TbKtcnsh nhóm 1

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (618.44 KB, 22 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC </b>

<b>TIỂU LUẬN MÔN HỌC </b>

<b>DÙNG KỸ THUẬT MULTIPLEX NESTED PCR - ICT </b>

<i><b>ĐỂ PHÁT HIỆN Human Papillomavirus </b></i>

<b>NGUY CƠ GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC </b>

<b>TIỂU LUẬN MÔN HỌC </b>

<b>DÙNG KỸ THUẬT MULTIPLEX NESTED PCR - ICT </b>

<i><b>ĐỂ PHÁT HIỆN Human Papillomavirus </b></i>

<b>NGUY CƠ GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

1.2. Mục tiêu của đề tài ... 2

1.3. Nội dung thực hiện ... 2

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3

2.1. Virus HPV ... 3

2.2. Virus HPV type 16 và 18 ... 3

2.2.1. Đặc điểm sinh học ... 3

2.2.1.1. Cấu tạo ... 3

2.2.1.2. Sự nhân lên của virus ... 5

2.2.2. Các con đường lây truyền virus HPV ... 5

2.3. Các phương pháp phát hiện virus HPV ... 6

2.3.1. Phương pháp xét nghiệm Papanicolaou (Pap) Test phết mỏng cổ tử cung ... 6

2.3.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 6

2.3.3. Phương pháp Real-time PCR (Real time - Polymerase Chain Reaction ) ... 6

2.3.4. Phương pháp Multiplex Nested PCR ... 7

2.3.5. Phương pháp kỹ thuật sắc ký miễn dịch (Immunochromatographic Test - ICT) .. 8

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 9

3.1. Địa điểm nghiên cứu... 9

3.2. Vật liệu nghiên cứu ... 9

3.3. Phương pháp nghiên cứu ... 9

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 11

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ... 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 15

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT </b>

HPV <i>: Human Papilloma virus </i>

DNA : Deoxyribonucleic acid

ICT : Immunochromatographic Test LCR : Last conserved region

PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic acid

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>DANH SÁCH CÁC BẢNG </b>

<b>Bảng 2.1. Bộ gen và các yếu tố điều hòa phiên mã của virus HPV type 16 và 18 ... 5Bảng 4.1. Hiệu suất của phép thử PCR - ICT ... 13</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>DANH SÁCH CÁC HÌNH </b>

<i><b>Hình 2.1. Cấu trúc nhiễm sắc thể Papillomavirus, các ORF được chú thích, và ACS </b></i>

bảo tồn trong nguồn gốc của sự sao chép (Ori). ... 4

<b>Hình 3.1. Kết quả đại diện của các sản phẩm Nested PCR cụ thể được khuếch đại cho </b>

HPV 16 và 18. ... 10

<b>Hình 4.1. Sơ đồ này mô tả thử nghiệm bộ quy tắc cách tiến hành và kết quả đại diện </b>

của phép thử ICT để phát hiện HPV 16 và 18 ... 11

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU </b>

Ung thư cổ tử cung (CTC) là bệnh ung thư phổ biến thứ 3 ở phụ nữ trên toàn thế giới, ước tính có 569.847 ca mắc mới và 311.365 ca tử vong trong năm 2018. Mỗi năm có khoảng 4.177 trường hợp ung thư cổ tử cung mới được chẩn đoán và khoảng 2.420 ca tử vong do ung thư này tại Việt Nam (Bray và ctv, 2018). Ung thư CTC có liên quan

<i>chặt chẽ với nhiễm các type Human Papilloma virus (HPV) nguy cơ cao đường sinh dục. Có hơn 150 type Human Papilloma virus được phát hiện, theo kết quả nghiên cứu, </i>

các type HPV16 (60%), HPV18 (19%), HPV45 (7%), HPV31 (3%), HPV33 (2%), HPV52 (2%), HPV39 (1%), HPV70 (1%), HPV56 (1%), HPV35 (1%), HPV58 (1%) và HPV59 (1%) là nhóm type nguy cơ cao thường gặp ở cổ tử cung (Lagheden và ctv, 2018). Virus xâm nhập vào biểu mô cổ tử cung tạo nên các biến đổi của tế bào và diễn tiến này kéo dài từ 10 đến 20 năm với biểu hiện từ tổn thương viêm nhiễm đơn giản đến tân sinh trong biểu mô, ung thư tại chỗ và xâm lấn. Do đó, việc phát hiện sớm bằng tế

