Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Đánh giá kết quả tạo phôi trong ống nghiệm và sàng lọc bất thường số lượng nhiễm sắc thể ở phôi giai đoạn tiền làm tổ từ noãn trữ lạnh tại Bệnh viện Quốc tế Sản Nhi Hải Phòng giai đoạn 05/2021 – 08/2023

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (7.1 MB, 95 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Đào Thị Phương

ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM VÀ SÀNG LỌC BẤT THƯỜNG SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC THỂ Ở PHÔI GIAI ĐOẠN TIỀN LÀM TỔ TỪ NOÃN TRỮ LẠNH

TẠI BỆNH VIỆN QUỐC TẾ SẢN NHI HẢI PHÒNG GIAI ĐOẠN 05/2021 – 08/2023

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2023

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

'toi xin cant doan

di

ttri nghiAn cti-n trong ludn vdn ndy td c6ng trinh

nghiAn. ct|u cua toi clVa tuAn nhting tdi liQu, tA heu do chfnh t6i tu tim hiAu virnghiAn ctl'u. Chlnh vi vQy, cdc k& qud nghi\n cint ddm bdo trung thryc vd khdchquan nhdt D6ng thdi, kAt qua ndy chtta nbng xudt hiQn trong bat ca mQt nghiAncil'u ndo. cdc sri ti'€u, k€t qua nau ftong ludn ttdn ld n'ung thwc nau sai toi hodnch.it.t trdch nhi€nt tru'6c phdt luqt.

Hd N\i, ngdy]'lthdng'lO ndm 2023

rAC

GIA LUAN VAN

DAO THI PHUONG

iI

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Trong qu6 trinh hodn thdnh 1u4n vdn ndy, t6i da nhan dugc sp gifp d6'qu.v b6Lr cua c6c thAy cd grito, citcnhd khoa hqc, c6c ddng nghiQp cirng gia dinhvii ban be.

Tru6c ti€n, t6i xin bdy to ldng bitlt on s6u s6c t6i TS. Nguy6n v6n Hph

dd trgc ti5p huOng ddn, chi d4y cho t6i v0 chuy6n m6n, d6ng thoi dQng vi6n,khich lo t6i trong su6t qu6 trinh hgc t6p, nghi0n cf'u vd hoDrn thdnh lu6n v5n.

T6i xin trdn trong c6m on Ban Ldnh dao BQnh viQn Qudc tri SAn Nhi HaiPhong d5 tpo nhfr'ng c1i6u kiQn thuQn lqi nh6t AO tOi thqc hiQn nghiOn cuu ndy'

'foi xin cdm on c6c d6ng nghiQp t4i Khoa FI6 trq Sinh sdn, BCnh viQn Qu6c t6

San Nhi Hai Irhdng dd dua ra nhirng loi khuyOn trong thoi gian t6i thuc hi6nnghi0p cf'u rpi Khoa vir tao di6u kiOn thuqn lcri nh6t cho tdi de hodn thdnh qu6trinh hgc tdp vd thUc hiqn nghiCn cuu.

'f6i xin tr6n trong cam on Ban LSnh dao, c6c thay c6 gi6o, gi6ng vi0n vdcdc cdn bo dang c6ng t6c t4i I{gc viQn Khoa hqc vd C6ng nghe, Vi6n Hdn lAm

Khoa hoc vd C6ng nghQ ViQt Nam dd 1u6n giirp dd t6i trong qu6 trinh hgc tapvir thuc hiQn lupn vdn.

Cudi cung, t6i xin bdy t6 ldng bi5t crn ch6n thAnh tor circ thdnh viOn tronggia dinh vd ban be, nhirn! ngudi dd lu6n o b6n t6i, c6 vfr vh dQng vi0n t6i nhfl'nglurc kh6 khdn cI6 c6 th€ hodn thdnh luOn vin ndry.

f6i xin tr6n trong c6m on!

,!

