Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.77 MB, 236 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HỒNG MỘNG HUYỀN

ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT THẢO DƯỢC LÊN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

192

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HỒNG MỘNG HUYỀN

MÃ SỐ NGHIÊN CỨU SINH P0616006

ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT THẢO DƯỢC LÊN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

i

LỜI CẢM ƠN

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Cô PGS.TS. Trần Thị Tuyết Hoa đã dành nhiều thời gian, cơng sức và tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện luận án và theo học tại trường.

Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô TS. Bùi Thị Bích Hằng, Bộ mơn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình hướng dẫn chuyên đề nghiên cứu sinh. Xin được gửi lời cảm ơn đến Thầy GS.TS. Trần Ngọc Hải, PGS.TS. Lê Quốc Việt, PGS. TS. Nguyễn Trọng Tuân, TS. Huỳnh Văn Hiền, Cô TS. Đặng Thụy Mai Thy, Chị TS. Trần Thị Mỹ Duyên và toàn thể Thầy Cô Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ; quý Thầy/Cô và các Anh/Chị em bộ môn Bệnh học Thủy sản đã sắp xếp công việc cũng như tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi có thể hồn thành chương trình học tập. Cảm ơn các hộ nuôi nuôi tôm ở tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng đã cung cấp thơng tin khảo sát về thảo dược trong nuôi tôm. Chân thành biết ơn các anh chị thuộc chi cục Thủy sản, trung tâm khuyến nông khuyến ngư tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng đã nhiệt tình hỗ trợ trong q trình thu thập số liệu.

Cảm ơn các Anh/Chị nghiên cứu sinh khóa 2016; sự hỗ trợ tích cực của các anh, em học viên cao học: Nguyễn Văn Toàn, Thura Win, Võ Tấn Huy, và các em sinh viên: Nguyễn Thị Quế Anh, Nguyễn Văn Thanh, Hà Thị Tuyết Nhi, Quách Thị Tiểu Nguyệt, Nguyễn Thị Huyền My, Bùi Văn Phiên, Nguyễn Quốc Khánh, Lê Kim Ngọc, Nguyễn Văn Khỏe, Phạm Minh Nhựt, Nguyễn Quí Nhân, Lê Khánh Tường, Nguyễn Thị Mỹ Ngân, Đặng Thị Bé Thảo.

Cuối cùng, sự thành công của luận án khơng thể khơng kể đến sự đóng góp khơng nhỏ của các thành viên trong gia đình, những người ln ủng hộ, động viên và giúp tơi vượt qua rất nhiều khó khăn trong thời gian học tập. Xin chân thành cảm ơn./.

NCS. HỒNG MỘNG HUYỀN

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

ii

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định được lồi thảo dược có khả năng tăng cường miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm thẻ chân trắng. Nội dung nghiên cứu bao gồm: (1) Khảo sát tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong q trình ni tơm biển ở tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng thuộc vùng ĐBSCL; (2) Nghiên cứu sàng lọc chọn ra một số lồi thảo dược có khả năng kháng vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi gây bệnh trên tôm; (3) Xác định

khả năng tăng cường miễn dịch trên tôm của một số chất chiết thảo dược; (4) Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tơm thẻ chân trắng.

Thảo dược hay các sản phẩm thảo dược được sử dụng chủ yếu ở mơ hình ni tơm thâm canh (chiếm 90,9%, n= 20/22) và siêu thâm canh (chiếm 78,8%, n= 52/66) ở Cà Mau và Sóc Trăng, áp dụng trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng. Nghiên cứu xác định được 18 loài thực vật đang được sử dụng trong ni tơm.

Trong đó, các lồi thực vật được dùng phổ biến bao gồm tỏi (Allium sativum) (73,6%, n= 53/72); diệp hạ châu (Phyllanthus spp.) (45,8%, 33/72); ổi (Psidium guajava) (12,5%, n= 9/72); mật gấu (Vernonia amygdalina) (8,3%; n= 6/72); thù lù (Physalis angulata) (8,3%, n= 6/72). Các loài thảo dược tiềm năng tập

trung ở bộ sơ ri (diệp hạ châu, mần ri), bộ cà (thù lù), bộ cúc (mật gấu, cỏ mực), bộ đào kim nương (ổi), bộ húng (ô rô).

Trong tổng số 15 loài thảo dược phổ biến ĐBSCL được lựa chọn để xác định hoạt tính kháng khuẩn thì có 6 lồi thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao

(nhạy) trên cả vi khuẩn V. parahaemolyticus (CM5) và V. harveyi (T2016-04).

Cụ thể, chất chiết bàng, lựu, diệp hạ châu thân đỏ, diệp hạ châu thân xanh, bần ổi, bần chua có đường kính vịng kháng khuẩn dao động từ 14,7 mm đến 21,7

mm. Tất cả 6 chất chiết này đều có tính kìm khuẩn đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus, V. harveyi với giá trị MIC (0,095 đến 1,56 mg/mL) và MBC

(6,25 đến 25 mg/mL). Ngoài ra, 6 chất chiết thảo dược này cũng có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với các chủng vi khuẩn phân lập từ ao nuôi tôm thuộc các vùng nuôi khác nhau ở ĐBSCL. Nghiên cứu cũng xác định chất chiết ổi chỉ có

hoạt tính kháng khuẩn đối với V. parahaemolyticus nhưng khơng có hoạt tính kháng khuẩn đối với V. harveyi; ngược lại chất chiết tỏi có hoạt tính kháng V. harveyi nhưng khơng có hoạt tính kháng V. parahaemolyticus.

Tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung 1% và 2% chất chiết bàng, lựu, diệp hạ châu thân đỏ, bần ổi và bần chua liên tục trong 4 tuần không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống và hệ số chuyển đổi thức ăn. Cụ thể, tăng trưởng hàng ngày dao động 0,14 đến 0,19 g/con, tốc độ tăng trưởng đặc biệt dao

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

iii

động từ 5,95 đến 6,71%/ngày. Hệ số chuyển đổi thức ăn dao động từ 0,95 đến

1,36. Tỷ lệ sống của tơm ở các nghiệm thức thí nghiệm dao động từ 80,3-90,4%.

Chế độ ăn bổ sung chất chiết lá bàng (T. catappa) (1%), chất chiết quả bần chua (S. caseolaris) (1%, 2%) trong 4 tuần liên tục giúp tôm thẻ chân trắng tăng

cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua tăng cường các chỉ số huyết học, hoạt tính PO, hoạt tính SOD, mức độ biểu hiện các gen miễn dịch (crustin,

lysozyme và penaeidin-3a) và tăng tỷ lệ sống khi gây nhiễm thực nghiệm với V. parahaemolyticus. Tỷ lệ chết tích lũy ở nghiệm thức bổ sung 2% chất chiết bần

chua (35,6%); 1% chất chiết bàng (44,5%); 1% chất chiết bần chua (46,7%) thấp hơn khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (71,1%).

Kết quả thử nghiệm ghi nhận chất chiết bàng (1%) và bần chua (1%) với nhịp bổ sung liên tục (trong tháng đầu thả nuôi) và nhịp bổ sung 2 tuần (tháng thứ 2) giúp cải thiện sức khỏe tôm thẻ chân trắng, gia tăng các thông số miễn

dịch không đặc hiệu và gia tăng tỷ lệ sống khi cảm nhiễm với V. parahaemolyticus.

Chất chiết từ methanol của lá bàng và quả bần chua được xác định có chứa các hợp chất sinh học bao gồm alkaloids, flavonoids, steroid và triterpenoids, đường khử, tannins và sesquiterpene lactones. Như vậy, đây là nghiên cứu đầu tiên xác định được chất chiết quả bần chua có hiệu quả trong tăng cường các thông số miễn dịch và khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tơm ni thương phẩm.

Từ khóa: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính, bàng, bần chua, chất chiết thảo

dược, đáp ứng miễn dịch, tôm thẻ chân trắng

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

iv

ABSTRACT

The study aimed to determine medicinal plants that can enhance the

immune response and disease resistance of whiteleg shrimp (Penaeus vannamei) to Vibrio parahaemolyticus causing AHPND. The research content

includes (1) surveying the current status and potential of herb usage in shrimp farming in Ca Mau and Soc Trang provinces in the Mekong Delta; (2) screening

for herbal extracts that are resistant to Vibrio parahaemolyticus and V. harveyi

causing diseases in shrimp; (3) determining the efficiency of the screened extracts in shrimp immunity enhancement; (4) testing the screened extracts in whiteleg shrimp to prevent acute hepatopancreatic necrosis.

The investigation showed that in Ca Mau and Soc Trang provinces, medicinal plants or herbal products were mostly used for both black tiger shrimp and whiteleg shrimp in intense shrimp farming (accounted for 90.9%, n=20/22) and super-intensive shrimp farming (accounted for 78.8%, n=52/66). Eighteen species of herbs have been used for shrimp farming. The most common was

Allium sativum, which accounted for 73,6% (n=53/72), followed by Phyllanthus spp. (45,8%, 33/72); Psidium guajava (12,5%, n=9/72); Vernonia amygdalina) (8,3%; n=6/72) and Physalis angulata (8,3%, n=6/72). The majority of potential

herbs belong to some orders such as Malpighiales, Solanales, Asterales, Myrtales and Lamiales.

