở vi khuẩn Gram dương mạc thể khá phát triển cho thấy hình
ảnh nhiều lá đồng tâm. Ở vi khuẩn Gram âm mạc thể chỉ là vết nhăn đơn giản.

Tế bào chất (nguyên tương)
Là cấu trúc được bao bọc bên ngoài bởi màng nguyên tương, ở trạng thái gel, cấu
trúc này gồm 80% nước, các protein có tính chất enzyme, cacbohydrat, lipid và các
ion vô cơ ở nồng độ cao, và các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp. Nguyên tương
chứa dày đặc những hạt hình cầu đường kính 18 nm gọi là ribosome. Ngồi ra cịn
có thể tìm thấy những hạt dự trữ glycogen, granulosa hoặc polymetaphotphat.
Ribosome
Là nơi tạo ra hoặc tổng hợp protein, được tạo thành từ các hạt giàu RNA.
Thể nhân
Có thể thấy với kính hiển vi ánh sáng sau khi nhuộm hoặc soi trực tiếp ở kính
hiển vi pha tương phản. Nhân có thể hình cầu, hình que, hình quả tạ hoặc hình chữ
V. Khảo sát ở kính hiển vi điện tử nhân khơng có màng nhân và bộ máy phân bào.
Nó là một sợi DNA trọng lượng phân tử 3×109 dallon và chứa một nhiễm sắc thể
duy nhất dài khoảng 1mm nếu không xoắn.
Nhân nối liền ở một đầu với thể mạc. Sự nối liền này giữ một vai trò chủ yếu
trong sự tách rời 2 nhiễm sắc thể con sau khi sợi nhiễm sắc thể mẹ tách đôi. Trong
sự phân chia nhân hai mạc thể qua chổ nối liền với màng nguyên tương di chuyển
theo những hướng đối nghịch theo hai nhóm con nối liền với chúng. Như thế màng
nguyên tương tự động như một bộ máy thô sơ của sự gián phân với mạc thể đảm
nhận vai trị thai vơ sắc.
Tiêu mao, nhung mao
Chịu trách nhiệm về tính di động của vi khuẩn. Người ta quan sát sự di động của
vi khuẩn dưới kính hiển vi đặt một giọt huyền dịch vi khuẩn ở lam kính và phủ một
lá kính mỏng. Lơng dài 3 – 12 mm hình sợi gợn sóng, mảnh 10 – 20 nm) nên phải

nhuộm với axit tannic để tạo thành một lớp kết tủa làm dày lông dễ phát hiện. Lông
phát xuất từ thể đáy ngay bên dưới màng nguyên tương và có chuyển động xoay tròn.

6

Bản chất protein nó tạo nên do sự tập hợp những đơn vị phụ gọi là flagellin tạo
thành một cấu trúc hình trụ rỗng. Cách thức mọc lơng là một đặc tính di truyền. Ở
một số loại nhiều lông mọc quanh thân, ở một số loại một lông mọc ở cực và ở một
số loại khác một chùm lông ở một cực. Nếu lông bị làm mất đi bằng cơ học thì lơng
mới được tạo thành nhanh chóng. Lơng đóng vai trị kháng ngun như kháng
ngun H ở vi khuẩn đường ruột.

Pili
Là những phụ bộ hình sợi, mềm mại hơn lơng, mảnh hơn nhiều và có xu hướng
thẳng đường kính 2 – 3nm và dài từ 0,3 – 1nm, tìm thấy từ một đến hàng trăm ở mặt
ngoài vi khuẩn, bản chất protein.
Pili phát xuất ở trong màng nguyên tương và xuyên qua vách tế bào. Pili được
tìm thấy ở vi khuẩn gram âm nhưng cũng có thể tìm thấy ở một số vi khuẩn gram
dương. Pili F có nhiệm vụ trong sự tiếp hợp. Những pili khác giúp cho vi khuẩn bám
vào niêm mạc hoặc bề mặt khác của tế bào.
Nha bào
Những thành viên của Bacillus, Clostridium và Sporosarcina tạo thành nội nha
bào dưới ảnh hưởng của mơi trường bên ngồi không thuận lợi, mỗi tế bào làm phát
sinh một nha bào. Nha bào có thể nằm ở giữa, ở đầu nút hoặc gần đầu nút tùy theo
loài, vách nha bào chứa những thành phần mucopeptide và axit dipicolinic. Sự đề
kháng của nha bào với hóa chất độc là do tính không thẩm thấu của vách nha bào,
sự đề kháng với nhiệt liên hệ đến trạng thái mất nước cao.
Vì chịu đựng với điều kiện khơng thuận lợi bên ngồi nha bào góp phần quan
trọng trong khả năng lây bệnh của trực khuẩn hiếu khí tạo nha bào như trực khuẩn
than hoặc trực khuẩn kỵ khí tạo nha bào như Clostridia, nhất là trực khuẩn uốn ván,