<i>bào học, xét nghiệm Human Papilloma virus là cần thiết, giúp nâng cao khả năng phòng </i>

ngừa, điều trị sớm tổn thương cổ tử cung nhằm giảm tỷ lệ tử vong của bệnh và nghiên

<i>cứu triển khai vaccine phòng ngừa Human Papilloma virus ở phụ nữ trẻ tuổi (Harper và DeMars, 2017). Nghiên cứu cộng đồng ghi nhận tỷ lệ nhiễm Human Papilloma virus </i>

khoảng 10% nhưng kết quả này khác nhau tùy theo từng khu vực, từng quốc gia trên thế giới như tỷ lệ tại Châu Phi là 22,12%, Châu Mỹ chiếm 12,95%, Châu Âu và Châu Á vào khoảng 8% (Bosch và ctv, 2008). Tại Việt Nam có tỷ lệ mắc HPV tương đối cao, theo nghiên cứu của Lục Thị Vân Bích (2011) tại khu vực TP. Hồ Chí Minh ghi nhận tỷ lệ nhiễm HPV là 19,97%. Theo nghiên cứu của Lê Quang Vinh (2015) tại khu vực Hà Nội ghi nhận tỷ lệ nhiễm HPV là 9,73%. Do đó, việc phát hiện và xác định các type HPV có vai trị vơ cùng quan trọng trong việc đánh giá nguy cơ ung thư cổ tử cung và một số ung thư đường sinh dục khác.

Các xét nghiệm sàng lọc HPV hiện nay bao gồm xét nghiệm tế bào cổ tử cung nhuộm Papanicolaou (PAP) và xét nghiệm HPV. HPV chưa được cơ lập bằng phương pháp ni cấy; do đó, nhiễm HPV được xác định bằng cách phát hiện DNA/RNA hoặc protein đặc hiệu của HPV từ các mẫu lâm sàng. Cho đến nay, chỉ có bộ xét nghiệm

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

Digene Hybrid Capture 2® (HC2) High-Risk HPV DNA Test được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm chấp thuận cho việc sử dụng lâm sàng. Bộ HC2 sử dụng lai hóa axit nucleic lỏng và phát hiện 13 loại HPV có nguy cơ cao. Thật không may, phương pháp phát hiện hỗn hợp này không xác định được các kiểu gen HPV cụ thể. Tuy nhiên, việc xác định các kiểu gen của HPV bị nhiễm để xác định các chiến lược quản lý lâm sàng phù hợp cho việc sàng lọc ung thư cổ tử cung và theo dõi sau tiêm chủng HPV là rất quan trọng (Meijer và ctv, 2006). Hơn nữa, khi khoảng 85% số ca tử vong do ung thư cổ tử cung xảy ra ở các nước đang phát triển, một bộ kiểm tra sàng lọc nhanh, chính xác và giá rẻ cho HPV có nguy cơ cao có thể là bước đột phá cần thiết cho các vùng khó khăn, nhưng bộ kiểm tra như vậy chưa có.

Nhiều phương pháp dựa trên PCR đã được phát triển để xác định HPV tạo ra kết quả đặc hiệu cho từng kiểu gen (Vince và ctv, 2002). Hầu hết các phép thử dựa trên PCR này sử dụng lai hóa DNA và các đầu dị bắt đặc hiệu cho các vùng bảo tồn di truyền trong các gen L1 của HPV 16 và 18. Tuy nhiên, việc sử dụng cơng nghệ này vẫn bị hạn chế vì phương pháp này yêu cầu nhiều bước phản ứng, thiết bị tốt và kỹ thuật viên được đào tạo tốt, làm cho việc sử dụng các phương pháp này không phù hợp cho việc kiểm tra nhanh ở các vùng thiếu điều kiện.

Mục tiêu của nghiên cứu này là phát triển một phương pháp xác định nhanh HPV 16 và 18, Multiplex Nested Polymerase Chain Reaction - Immunochromatographic Test (PCR - ICT) là một phương pháp kết hợp giữa Multiplex Nested PCR và kỹ thuật sắc ký miễn dịch, có thể khơng chỉ chính xác cao mà còn dễ sử dụng và giá thành thấp.