Among fifteen medicinal plants being chosen to determine their antibacterial activity, six medicinal plants had strong antibacterial activities

(sensitive) against both V. parahaemolyticus (CM5), and V. harveyi (T2016-04). In the test of agar diffusion, Terminalia catappa, Punica granatum, Phyllanthus amarus, P. urinaria L., Sonneratia ovata and S. caseolaris had the diameter of inhibition zones ranging from 14.7 mm to 21.7

mm. Moreover, those six extracts were bacteriostatic. Their values of MIC (minimum inhibitory concentration) and MBC (minimum bacterial

concentration) values for both V. parahaemolyticus and V. harveyi varied from

0.095 to 1.56 mg/mL and from 6.25 to 25 mg/mL, respectively. In addition, these herbal extracts had strong activity against the isolated bacteria from farmed shrimp in the Mekong Delta. In addition, the guava extract had a strong

effect on V. parahaemolyticus but not on V. harveyi; meanwhile, the garlic was

the opposite results.

Whiteleg shrimp (P. vannamei) fed with the diet supplement of 1% and 2% of Terminalia catappa, Punica granatum, Phyllanthus amarus, P. urinaria L., Sonneratia ovata, and S. caseolaris in 4 continuous weeks, there were no

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

v

significant effects on shrimp growth, survival rate, or feed conversion ratio. In detail, weight gain and specific growth rate were 0,14 to 0,19 g/shrimp and 5,95 to 6,71%/day. Survival rates ranged from 80.3% to 90.4%. The feed conversion ratio was from 0,95 to 1,36.

Being fed constantly with the extract of T. catappa (1%), S. caseolaris

(1%, 2%) for 4 weeks, the whiteleg shrimp had an enhancement of non-specific immune response, which was indicated through higher values of the hematological parameters, PO activity, SOD activity, gene expression of

crustin, lysozyme, penaeidin-3a) and resistance to V. parahaemolyticus causing

acute hepatopancreatic necrosis disease in comparison with the control

(P<0.05). In detail, the cumulative mortality in the treatments of 2% S. caseolaris (35,6%); 1% T. catappa (44,5%); 1% S. caseolaris (46,7%) was

much lower than in the control treatment (71,1%).

The results revealed that T. catappa L. and S. caseolaris (1%) extracts with

continuous supplementation (in the first month of stocking) and 2-week interval supplementation (from the 2nd month of stocking) enhanced shrimp health, boosted non-specific immunological parameters and increased survival rate

when being challenge against V. parahaemolyticus.

The extracts of T. catappa L. and S. caseolaris both contained bioactive

compounds such as alkaloids, flavonoids, steroids, triterpenoids, reduced sugars, tannins, and sesquiterpene lactones. In conclusion, this is the first study

showed that the extract of S. caseolaris was able to improve immunological

parameters and resistance to acute hepatopancreatic necrosis in shrimp farming.

Keywords: Acute hepatopancreatic necrosis disease, herbal extract,

immune response, Penaeus vannamei, Terminalia catappa L., Sonneratia caseolaris.

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

vi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là Hồng Mộng Huyền, là NCS ngành nuôi trồng thủy sản, khóa 2016. Tơi xin cam đoan luận án “Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng

(Penaeus vannamei)” là cơng trình nghiên cứu khoa học thực sự của bản thân

tôi được sự hướng dẫn của PGS. TS. Trần Thị Tuyết Hoa. Đề tài này được tài trợ bởi Dự án Nâng cấp Trường Đại học Cần Thơ (VN14-P6) bằng nguồn vốn vay ODA từ chính phủ Nhật Bản (Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng hóa sinh và hóa - dược trong ni trồng thủy sản). Do đó, số liệu nghiên cứu sẽ được sử dụng trong khuôn khổ dự án.

Các thông tin được sử dụng tham khảo trong đề tài luận án được thu thập từ các nguồn đáng tin cậy, đã được kiểm chứng, được công bố rộng rãi và được tơi trích dẫn nguồn tham khảo rõ ràng ở phần Danh mục tài liệu tham khảo. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án này là do chính tơi thực hiện một cách nghiêm túc, trung thực và không trùng lắp với các đề tài khác đã được công bố trước đây.

Tôi xin lấy danh dự và uy tín của bản thân để đảm bảo cho lời cam đoan này.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2024

Cán bộ hướng dẫn chính Tác giả thực hiện

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...xvi

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ... 1

1.1 Tính cấp thiết của luận án ... 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án ... 3

1.3 Nội dung nghiên cứu của luận án ... 3

1.4 Những đóng góp mới của luận án ... 5

1.5 Ý nghĩa thực tiễn của luận án ... 6

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 7

2.1 Đặc điểm sinh học, tình hình ni và tiêu thụ tơm thẻ chân trắng ... 7

2.1.1 Đặc điểm sinh học ... 7

2.1.2 Tình hình ni và tiêu thụ tơm thẻ chân trắng ... 8

2.2 Một số bệnh vi khuẩn và hệ miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng ... 14

2.2.1 Một số bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng ... 14

2.2.1.1 Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ... 14

2.2.1.2 Bệnh phát sáng do vi khuẩn Vibrio harveyi ... 20

2.2.1.3 Giải pháp phòng trị vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên tôm ... 23

2.2.2 Hệ miễn dịch trên tôm ... 26

2.2.2.1 Thành phần và chức năng của hệ miễn dịch không đặc hiệu ... 26

2.2.2.2 Yếu tố môi trường tác động đến đáp ứng miễn dịch ... 31

2.3 Thảo dược và tác dụng của thảo dược trong nuôi tôm ... 31

2.3.1 Sơ lược về thảo dược ... 31

2.3.2 Thành phần loài và phương pháp bổ sung thảo dược trong nuôi trồng thủy sản ... 34

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

viii

2.3.3 Vai trị của thảo dược trong ni trồng thủy sản ... 35

2.3.3.1 Hoạt tính kháng vi khuẩn ... 36

2.3.3.2 Khả năng kích thích miễn dịch ... 40

2.3.4 Cơ chế tác động của các chất chiết xuất thảo dược và yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng của thảo dược ... 43

2.3.4.1 Cơ chế kháng khuẩn của thảo dược ... 43

2.3.4.2 Một số hợp chất và cơ chế tác động của thảo dược đến hệ miễn dịch ... 44

2.3.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến thảo dược trong nuôi trồng thủy sản ... 45

2.3.5 Đặc điểm thảo dược vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long ... 48

2.3.5.6 Một số loại thảo dược khác... 56

CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 65

3.1 Phương tiện nghiên cứu ... 65

3.1.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm ... 65

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm ... 65

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ... 65

3.1.4 Mơi trường và hóa chất thí nghiệm ... 66

3.2 Phương pháp nghiên cứu ... 67

3.2.1 Xác định tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ở một số địa phương thuộc vùng ĐBSCL ... 67

3.2.1.1 Địa điểm và số lượng hộ nuôi tôm ... 67

3.2.1.2 Phương pháp phỏng vấn hộ nuôi tôm ... 68

3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của chất chiết thảo dược ... 68

3.2.2.1 Phương pháp ly trích thảo dược... 68

3.2.2.2 Phương pháp phục hồi, nuôi và định danh vi khuẩn ... 68

3.2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn... 70

3.2.2.4 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu ... 71

3.2.2.5 Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu ... 71

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

ix

3.2.2.6 Khảo sát khả năng ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng

khuẩn đối với vi khuẩn phân lập từ ao tôm bệnh ... 72

3.2.3 Thí nghiệm xác định khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch, kháng bệnh và tăng trưởng của chất chiết thảo dược ở tôm thẻ chân trắng ... 73

3.2.3.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng ... 73

3.2.3.2 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng ... 75

3.2.3.3 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng đề kháng mầm bệnh vi khuẩn của tôm thẻ chân trắng ... 77

3.2.4 Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tơm thẻ chân trắng ... 78

3.2.4.1 Thí nghiệm bổ sung chất chiết thảo dược cho tôm thẻ chân trắng ... 79

3.2.4.2 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng ... 80

3.2.4.3 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng phịng AHPND của tơm thẻ chân trắng ... 80

3.2.4.4 Định tính một số thành phần hợp chất hóa học trong chất chiết bàng và bần chua ... 81

3.3 Phương pháp xử lý số liệu ... 81

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 82

4.1 Tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong ni tơm ở Cà Mau và Sóc Trăng ... 82

4.1.1 Đặc điểm hộ nuôi và kỹ thuật ni ... 82

4.1.2 Tình hình sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ... 84

4.1.3 Tiềm năng và nhu cầu sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ... 87

4.2 Hoạt tính kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus, V. harveyi của chất chiết thảo dược ... 90

4.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thảo dược ... 90

4.2.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của chất chiết thảo dược ... 97

4.2.3 Khảo sát khả năng ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn phân lập từ ao tôm bệnh ... 102

4.2.3.1 Phân lập V. parahaemolyticus và V. harveyi từ ao nuôi tôm ... 102

4.2.3.2 Khảo sát khả năng ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn phân lập từ ao tôm bệnh ... 105

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

x

4.3 Xác định khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch, kháng bệnh và tăng

trưởng của tôm thẻ chân trắng khi sử dụng một số chất chiết thảo dược ... 106

4.3.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng ... 106

4.3.2 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng ... 110

4.3.3 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng đề kháng mầm bệnh vi khuẩn của tôm thẻ chân trắng ... 117

4.4 Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phịng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tơm thẻ chân trắng ... 122

4.4.1 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng ... 123

4.4.1.1 Tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng ... 123

4.4.1.2 Tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng... 125

4.4.2 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng phòng AHPND của tôm thẻ chân trắng ... 131

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 138

5.1 Kết luận ... 138

5.2 Kiến nghị ... 139

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 140

PHỤ LỤC ... 174

PHỤ LỤC 1: Nội dung phiếu khảo sát ... 174

PHỤ LỤC 2: Một số thông tin về hộ nuôi tôm được khảo sát ... 180

PHỤ LỤC 3: Thông tin thảo dược sử dụng trong nghiên cứu ... 185

PHỤ LỤC 4: Một số loại hóa chất sử dụng trong phân tích THC, GC, HC 186 PHỤ LỤC 5: Kết quả phân tích thống kê ... 187