hoại thư, sinh hơi, ngộ độc thịt.2

b) Các loại vi khuẩn ngày nay
Có vơ số các loại vi khuẩn khác nhau. Cách phân loại vi khuẩn là theo hình dạng
của chúng như hình cầu, hình que, hình xoắn, hình dấu phẩy (phẩy khuẩn) hay hình
sợi...
Cầu khuẩn là những vi khuẩn có hình cầu nhưng cũng có thể là hình bầu dục hoặc
hình ngọn nến, cầu khuẩn cịn có cách gọi khác là cocci, có đường kính trung bình

2 Vi khuẩn là gì? Cấu tạo, mơi trường sinh sống thế nào? Lợi hay hại? – BV Đa khoa Tâm Anh

7

khoảng 1 μm. Cầu khuẩn được chia thành: Song cầu, liên cầu khuẩn, tụ cầu, trực
khuẩn và xoắn khuẩn.

Trực khuẩn: Đây là tên chung của những vi khuẩn có hình que. Có kích thước
của từ 0,5 - 1 - 4μm.

Xoắn khuẩn: Tên gọi của những vi khuẩn có từ hai vịng xoắn trở lên, kích thước
thay đổi 0,5 - 3 - 5 - 40μm. Xoắn khuẩn phần lớn thuộc loại hoại sinh, rất ít có khả
năng gây bệnh.

1.2. Virus:
Virus là một đơn vị sinh học nhỏ bé (kích thước từ 20 - 300 nm), có khả năng
biểu hiện những tính chất cơ bản của sự sống: gây nhiễm cho tế bào, duy trì được
nịi giống qua các thế hệ mà vẫn giữ tính ổn định về mọi đặc điểm sinh học của nó
trong tế bào cảm thụ thích hợp.
Đặc điểm cơ bản nhất để phân biệt virus với vi khuẩn là virus chỉ chứa một trong
hai loại acid nucleic (ADN hoặc ARN), virus sinh sản tăng lên theo cấp số nhân, cịn

vi khuẩn sinh sản theo kiểu phân đơi.

a) Cấu trúc của virus:
Virus có cấu trúc rất đơn giản,
khơng có enzym hơ hấp và
enzym chuyển hóa, vì vậy virus
bắt buộc phải ký sinh trong tế
bào cảm thụ.
Virus có nhiều hình thể khác
nhau: hình cầu, hình khối, hình
sợi, hình que, hình chùy, hình
khối phức tạp. Hình thể mỗi loại
rất khác nhau nhưng ln ổn định
đối với từng loại. Tùy theo cách
sắp xếp của acid nucleic và
capsid chia làm hai loại đối
xứng:
Đối xứng hình xoắn ốc: acid
nucleic và các capsomer được
sắp xếp dọc theo hình lị xo đều hay khơng đều.

8

Đối xứng hình khối: khi các capsomer được sắp xếp thành các hình khối cầu đa
diện.

Một số lồi có thể sắp xếp đối xứng khối và đối xứng xoắn trên từng phần. Cách
đối xứng này là đối xứng phức tạp.

