NGHIÊN CỨU SỰ ỔN ĐỊNH VỀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01 PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.66 MB, 10 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

NGHIÊN CỨU SỰ ỔN ĐỊNH VỀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01 PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Phạm Văn Sơn

1*

, Nguyễn Thị Lan

2

, Nguyễn Văn Cảm

3

, Nguyễn Bá Hiên

2 1

Nghiên cứu sinh, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

2

Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3

Hội Thú y Việt Nam Email

*

:

Ngày gửi bài: 27.02.2017 Ngày chấp nhận: 25.04.2017

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện trên chủng virus KTY-PRRS-01 phân lập tại Việt Nam. Chủng virus KTY-PRRS-01 được cấy chuyển liên tiếp 5 đời trên môi trường tế bào Marc145 và ở mỗi đời cấy chuyển virus được kiểm tra các đặc tính sinh học và sinh học phân tử chủ yếu. Kết quả nghiên cứu cho thấy qua 5 đời cấy chuyển, khả năng nhân lên và hủy hoại tế bào của chủng virus này theo thời gian sai khác không đáng kể. Virus gây bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm, bệnh tích tế bào đạt 80% ở thời điểm 72 giờ và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 84 giờ. Hiệu giá virus ổn định ở 5 đời cấy chuyển với giá trị hiệu giá trung bình đạt từ 3,03x106/ml đến 7,12x106/ml. Gen ORF5 và ORF7 của chủng virus nghiên cứu ở 5 đời cấy chuyển đã được giải trình tự. Kết quả so sánh trình tự nucleotide và axit amin của các gen này cho thấy khơng có sai khác về trình tự nucleotide cũng như axit amin ở 5 đời cấy chuyển. Như vậy, chủng virus KTY-PRRS-01 ổn định về một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử qua 5 đời cấy chuyển.

Từ khóa: PRRS, ổn định, đặc tính sinh học và sinh học phân tử.

Study on Some Biological and Molecular Biological Characteristics of the KTY-PRRS-01 Virus Strain Isolated in Vietnam

ABSTRACT

The study was carried out on the KTY-PRRS-01 virus strain isolated in Vietnam. The PRRSV strains were cultured for 5th consecutive generations on the Marc145 cell and in each passage the virus was tested for biology and molecular biology characteristics. The results of the study showed that through 5th passages, the ability to multiply and destroy the cells of the original virus over time had no significant difference in the generations. The virus began to multiply and had cytopathogenic effect after 48 hours post - infection, cytopathogenic effect reached 80% at 72 hours post - infection, and the cells were completely destroyed after 84 hours post - infection. TCID50 of virus was stable through 5th passages with a titre from 3,03x106/ml to 7,12x106/ml. The ORF5 and ORF7 gene sequences of the virus strain through 5th passages were sequenced. Sequences of these genes showed no difference in nucleotide sequences as well as amino acids through 5th passages. Thus the KTY-PRRS-01 virus strain is stable in biological and molecular biology characteristics over 5th passages.

Keywords: PRRS, stablebiological and molecular biological characteristics.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) hay bệnh tai xanh được đặc trưng bởi những rối loạn sinh sản của lợn nái và

những vấn đề về đường hô hấp ở lợn con và lợn trưởng thành (Meulenberg et al., 1993). Bệnh gây ra bởi virus PRRS, thuộc bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Cavanagh, 1997). PRRSV được nhóm thành hai kiểu gen, châu Âu (type 1) và Bắc Mỹ (type 2), các dấu hiệu lâm