PHỤ LỤC 6: Số lượng tôm thẻ chân trắng chết hàng ngày khi cảm nhiễm V. parahaemolyticus ... 211

PHỤ LỤC 7: Thí nghiệm xác định giá trị LD50 ... 215

PHỤ LỤC 8: Một số hình ảnh trong quá trình nghiên cứu ... 217

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

xi

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Cơ chế gây bệnh của V. harveyi ... 21

Bảng 2.2: Vai trị của tế bào máu tơm ... 27 Bảng 2.3: Các loại thảo dược giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc

hiệu trên tôm (Harikrishnan et al., 2011a) ... 41

Bảng 2.4: Cơ chế diệt khuẩn của các nhóm hợp chất chính cơ lập từ thực vật. ... 44

Bảng 2.5: Công dụng của cây bàng T. catappa L... 50

Bảng 2.6: Thành phần hóa học của lựu ... 52 Bảng 3.1: Thông tin tổng quát của các hộ phỏng vấn về tình hình sử dụng thảo dược trong ni tơm ... 68 Bảng 3.2: Trình tự mồi sử dụng trong các phản ứng realtime PCR ... 77 Bảng 4.1: Thông tin về đặc điểm của các hộ nuôi tôm ... 82 Bảng 4.2: Các thông số kỹ thuật về ao nuôi, mật độ thả, tỉ lệ sống và giá trị kinh tế của các hộ ni tơm ... 83 Bảng 4.3: Thơng tin về tình hình sử dụng thảo dược trong các hộ ni tơm ở Cà Mau và Sóc Trăng ... 84 Bảng 4.4: Cách thức sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi tôm ... 85 Bảng 4.5: Đánh giá về công dụng của thảo dược trong nuôi tôm ... 86 Bảng 4.6: Các loại sản phẩm phòng trị bệnh hộ nuôi lựa chọn sử dụng trong Bảng 4.10: Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm ở ao nuôi ... 103 Bảng 4.11: Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm và nước ao nuôi tôm ... 104 Bảng 4.12: Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thảo dược đối với các

chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus và V. harveyi phân lập từ ao nuôi tôm (mm)

... 105 Bảng 4.13: Tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung thảo dược sau 4 tuần nuôi ... 107

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

xii

Bảng 4.14: Tổng tế bào máu (THC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược sau 2 tuần và 4 tuần... 111 Bảng 4.15: Tổng tế bào khơng hạt (HC), có hạt (GC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược sau 2 tuần và 4 tuần ... 111 Bảng 4.16: Tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng sau 8 tuần ... 123 Bảng 4.17: Tổng tế bào máu (THC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết bàng và bần chua ... 125 Bảng 4.18: Tổng tế bào khơng hạt (HC), tế bào có hạt (GC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết bàng và bần chua ... 126

Bảng 4.19: Thành phần hóa học trong chất chiết bàng (T. catappa) và bần chua (S. caseolaris)……….….135

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

xiii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ các nội dung nghiên cứu tổng quát của luận án ... 4 Hình 2.1: Bản đồ các nước ni tơm thẻ chân trắng ... 7 Hình 2.2: Biểu đồ sản lượng tôm nuôi theo khu vực/nước và xu hướng tăng trưởng đến năm 2021 ... 9 Hình 2.3: Biểu đồ sản lượng tơm nuôi ở các nước thuộc Châu Á và xu hướng tăng trưởng đến năm 2021 ... 10 Hình 2.4: Diễn biến diện tích ni tơm thẻ chân trắng vùng ĐBSCL giai đoạn Hình 2.9: Kích cỡ tơm thu hoạch ở Châu Á ... 13 Hình 2.10: Bản đồ các quốc gia xuất hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ... 15 Hình 2.11: Trình tự đầy đủ của plasmid pVA1 gây bệnh AHPND trên tôm .. 16 Hình 2.12: Tơm thẻ chân trắng nhiễm AHPND có màu nhợt nhạt ruột rỗng, gan tụy nhợt nhạt, teo (trái); tơm khỏe có màu sắc bình thường (phải) ... 17

Hình 2.13: Bản đồ trình tự của plasmid pVHvo liên quan đến AHPND trong V. owensii và sơ đồ nhận dạng trình tự của plasmid pVH ... 19Hình 2.14: Mơ hình hệ thống cảm biến quorum sensing của V. harveyi) ... 22

Hình 2.15: Số lượng bài báo nghiên cứu về việc sử dụng thảo dược, tảo, hay các sản phẩm tự nhiên trong nuôi trồng thủy sản ... 33 Hình 2.16: Số lượng bài báo nghiên cứu về việc sử dụng thảo dược chống lại

Vibrio gây bệnh trên tơm ... 33

Hình 2.17: Tỉ lệ phần trăm (%) các bộ phận cây được sử dụng nghiên cứu dùng trong ni trồng thủy sản ... 34 Hình 2.18: Tỉ lệ phần trăm (%) hoạt tính sinh học của các chiết xuất thực vật sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ... 36 Hình 2.19: Dung mơi phân cực và các hợp chất có độ phân cực tương ứn) ... 46 Hình 2.20: Các bước nghiên cứu sử dụng cây thuốc trong nuôi trồng thuỷ sản ... 47

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

xiv

Hình 2.21: Tỷ lệ phần trăm nông dân sử dụng phụ gia thức ăn và chiết xuất thảo

dược (mũi tên) trong trại ni... 48

Hình 3.2: Sơ đồ thí nghiệm xác định tác động của thảo dược kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus trên tôm thẻ chân trắng ... 73

Hình 3.3: Sơ đồ thí nghiệm chế độ bổ sung thảo dược trên tôm thẻ chân trắng ... 79

Hình 4.1: Biểu đồ thể hiện phần trăm hộ biết đến thực vật làm thảo dược trong ni tơm ... 88

Hình 4.2: Lồi thảo dược được hộ ni biết đến trong q trình khảo sát ... 89

Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR đối với 2 chủng vi khuẩn Vibrio. .. 91

Hình 4.4: Hoạt tính kháng của các loại chiết xuất thảo dược. ... 93

Hình 4.5: Các loại thảo dược có hoạt tính kháng V. parahaemolyticus (CM5) và V. harveyi (T2016-04) ... 97

Hình 4.6: Khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus (CM5) của chất chiết thảo dược. ... 98

Hình 4.7: Khuẩn lạc vi khuẩn V. parahaemolyticus (A) trên môi trường ChromAgar Vibrio, (B) trên mơi trường TCBS ... 103

Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR đối với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. ... 103

Hình 4.9: Khuẩn lạc vi khuẩn V. harveyi (A) trên môi trường TCBS, (B) trên môi trường phát quang ... 104

Hình 4.10: Kết quả điện di sản phẩm PCR đối với chủng vi khuẩn V. harveyi. ... 104

Hình 4.11: Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn thảo dược sau 4 tuần nuôi. 107 Hình 4.12: Hoạt tính PO (490 nm) của tơm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược ở tuần 2 và tuần 4. ... 113

Hình 4.13: Hoạt tính SOD (U/mL) của tơm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược ở 2 tuần và 4 tuần. ... 114

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

xv

Hình 4.14: Ảnh hưởng của thời gian bổ sung chất chiết đến mức độ biểu hiện của các gen miễn dịch (A) crustin, (B) lysozyme và (C) penaeidin-3a trong máu của tôm thẻ chân trắng. ... 116 Hình 4.15: Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng sau 14 ngày cảm nhiễm

với vi khuẩn V. parahaemolyticus (CM5). ... 118Hình 4.16: Tơm thẻ chân trắng thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính. ... 119Hình 4.17: Kết quả PCR tái định danh vi khuẩn V. parahaemolyticus (CM5)

trong thí nghiệm cảm nhiễm. ... 119 Hình 4.18: Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 tuần bổ sung chất chiết thảo

Hình 4.21: Ảnh hưởng của nhịp bổ sung chất chiết đến mức độ biểu hiện của các gen miễn dịch (A) crustin, (B) lysozyme và (C) penaeidin-3a trong máu của

tôm thẻ chân trắng.. ... 130

Hình 4.22: Tỷ lệ chết tích lũy của tơm thẻ chân trắng sau 14 ngày cảm nhiễm

với vi khuẩn V. parahaemolitycus (CM5). ... 132Hình 4.23: Tơm thẻ chân trắng thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính. ... 133Hình 4.24: Kết quả PCR tái định danh vi khuẩn V. parahaemolyticus (CM5)

trong thí nghiệm cảm nhiễm. ... 133

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

xvi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease AHPNS Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome AS Anticoagulant solution

C:N Tỷ lệ cacbon và nitơ cDNA Complementary DNA CFU Colony-forming unit

CAGR Compound annual growth rate ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long ĐC Đối chứng

DHC Differential hemocyte count DNA Deoxyribonucleic acid EMS Early Mortality Syndrome EGCG Epigallocatechin gallate

FAO Food & Agriculture Organization of the United Nations FCR Feed Conversion Ratio

GOAL Global Outlook for Aquaculture Leadership GPx Glutathione peroxidase

GST Glutathione S-transferase HC Hyaline cell

H&E Haematoxylin & Eosin HSP70 Heat shock 70kDa protein

Ig Immunoglobin Kg Kilogram

LC Large granular cell LD50 The 50% lethal dose LPS Lipopolysaccharides

MBC Minimum bactericidal concentration MHC Major Histocompatibility Complex MIC Minimum inhibitory concentration NA Nutrient Agar

NACA Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

xvii

NB Nutrient Broth NOS Nitric oxide synthase OD Optical density

OIE World Organisation for Animal Health

OECD Organisation for Economic Co-operation Development ORF Open reading frame

PCR Polymerase Chain Reaction PG Peptidoglycans

PL Postlarvae PO Phenoloxidase ProPO Prophenoloxidase RNA Ribonucleic Acid

RPS Relative Percentage Survival SGC Semi-granular cell

SOD Superoxide dismutase

TCBS Thiosulfate-Citrate Bile Salts THC Total hemocyte count

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

1

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết của luận án

Ở Việt Nam, theo qui hoạch và định hướng phát triển ngành nuôi tôm nước lợ mặn vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đến 2020 và tầm nhìn 2030 của Bộ Nng nghiệp và Phát triển Nơng thơn, tổng diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng theo mô hình ni thâm canh đạt 90.000 ha (năm 2020) và tăng lên 100.000 ha (năm 2030), tăng trưởng bình qn 1,06%/năm, qui hoạch ni tập trung ở Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Tiền Giang, Long An. Đến năm 2030, tổng sản lượng nuôi tôm nước lợ các tỉnh ven biển vùng ĐBSCL là 900.000 tấn, trong đó sản lượng tơm thẻ chân trắng đạt 450.000 tấn (chiếm 50%). Định hướng phát triển theo hướng hiệu quả, bền vững đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ trong nước và chế biến xuất khẩu.