Hii NQi, ngdy ]lthting lC niim 2023

DAO THI PHUONG

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Danh mục bảngDanh mục các hìnhDanh mục biểu đồ

MỞ ĐẦU ... 1

Chương 1.TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM ... 3

1.1.1. Khái niệm về thụ tinh trong ống nghiệm ... 3

1.1.2. Đánh giá sự phát triển của phôi ... 3

1.2. SINH LÝ NỖN ... 6

1.2.1. Sự sinh nỗn ... 6

1.2.2. Đánh giá hình thái nỗn ... 8

1.3. BẢO QUẢN LẠNH NOÃN ... 12

1.3.1. Định nghĩa ... 12

1.3.2. Các phương pháp trữ lạnh và rã đơng nỗn ... 12

1.3.3. Các nghiên cứu về tác động của quá trình trữ rã đối với noãn . 14 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA QUÁ TRÌNH TRỮ RÃ ĐỐI VỚI KẾT QUẢ PHÔI HỌC VÀ LÂM SÀNG ... 18

1.4.1. Kết quả phôi học ... 18

1.4.2. Kết quả sản khoa và chu sinh ... 20

Chương 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 21

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ... 21

2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn ... 21

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ... 21

2.1.3. Thiết kế nghiên cứu ... 21

2.3.2. Phương pháp rã đơng nỗn/phơi ... 24

2.3.3. Phương pháp vi tiêm tinh và nuôi cấy phôi ... 24

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

2.3.5. Phương pháp sinh thiết phôi ... 25

2.3.6. Chuyển phơi trữ đơng ... 26

2.3.7. Phân tích số liệu nghiên cứu ... 26

2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU ... 27

Chương 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 28

3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ... 28

3.2. KHẢ NĂNG SỐNG SĨT CỦA NỖN SAU RÃ ĐƠNG ... 30

3.3. KẾT QUẢ PHÔI HỌC ... 33

3.3.1. Đặc điểm thụ tinh ... 33

3.3.2. Khả năng tạo phôi phân chia (ngày 3) ... 35

3.3.3. Khả năng tạo phôi nang ... 37

3.3.4. Chất lượng di truyền ... 38

3.4. KẾT QUẢ LÂM SÀNG ... 41

3.4.1. Phân bố phôi chuyển theo chất lượng di truyền và hình thái.... 41

3.4.2. Kết quả thai ... 42

3.4.3. Ảnh hưởng của chất lượng di truyền phơi tới tỉ lệ có thai ... 44

3.5. ĐÁNH GIÁ CÁC YẾU TỐ NGƯỜI MẸ TIÊN LƯỢNG PHƠI

DANH MỤC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ... 52

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 53

PHỤ LỤC ... i

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Viết tắt Tiếng Việt Tiếng Anh

AFC Đếm số nang nỗn thứ cấp Antral follicle count

AMH Hc mơn buồng trứng Anti-Mullerian Hormone

AUC Diện tích dưới đường cong Area under curve

Azoospermia Vơ tinh

COH Kích thích buồng trứng có kiểm soát

Controlled Ovarian Stimulation

CPA Chất bảo quản lạnh Cryoprotectant agent

Cryptospermia Tinh trùng được tìm thấy sau ly tâm tinh dịch

FSH Kích nỗn bào tố Follicle Stimulating Hormone

Gran Độ mịn bào tương chất Granularity

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

GVBD Vỡ túi mầm Germinal vesicle breakdown

HSA Albumin huyết thanh người Human serum albumin

ICM Khối tế bào nội phôi Inner cell mass

ICSI Tiêm tinh trùng vào bào tương

IVF Thụ tinh trong ống nghiệm In vitro fertilization

LH Hc mơn hồng thể hố Luteinizing hormone

M-SER Mạng lưới nội chất trơn của ty thể

Mitochondrial-Smooth Endomedium Reticulum

MV Phức hợp ty thể-túi Mitochondrial vesicle

OCC Khối phức hợp tế nào noãn Oocyte-cumulus complex

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

sắc thể ở phôi tiền làm tổ

PVS Khoanh quanh noãn Perivitelline space

characteristic

Reticulum

SOAT Tinh trùng ít, yếu, dị dạng nghiêm trọng

Severe

OligoAsthenoTeratozoospermia

TEM Kính hiển vi điện tử truyền

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Bảng 1.1. Đánh giá hình thái phôi phân chia (ngày 3) theo đồng thuận Alpha 4