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

sàng của nhiễm trùng đều giống nhau, nhưng các chủng phân lập lại khác nhau về độc lực ở động vật nhiễm bệnh (Halbur et al., 1995) và đặc tính kháng nguyên, di truyền (Nelson et al., 1993, Nelsen et al., 1999, Meng, 2000). Dịch tai xanh xuất hiện ở hầu hết các khu vực chăn nuôi lợn quy mô lớn trên khắp thế giới. Tổn thất hàng năm cho ngành chăn nuôi lợn ở Hoa Kỳ do PRRS gây ra ước tính khoảng 664 triệu USD (Holtkamp et al., 2013). Đối với lợn nái, bệnh gây hậu quả nghiêm trọng như: lợn con sơ sinh yếu ớt, giảm số con sơ sinh sống sót/ổ, tình trạng bệnh âm ỉ, rối loạn sinh sản, động dục kéo dài, chậm động dục trở lại. Đối với đực giống, lượng tinh dịch giảm, chất lượng tinh dịch kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con (Pejsak et al., 1997). Kháng thể bệnh tai xanh lần đầu tiên được phát hiện ở Việt Nam năm 1997 trên một đàn lợn nhập từ Mỹ. Từ năm 2007 đến nay, bệnh liên tục xảy ra và bùng phát ở rộng khắc các tỉnh thành trong cả nước gây thiệt hại nặng cho ngành chăn ni. Tình hình bệnh tai xanh ngày càng phức tạp đòi hỏi sự chủ động trong phòng chống dịch bệnh, trong đó phương pháp phịng bệnh hiệu quả nhất là sử dụng vacxin. Tuy nhiên sự đa dạng di truyền và thay đổi kháng nguyên của các chủng PRRSV là một trở ngại lớn trong việc phát triển một loại vacxin có hiệu quả để kiểm soát PRRS. Các vacxin sống đã được sử dụng phổ biến để kiểm soát PRRSV vì chúng có khả năng bảo vệ tốt hơn so với vacxin đã vô hoạt hoặc các vacxin tái tổ hợp (Charerntantanakul, 2012, Zuckermann et al., 2007, Kim et al., 2011, Hu and Zhang, 2014). Tuy nhiên, ngày càng có nhiều quan ngại về sự an tồn của việc sử dụng vacxin sống vì sự hồi phục nhanh chóng độc lực của PRRSV trong quá trình sao chép ở lợn (Pejsak el al., 1997, Hu and Zhang, 2014, Mengeling et al., 2003). Hiện nay, trước tình hình nước ta đang phải tốn rất nhiều chi phí cho các loại vacxin ngoại nhập mà hiệu quả phòng bệnh chưa được như mong muốn. Vì vậy, nhằm chủ động nguồn cung cấp vacxin hiệu quả cao, giảm chi phí nhập khẩu, việc sản xuất được vacxin từ các chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam là việc làm cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao. Xuất phát từ

mục đích này, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm từ các ổ dịch PRRS trên địa bàn cả nước, phân lập và tuyển chọn được một số chủng virus có tiềm năng cho sản xuất vacxin. Một trong số những chủng virus tuyển chọn được là chủng virus KTY-PRRS-01. Để sản xuất được vacxin hiệu quả, cần phải hiểu rõ đặc điểm sinh học của chủng virus, đặc biệt là đặc điểm sinh học phân tử, do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự ổn định về một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-01 này với mục tiêu xác định được khả năng sinh trưởng ổn định và đặc điểm di truyền của chủng này, làm cơ sở cho việc lựa chọn chủng virus sử dụng trong sản xuất vacxin vô hoạt phòng PRRS ở Việt Nam.

2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Nguyên liệu

Tế bào Marc-145 (được cung cấp từ ngân hàng tế bào ATCC - Mỹ), chủng virus KTY-PRRS-01 (phân lập từ mẫu phổi của lợn mắc PRRS tại ổ dịch PRRS ở tỉnh Thái Bình, Việt Nam năm 2013 và được thẩm định tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc thú y TWI về tính vơ trùng, thuần khiết, có hiệu giá đạt 3,16x106/ml); môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium, Gibco); FBS (Fetal Bovine Serum, Invitrogen); dung dịch PBS 1X (Photphat Buffer Saline), Trypsin-EDTA (Invitrogen); bộ kit tách chiết RNA (Qiagen), kit RT-PCR (Invitrogen), kit giải trình tự (Beckman couter); máy PCR (eppendorf), máy giải trình tự (CED 8000, beckman couter); buồng an toàn sinh học cấp II (esco).

2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nuôi cấy tế bào

- Khôi phục tế bào

Trước khi nuôi cấy tế bào cần chuẩn bị môi trường đầy đủ (DMEM, 10% FBS làm ấm trong tủ ấm 37oC trong 30 phút). Nuôi cấy tế bào gồm các bước sau:

Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng; Bước 2: Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào;

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

Bước 3: Chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5 ml môi trường đầy đủ:

Bước 4: Nuôi cấy và theo dõi sự phát triển hàng ngày của tế bào ở 370C với 5% CO2.