Tuy nhiên, việc thâm canh hóa nâng cao năng suất kết hợp với vấn đề thời tiết thay đổi thất thường, đã làm gia tăng tình hình dịch bệnh ở hầu hết các mơ hình ni tơm thương phẩm. Vi khuẩn gây bệnh trên tôm nuôi được xác định

chủ yếu là do các loài Vibrio spp. Ở trại sản xuất tôm giống, Vibrio harveyi là

mầm bệnh vi khuẩn thường gặp, gây bệnh phát sáng trên ấu trùng, hậu ấu trùng tôm. Bệnh phát sáng được ghi nhận gây thiệt hại về kinh tế cho nghề nuôi tôm của nhiều nước trên thế giới như Indonesia (Sunaryanto & Mariam, 1986), Thái

Lan (Jiravanichpaisal et al., 1994), Philippines (Baticados et al., 1990; Lavilla-Pitogo et al., 1990), Australia (Pizzutto & Hirst, 1995), Đài Loan (Liu et al., 1996 a; b) và Ecuador (Robertson et al., 1998). Trong ao nuôi thương phẩm,

bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute hepatopancreatic necrosis disease - AHPND) được ghi nhận là một trong các bệnh phổ biến trên tôm nuôi vùng ĐBSCL. Từ đầu năm 2022 đến nay, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính xảy ra tại 75 xã của 11 tỉnh, thành phố với tổng diện tích trên 342 ha, tăng 7% (Tổng cục Thủy sản, 2022).

AHPND được xác định do Vibrio parahaemolyticus chứa plasmid mang gen độc tố (Photorhabdus insect-related, PirA, PirB) (Tran et al., 2013a; b; Kondo et al., 2014; Han et al., 2015a), gây chết đến 100% đàn tôm. Bệnh xuất hiện trên tôm ở giai đoạn 30 đến 35 ngày nuôi (FAO, 2013; Hong et al., 2016; NACA, 2012), và ở giai đoạn tơm 46 đến 96 ngày ni (De la Pa et al., 2015). Ngoài ra, các loài vi khuẩn Vibrio spp. (Vibrio harveyi, V. campbellii, V. punensis và V. owensii) chứa plasmid mang gen độc tố cũng có khả năng gây AHPND (Kondo et al., 2015; Dong et al., 2017; Liu et al., 2018; Restrepo et al., 2018; Xiaosha et al., 2020). Xiao et al. (2017) cho rằng plasmid mang gen

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

2

độc tố PirA, PirB gây bệnh AHPND trên tôm phổ biến ở nhiều loài Vibrio. Các gen độc tố có thể được truyền từ loài vi khuẩn Vibrio này sang loài vi khuẩn Vibrio khác (Kondo et al., 2015). Do đó, khả năng kiểm sốt bệnh hoại

tử gan tụy cấp tính hay bệnh do vi khuẩn nói chung cũng gặp nhiều khó khăn. Sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh do vi khuẩn là giải pháp thường được người nuôi tôm áp dụng, tuy có tác động tích cực nhưng vẫn khơng được khuyến cáo sử dụng vì các tác động xấu đến môi trường. Việc sử dụng nhiều kháng sinh đã dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc

(Miranda & Zemelman, 2002; Seyfried et al., 2010), kháng sinh tồn lưu trong

sản phẩm thủy sản, dẫn đến những hậu quả tiềm ẩn đối với sức khỏe con người

(Romero Ormazábal et al., 2012). Việc sử dụng nhiều chất kháng sinh, thuốc

tổng hợp đã cho thấy các hiện tượng mẫn cảm và tác dụng phụ không mong muốn (Atal, 1982), như ảnh hưởng đến sự phát triển và ức chế cơ chế tự bảo vệ của ấu trùng (Brown, 1989). Vaccin cũng được coi là một liệu pháp tiềm năng giúp phòng bệnh vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, vaccin thương mại quá đắt để sử dụng rộng rãi bởi một loại vaccine đơn chỉ có hiệu quả chống

lại một loại mầm bệnh (Sakai, 1999; Pasnik et al., 2005; Harikrishnan et al.,

2011b).

Trong nhóm các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, chất chiết thảo dược là những chiết xuất từ thực vật có chứa các hợp chất sinh học giúp phòng và trị bệnh ở đối tượng sử dụng (Prasad & Variyur Padhyoy, 1993). Nhiều loại thảo dược được xác định có chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học cao giúp kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, ký sinh trùng, kích thích tăng trưởng, kích thích

sự thành thục, chống stress, tăng cường miễn dịch (Direkbusarakom et al., 2004; Chitmanat et al., 2005; Citarasu, 2010; Chakraborty & Hancz, 2011; Harikrishnan et al., 2011a; b; c; Ji et al., 2012; Reverter et al., 2014; 2017;

2021). Đặc biệt, nhiều loài thảo dược được xác định có hoạt tính kháng khuẩn cao, có phổ kháng khuẩn rộng, diệt được cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm

(Castro et al., 2008; Roomiani et al., 2013). Bên cạnh đó, thảo dược với nhiều

ưu điểm như rẻ, dễ chuẩn bị, hiệu quả phòng bệnh cao do dễ hấp thu, ít tác dụng phụ trong q trình điều trị bệnh và khơng ảnh hưởng đến môi trường cũng như không nguy hiểm đến đối tượng nuôi (Hai, 2015).

Trong thời gian gần đây, các cơng trình nghiên cứu sử dụng chất chiết thảo

dược giúp tăng khả năng kháng vi khuẩn Vibrio và tăng cường đáp ứng miễn dịch tôm đã tăng lên đáng kể (Ghosh et al., 2021). Ví dụ, Gracilaria spp. (họ Gracilariaceae) và Sargassum spp. (họ Sargassaceae) đã được sử dụng hầu hết cho các thí nghiệm in-vitro và in-vivo để xác định hiệu quả phòng bệnh trên tơm. Một số lồi thực vật khác như Eucalyptus camaldulensis, Psidium guajava,

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

3

Rhodomyrtus tomentosa và Syzygium cumini (họ Myrtaceae) đã được xác định hiệu quả giúp tôm kháng Vibrio gây bệnh (Reverter et al., 2017; Ghosh et al.,

2021). Do vậy, việc sàng lọc các lồi thảo dược sẵn có giúp tăng cường hệ miễn dịch tôm, tăng sức đề kháng mầm bệnh nhằm tìm ra giải pháp phịng bệnh an toàn sinh học sẽ mang lại hiệu quả thiết thực cho người nuôi tôm vùng ĐBSCL.

Từ những cơ sở nêu trên, đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên miễn dịch và khả năng kháng khuẩn trên tôm thẻ chân trắng

(Penaeus vannamei)” được thực hiện.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Nghiên cứu được thực hiện nhằm: (i) Đánh giá tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm biển ở một số hộ nuôi tôm thuộc các tỉnh thuộc vùng ĐBSCL; (ii) Chọn lọc được một số loài thảo dược phổ biến ở ĐBSCL có

hoạt tính kháng khuẩn trong điều kiện in-vitro, cũng như khả năng tăng cường miễn dịch và giúp tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) kháng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trong điều kiện in-vivo; (iii) Xác định một số hợp

chất tự nhiên trong chất chiết thảo dược có hiệu quả trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính. Trên cơ sở đó, kết quả nghiên cứu góp phần đóng góp các thông tin khoa học làm cơ sở đề xuất giải pháp ứng dụng sản phẩm thảo dược

trong phòng bệnh do vi khuẩn gây ra, đặc biệt là nhóm vi khuẩn Vibrio, điều

này góp phần đề xuất các giải pháp quản lý dịch bệnh tổng hợp và phát triển nghề nuôi tôm biển bền vững.

1.3 Nội dung nghiên cứu của luận án

Nhằm đạt được mục tiêu đề ra, luận án được thực hiện bao gồm 4 nội dung chính (Hình 1.1):

Khảo sát tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong quá trình ni tơm biển ở tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng thuộc vùng ĐBSCL.

Sàng lọc một số lồi thảo dược có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi gây bệnh trên tôm.

Xác định khả năng tăng cường miễn dịch tôm của một số chất chiết thảo dược.

Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tơm thẻ chân trắng.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

4

Hình 1.1: Sơ đồ các nội dung nghiên cứu tổng quát của luận án

1) Khảo sát tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi

Xác định loại chất chiết thảo dược lên tăng trưởng, đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng

khuẩn V. parahaemolyticus trên

tơm thẻ chân trắng

Phân tích thành phần một số hợp chất hóa học cơ bản trong mơt số chất chiết thảo dược có hiệu quả trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tơm.

4) Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phịng bệnh AHPND trên tơm

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

5 1.4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án có những đóng góp về mặt nghiên cứu khoa học và khả năng ứng dụng của thảo dược đối với ngành nuôi trồng thủy sản ở một số nội dung:

Khảo sát cho thấy tỷ lệ hộ nuôi sử dụng thảo dược trong nuôi tơm là rất cao, mơ hình sử dụng là thâm canh và siêu thâm canh, đối tượng áp dụng cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng.

Xác định được 18 loài thực vật đang được sử dụng trong ni tơm, trong đó tỏi là loài được sử dụng phổ biến nhất, tiếp theo là cây diệp hạ châu

(Phyllanthus spp.), ổi (Psidium guajava), mật gấu (Vernonia amygdalina), thù lù (Physalis angulata). Các loài thảo dược tiềm năng tập trung ở bộ sơ ri (diệp

hạ châu, mần ri), bộ cà (thù lù), bộ cúc (mật gấu, cỏ mực), bộ đào kim nương (ổi), bộ húng (ô rô).

Xác định được 6 loài thảo dược thu thập ở vùng ĐBSCL có hoạt tính kháng

khuẩn cao đối với V. parahaemolyticus (CM5) và V. harveyi (T2016-04) bằng

phương pháp khuếch tán đĩa thạch, bao gồm chất chiết bằng methanol của bàng

(Terminalia catappa), lựu (Punica granatum), diệp hạ châu thân đỏ (P. urinaria L.), diệp hạ châu thân xanh (Phyllanthus amarus Schumach & Thonn), bần ổi (Sonneratia ovata), bần chua (S. caseolaris). Tất cả 6 chất chiết thảo dược này

đều có tính kìm khuẩn. Ngồi ra, các chất chiết này đều thể hiện hoạt tính kháng

khuẩn mạnh đối với các chủng V. parahaemolyticus và V. harveyi phân lập từ

ao nuôi tôm.

Xác định được liều lượng và thời gian bổ sung chất chiết xuất từ lá bàng

(T. catappa) và chất chiết xuất từ quả bần chua (S. caseolaris) (1% và nhịp bổ sung 2 tuần) giúp tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử

gan tụy cấp tính. Đồng thời với liều lượng và thời gian bổ sung các chất chiết này không ảnh hưởng đến tăng trưởng, tỷ lệ sống và hệ số chuyển đổi thức ăn của tôm thẻ chân trắng.

Đây cũng là kết quả đầu tiên xác định được chất chiết quả bần chua có hiệu quả trong tăng cường các thông số miễn dịch và khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tơm ni thương phẩm. Kết quả nghiên cứu xác định được tiềm năng của chất chiết bàng và bần chua có thể ứng dụng trong phịng bệnh cho tơm ni.

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

6 1.5 Ý nghĩa thực tiễn của luận án

Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thảo dược trên vi khuẩn

gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (V. parahaemolyticus) và vi khuẩn gây bệnh phát sáng (V. harveyi) là cơ sở khoa học và tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo

nhằm xác định giải pháp phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính và bệnh phát sáng hiệu quả và an toàn.

Kết quả đạt được của nghiên cứu cung cấp thông tin, số liệu về tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi trồng thủy sản. Cụ thể, thông tin khảo sát giúp xác định rõ thực trạng và nhu cầu sử dụng thảo dược của người ni tơm; chọn lọc được một số lồi thảo dược có khả năng kháng khuẩn, tăng cường miễn dịch kháng vi khuẩn gây bệnh và không ảnh hưởng đến tăng trưởng của tôm nuôi; xác định lồi thảo dược có khả năng ứng dụng vào q trình ni tơm thẻ chân trắng thương phẩm.

Từ đó, kết quả nghiên cứu đóng góp thơng tin khoa học: (i) cho định hướng ứng dụng thảo dược vào quy trình ni tơm; nhằm hạn chế việc sử dụng thuốc và hóa chất trong ni thủy sản; (ii) giúp cho các nhà khoa học và cơ quan quản lý thuốc kháng sinh có giải pháp ngăn chặn và kiểm soát vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh nhằm hướng đến việc sản xuất tôm an toàn và bền vững.

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

7

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học, tình hình ni và tiêu thụ tơm thẻ chân trắng 2.1.1 Đặc điểm sinh học

Tơm thẻ chân trắng có tên khoa học là Penaeus vannamei (Boone, 1931) hay còn được gọi với tên Litopenaeus vannamei, loài này thuộc họ tơm he, họ

tơm này là họ tơm có nhiều lồi được ni phổ biến trên thế giới (Flegel, 2007;

Fofonoff et al., 2018). Năm 1997, Pérez Farfante & Kensley đã đề xuất tôm thẻ chân trắng với danh pháp khoa học là Litopenaeus vannamei, nhóm tác giả đã

dựa trên những khác biệt về hình thái, đặc biệt là những đặc trưng về cơ quan sinh dục. Tuy nhiên, kết quả dựa vào đặc điểm hình thái để phân nhánh giống

Penaeus đã không thống nhất với các kết quả phân tích di truyền, do vậy được kết luận giữ nguyên tên giống Penaeus (Fofonoff et al., 2018). Flegel (2007)

cho rằng sự định loại sai sẽ ảnh hưởng đến nghiên cứu dịch tễ học, cũng như việc quản lý dịch bệnh trên tôm.

Tôm thẻ chân trắng là lồi tơm nhiệt đới, có nguồn gốc từ vùng biển Tây

Mỹ Latinh, phân bố từ phía Nam Peru đến phía bắc Mexico. Đầu những năm 1970, chúng được đưa đến các đảo ở Thái Bình Dương, từ đây các nghiên cứu đầu tiên về lai tạo giống được tiến hành nhằm nâng cao tiềm năng nuôi trồng thủy sản đối với đối tượng này. Vào cuối những năm 1970 và đầu những năm 1980, tôm thẻ chân trắng được đưa tới Hawaii và bờ biển phía Đơng Đại Tây Dương, bao gồm các nước thuộc Châu Mỹ, phía Nam Carolina, Bắc Texas đến Trung Mỹ và Nam Brazil. Từ đó, tơm thẻ chân trắng đã trở thành lồi ni chính ở Ecuador, Mexico, Venezuela, Brazil, và Trung Mỹ. Tơm thẻ chân trắng được đưa vào Châu Á nuôi thử nghiệm từ năm 1978 đến năm 1979, nhưng chỉ được thương mại hóa từ năm 1996 ở Trung Quốc và Đài Loan, sau đó mở rộng sang Philippin, Indonesia, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia và Ấn Độ (2000-2001) (Hình 2.1) (FAO, 2006).

Hình 2.1: Bản đồ các nước nuôi tôm thẻ chân trắng (vùng màu cam)

(FAO, 2006)

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

8

Ở Việt Nam vào đầu những năm 2000, tôm thẻ chân trắng cũng được du nhập và nuôi, tuy nhiên việc ni đối tượng này vẫn cịn hạn chế vì những lo ngại rằng tơm thẻ chân trắng có khả năng truyền bệnh truyền nhiễm cho tôm bản địa. Mãi đến năm 2006, ngành thuỷ sản đã cho phép nuôi bổ sung tôm chân trắng tại các tỉnh từ Quảng Ninh đến Bình Thuận, nhưng vẫn cấm ni tại khu vực ĐBSCL. Đầu năm 2008, nhận thấy thị trường thế giới đang có xu hướng tiêu thụ mạnh mặt hàng tôm thẻ chân trắng của Thái Lan, Trung Quốc… và sản phẩm tôm sú nuôi của Việt Nam bị cạnh tranh mạnh, hiệu quả sản xuất thấp, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN&PTNT) đã ban hành Chỉ thị số 228/CT-BNN&PTNT cho phép nuôi tôm chân trắng tại vùng ĐBSCL nhằm đa dạng hoá sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu, giảm áp lực cạnh tranh, đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng của các nước trong khu vực và trên thế giới (Bộ NN&PTNT).

2.1.2 Tình hình ni và tiêu thụ tơm thẻ chân trắng

Theo ghi nhận từ FAO (2006) (FAO Fisheries & Aquaculture Department) tơm thẻ chân trắng được ni với các hình thức: quảng canh, bán thâm canh, thâm canh và siêu thâm canh, tương ứng với mật độ thả thấp, trung bình, cao và rất cao. Thơng số chi tiết mơ tả các mơ hình bao gồm: (i) Mơ hình quảng canh: tơm ni ở những vùng gần biển, không sử dụng hệ thống bơm nước, không sục khí. Ao có hình dạng khơng đều, thường diện tích 5-10 ha (tối đa 30 ha) và độ sâu 0,7-1,2 m. Giống từ tự nhiên thông qua việc lấy nước bằng cống cấp nước hay thu mua, tôm được thả với mật độ 4-10 PL/m2. Thức ăn cho tôm chủ yếu là thức ăn tự nhiên và cho ăn một lần trong ngày hay ăn thức ăn có hàm lượng protein thấp. Kích cỡ tơm thu hoạch 11-12 g/con sau 4-5 tháng nuôi. Năng suất đạt 150-500 kg/ha/vụ, với 1-2 vụ/năm. (ii) Mơ hình bán thâm canh: ao ni có diện tích 1-5 ha, giống được thả với mật độ 10-30 PL/m2. Ao nuôi thường được thay nước, độ sâu của ao là 1,0-1,2 m và sục khí ở mức tối thiểu. Thức ăn cho tôm ăn là thức ăn tự nhiên và được bổ sung thêm thức ăn công nghiệp với chế độ 2-3 lần/ngày. Năng suất trong các ao bán thâm canh dao động từ 500-2000 kg/ha/vụ, với 2 vụ/năm. (iii) Mơ hình thâm canh: các trang trại thường được đặt tại các khu vực không có thủy triều, nơi ao có thể thốt nước hồn tồn, phơi khơ và thuận tiện cho chuẩn bị trước trong mỗi lần thả nuôi, cách xa biển ở những khu vực có độ mặn thấp. Ao được thiết kế là ao đất, hay có lót bạt để giảm xói mịn và tăng cường chất lượng nước. Ao thường nhỏ (0,1-1,0 ha), có hình vng hoặc tròn. Độ sâu của nước thường lớn hơn 1,5 m. Mật độ thả giống dao động từ 60-300 PL/m2. Cho ăn với thức ăn công nghiệp chế độ ăn 4-5 lần/ngày, FCR đạt khoảng 1,4 - 1,8 : 1 kg tôm. Sản lượng tơm khoảng 20.000 kg/ha/vụ, với 2-3 vụ/năm, có thể đạt được tối đa 30.000-35.000 kg/ha/vụ. Mô