<i>Xây dựng và tối ưu hóa quy trình phát hiện Human Papilloma virus bằng kỹ thuật </i>

Multiplex Nested PCR kết hợp ICT.

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU </b>

<b>2.1. Virus HPV </b>

HPV là những virus nhỏ khơng có vỏ bọc, đường kính khoảng 55 nm. Tất cả các loại HPV đều chứa bộ gen DNA vịng sợi đơi có kích thước khoảng 8 kb, có thể được chia thành ba vùng: sớm, muộn và LCR (vùng kiểm soát dài). Vùng đầu chứa ORF (khung đọc mở) mã hóa các protein phi cấu trúc đã được chỉ định từ E1 đến E8. Hai gen muộn (L1 và L2) mã hóa các protein cấu trúc capsid của virus, cần thiết cho sự hình thành, lây truyền và lây lan của virion. Các sản phẩm gen sớm của HPV điều hòa vòng đời của virus và điều khiển bộ máy tế bào để sao chép, phiên mã và dịch mã các protein của virus (E1 và E2), điều chỉnh các sản phẩm gen của virus sớm, gây ra sự sắp xếp lại bộ xương tế bào (E4) và gây ra sự hủy bỏ điều hịa chu trình tế bào (E6 và E7) (Pinidis và ctv, 2016).

<b>2.2. Virus HPV type 16 và 18 </b>

HPV 16 gây ra hơn 50% ca ung thư cổ tử cung và HPV 18 gây ra 10 – 20%; chúng chiếm khoảng 70% số ca ung thư cổ tử cung trên toàn thế giới.

HPV 16 là một loại virus khơng có vỏ bao gồm hai cấu trúc protein, protein vỏ chính L1 và protein vỏ bọc nhỏ chủ yếu nằm bên trong L2, tạo thành một vỏ bọc hai mươi mặt (T = 7) có đường kính 55 nm. Trong trường hợp nhiễm dai dẳng, bộ gen của HPV được duy trì dưới dạng các plasmid hình trịn, chưa tích hợp và tồn tại trong nhân của các tế bào bị nhiễm bệnh.

Bộ gen của HPV 18 đã được tích hợp vào bộ gen của tế bào. Điều thú vị là bộ gen của virus đã bị chia cắt ở phần cuối của “vùng đầu” thành hai phần trong mỗi bản sao hợp nhất. Trong các tế bào HeLa và C4 - 1, một đoạn trình tự đặc hiệu của HPV 18 từ vùng mã hóa E2 đến L2 bị thiếu, nhưng bộ gen của HPV được phiên mã đặc biệt từ vùng E6 - E7 - E1 thành các RNA dương tính với poly(A) mà được giữ lại ở các trình tự tế bào ở đầu 3 của chúng có nguồn gốc từ vị trí tích hợp riêng lẻ của bộ gen HPV 18.

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<i><b>Hình 2.1. Cấu trúc nhiễm sắc thể Papillomavirus, các ORF được chú thích, và ACS </b></i>

<i>được chú thích. Các protein khơng cấu trúc từ vùng sớm của nhiễm sắc thể, bao gồm E1, E2, E1^E4, E5, E6, E7, và E8^E2, được hiển thị bằng màu tím. Các protein vỏ virus, L1 và L2, từ vùng muộn của nhiễm sắc thể được hiển thị bằng màu xanh. URR (vàng), vùng điều hòa hướng lên. PE và PL đánh dấu các khởi động viên sớm và muộn, và pAE và pAL đại diện cho các điểm polyadenylation sớm và muộn. (b) Sự bảo tồn của chuỗi ARS đồng nhất của động vật có vú (ACS) [16] trong Ori của các nhiễm sắc thể papillomavirus được chọn. Hiển thị trong bảng này là các cơ sở bảo tồn với ma trận trọng số vị trí (sequence logo bits) của 167 yếu tố ACS được dự đoán [16] so với các chuỗi Ori virus từ các vùng đuôi URR được chọn (đỏ)-đầu (đen). Được điều chỉnh với sự cho phép từ Ref. [16]. Bản quyền 2018 Springer Nature. ARS - chuỗi tự sao chép.</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>Bảng 2.1. Bộ gen và các yếu tố điều hòa phiên mã của virus HPV type 16 và 18 </b>

<b>2.2.1.2. Sự nhân lên của virus </b>

Virus HPV là một loại virus DNA đơn chuỗi, có khả năng xâm nhập vào các tế bào biểu mơ của da và niêm mạc. Q trình nhân lân của virus HPV gồm có các bước:

Bước 1: Virus HPV gắn vào các thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mơ và tiến hành q trình nhập vi khuẩn (viral entry). Trong quá trình này, virus sẽ phá vỡ lớp vỏ bọc của tế bào và giải phóng DNA virus vào trong nhân tế bào.