- Cấy chuyển tế bào khi tế bào đạt mật độ 100% Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS (không chứa Ca2+ hoặc Mg2+);

Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin - EDTA ủ trong 5 đến 10 phút, sau đó thêm 7 ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm;

Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng,

Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào; Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình ni (6 ml/bình T25, 15 ml/bình T75);

Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.

- Thu tế bào để giữ giống

Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào chỉ khác ở bước 5 và bước 6.

Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5x106 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1 ml/ống.

Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20oC trong 2 - 3 giờ, chuyển sang -80oC qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng.

2.2.2. Nhân virus PRRS

Tiến hành nhân virus trên tế bào Marc145 khi tế bào được ni cấy trong bình ni có độ

che phủ đáy bình 60 - 70%. Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ và rửa tế bào 2 lần bằng PBS 1X. Bổ sung 0,5 ml virus gốc/T25. Ủ virus và tế bào trong 1 h ở 370C. Sau khi ủ,bổ sung 5 ml mơi trường duy trì DMEM 2% FBS. Nuôi virus trong tủ ấm 370C, 5% CO2, quan sát biến đổi bệnh tích tế bào Marc145 dưới kính hiển vi soi ngược sau 24 h, 48 h, 60 h, 72 h. Thu virus khi bệnh tích tế bào đạt 80%.

2.2.3. Phương pháp xác định hiệu giá virus Tế bào Marc145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng (2,0x104 tế bào/giếng). Virus được pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp của các giếng theo thứ tự đánh dấu trước (25 µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 8 lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM có chứa 2% FBS được bổ sung vào (100 µl/giếng).

CPE được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm. TCID50 được xác định theo phương pháp của Spearman Kaber.

Log TCID50 = (Xo + d/2) - d × (∑ri/n) Trong đó:

Xo là log của bậc pha loãng virus cao nhất d là log của bậc pha loãng

ri là số giếng tế bào âm tính ở mỗi bậc pha loãng

n là số giếng tế bào được gây nhiễm ở mỗi bậc pha lỗng.

2.2.4. Giải trình tự gen

Đoạn gen ORF5 được khuếch đại theo phương pháp của Opriessnig et at. ( 2002) và ORF7 được khuếch đại theo Xiaofang Hao et al. (2011) như bảng sau:

Bảng 1. Trình tự mồi sử dụng trong giải trình tự

Mồi Tên mồi Trình tự nucleotide Kích thước sản phẩm PCR

P5R GTT TTC TAT TAC CTA ACA CGC CAG

Mồi ngược GTT GCT CCA TTT CAT GAC A

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Sản phẩm khuếch đại đoạn gen ORF5 và ORF7 được tinh sạch bằng kit Qiagen. Sản phẩm sau khi tinh sạch được đưa vào thực hiện phản ứng PCR sequencing: Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2 ml với các thành phần: 8,0 µl DTCS Quick Start Master Mix, 7 µl DNA mẫu, 0,2 µl Primer, 4,8 µl dH2O. Với chương trình chạy PCR giải trình tự sau: 960C/20 giây, 500C/20 giây, 600C/4 phút trong 30 chu kỳ. Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter - Mỹ). Sản phẩm sau khi tinh sạch được chuyển vào đĩa chạy mẫu để tiến hành giải trình tự.

2.3. Xử lý số liệu

Phân tích xác nhận chuỗi gen thu được thơng qua chương trình Blast trên Ngân hàng

gen (GenBank) ( Xác định sự tương đồng về nucleotide của phân đoạn gen thu được trong nghiên cứu bằng phần mềm Bioedit 7.2.5. Xác định nguồn gốc phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gen của chủng virus thu nhận được bằng phần mềm MEGA 6.0.

3. KẾT QUẢ

3.1. Đánh giá sự ổn định về đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-01

3.1.1. Khả năng nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-01 sau 5 đời cấy chuyển

Nghiên cứu xác định sự ổn định về khả năng nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-01 được chúng tôi thực hiện cấy chuyển liên tục 5 Bảng 2. Kết quả xác định khả năng nhân lên và hủy hoại tế bào

của chủng virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển Ký hiệu Thời gian (giờ) Bệnh tích tế bào* (%)