Cấu trúc cơ bản còn được gọi là cấu trúc chung. Cấu trúc cơ bản bao gồm hai

thành phần chính mà mỗi virus đều phải có:

Acid nucleic (AN):
Mỗi loại virus đều phải có một trong hai acid nucleic: ARN (acid ribonucleic)
hoặc ADN (acid deoxyribonucleic). Những loại có cấu trúc ADN phần lớn đều mang
ADN sợi kép. Ngược lại, loại mang ARN thì chủ yếu ở dạng sợi đơn.
Các acid nucleic (AN) chỉ chiếm từ 1% tới 2% trọng lượng của hạt virus nhưng
có chức năng đặc biệt quan trọng:
AN mang mọi mật mã di truyền đặc trưng cho từng loài.
AN quyết định khả năng gây nhiễm trùng trong tế bào cảm thụ.
AN quyết định chu kỳ nhân lên trong tế bào cảm thụ.
AN mang tính bán kháng nguyên đặc hiệu.
Thành phần capsid:
Capsid là cấu trúc bao quanh acid nucleic. Bản chất hóa học của capsid là protein.
Capsid được tạo bởi nhiều đơn vị capsid bao gồm các phân tử protein có sắp xếp đặc
trưng cho từng lồi. Các đơn vị capsid đó được gọi là các capsomer.
Cùng với phần “lõi” AN, phần “vỏ” capsid của virus có thể sắp xếp đối xứng
xoắn, đối xứng khối hoặc đối xứng phức hợp. Cấu trúc capsid có chức năng quan
trọng:
Bao quanh AN để bảo vệ không cho enzym nuclease và các yếu tố phá hủy AN
khác.
Protein capsid tham gia vào sự bám vào những vị trí đặc hiệu của tế bào cảm thụ
(với các loại khơng có bao envelop).
Protein capsid mang tính kháng nguyên đặc hiệu. Capsid giữ cho hình thái và
kích thước ln được ổn định.

b) Cấu trúc riêng:
Cấu trúc riêng cịn được gọi là cấu trúc đặc biệt, chỉ có ở một số loài nhất định để
thực hiện những chức năng đặc trưng cho loại đó.
Cấu trúc bao ngoài (envelop):

9

Một số loài bên ngoài lớp capsid cịn bao phủ một lớp bao ngồi, được gọi là
envelop.

Bản chất hóa học của envelop là một phức hợp: protein, lipid, carbohydrate, nói
chung là lipoprotein hoặc glycoprotein. Nếu chỉ có màng thì đó là lớp dilipid. Nếu
có thêm gai nhú (spike) thì đó là glycoprotein.

Trên bao ngồi của một số lồi có những núm lồi lên, mang những chức năng
riêng biệt.

Chức năng riêng của envelop: Tham gia vào sự bám trên các vị trí thích hợp của
tế bào cảm thụ. Ví dụ: gpl20 của HIV hoặc hemagglutinin cúm. Tham gia vào giai
đoạn lắp ráp và giải phóng virus ra khỏi tế bào sau chu kỳ nhân lên.

Envelop tham gia vào hình thành tính ổn định kích thưốc và hình thái. Tạo nên
các kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt virus. Một số kháng nguyên này có khả năng
thay đổi cấu trúc.

Enzyme:
Trong thành phần cấu trúc có một số enzym, đó là những enzym cấu trúc, chúng
gắn với cấu trúc của hạt virus hồn chỉnh. Các enzym cấu trúc có thể gặp:
Neuraminidase, ADN hoặc ARN polymerase, men sao chép ngược (Reverse
transcriptase). Mỗi enzym cấu trúc có những chức năng riêng trong chu kỳ nhân lên
trong tế bào cảm thụ và chúng cũng mang tính kháng ngun riêng, đặc hiệu ở mỗi
lồi.

2. Kỹ thuật PCR và Real-time PCR:

2.1. Kỹ thuật PCR:

Cụm từ PCR được viết tắt từ Polymerase Chain Reaction nghĩa là chuỗi phản ứng
polymerase hay phản ứng khuếch đại gene. Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn
DNA với tốc độ nhanh, có độ chính xác cao, khơng cần sự hiện diện của tế bào.

PCR là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA hoặc sản xuất
và nhân bản nhiều mẫu DNA giống nhau theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến
hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó từ một mẫu nhỏ ban đầu hoặc là
một bản sao duy nhất.

Nó được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình xử lý DNA để giải trình tự.
PCR giúp phát hiện sự hiện diện hay vắng mặt của một gen để xác định các tác nhân
gây bệnh trong quá trình nhiễm trùng và khi tạo ra các cấu hình DNA pháp y từ các
mẫu DNA nhỏ.