Bước 2: DNA virus HPV sẽ được duy trì ở dạng vịng kín (episome) trong nhân tế bào. Virus sẽ sử dụng các yếu tố phiên mã và dịch mã của tế bào để sản sinh các protein cần thiết cho quá trình nhân lên.

Bước 3: Khi tế bào biểu mô chia tách, DNA virus HPV sẽ được sao chép theo kiểu theta (theta replication) và được phân chia đều cho hai tế bào con. Trong giai đoạn này, virus sẽ duy trì số lượng DNA virus ổn định trong mỗi tế bào.

Bước 4: Khi tế bào biểu mơ chuyển hóa thành tế bào biểu mô lớp sừng (keratinocyte), virus sẽ kích hoạt q trình sao chép DNA virus theo kiểu cuộn (rolling circle replication) và sản sinh ra nhiều bản sao DNA virus. Trong giai đoạn này, virus sẽ tăng số lượng DNA virus trong mỗi tế bào.

Bước 5: Khi tế bào biểu mô lớp sừng chết, virus sẽ tổng hợp các protein cấu trúc để hình thành các vỏ vi khuẩn (viral capsid) và đóng gói DNA virus vào trong. Trong giai đoạn này, virus sẽ hồn thành q trình nhân lên và phóng thích các hạt con virus ra ngoài.

<b>2.2.2. Các con đường lây truyền virus HPV </b>

Bất kỳ ai cũng có thể bị nhiễm HPV khi quan hệ tình dục qua đường miệng, âm đạo, hậu mơn với người bị nhiễm bệnh. HPV có thể lây lan sang người khác ngay cả khi người bệnh khơng hề có dấu hiệu hay triệu chứng gì. HPV chủ yếu lây truyền qua đường

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

tình dục do da tiếp xúc trực tiếp với da, niêm mạc miệng, hầu họng hoặc tiếp xúc với dương vật, tử cung, âm đạo, hậu môn của người bị nhiễm bệnh.

HPV cũng có thể lây nhiễm qua những vật dụng của người bị bệnh đã dùng như cắt móng tay, kim bấm sinh thiết, đồ lót... Dùng bao cao su có thể tránh lây nhiễm được nhiều bệnh, trong đó có HPV. Tuy nhiên cũng khơng phải an tồn tuyệt đối bởi những vùng tiếp xúc ngồi bao cao su vẫn có thể bị nhiễm bệnh.

HPV không lây nhiễm qua các con đường như: từ bồn cầu, ôm hay nắm tay, ăn chung hoặc dùng chung bát đũa, bơi chung hồ bơi hay bồn tắm với người mắc bệnh. HPV cũng không di truyền.

Mặc dù hầu hết trường hợp nhiễm HPV đều có thể tự khỏi và các tổn thương tiền ung thư cũng có thể tự khỏi, nhưng vẫn có nguy cơ đối với phụ nữ nhiễm HPV gây tổn thương mạn tính và tiền ung thư sẽ xâm lấn và phát triển thành ung thư cổ tử cung. Ở phụ nữ có hệ miễn dịch bình thường thì mất khoảng 15 - 20 năm để ung thư cổ tử cung phát triển. Nhưng ở những phụ nữ có hệ miễn dịch kém (chẳng hạn như những người nhiễm HIV) thì có nhiều khả năng nhiễm HPV dai dẳng và tiến triển nhanh thành ung thư, chỉ mất 5 - 10 năm phát triển ung thư cổ tử cung. Đồng thời các trường hợp này cũng dễ nhiễm các tác nhân lây truyền qua đường tình dục khác như virus gây mụn rộp, chlamydia và bệnh lậu...