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Đối chứng tế bào 24 h CPE 48 h CPE 72 h CPE 84 h Hình 1. Bệnh tích tế bào (CPE) do chủng KTY-PRRS-01

gây ra ở các thời điểm khác nhau đời và tiến hành so sánh khả năng gây bệnh tích

tế bào của chủng virus qua các đời. Từ lô virus KTY-PRRS-01 gốc (P0), chúng tôi cấy chuyển trên tế bào Marc145, lần lượt ký hiệu các đời là P1, P2, P3, P4, P5. Ở mỗi đời cấy chuyển tiến hành theo dõi tỉ lệ tế bào bị virus phá hủy (CPE - bệnh tích tế bào) so với toàn bộ tế bào trên vi trường kính hiển vi soi ngược ở các thời điểm 24 h, 48 h, 72 h và 84 h sau gây nhiễm virus. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 5 đời cấy chuyển chủng virus KTY-PRRS-01 được tổng hợp và trình bày ở bảng 2.

Trên bảng 2 và hình 1 cho thấy, ở thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm chưa thấy có sự khác biệt giữa bình gây nhiễm và bình đối chứng âm. Tuy nhiên sau 48 giờ, bệnh tích xuất hiện tương đối rõ ràng, từ đời 0 đến đời 5 đều có từ 35 - 40% bệnh tích tế bào quan sát được. Ở 84 giờ sau gây nhiễm, 100% tế bào các đời đều bị phá hủy bởi virus. Như vậy, có thể thấy được chủng virus nghiên cứu có khả năng nhân lên và hủy hoại tế bào Marc145 tương đối ổn định ở 5 đời cấy chuyển.

3.1.2. Xác định hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-01 sau 5 đời cấy chuyển

Để nghiên cứu sự ổn định về một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-01, chúng tôi tiến hành xác định hiệu giá virus qua các đời cấy chuyển, ở mỗi đời cấy chuyển thí nghiệm được lặp lại 3 lần và tính tốn giá trị TCID50 trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 3.

Qua bảng 3 cho thấy, hiệu giá virus của chủng virus KTY-PRRS-01 đạt từ 3,03x106/ml đến 7,12x106/ml và tương đối ổn định qua các đời cấy chuyển. Theo TCVN 8685-12:2014, vacxin nhược độc PRRS được coi là đạt nếu mỗi liều vacxin có ít nhất 105 TCID50. Trong nghiên cứu sản xuất vacxin vô hoạt, một liều vacxin cũng phải chứa ít nhất 106 TCID50 virus đã được vô hoạt. Như vậy chủng virus KTY-PRRS-01 nghiên cứu có hiệu giá đạt tiêu chuẩn so với hiệu giá quy định của chủng virus sử dụng làm vacxin nhược độc và vô hoạt.

Bảng 3. Kết quả xác định hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển

Kí hiệu Hiệu giá virus trung bình (TCID50/ml)

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

3.1.3. Xác định quy luật sinh trưởng trên môi trường nuôi cấy của chủng virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển

Chủng virus nghiên cứu được gây nhiễm lên môi trường tế bào Marc145 một lớp với MOI = 0,01, ủ ở 370C, 5% CO2. Sau đó, tại mỗi thời điểm: 24, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau khi gây nhiễm tiến hành thu virus. Xác định hiệu giá TCID50 những ống virus thu được ở mỗi thời điểm và dựng đồ thị sinh trưởng của virus (đường biểu diễn sự nhân lên của virus dựa trên biến là Log10 TCID50/ml của virus ở mỗi thời điểm thu virus khác nhau). Đồng thời với việc xây dựng đồ thị sinh trưởng của virus, nghiên cứu còn tiến hành so sánh đồ thị này ở đời P0 và P5 của chủng virus PRRS nghiên cứu để thấy được sự ổn định nhân lên của virus. Kết quả xác định quy luật sinh trưởng của chủng virus KTY-PRRS-01 qua các đời cấy chuyển được trình bày ở hình 2.

Trên hình 2 cho thấy có sự tương đồng rõ rệt về quy luật sinh trưởng ở đời P0 và P5 của chủng virus KTY-PRRS-01, hiệu giá virus tăng dần từ 24 - 72 h sau gây nhiễm và đạt cao nhất ở thời điểm 72 giờ sau khi gây nhiễm cả ở đời P0 và P5. Cụ thể hiệu giá virus ở đời P0 đạt 1,35x106 TCID50/ml, đời P5 đạt 2,40x106 TCID50/ml. Sau đó hiệu giá virus giảm nhẹ ở

thời điểm 84 h và 96 h sau gây nhiễm. Như vậy, quá trình nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-01 là một quá trình liên tục trên tế bào Marc145 (virus xâm nhập vào tế bào, phá hủy tế bào và giải phóng ra mơi trường ni cấy) hàm lượng virus đạt cao nhất sau 72 h gây nhiễm virus. Nghiên cứu về quy luật sinh trưởng của chủng virus KTY-PRRS-01 cũng phù hợp với công bố trước đây của Han et al. (2007) về quy luật sinh trưởng của chủng virus PRRS-VR2332 trên môi trường nuôi cấy Marc145.