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

9

hình này có thể vận hành theo hệ thống biofloc và duy trì hệ vi sinh vật dị dưỡng. Thức ăn có hàm lượng protein thấp và được cho ăn 2-5 lần/ngày, đồng thời phải duy trì tỷ lệ C: N là 10: 1, ao ni hình thành các hạt floc là một nhóm hệ sinh vật, tôm sẽ tiêu thụ các hạt floc này, giảm sự phụ thuộc vào thức ăn giàu protein, giảm FCR và tăng hiệu quả chi phí. (iv) Mơ hình siêu thâm canh tơm được ni khép kín, khơng trao đổi nước (chỉ bổ sung lượng ít do bay hơi hoặc xả thải), tôm giống được kiểm tra là tôm sạch bệnh. Hệ thống nuôi này được cho là an toàn sinh học, thân thiện với mơi trường, có thể sản xuất tơm chất lượng cao, tiết kiệm chi phí. Sản lượng 28.000-68.000 kg/ha/vụ với tốc độ tăng trưởng 1,5 g/tuần, tỷ lệ sống đạt 55-91%, trọng lượng trung bình 16-26 g và FCR là 1,5-2,6:1 kg tôm. Ở Việt Nam, một số tỉnh giáp biển cũng đã sớm có những ban hành các qui định điều kiện nuôi tôm phù hợp với địa bàn địa phương, như quyết định số 05/2019/QĐ-UBND ngày 12/3/2019 của Ủy ban Nhân Dân tỉnh Trà Vinh về điều kiện nuôi tôm nước lợ siêu thâm canh, công nghệ cao trên địa bàn tỉnh Trà Vinh.

Bên cạnh sự phát triển về sự đa dạng hình thức, kỹ thuật ni nhằm nâng cao năng xuất, thì trong một thập kỷ qua tình hình dịch bệnh và khủng hoảng kinh tế cũng dẫn đến ngành công nghiệp ni tơm có nhiều biến động, tuy nhiên năm 2016 và 2017 đã có dấu hiệu phục hồi. Theo khảo sát của Liên minh Nuôi trồng Thủy sản Toàn cầu (Global Outlook for Aquaculture Leadership – GOAL) và Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (Food & Agriculture Organization of the United Nations - FAO) tỷ lệ tăng trưởng hàng năm (compound annual growth rate - CAGR) giai đoạn 2012 đến 2017 là 2,2%. Bên cạnh đó GOAL đã báo cáo năm 2018 sản lượng gia tăng + 11% so với năm 2017 và có những ước tính về sự tăng trưởng hơn nữa vào năm 2021 (Hình 2.2) (GOAL, 2019).

Hình 2.2: Biểu đồ sản lượng tôm nuôi theo khu vực/nước và xu hướng tăng

trưởng đến năm 2021 (Nguồn: FAO (2019) và GOAL (2011 đến 2018) cho năm 2010 đến 2017, GOAL (2019) cho năm 2018 đến 2021)

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

10

Sản lượng tơm trên tồn cầu đạt 4,5 triệu tấn vào năm 2018 và có khả năng lên hơn 5,00 triệu tấn vào năm 2021. Đặc biệt tăng trưởng mạnh ở Việt Nam và Trung Quốc, với dự đoán về CAGR lần lượt là 4,6 và 3,9% từ 2018 đến 2021. Bên cạnh xu hướng tăng lên về sản lượng tơm của Việt Nam và Trung Quốc thì các nước Ấn Độ và Indonesia cho thấy sự giảm xuống, cụ thể ở Indonesia dự kiến chỉ sản xuất 450.000 tấn vào năm 2021, tức là giảm 18% so với sản lượng được báo cáo trong năm 2017. Ấn Độ đạt mức sản xuất là 700.000 tấn vào năm 2018 nhưng dự kiến sản lượng giảm xuống 600.000 tấn vào năm 2021. Tuy nhiên, Thái Lan sản lượng tôm vẫn đang tiếp tục phục hồi sau sự tác động của AHPND, nhưng có tốc độ tăng trưởng chậm với sản lượng dự kiến sẽ đạt 330.000 tấn vào năm 2021, chỉ bằng 56% của năm 2010 (trước khi dịch bệnh AHPND xuất hiện (Hình 2.3) (GOAL, 2019).

Hình 2.3: Biểu đồ sản lượng tôm nuôi ở các nước thuộc Châu Á và xu hướng tăng trưởng đến năm 2021 (Nguồn: FAO (2019) và GOAL (2011 đến

2018) cho năm 2010 đến 2017, GOAL (2019) cho năm 2018 đến 2021)

Nuôi tôm thẻ chân trắng vùng ĐBSCL bắt đầu phát triển vào năm 2008 Quyết định số 456/QĐ-BNN-NTTS ngày 04/02/2008 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN&PTNT). Đến năm 2014, tổng diện tích ni tơm thẻ chân trắng tại 8 tỉnh (Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh, Bến Tre, Kiên Giang, Tiền Giang, Long An) vùng ven biển ĐBSCL là 60.952 ha, tăng hơn 13 lần so với năm 2008 (4.477 ha) với mức tăng trưởng bình quân đạt 54,53%/năm (Hình 2.4).

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

11

Hình 2.4: Diễn biến diện tích ni tơm thẻ chân trắng vùng ĐBSCL giai đoạn 2008 – 2014 (Nguồn: Tổng cục Thủy sản, Sở NN&PTNT 8 tỉnh ven biển

vùng ĐBSCL)

Trong đó, tỉnh Sóc Trăng có diện tích ni tơm thẻ chân trắng lớn nhất chiếm 44,33% kế đến là Bạc Liêu, Cà Mau lần lượt là 13,25; 10,83% (Hình 2.5) vào năm 2014.

Hình 2.5: Cơ cấu diện tích ni tơm thẻ chân trắng các tỉnh vùng ĐBSCL năm 2014 (Nguồn: Tổng cục Thủy sản, Sở NN&PTNT 8 tỉnh ven biển vùng

Nhưng về sản lượng Sóc Trăng đạt cao nhất với 26,86%, kế đến Cà Mau với 16,34%, Bạc Liêu chỉ đạt 12,40% thấp hơn Bến Tre với 15,64%, phần còn lại là Trà Vinh, Kiên Giang, Tiền Giang, Long An vào năm 2014 (Hình 2.6).

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

12

Hình 2.6: Cơ cấu sản lượng ni tôm thẻ chân trắng các tỉnh vùng ĐBSCL năm 2014 (Nguồn: Tổng cục Thủy sản, Sở NN&PTNT 8 tỉnh ven biển

vùng ĐBSCL)

Qua những con số thống kê trên cho thấy Cà Mau và Kiên Giang là 2 tỉnh được trú trọng đầu tư và khai thác triệt để điều kiện của vùng nhằm tăng cường diện tích nuôi và nâng cao sản lượng. Theo Bộ NN&PTNT định hướng diện tích ni tơm thẻ chân trắng vào 2030 thì tỉnh Cà Mau có diện tích ni lớn nhất kế đến là Sóc Trăng. Các tỉnh khác cũng có diện tích tăng lên nhưng thấp hơn so với Cà Mau và Sóc Trăng. Đồng thời sản lượng tôm thẻ chân trắng theo định hướng đến năm 2030 sản lượng tôm thẻ chân trắng gần bằng sản lượng tơm sú, ở Sóc Trăng sản lượng tôm thẻ chân trắng cao hơn tôm sú và đứng hàng thứ 2 trong tổng 8 tỉnh ven biển ĐBSCL (Hình 2.7 và 2.8).

Hình 2.7: Diện tích nuôi tôm nước lợ ở các tỉnh ĐBSCL đến năm 2020 và tầm nhìn đến 2030 (ha)

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

13

Hình 2.8: Sản lượng ni tơm nước lợ các tỉnh ĐBSCL đến năm 2020, tầm nhìn đến 2030 (tấn)

Theo quyết định số 456/QĐ-BNN-NTTS cho phép phát triển mơ hình ni tơm thẻ chân trắng thâm canh. Diện tích ni tơm thẻ chân trắng theo mơ hình nuôi thâm canh đạt 90.000 ha (năm 2020) và tăng lên 100.000 ha (năm 2030), tăng trưởng bình qn 1,06%/năm. Diện tích ni tơm thẻ chân trắng thâm canh được bố trí ni tập trung ở các huyện Đầm Dơi, Cái Nước, Phú Tân, Thới Bình, Năm Căn, Trần Văn Thời, Ngọc Hiển và thành phố Cà Mau (Cà Mau), thị xã Vĩnh Châu và các huyện Trần Đề, Long Phú, Cù Lao Dung, Mỹ Xuyên (Sóc Trăng) và một số huyện và thành phố trực thuộc các tỉnh Bạc Liêu, Bến Tre, Trà Vinh, Kiên Giang, Tiền Giang, Long An. Qua kế hoạch định hướng phát triển diện tích ni và sản lượng đạt được vào năm 2030 còn cho thấy được một số tỉnh được chọn là nơi đột phá về năng xuất trong đó Cà Mau và Sóc Trăng là 2 tỉnh có tiềm năng nhất tính đến kế hoạch 2030.