Bảng 2.1. Đánh giá hình thái và xếp loại chất lượng phôi ngày 3 ... 25

Bảng 3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu ... 28

Bảng 3.2. Tỉ lệ nỗn sống sót sau rã đơng ... 31

Bảng 3.3. Tỉ lệ thụ tinh ... 34

Bảng 3.4. Đặc điểm phôi phân chia (ngày 3) ... 36

Bảng 3.5. Khả năng tạo phôi nang ... 37

Bảng 3.6. Phân bố phôi theo chất lượng di truyền và nguồn gốc nỗn ... 39

Bảng 3.7. Phân bố phơi chuyển theo chất lượng di truyền ... 41

Bảng 3.8. Phân bố phơi chuyển theo chất lượng hình thái ... 41

Bảng 3.9. Đặc điểm thai ở 2 nhóm nỗn ... 42

Bảng 3.10. Tỉ lệ có thai chuyển phơi nguyên bội ... 44

Bảng 3.11. Tỉ lệ có thai chuyển phôi thể khảm ... 45

Bảng 3.12. Tiên lượng phôi nguyên bội theo ngưỡng AMH ... 48

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Hình 1.1. Các giai đoạn phơi nang ... 5

Hình 1.2. OCC trưởng thành và chưa trưởng thành ... 8

Hình 1.3. Nỗn ở các giai đoạn ... 9

Hình 1.4. Phân loại hình thái thể cực thứ nhất ... 9

Hình 1.5. Phân loại hình thái khoang quanh nỗn ... 10

Hình 1.6. Các bất thường chất lượng bào tương chất ... 11

Hình 2.1. Sơ đồ lựa chọn mẫu trong nghiên cứu ... 23

Hình 3.1. Phân biệt hình thái nỗn sống sót và nỗn thối hố sau rã đơng .. 30

Hình 3.2. Đặc điểm hình thái hợp tử thụ tinh ... 33

Hình 3.3. Chất lượng hình thái phơi ni cấy ngày 3 ... 35

Hình 3.4. Kết quả phân tích số lượng NST bằng NGS ... 38

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Biểu đồ 3.1. So sánh tỉ lệ sống sót sau rã đơng với các nghiên cứu khác... 32 Biểu đồ 3.2. Tỉ lệ các dạng bất thường NST theo nguồn gốc noãn ... 40 Biểu đồ 3.3. Kết cục lâm sàng theo nguồn gốc noãn ... 43 Biểu đồ 3.4. Đường cong ROC xác định các yếu tố tiên lượng kém cho mơ hình tiên lượng phơi ngun bội ... 46 Biểu đồ 3.5. Đường cong ROC xác định các yếu tố tiên lượng tốt cho mô hình tiên lượng phơi ngun bội ... 47 Biểu đồ 3.6. Phân bố tỉ lệ phôi nguyên bội theo ngưỡng AMH 1,36 ... 48

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

MỞ ĐẦU

Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm tại phịng thí nghiệm bắt đầu bằng việc thu nhận giao tử đực (tinh trùng) và giao tử cái (noãn). Tùy thuộc vào mong muốn và tình trạng bệnh lý của từng đối tượng, bác sĩ và chuyên viên phôi học sẽ đưa ra các phương hướng thực hiện các kỹ thuật đối với giao tử. Noãn được thụ tinh với tinh trùng thành phôi và sau đó được chuyển vào tử cung của bệnh nhân. Trường hợp sau khi thu nhận giao tử không thực hiện thụ tinh ngay thì giao tử cần được bảo quản lạnh để bảo tồn hình thái và chức năng. Bác sĩ lâm sàng có thể lựa chọn trữ lạnh nỗn như một phương án dự phịng cần thiết cho những phụ nữ có nguy cơ cao bị suy buồng trứng do quá trình điều trị ung thư [1-3], hoặc nhóm phụ nữ có nguy cơ mắc hội chứng quá kích buồng trứng. Bên cạnh đó, khả năng sinh sản giảm theo độ tuổi là yếu tố đáng cân nhắc trong việc thực hiện trữ nỗn chủ động với mục đích bảo tồn khả năng sinh sản cho những phụ nữ đang trong độ tuổi sinh sản nhưng chưa sẵn sàng mang thai [4]. Trữ lạnh noãn nhiều lần (gom noãn) để đạt được số lượng noãn tối ưu cho một chu kỳ tạo phôi là lựa chọn phù hợp với nhóm bệnh nhân đáp ứng kích thích buồng trứng kém [5]. Việc tư vấn thực hiện trữ lạnh noãn nên được cá thể hóa và dựa trên nhiều yếu tố, chẳng hạn như tuổi của bệnh nhân, tình trạng dự trữ buồng trứng, mức độ khẩn cấp của điều trị và loại điều trị ung thư cũng như nguy cơ suy sinh dục [6].