3.2. Đánh giá sự ổn định về đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển

3.2.1. Khuếch đại gen ORF5 và ORF7 của chủng virus qua 5 đời cấy chuyển

Ở mỗi đời cấy chuyển chủng virus KTY-PRRS-01, hai đoạn gen ORF5 và ORF7 được khuếch đại với cặp mồi đã được trình bày ở trên. Kết quả khuếch đại được thể hiện qua hình 3 cho thấy sản phẩm điện di cho kích thước đặc hiệu đúng theo thiết kế của mồi. Trong đó đoạn ORF5 có kích thước 764 bp, đoạn ORF7 có kích thước 420 bp. Ở cả 5 đời cấy chuyển đều cho băng điện di rõ, sáng, gọn và đều nhau. Điều này một lần nữa khẳng định cho sự ổn định về hàm lượng virus qua các đời cấy chuyển.

Hình 2. Đồ thị sinh trưởng của virus KTY-PRRS-01 ở P0 và P5

Hiệu giá virus P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau sau khi gây nhiễm - Log10 TCID50/ml

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm đoạn gen ORF5 và ORF7 của 5 đời cấy chuyển Ghi chúa: A-ORF5 (764bp); B-ORF7 (420bp); P0, P1, P2, P3, P4, P5 là virus ở các đời cấy chuyển lần lượt 0, 1, 2, 3, 4, 5; C+ là đối chứng dương tính (tế bào gây nhiễm chủng virus vacxin Trung Quốc JXA1); C- là đối chứng âm tính (tế bào khơng gây nhiễm virus)

3.2.2. Giải trình tự gen ORF5, ORF7 của chủng virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển

Sản phẩm của phản ứng khuếch đại đoạn gen ORF5 và ORF7 được tinh sạch và tiến hành

giải trình tự hai gen này ở các đời cấy chuyển khác nhau. Kết quả so sánh trình tự nucleotide ở các đời cấy chuyển được trình bày ở hình 4 và hình 5. Đoạn gen ORF5 có trình tự 603 bp và đoạn gen ORF7 có trình tự 372 bp.

Hình 4. So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của chủng virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển Ghi chú: Dấu chấm biểu thị sự giống nhau về nucleotide

B A

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Hình 5. So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển Ghi chú: Dấu chấm biểu thị sự giống nhau về nucleotide

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

Từ kết quả các hình 4, 5 cho thấy, ở 5 đời cấy chuyển liên tục chủng virus KTY-PRRS-01 khơng có sự sai khác hay biến đổi nào về trình tự nucleotide trên cả 2 đoạn ORF5 và ORF7, sự tương đồng nucleotide giữa các đời cấy chuyển đạt 100%, có nghĩa là khơng có sự sai khác về thành phần axit amin của hai đoạn gen này. Như vậy, chủng virus KTY-PRRS-01 là hoàn toàn ổn định về đặc tính di truyền và cấu trúc gen ORF5, ORF7. Một lần nữa thấy rằng chủng virus KTY-PRRS-01 hoàn toàn ổn định về đặc tính sinh học phân tử qua 5 đời cấy chuyển.

4. KẾT LUẬN

Chủng virus KTY-PRRS-01 có khả năng nhân lên và hủy hoại tế bào ổn định qua 5 đời cấy chuyển. Virus nhân lên và gây bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm, 80% tế bào bị hủy hoại ở thời điểm 72 giờ và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 84 giờ gây nhiễm. Hiệu giá virus của chủng virus KTY-PRRS-01 đạt từ 3,03x106/ml đến 7,12x106/ml và tương đối ổn định qua các đời cấy chuyển. Khơng có sự sai khác về trình tự nucleotide và trình tự axit amin của đoạn gen ORF5, ORF7 khi cấy chuyển virus liên tục 5 đời trên môi trường tế bào Marc145. Như vậy chủng virus KTY-PRRS-01 phân lập tại Việt Nam có các đặc tính sinh học và sinh học phân tử ổn định qua 5 đời cấy chuyển trên tế bào Marc145.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Cavanagh D. (1997). Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae. Arch Virol., 142: 629-633.