Tuy nhiên với tình hình dịch bệnh ngày càng phức tạp và dưới sự tác động yếu tố thời tiết, để giảm thiểu rủi ro người ni dân thu hoạch tơm với kích cỡ

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

14

Cụ thể, ở biểu đồ Hình 2.9 cho thấy ở các nước Châu Á, kích cỡ tơm thu hoạch có xu hướng nhỏ hơn (khoảng 51-60 con/kg và nhỏ hơn) kể từ năm 2011. Tỷ lệ kích cỡ tơm thu hoạch nhỏ tăng từ 27% trong năm 2010 lên 48% vào năm 2017. Tuy nhiên tỷ lệ kích cỡ tơm thu hoạch nhỏ giảm xuống cịn 37% vào năm 2018, nhưng nhìn chung vẫn cao hơn so với kích cỡ tơm thu hoạch được báo cáo trước năm 2010. Cụ thể nguyên nhân do bùng phát dịch bệnh AHPND vào năm 2009 (GOAL, 2019).

2.2 Một số bệnh vi khuẩn và hệ miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng

Bệnh được định nghĩa là sự thay đổi bất kỳ từ trạng thái bình thường của sức khỏe. Là sự kết hợp của các triệu chứng do duy nhất một nguyên nhân hoặc nhiều nguyên nhân xảy ra cùng nhau để tạo thành một biểu hiện lâm sàng riêng biệt. Kết quả là dẫn đến các dấu hiệu bệnh lý của bệnh như tăng trưởng kém hoặc giảm sức đề kháng, căng thẳng (Dorland’s Medical Dictionary, 1968). Các bệnh xuất hiện trên tôm nuôi bao gồm bệnh truyền nhiễm và bệnh không truyền nhiễm (Lightner & Redmanr, 1998). Trong đó, bệnh truyền nhiễm với tác nhân chủ yếu là virus, vi khuẩn, nấm, protista và metazoan (Lightner, 1993; 1996;

Brock & Lightner, 1990b; Fulks et al., 1992). Một số tác nhân gây bệnh không

truyền nhiễm bao gồm các biến động tiêu cực của môi trường, mất cân bằng dinh dưỡng, chất độc và yếu tố di truyền (Brock & Lightner, 1990a; Lightner, 1996).

Hiện nay với sự tăng cường của ngành nuôi tôm và chuyển giao các sinh vật thủy sản trên toàn thế giới dẫn đến gia tăng tỷ lệ mắc bệnh truyền nhiễm, cũng như sự diễn biến phức tạp của tình hình dịch bệnh. Nhóm vi khuẩn gây

bệnh trên tơm thẻ chân trắng chủ yếu là do Vibrio, nhóm vi khuẩn Vibrio có thể

đóng vai trị là tác nhân gây bệnh chính hoặc tác động như các tác nhân cơ hội

trong nhiễm trùng thứ phát (Saulnier et al., 2000). Trong đó, vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính và Vibrio harveyi gây bệnh

phát sáng trên tôm được đánh giá là tác nhân gây bệnh liên quan đến làm giảm tỷ lệ sống của tôm ở các trại giống và ao nuôi (Song & Lee, 1993).

2.2.1 Một số bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng

2.2.1.1 Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) xuất hiện đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 2009, sau đó bệnh xuất hiện ở Việt Nam vào năm 2010; Malaysia vào năm 2011; Thái Lan năm 2012 (Flegel,

2012; Lightner et al., 2012); Mexico năm 2013 (Nunan et al., 2014), năm 2015 ở Philippin (de la Peña et al., 2015; Dabu et al., 2017); năm 2016 ở Úc, Nam

Mỹ; năm 2017 ở Myanmar; năm 2019 ở Bangladesh, Mỹ (Hình 2.10) (Kumar

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

15

et al., 2021). Đầu tiên, bệnh được báo cáo với tên gọi là hội chứng chết sớm

(Early Mortality Syndrome - EMS), do bệnh có khả năng gây chết hàng loạt ấu trùng tôm trong vài ngày. Sau đó, bệnh được đề xuất với tên mới là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreas Necrosis Syndrome - AHPNS), tên gọi nhằm mô tả chi tiết hơn cho giai đoạn biểu hiện cấp tính của bệnh, ở Đơng Nam Á bệnh hoại tử gan tụy cấp tính đã gây thiệt hại đáng kể ở các trang

trại nuôi tôm (Tran et al., 2013a).

Hình 2.10: Bản đồ các quốc gia xuất hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Kumar et al., 2021)

Khả năng gây thiệt hại về kinh tế do AHPND là rất lớn, cụ thể là khi dịch bệnh mới xuất hiện lần đầu tiên ở Trung Quốc đã làm giảm 80% sản lượng tôm nuôi; ở Việt Nam dịch bệnh cũng làm tổn thất kinh tế ước tính là 570.000-7.200.000 USD được ghi nhận vào khoảng 2011 và 2012, do sản lượng giảm từ 70.000 tấn trong năm 2010 xuống 40.000 (2011) và 30.000 tấn (2012). Trong suốt năm 2012; ở Thái Lan tổng sản lượng tôm bị mất do dịch bệnh khoảng 7%,

đặc biệt tập trung nhiều ở các khu vực ven biển (Lightner et al., 2013). Năm

2013, bệnh này đã được báo cáo xuất hiện ở các nước phía tây bán cầu và Mexico, làm thiệt hại khoảng 118 triệu USD, việc lây lan mầm bệnh sang khu vực tây bán cầu đã trở thành một mối quan tâm lớn cho các nhà sản xuất tôm

trong khu vực (Schryver et al., 2014).

Tác nhân gây bệnh

Năm 2013, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tơm ni được xác định là do

vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, vi khuẩn này mang plasmid mã hóa gen gây độc (Tran et al., 2013a; b; Kondo et al., 2015). Plasmid có kích thước khoảng

70 kbp, plasmid có chứa các gen mã hóa tương đồng với gen độc tố thuộc loài

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

16

Photorhabdus, gen mã hóa độc tố (Photorhabdus insect-related - Pir) này có khả năng tiêu diệt cơn trùng, có tên là PirA và PirB (Hình 2.11) (Yang et al., 2014; Kondo et al., 2014; Han et al., 2015a; Lee et al., 2015). Plasmid hiện diện trong vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND đã được xác định là pVA1 (Lee et al., 2015; OIE, 2021).

Hình 2.11: Trình tự đầy đủ của plasmid pVA1 gây bệnh AHPND trên tôm

(Lee et al., 2015)

Dấu hiệu bệnh lý

Tơm ni nhiễm AHPND có các dấu hiệu lâm sàng bao gồm (i) tôm ngừng ăn, bơi chậm; (ii) vỏ mỏng, màu tôm nhợt nhạt, ruột không liên tục hay rỗng; (iii) gan tụy có biểu hiện trắng nhợt nhạt, teo, dai (Hình 2.12) (NACA, 2012; NACA, 2014).

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

17

Hình 2.12: Tơm thẻ chân trắng nhiễm AHPND có màu nhợt nhạt ruột rỗng, gan tụy nhợt nhạt, teo (trái); tơm khỏe có màu sắc bình thường

(phải) (Lightner & Flegel, 2013)

Lồi và giai đoạn cảm nhiễm

Tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính được xác định gây chết tơm sú và tôm thẻ chân trắng (OIE, 2021) ở thời điểm 30-35 ngày, hay sớm hơn 10

ngày sau khi thả giống (Leaño & Mohan, 2012; Tran et al., 2014b; Joshi et al., 2014; Nunan et al., 2014; Soto-Rodriguez et al., 2015). Tuy nhiên, ở Philippin

cũng đã ghi nhận dịch bệnh bùng phát ở thời điểm 46-96 ngày sau khi thả nuôi

trên cả tơm sú và tơm thẻ chân trắng (De la Pa et al., 2015).

Phương thức lan truyền

Tác nhân gây bệnh được xác định lan truyền qua đường miệng, cụ thể tác nhân gây bệnh xâm nhập vào miệng sau đó đến dạ dày, ruột và tạo ra chất độc gây ra sự phá hủy cấu trúc mô, đặc biệt là mô gan tụy (OIE, 2021). Theo Tran

et al. (2014b) thông qua các nghiên cứu thực nghiệm cho thấy chủng V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND không thể truyền qua tôm nhiễm bệnh đã được đông lạnh. Tuy nhiên, Lee et al. (2022) lại cho rằng gen độc tố pirA/B của V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính được phát hiện trong tôm

đông lạnh nhập khẩu từ các nước đến Hàn Quốc. Bên cạnh đó, nhóm tác giả này đã tiến hành thử nghiệm chứng minh khả năng lây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính

(AHPND) liên quan đến vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của tôm đông lạnh được trữ ở -80°C. Ngoài ra, theo Andrews et al. (2000); Su & Liu (2007) một số chủng V. parahaemolyticus không gây bệnh AHPND cũng nhạy cảm với

nhiệt độ quá thấp (đông lạnh), hay nhiệt độ cao và các chất khử trùng. Cho đến

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

18

nay, các báo cáo chính thức vẫn chưa ghi nhận về chủng V. parahaemolyticus

gây bệnh trên tơm có ảnh hưởng đến sức khỏe con người (FAO, 2013).

