Phương pháp rt pcr

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (980.62 KB, 27 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>NHÓM 5</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>Vy Ngọc Hoàng YếnCao Hoàng Quảng Huy</b>

<b>NHĨM 5</b>

<small>Thiết bị và kĩ thuật Cơng Nghệ Sinh Học</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<small>Một số ứng dụng phổ biến của kỹ thuật </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>1</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<small>Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là real-time</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<small>Hệ thống Real Time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính</small>

<small>Gồm 2 q trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành.</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<small>dNTP, DNA Polymerase, DNA mạch khuôn, cặp mồi và dung dịch đệm. </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>Nội dung 1</b>

<small>Điểm khác biệt đó là real-time PCR sử dụng chất phát huỳnh quang để máy có thể phát hiện và đo được cường độ tín hiệu từ chất này. Khi phản ứng nhân bản xảy ra tới một chu kỳ nhất định, cường độ tín hiệu huỳnh quang sẽ bắt đầu có sự gia tăng rõ rệt và </small>

<small>tương quan với số lượng bản sao DNA được tạo ra</small>

.

<small>Kết quả được thể hiện dưới dạng biểu đồ quan sát được qua mỗi chu kỳ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về hiệu quả khuếch đại DNA mục tiêu.</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<b>Nội dung 1</b>

<small>Để real-time PCR xác định được chính xác số lượng bản đích ban đầu có trong mẫu thử, phải thực hiện real-time PCR các mẫu thử chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu cần xác định số lượng cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng.</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

Thành phần của phản ứng real-time PCR

<b>Chất màu huỳnh quang chèn vào sợi đơi DNA: SYBR Green</b>

Đặc điểm là có ái lực rất cao với sợi đôi DNA và chúng có khả năng làm cho sợi đơi DNA phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thước.

Trong quá trình khuếch đại thì chất màu huỳnh quang sẽ chèn vào sợi đôi DNA

giai đoạn kéo dài và hệ thống nhận biết của máy sẽ ghi nhận tín hiệu huỳnh quang ở thời điểm kết thúc của mỗi chu kỳ nhiệt.

<b> Probe (các đoạn trình tự dị): Taqman probe, Beacon probe...</b>

Probe là những đoạn trình tự oligonucleotid sợi đơn có khả năng bắt cặp đặc hiệu với DNA đích và hiện tượng bắt cặp này sẽ dẫn đến sự phát huỳnh quang.

Cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào số lượng probe bắt cặp, hay chính xác hơn là phụ thuộc vào số lượng bản sao DNA đặc hiệu hiện diện trong ống phản ứng.

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

<b>Nội dung 2</b>

SYBR Green: cơ chế hoạt động

(1) Khi chưa có sản phẩm khuếch đại thì ống thứ nghiệm không phát được hùynh quang khi nhận được ánh sáng kích thích

(2) Nhưng khi có hiện diện của sản phẩm khuếch đại thì SYBR I chèn vào và tập trung trên phân tử DNA , làm cho ống phản ứng bị phát huỳnh quang khi nhân được ánh sáng kích thích.

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

<b>Nội dung 3</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

<b>Nội dung 3</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

<b>Nội dung 3:Taqman Probe</b>

<small>[1] Khi chưa có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Taqman probe không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích vì huỳnh quang phát ra bị quencher hấp phụ hết.</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

<b>Nội dung 3:Taqman Probe</b>

<small> [2] (a) Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Taqman probe sẽ bắt cặp trên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp sau giai đoạn biến tính.</small>

<small>[2] (b) Taqman probe sẽ trở thành trình tự cản đầu 3’ khi Taq polymerase kéo dài mồi để bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung.</small>

<small>[2] (c) Nhờ có hoạt tính 5’-3’ exonuclease nên Taq polymerase sẽ cắt bỏ Taqman probe làm reporter bị cắt rời xa quencher và nhờ vậy mà huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ khơng cịn bị quencer hấp phụ nữa.</small>

<small>[2] (d) Giai đoạn phát huỳnh quang của reporter xảy ra trong suốt quá trình Taq polymerase kéo dài mồi để tổng hợp sợi bổ sung.</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

Một số ứng dụng phổ biến của kỹ thuật realtime PCR

<b>1)Định lượng trình tự đích trong mẫu:</b>

▪ Định lượng tuyệt đối: Sử dụng đường chuẩn realtime PCR và Ct của mẫu có thể tính được hàm lượng DNA trong mẫu (theo đơn vị số copy hoặc ng). ▪ Định lượng tương đối: Trong điều kiện lượng mẫu đầu vào là như nhau,

mẫu có Ct nhỏ hơn thì sẽ có hàm lượng trình tự đích cao hơn. Tuy nhiên trong thực tế thì khơng có bằng chứng nào để khẳng định lượng mẫu đầu vào là như nhau, vì vậy cần phải có giá trị Ct tham chiếu của gene chứng nội (IC), việc so sánh sẽ diễn ra gián tiếp thông qua việc so sánh với IC. Đó là nguyên lý của phương pháp định lượng tương đối 2-ΔΔCt của Livak ΔΔCt của Livak

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

Một số ứng dụng phổ biến của kỹ thuật realtime PCR

<b> 2) Định tính trình tự đích trong mẫu:</b>

<b> Giống như PCR, realtime-ΔΔCt của Livak PCR cũng có thể được sử dụng để thực hiện định </b>

tính các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, nấm, .... ngoài ra việc tối ưu trình tự mẫu dị có thể giúp phát hiện cả các đột biến điểm hay các đoạn DNA có đa hình trình tự đơn (SNP), ...

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

<b><small>Thanks For Watching!</small></b>

</div>