Charerntantanakul W. (2012). Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: immunogenicity, efficacy and safety aspects. World J Virol., 1: 23-30. 10.5501/wjv.v1.i1.23. Halbur P.G., Paul P.S., Frey M.L., Landgraf J.,

Eernisse K., Meng X.J., Lum M.A., Andrews J.J., Rathje J.A. (1995). Comparison of the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus. Vet Pathol., 32: 648-660. 10.1177/030098589503200606.

Han J., G. Liu, Y. Wang, K. S. Faaberg (2007). Identification of nonessential regions of the nsp2 replicase protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain VR-2332 for replication in cell culture. Journal of virology, 81(18): 9878-9890.

Hu J., Zhang C. (2014). Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: current status and strategies to a universal vaccine. Transbound Emerg Dis., 61: 109-120. 10.1111/tbed.12016. Holtkamp D.J., Kliebenstein J.B., Neumann E.J.,

Zimmerman J.J., Rotto H.F.,Yoder T.K., Wang C., eske P.E., Mowre C.L., Haley C.A. (2013). Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J Swine Health Prod., 21: 72-84.

Kim H., Kim H.K., Jung J.H., Choi Y.J., Kim J., Um C.G., Hyun S.B., Shin S., Lee B.,Jang G., Kang B.K., Moon H.J., Song D.S. (2011). The assessment of efficacy of porcine reproductive respiratory syndrome virus inactivated vaccine based on the viral quantity and inactivation methods. Virol J., 8: 323. 10.1186/1743-422X-8-323.

Mengeling W.L., Lager K.M., Vorwald A.C., Clouser D.F. (2003). Comparative safety and efficacy of attenuated single-strain and multi-strain vaccines for porcine reproductive and respiratory syndrome. Vet Microbiol., 93: 25-38.10.1016/S0378-1135 (02)00426-1.

Meulenberg J.J., Hulst M.M., deMeijer E.J., Moonen P.L., denBesten A.,deluyver E.P., Wensvoort G., Moormann R.J.(1993). Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV. Virology, 192: 62-72. 10.1006/viro. 1993.1008.

Meng X.J. (2000). Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: implications for current vaccine efficacy and future vaccine development. Vet Microbiol., 74:309-329. 10.1016/S0378-1135(00)00196-6.

Nelson E.A., ChristopherHennings J., Drew T., Wensvoort G., Collins J.E.,Benfield D.A.(1993). Differentiation of U.S. and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies J Clin Microbiol., 31: 3184-3189.

Nelsen C.J., Murtaugh M.P., Faaberg K.S. (1999). Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents. J Virol., 73: 270-280.

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Opriessnig T., P. Halbur, K.-J. Yoon, R. Pogranichniy, K. Harmon, R. Evans, K. Key, F. Pallares, P. Thomas and X. Meng (2002). Comparison of molecular and biological characteristics of a modified live porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine (ingelvac PRRS MLV), the parent strain of the vaccine (ATCC VR2332), ATCC VR2385, and two recent field isolates of PRRSV. Journal of virology, 76(23): 11837-11844.

Pejsak Z., Stadejek T., Markowska-Daniel.I. (1997). Clinical signs and economic losses caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus in a large breeding farm. Vet Microbiol., 55: 317-322. 10.1016/S0378-1135(96)01326-0. Xiaofang Hao, Zengjun Lu, Wendong Kuang, Pu Sun,

Yu Fu, Lei Wu, Qing Zhao, Huifang Bao, Yuanfang Fu, Yimei Cao, Pinghua Li, Xingwen Bai, Dong Li, Zaixin Liu. (2011). Polymorphic genetic characterization of the ORF7 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in China. Virology Journal, 8: 73. Zuckermann F.A., Garcia E.A., Luque I.D.,

ChristopherHennings J., Doster A., Brito M., Osorio F. (2007). Assessment of the efficacy of commercial porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccines based on measurement of serologic response, frequency of gamma-IFN-producing cells and virological parameters of protection upon challenge. Vet Microbiol., 123: 69-85. 10.1016/j.vetmic. 2007.02.009.

</div>