10

a) Phản ứng PCR gồm 3 bước chủ đạo:

Biến tính (Denature
DNA): DNA mạch đơi
tách thành mạch đơn (94
– 96°C)

Bắt cặp (Anneal
primer): Nhiệt độ hạ
xuống (50 – 65°C) các
primer bám vào phân tử
DNA, bản chất của

primer là những đoạn
DNA mạch đơn có chiều
dài từ 15-30 nucleotide.

Kéo dài (Extend
primer): Nhiệt độ tối ưu để enzyme tổng hợp DNA mạch mới hoạt động (70 – 72°C)
– Giai đoạn tối ưu để tổng hợp DNA mạch mới hoạt động.

b) Nguyên tắc cơ bản
Dựa trên sự hoạt động của emzyme
Sự hiện diện của mồi chuyên biệt
Khả năng nối dài mồi của taq polymerase
Các nu tự do trong môi trường

11

c) Thành phần cơ bản trong phản ứng PCR:

1. Polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), enzyme này có nhiệt độ hoạt động
tối ưu ở 72°C.

2. 4 loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP là nguyên liệu để
tổng hợp ra các bản sao DNA.

3. DNA chứa trình tự mục tiêu (Template): Thơng thường trong xét nghiệm thì
đây là DNA thu nhận từ mẫu cần xét nghiệm.

4. Cặp mồi đặc hiệu (Primer): Đây là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 20
nucleotide và bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân
bản.

5. Cation 𝑀𝑔2+ (𝑀𝑔𝐶𝑙2) đây là co-factor quan trọng để Taq polymerase hoạt
động hiệu quả.

6. Dung dịch đệm Tris-KCI (PCR Buffer): Cung cấp môi trường thuận lợi cho
phản ứng nhân bản diễn ra.
d) Nguyên tắc hoạt động PCR:

Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

12

Giai đoạn biến tính: Nhiệt
độ sẽ được đưa lên 94 – 96°C,
từ 2 – 5 phút các liên kết
hydro sẽ bị phá vỡ khiến
DNA bị biến tính trở thành
dạng mạch đơn.

Giai đoạn bắt cặp (hoặc
giai đoạn gắn mồi): Nhiệt độ
được hạ xuống 50 – 65°C, 20
giây – 2 phút, các đoạn mồi sẽ
bắt cặp bổ sung vào 2 đầu
trình tự mục tiêu.

Giai đoạn kéo dài: Nhiệt
độ được đưa lên 68 – 72°C,
20 giây – 5 phút, Taq
polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung.

Giai đoạn biến tính:
Trong giai đoạn này, dung dịch chứa DNA mẫu và tất cả các thành phần cốt lõi
khác được đun nóng đến 94 – 95°C.

13

Đối với những enzyme DNA polymerase bắt buộc phải kích hoạt bằng nhiệt độ.
Nhiệt độ cao gây ra liên kết hydro giữa các bazơ trong hai dải DNA mẫu để phá
vỡ và hai sợi tách rời. Điều này dẫn đến hai chuỗi DNA đơn lẻ, sẽ hoạt động như
các khuôn mẫu để tạo ra các chuỗi DNA mới.
Điều quan trọng là nhiệt độ được duy trì ở giai đoạn này đủ lâu để đảm bảo rằng
các sợi DNA đã tách hoàn toàn.
Điều này thường mất từ 15 – 30 giây.
Giai đoạn bắt cặp:
Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50 – 65°C trong 20 – 40 giây để mồi gắn vào
sợi DNA đơn.
Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mỗi bắt cặp với sợi DNA, nhưng cũng
đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là mồi chỉ nên gắn hồn tồn với phần
trình tự bổ sung trên mạch khuôn.
Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gần không đặc hiệu.
Nếu q cao, mồi có thể khơng gắn được.
Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3 – 5°C so với Tm của mồi dùng
trong phản ứng. Polymerase liên kết với các phân tử lai DNA mồi – khuôn và bắt
đầu tổng hợp DNA.
Các đoạn mồi được thiết kế để bổ sung theo thứ tự các đoạn ngắn của DNA trên
mỗi đầu của chuỗi được sao chép.
Đoạn mới được xem là tác nhân đầu tiên trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme
polymerase chi có thể thêm các base DNA vào một chuỗi DNA kép. Chỉ một khi
đoạn mỗi được kể nói thì enzyme polymerase có thể gắn và bắt đầu tạo ra chuỗi