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu về noãn trữ lạnh đã được thực hiện. Lê Thanh Huyền và cộng sự (2018) đánh giá biến đổi hình thái nỗn và khả năng phát triển của noãn trữ lạnh bằng phương pháp thuỷ tinh hoá cho kết quả tỉ lệ nỗn sống sau rã đơng 89,09%, tỉ lệ thụ tinh 71,28%, tỉ lệ phôi tốt ngày 3 là 38,71%, tỉ lệ có thai lâm sàng 29,41%, tỉ lệ làm tổ 12,94% [7]. Một nghiên cứu khác của Lê Thuỵ Hồng Khả và cộng sự (2020) báo cáo kết quả đơng lạnh nỗn ở bệnh nhân điều trị thụ tinh trong ống nghiệm với tỉ lệ noãn sống sau rã đông đạt 95,59 ± 13,60%, tỉ lệ thụ tinh 78,96 ± 24,88%; tỉ lệ thai lâm sàng và tỉ lệ làm tổ lần lượt là 30,8% và 21,61% [8].

Trên thế giới đã có nhiều bằng chứng khoa học đã chứng minh trữ lạnh nỗn là một kỹ thuật an tồn và hiệu quả [9-11]. Tuy nhiên, hầu hết các báo cáo đều nghiên cứu trên nhóm nỗn trữ có nguồn gốc từ nỗn hiến. Việc so sánh kết quả phơi học, lâm sàng và kết quả di truyền giữa nhóm nỗn trữ lạnh và nhóm nỗn tươi tự thân trong cùng một điều kiện tại cùng một thời điểm thụ

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

tinh có thể củng cố vai trị và hiệu quả của trữ lạnh nỗn. Trên cơ sở đó, chúng tơi thực hiện đề tài:

“Đánh giá kết quả tạo phôi trong ống nghiệm và sàng lọc bất thường

số lượng nhiễm sắc thể ở phơi giai đoạn tiền làm tổ từ nỗn trữ lạnh tại Bệnh viện Quốc tế Sản Nhi Hải Phòng giai đoạn 05/2021 – 08/2023” với mục tiêu:

1. So sánh kết quả tạo phôi trong ống nghiệm (kết cục phôi học và lâm sàng) và kết quả sàng lọc bất thường số lượng nhiễm sắc thể ở phôi tiền làm tổ (PGT-A) của noãn trữ rã so với noãn tươi.

2. Đánh giá một số yếu tố người mẹ tiên lượng phôi nguyên bội ở các bệnh nhân thực hiện tích luỹ nỗn bằng phương pháp thuỷ tinh hoá.

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. TỔNG QUAN VỀ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

1.1.1. Khái niệm về thụ tinh trong ống nghiệm

Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) bắt đầu với kích thích buồng trứng để thu được nhiều noãn trong cùng một chu kỳ giúp tăng xác suất thành công và tăng hiệu quả điều trị so với việc chỉ có 1-2 nỗn rụng trong chu kỳ tự nhiên. Noãn được thụ tinh với tinh trùng để tạo phôi và được nuôi cấy theo dõi trong các tủ nuôi cấy chuyên biệt mô phỏng các điều kiện trong tử cung của người mẹ trong thời gian từ 3-6 ngày. Phôi có chất lượng hình thái tốt sẽ được cân nhắc để chuyển vào tử cung của người mẹ. Việc lựa chọn số lượng phơi chuyển cịn tuỳ thuộc vào chất lượng phôi, tuổi phôi và điều kiện tiếp nhận của niêm mạc tử cung. Các phôi hữu dụng còn dư chưa sử dụng đến sẽ được trữ lạnh để dùng cho các lần chuyển phôi sau mà khơng cần thực hiện thêm chu kỳ kích thích buồng trứng nào. Sau khi cấy vào tử cung, phơi có thể làm tổ trong niêm mạc tử cung và dần phát triển thành thai nhi. Khoảng 10-12 ngày sau cấy phơi, bệnh nhân có thể thử thai que thử thai hoặc xét nghiệm máu để biết kết quả. Sau khi phôi được xác nhận đã làm tổ, việc theo dõi thai kì và sản khoa của thai từ IVF hoàn toàn giống như một thai bình thường. Một điểm lưu ý rằng, tỉ lệ đa thai (từ hai thai trở lên) thường cao hơn đối với những trường hợp thực hiện IVF so với thai tự nhiên. Mọi nỗ lực để giảm tỉ lệ đa thai và các biến chứng thai kỳ liên quan như đái tháo đường, tăng huyết áp thai kỳ, tiền sản giật có thể đạt được nhờ giảm số lượng phôi chuyển, tăng cường cải thiện hiệu quả nuôi cấy để phôi đạt chất lượng tốt.