Phương pháp chẩn đoán

Một số phương pháp chẩn đoán AHPND đã được công bố bao gồm: (i) Dựa vào dấu hiệu lâm sàng; (ii) Phương pháp mô học giúp xác định tình trạng nhiễm bệnh AHPND. Cụ thể, các dấu hiệu đầu tiên như thoái hoá tế bào gan tụy; thiếu hoạt động phân bào đẳng nhiễm của tế bào có nguồn gốc từ mơ phôi (tế bào E, Embryozellen); rối loạn chức năng các tế bào trung tâm tổ chức gan tụy như tế bào tiết: B (Basenzellen), tế bào xơ: F (Fibrillenzellen), tế bào dự trữ: R (Restzellen); bệnh nặng hơn thì các tế bào có nhân lớn bất thường và sự bong tróc tế bào. Giai đoạn cuối các tế bào máu tập hợp ở khoảng giữa các ống gan

và nhiễm khuẩn (FAO, 2013; Praveena et al., 2014); (iii) Phương pháp PCR

giúp phát hiện nhanh AHPND đã được phát triển với nhiều quy trình khác nhau

(Sirikharin et al., 2015; Dangtip et al., 2015; Han et al., 2015b), nhằm giúp

nhanh chóng phát hiện và ngăn ngừa sự lây lan bệnh đến các quốc gia khác

(Nunan et al., 2014).

Vào năm 2015, một nghiên cứu được công bố cho thấy chủng vi khuẩn ký hiệu KC13.17.5 phân lập trên tôm nuôi tại Việt Nam có dấu hiệu bệnh lý tương tự với AHPND. Chủng này khi phân tích trình tự gen, kết quả cho thấy có sự

tương đồng cao với các gen của vi khuẩn V. harveyi và V. campbellii hơn là so với vi khuẩn V. parahaemolyticus. Chủng vi khuẩn này cũng có sự hiện diện các gen độc tố (Photorhabdus insect-related - Pir (PirA, PirB) và có trình tự giống với plasmid gây bệnh AHPND (Kondo et al., 2015). Hay trong một nghiên cứu khác, nhóm tác giả thử nghiệm cảm nhiễm tôm thẻ chân trắng P. vannamei với một chủng V. campbellii (20130629003S01) mang pirVP được

phân lập từ ao nuôi và đã chứng minh rằng V. campbellii là tác nhân gây bệnh của AHPND (Dong et al., 2017). Năm 2018, Liu et al. đã chứng minh chủng V. owensii cũng là tác nhân gây bệnh AHPND ở tôm thẻ chân trắng được nuôi ở Trung Quốc (Hình 2.13). Bên cạnh đó các gen PirVP gây ra AHPND cũng được

xác định trong một loài Vibrio mới là V. punensis (Restrepo et al., 2018). Năm 2020, Xiaosha et al. cũngđã tiến hành giải trình tự hồn chỉnh bộ gen của chủng

V. owensii (SH‑14) phân lập từ tôm thẻ chân trắng bị bệnh hoại tử gan cấp tính

(Bảng 2.1).

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

19

Hình 2.13: Bản đồ trình tự của plasmid pVHvo liên quan đến AHPND

trong V. owensii và sơ đồ nhận dạng trình tự của plasmid pVH (Xiao at al.,

2017)

Bảng 2.1: Các loài vi khuẩn Vibrio được ghi nhận gây bệnh AHPND trên tôm (Kumar et al., 2021)

Vibrio parahaemolyticus P. monodon,

P. vannamei Các nước nuôi tôm

V. parahaemolyticus Macrobrachium rosenbergii

Điều kiện phịng thí nghiệm

Malaysia, Việt Nam

Từ những cơ sở đó, Xiao et al. (2017) đã cho rằng plasmid mang gen độc tố PirA, PirB gây bệnh AHPND trên tơm phổ biến ở nhiều lồi Vibrio. Điều này cũng có nghĩa là các gen độc tố có thể được truyền từ loài vi khuẩn Vibrio này

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

20

sang loài vi khuẩn Vibrio khác (Kondo et al., 2015), những nhận định hồn tồn

có cơ sở bằng việc có những kết quả nghiên cứu tương tự vào các năm gần đây, việc phát hiện này rất có ý nghĩa trong phịng bệnh vi khuẩn trong tương lai. Qua đó cho thấy khả năng đồng nhiễm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính và phát

sáng từ V. harveyi là rất cao. Tuy nhiên trước đây V. harveyi được biết đến phổ

biến nhất là tác nhân gây bệnh phát sáng trên tôm.

2.2.1.2 Bệnh phát sáng do vi khuẩn Vibrio harveyi

Tác nhân gây bệnh

Trong những năm 1987-1990, bệnh phát sáng trên tôm sú (Penaeus monodon) được xác định tác nhân là vi khuẩn Vibrio harveyi (Pass et al., 1987; Lavilla-Pitogo et al., 1990). Tuy nhiên, bệnh phát sáng trên tơm cịn được ghi nhận là do một số lồi vi khuẩn khác như V. splendidus, V. orientalis, V. fischer.

Bệnh được tìm thấy trên ấu trùng, hậu ấu trùng tôm sú ở Indonesia (Sunaryanto

& Mariam, 1986), Thai Lan (Jiravanichpaisal et al., 1994), Philippin (Baticados et al., 1990; Lavilla-Pitogo et al., 1990), Australia (Pizzutto & Hirst, 1995), Đài

Loan (Liu et al., 1996a) và Ecuador (Robertson et al., 1998).

Vi khuẩn V. harveyi là vi khuẩn Gram âm nên thành tế bào có lớp

peptidoglycan mỏng, khơng có acid teicoic, lipid và protein cao, có tiêm mao nên giúp vi khuẩn chuyển động trong mơi trường lỏng. Ban đầu, vi khuẩn này

có tên là Achromobacter harveyi (Johnson & Shunk, 1936). Sau đó, vi khuẩn được đổi tên là Lucibacterium harveyi và Beneckea harveyi, hiện tại được biết đến với tên gọi V. harveyi (Farmer et al., 2005).

Kết quả phân tích gen 16S rRNA xác định V. harveyi là một trong các lồi chính của giống Vibrio (Dorsch et al., 1992). Kết quả giải trình tự đã xác định bộ gen của vi khuẩn V. harveyi bao gồm hai nhiễm sắc thể và một plasmid, trong

đó nhiễm sắc thể I có 3.765.351 nucleotide; nhiễm sắc thể II có 2.204.018 nucleotide và plasmid chứa 89.008 nucleotide. Bộ gen có chứa gen mã hóa

6.040 protein và 166 gen mã hóa RNA. Đặc tính đặc biệt của V. harveyi (trong

họ Vibrionaceae) là có khả năng phát quang sinh học nhờ enzyme luciferase

(Sudalayandi et al., 2012).

Vi khuẩn V. harveyi được tìm thấy trong môi trường nước biển, chủ yếu là vùng nhiệt đới, phát triển mạnh ở mơi trường có độ mặn 20-30‰. Ngồi ra, V. harveyi cịn phát triển nhanh ở mơi trường nước có hàm lượng hữu cơ cao, oxy hịa tan thấp. V. harveyi là tác nhân gây bệnh của một số lồi cá, tơm, khả năng

gây bệnh phụ thuộc vào mật độ của tế bào vi khuẩn tại một thời điểm nhất định,

với mật độ của vi khuẩn V. harveyi trong ao nuôi là 102 CFU/mL làm tôm he chết (Lightner, 1993).

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

21

Vi khuẩn V. harveyi là một mầm bệnh nguy hiểm đối với động vật biển,

đặc biệt là trên tôm thuộc họ tôm he (penaeid). Theo Austin & Zhang (2006) các sản phẩm ngoại bào (Extracellular products) được coi là những yếu tố quan

trọng quyết định đến độc lực của V. harveyi (Bảng 2.1). Liu et al. (1996b) đã nghiên cứu khả năng gây bệnh của các chủng V. harveyi được phân lập từ tôm

sú bệnh, kết quả cho thấy độc lực của các chủng vi khuẩn này có cả trên vi khuẩn sống và trong các sản phẩm ngoại bào. Ở cả 2 dạng đều có hàm lượng protease cysteine (caseinase) cao hơn, phospholipase và hoạt tính tan huyết mạnh hơn so với các chủng khơng gây độc. Trong đó, các cysteine protease bản

chất là chất độc exotoxin, là tác nhân gây bệnh chính (Lee et al., 1996, Lee et al., 1997, Liu & Lee 1999).

Bảng 2.1: Cơ chế gây bệnh của V. harveyi (Austin & Zhang, 2006)

Các sản phẩm ngoại bào (cysteine protease, phospholipase,

haemolysin)

Liu et al. (1996b); Soto-Rodriguez et al. (2003)

Lipopolysaccharide Montero & Austin (1999)

Bacteriocin-like substance Prasad et al. (2005)

Quorum-sensing factors Henke & Bassler (2004) Liên kết các ion sắt Owens et al. (1996)

Khả năng gắn kết và hình thành

Đặc điểm đặc biệt nhất của V. harveyi là khả năng phát quang sinh học.

Điều này xảy ra thơng qua q trình cảm biến (quorum sensing - một cách để các tế bào giao tiếp với nhau). Quá trình phát quang sinh học phụ thuộc vào nồng độ của các tế bào vì enzyme luciferase sẽ được sản xuất ở nồng độ tế bào đủ cao thông qua một loạt các phản ứng hóa học gây ra bởi autoinducers (AI). Khi mật độ tế bào thấp, LuxO phosphorylated (một protein điều hịa phản ứng) kích hoạt q trình phiên mã của các gen mã hóa RNA khi nó làm mất ổn định và ngăn chặn sự phiên mã của LuxR (một protein điều hòa cảm biến quorum sensing). Khi mức độ tự động tăng lên, giảm LuxO, tăng LuxR và cho phép biểu

hiện các gen liên quan đến cảm biến quorum sensing (Christopher & Bonnie,

2006) (Hình 2.14).

</div>