DNA bổ sung mới từ các cơ sở DNA có liên kết rời rạc lúc đầu.
Hai dải DNA tách rời được bổ sung và chạy theo các hướng ngược.
Bước này thường mất khoảng 10 – 30 giây.
Giai đoạn mở rộng:
Trong bước cuối cùng này, nhiệt được tăng lên 72°C để cho phép DNA mới được
tạo ra bởi một enzyme enzyme Taq DNA polymerase đặc biệt bổ sung thêm các base
DNA.
Các chuỗi ADN mới được tạo ra bằng cách sử dụng các sợi gốc làm mẫu. Một
enzyme DNA polymerase kết hợp các nucleotide DNA tự do với nhau. Enzyme này

14

thường là Taq polymerase, một enzyme ban đầu được phân lập từ một vi khuẩn ưa
nhiệt gọi là Thermus aquaticus.

Thứ tự mà trong đó các nucleotide tự do được thêm vào được xác định bởi trình
tự nucleotide trong sợi DNA gốc (mẫu).

Kết quả của một chu kỳ PCR là hai chuỗi chuỗi DNA mục tiêu, mỗi chuỗi chứa
một sợi mới được tạo ra và một sợi ban đầu.

Chu trình nhiệt của 1 quy trình PCR:
Như vậy, cứ qua một
chu kỳ nhiệt, số mạch
DNA sẽ được nhân đôi.
Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại
liên tục 30 – 40 lần thì số
bản sao sẽ là 230 ~ 240
bản sao.
Số lượng bản sao DNA

khổng lồ này khi được
gắn các phân tử phát tín
hiệu (ví dụ Ethidium
Bromide) có thể nhìn thấy
bằng mắt thường trên gel
điện di dưới ánh đèn UV.

e) Phát hiện sản phẩm PCR:
Điện di trên gel agarose
Phân loại DNA dựa vào kích thước
1. Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương, đoạn DNA

có kích thước ngắn di chuyển nhanh hơn so với đoạn có kích thước lớn.
2. Trong khi điện di, ethidium bromide sẽ đan xen vào cấu trúc sợi đôi DNA và

làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan sát dưới đèn UV.
f) Ứng dụng:

Phát hiện các tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan
B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1...), các
vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum...).

15

Phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường tình dục (Neisseria gonorrhoeae,
Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum...).

Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị
điều trị kháng sinh trước đó (ví dụ: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất
đầu...)

Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như Staphylococcus aureus – MRSA,
các vi khuẩn sinh ESBL hoặc betalactamase, carbapenemase...)

Xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt
của Escherichia coli.

Trong công nghệ sinh học, xét nghiệm sinh học phân tử được sử dụng trong việc
lập bản đồ gen, phát hiện gen, dịng hố gen, giải mã trình tự ADN...

Phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết.
Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát
hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA1 - BRCA2 trong ung thư vú, gen
TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-
1,2 trong u xơ thần kinh, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin...)
Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte
antigen)...

g) Ưu điểm:
Xét nghiệm PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với xét nghiệm thông
thường khác như:
Cho kết quả xét nghiệm nhanh, không quá 5 giờ kể từ khi bắt đầu làm xét nghiệm.
Độ đặc hiệu rất cao.
Phát hiện được nhiều tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà phịng thí nghiệm hóa,
sinh hay miễn dịch truyền thống khơng phát hiện được.
Cho kết quả định lượng số copies virus, hỗ trợ bác sĩ điều trị đánh giá giai đoạn,
hiệu quả điều trị, và tiên lượng bệnh.
Phát hiện các đột biến gene gây ung thư, và các bệnh di truyền khác...nhằm có
biện pháp phịng ngừa bệnh.

h) Nhược điểm:
Phải có phịng lab hiện đại, chuẩn mực; đòi hỏi kỹ thuật viên, bác sĩ phải có trình
độ chun mơn cao.
Giá thành xét nghiệm PCR còn khá cao.

16

Vài trường hợp như đã dùng kháng sinh, lấy hay bảo quản bệnh phẩm sai quy
cách có thể ức chế PCR khiến độ nhạy của xét nghiệm thấp.