<b>2.3. Các phương pháp phát hiện virus HPV </b>

<b>2.3.1. Phương pháp xét nghiệm Papanicolaou (Pap) Test phết mỏng cổ tử cung </b>

Phương pháp xét nghiệm Papanicolaou Test được thực hiện bằng cách phết tế bào cổ tử cung lên lam kính, nhuộm và soi dưới kính hiển vi. Nếu nhiễm HPV, sẽ thấy sự hiện diện của các tế bào rỗng (koilocyte), đây là những tế bào có nhân tăng sắc và cuộn lại, có quầng sáng quanh nhân do bào tương bị thối hóa. Pap Test giúp tầm sốt nhiễm HPV định kỳ hàng năm, nếu kết quả âm tính trong ba năm liên tiếp thì chỉ cần làm lại mỗi ba năm. Tuy nhiên, Pap Test có độ nhạy khơng cao và hơn nữa test này không giúp phân biệt được các type HPV.

<b>2.3.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) </b>

Cho phép phát hiện HPV - DNA với độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao và được sử dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm sinh học phân tử. Về mặt lý thuyết, PCR có khả năng phát hiện một bản sao (copy) của trình tự đích trong bệnh phẩm.

<b>2.3.3. Phương pháp Real-time PCR (Real time - Polymerase Chain Reaction ) </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Là một cơng cụ chẩn đốn có độ nhạy, độ đặc hiệu và tính khả thi cao để phát hiện nhiễm HPV và định type HPV. Phương pháp này được sử dụng với mục đích chính là chẩn đốn nhiễm HPV, có kết quả nhanh và khơng cho dương tính giả do ngoại nhiễm của phương pháp PCR. Với mục đích định type HPV, phương pháp Real-time PCR chỉ xác định được một số ít type HPV (4 - 5 type thường gặp nhất) trong một xét nghiệm.

<b>2.3.4. Phương pháp Multiplex Nested PCR </b>

Kỹ thuật Multiplex Nested PCR là một kỹ thuật kết hợp giữa kỹ thuật Multiplex PCR và kỹ thuật Nested PCR. Đây là một kỹ thuật dùng hai bộ cặp primer khác nhau để tăng cường các đoạn DNA đặc hiệu cho các kiểu gen HPV trong hai vòng PCR liên tiếp. Các bước thực hiện kỹ thuật Multiplex nested PCR như sau:

Chuẩn bị một ống phản ứng chứa các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR, bao gồm: DNA mẫu, nhiều cặp mồi vịng ngồi (outer primers), nhiều cặp mồi vòng trong (inner primers), dNTPs, Taq polymerase và buffer. Các cặp mồi được thiết kế sao cho có độ đặc hiệu cao, nhiệt độ nóng chảy tương đương và tránh hình thành dimer primer.

Thực hiện phản ứng PCR vịng ngồi (outer PCR) bằng cách đưa ống phản ứng vào máy PCR và thiết lập các chu kỳ nhiệt độ thích hợp. Trong q trình này, các cặp mồi vịng ngồi sẽ bắt cặp với các trình tự DNA mục tiêu và tạo ra các sản phẩm PCR chứa các trình tự DNA mục tiêu.

Lấy một phần sản phẩm của phản ứng PCR vịng ngồi làm mẫu cho phản ứng PCR vòng trong (inner PCR). Thêm các thành phần còn lại cho phản ứng PCR vòng trong vào ống phản ứng mới.

Thực hiện phản ứng PCR vòng trong bằng cách đưa ống phản ứng vào máy PCR và thiết lập các chu kỳ nhiệt độ thích hợp. Trong q trình này, các cặp mồi vịng trong sẽ bắt cặp với các trình tự DNA mục tiêu trong sản phẩm của phản ứng PCR vịng ngồi và tạo ra các sản phẩm PCR có chiều dài ngắn hơn và độ đặc hiệu cao hơn.

Phân tích kết quả của phản ứng PCR vòng trong bằng cách sử dụng các phương pháp như điện di gel agarose, Real-time PCR hay sắc ký miễn dịch. Các sản phẩm PCR có chiều dài khác nhau tương ứng với các trình tự DNA mục tiêu khác nhau sẽ được xác định bằng cách so sánh với các tiêu chuẩn có sẵn.

</div>