PCR vẫn có nhược điểm là độ nhạy (sensitivity. Se) trong một số bệnh phẩm còn
thấp, nghĩa là cho "âm tính giả cịn cao. Điển hình là PCR trong bệnh viêm màng
não lao (Tuberculous meningitis), một bệnh địi hỏi phải chẩn đốn và điều trị sớm
để tiên lượng tốt và ít biển, di chứng. Dù PCR lao cho dịch não tủy có độ đặc hiệu
Sp cao gần tuyệt đối 98%, nhưng độ nhạy Se lạ rất thấp 56%. Vì thế, các bác sĩ lâm
sàng thường phải: Làm PCR lao thêm trên các mẫu khác như máu, nước tiểu, đờm,
dịch màn phối, màng bụng và làm thêm các xét nghiệm khác như IDR, soi đàm, chụp
phối...

2.2. Kỹ thuật Real-time PCR:
Kỹ thuật Real-time Polymerase Chain Reaction (real-time PCR) là một phương
pháp phân tích DNA hoặc RNA một cách chính xác và độ nhạy cao. Nó cịn được
gọi là quantitative PCR (qPCR) vì nó cung cấp thơng tin về lượng mục tiêu ban đầu
trong mẫu một cách số lượng.
Kỹ thuật này gần tương tự như kỹ thuật PCR, tuy nhiên ở đây có thêm một thiết
bị ghi tín hiệu khi xả ra phản ứng tổng hợp PCR. Dựa trên việc so sánh số vòng mẫu
thử và số vòng của mẫu chuẩn đạt được trong cũng một khoảng thời gian xảy ra phản
ứng, từ đó sẽ tính được số vòng mẫu thử gấp bao nhiêu lần số vòng mẫu chuẩn, rồi
dựa vào đó người ta tính được nồng độ DNA của mẫu thử.
Lưu ý: khi làm PCR thơng thường thì ta có thể dùng nắp ống tube PCR màu, cịn

khi làm Real-Time PCR thì khuyến cáo dùng loại nắp trong ở ống tube Real-Time
PCR.
Thành phần: tương tự như PCR, nhưng có thêm TaqMan probe hoặc EvaGreen
(mẫu dò).
Realtime PCR sử dụng mẫu dị TaqMan, trong kỹ thuật realtime PCR, có nhiều
cách khác nhau để tạo ra tín hiệu huỳnh quang sau mỗi chu kỳ. Cách dựa trên mẫu
dò TaqMan là một loại mẫu dò (probe) được sử dụng khá phổ biến trong kỹ thuật
realtime PCR. Thành phần trong một phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu

17

dòTaqMan gần như tương đồng với một phản ứng PCR thơng thường, ngoại trừ việc
trong thành phần có chứa thêm mẫu dò TaqMan.

Sơ đồ nguyên lý hoạt động của mẫu dò TaqMan
Mẫu dò TaqMan là một đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 24 - 30bp với đầu 5'
gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) và đầu 3' còn lại gắn chất hấp thụ
(quencher). Khi mẫu dò TaqMan còn nguyên vẹn, quencher sẽ hấp thụ tất cả ánh
sáng huỳnh quang do reporter phát ra. Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bị Taq
polymerase cắt mẫu dò bằng hoạt tính 5' - 3' exonuclease, reporter được giải phóng
tín hiệu huỳnh quang khơng cịn bị quencher hấp thu.

18

Mồi trong phản ứng realtime PCR thường có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55 –
60oC và thấp hơn mẫu dò TaqMan khoảng 5 – 10oC để đảm bảo mẫu dị ln bắt cặp
trước. Trình tự đích lựa chọn cũng không nên dài quá 150bp để phản ứng diễn ra tối
ưu nhất.

Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan cũng chỉ có

2 giai đoạn:

1. Biến tính ở 94 – 95oC trong 15 – 30 giây.
2. Bắt cặp và kéo dài ở 60oC trong 30 – 60 giây.

a) Nguyên lý hoạt động:
Real-time PCR sử dụng một loại enzyme gọi là DNA polymerase để nhân bản
đoạn DNA hoặc RNA cụ thể trong mẫu.
Sự nhân bản được theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách sử dụng các
chất làm đầy (dye) fluorescein.
Dye fluorescein phát sáng khi nó tương tác với DNA được sản xuất, và cường độ
sáng được đo lường theo thời gian để xác định lượng mục tiêu.
Mục tiêu ứng dụng:
Real-time PCR thường được sử dụng để định lượng mức độ gen cụ thể
Nó cũng được sử dụng trong việc phát hiện, định lượng vi khuẩn, virus, và giảm
sự thất bại của quy trình so với PCR truyền thống.

b) Ưu Điểm:
Độ nhạy và độ chính xác cao: Real-time PCR có độ nhạy và độ chính xác cao,
giúp định lượng ngay cả những lượng mục tiêu nhỏ trong mẫu.
Nhanh chóng và hiệu quả: Q trình real-time PCR thường nhanh chóng, mang
lại kết quả trong thời gian ngắn.
Không cần phải phân tích sau PCR: Trong truyền thống, bạn phải chạy gel để
xem kết quả sau khi đã thực hiện PCR, nhưng với real-time PCR, dữ liệu được thu
thập ngay lập tức.

c) Ứng dụng rộng rãi:
Real-time PCR được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như y học, nghiên cứu sinh
học, thực phẩm và môi trường để đánh giá và định lượng DNA hoặc RNA.
Real-time PCR đóng một vai trị quan trọng trong các phịng thí nghiệm sinh học

phân tử hiện đại, mang lại sự tiện lợi và độ chính xác cao trong việc định lượng và
phân tích gen và RNA.

19

3. Ý nghĩa ứng dụng kỹ thuật phân tử trong định lượng vi sinh vật:
Việc định lượng vi khuẩn và virus có ý nghĩa quan trọng trong nhiều lĩnh vực
khoa học và ứng dụng, bao gồm y học, nông nghiệp, môi trường, và nghiên cứu cơ
bản. Dưới đây là một số lý do chính tại sao cần phải định lượng chúng:

 Y học và Sức khỏe Cộng đồng:
Chẩn đoán bệnh: Vi khuẩn và virus thường liên quan đến nhiều bệnh truyền
nhiễm. Việc định lượng chúng giúp trong q trình chẩn đốn, điều trị và theo dõi
sự tiến triển của bệnh nhân.
Kiểm soát dịch bệnh: Định lượng vi khuẩn và virus là quan trọng trong việc kiểm
soát dịch bệnh và đưa ra các biện pháp phòng ngừa.
Nghiên cứu Sinh học và Động lực học Tế bào: Hiểu về sự phát triển và chuyển
hóa của tế bào: Vi khuẩn và virus thường được sử dụng trong nghiên cứu cơ bản để
hiểu rõ hơn về quá trình sinh học, động lực học tế bào, và tương tác tế bào.
Phát triển và Kiểm thử Thuốc: Nghiên cứu và phát triển thuốc: Đối với vi khuẩn
và virus gây bệnh, việc định lượng chúng là quan trọng trong quá trình phát triển và
kiểm thử các loại thuốc và vắc xin.
Để định lượng vi sinh vật có nhiều phương pháp tùy thuộc vào mục tiêu cụ thể,
loại vi sinh vật, và môi trường mẫu. Một số phương pháp:
- Phương pháp đếm trực tiếp:
Đếm trực tiếp dưới kính hiển vi: Sử dụng kính hiển vi để đếm số lượng vi sinh
vật trong một khối lượng hoặc thể tích cố định của mẫu.
Máy đếm tự động: Sử dụng các thiết bị tự động có thể đếm và ghi lại số lượng vi
sinh vật một cách tự động.
Phương pháp này có ưu điểm là giá thành thấp, dễ thực hiện nhưng việc định

lượng đúng hay sai phụ thuộc phần nhiều vào kỹ thuật viên, dễ xảy ra sai sót.
- Phương pháp ni cấy và đếm (Plate Count):
Nuôi cấy vi sinh vật trên agar: Mẫu được trải lên bề mặt của một mơi trường ni
cấy, và sau đó được ủ để vi sinh vật phát triển thành các đám.
Đếm số lượng đám vi sinh vật: Sau một khoảng thời gian ủ, số lượng đám được
đếm để ước tính số lượng vi sinh vật ban đầu.
Phương pháp này dễ thực hiện và việc định lượng vi sinh vật được thực hiện thủ
cơng hoặc có sự hỗ trợ của máy đếm vi sinh vật nhưng có nhược điểm khi gặp cái vi
khuẩn chậm mọc, khó mọc, virus và vi nấm mọc chậm; tạp nhiễm/

20