1.1.2. Đánh giá sự phát triển của phơi

 Giai đoạn hợp tử (tiền nhân)

Nỗn thụ tinh thường có hình cầu, với 2 thể cực và 2 tiền nhân (pronuclei - PN) có màng bao riêng biệt, kích thước bằng nhau, nằm sát nhau ở vùng trung tâm của nỗn. PN có chứa các hạt nhân NPB (Nucleolar Precursor Body) với số lượng và kích thước tương đương nhau, sắp xếp thẳng hàng tại vùng giao nhau của màng 2 tiền nhân. Những đặc điểm như số PN khác 2; PN cách xa nhau, quá khác biệt nhau về kích thước hoặc có NPB quá nhỏ đều được xem là những đặc điểm bất thường của PN.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

 Phơi phân chia

 Hình thái và số lượng phôi bào

Phôi bào phân chia theo quy luật luỹ thừa của 2, nên số lượng phôi bào thường là chẵn. Số lượng phôi bào có thể là số lẻ 3, 5, 7 khi quan sát ở giai đoạn phân chia hay khi xuất hiện sự phân chia không đồng bộ. Thông thường, phôi gồm các phơi bào có kích thước gần như bằng nhau sắp xếp cạnh nhau tạo thành hình trịn. Nhiều hệ thống điểm đánh giá phơi đã được phát triển, trong đó hệ thống đánh giá phơi theo đồng thuận của hiệp hội Alpha được dùng phổ biến nhất ở Việt Nam và châu Âu [12] (Xem Bảng 1.1)

 Mảnh vỡ bào tương

Mảnh vỡ bào tương là một khối bào tương có màng bao, nằm ngồi tế bào, có kích thước <45μm đối với phôi ngày 2 và <40μm đối với phôi ngày 3. Các mức độ của mảnh vỡ bào tương bao gồm: nhẹ (<10%), vừa phải (10 – 25%) và nặng (>25%). Giá trị % được tính dựa trên thể tích của phơi bào, ví dụ ở phôi 4 tế bào, 25% mảnh vỡ bào tương sẽ tương đương với thể tích 1 phơi bào.

Bảng 1.1. Đánh giá hình thái phơi phân chia (ngày 3) theo đồng thuận Alpha

Kích thước phơi bào phù hợp giai đoạn phát triển Khơng có phơi bào đa nhân

Kích thước phơi bào khơng phù hợp giai đoạn phát triển Có phơi bào đa nhân

 Phơi nang

Hình thái phơi nang được đánh giá dựa trên 3 tiêu chuẩn là độ nở rộng của khoang phôi, khối tế bào nội phôi (ICM – Inner cell mass) và lớp tế bào lá nuôi (TE – Trophectoderm).

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

 Độ nở rộng khoang phơi

Hiện tượng tích lũy dịch giữa các tế bào xảy ra vào giai đoạn ngày 4 và ngày 5 trong q trình ni cấy phơi. Sự tăng lên của dịch trong khoang phôi nang và số lượng tế bào làm tăng kích thước của phơi, làm mỏng màng ZP. Cuối cùng, màng ZP vỡ giải phóng khối tế bào gọi là sự thốt màng. Q trình hình thành khoang phơi nang là nhờ sự hoạt động của kênh xuyên màng Na/K-ATPase. Các kênh này bơm Na+ và K+ vào khoang phôi nang làm tăng áp suất thẩm thấu, kết quả là nước thẩm thấu vào khoang phơi nang, từ đó làm gia tăng áp lực nước và làm tăng dần kích thước của khoang trong suốt giai đoạn phơi nang. Độ nở rộng khoang phôi được chia thành 6 giai đoạn [13] (Hình 1.1).

Hình 1.1. Các giai đoạn phơi nang

 Hình thái ICM

Khi phơi nang đạt được nở rộng độ 3 hoặc cao hơn thì có thể dễ dàng quan sát 2 quần thể tế bào mới hình thành. Phần tế bào ở bên ngồi phơi giúp định hình cấu trúc phơi nang được gọi là lớp tế bào lá nuôi phôi TE, phần tế bào còn lại nằm bên trong khoang phôi nang thường tạo thành một cụm tế bào được gọi là khối tế bào ICM sẽ phát triển thành phơi thai. Hình thái ICM được phân thành 3 loại [12]. Loại A chứa nhiều tế bào và tế bào được nén chặt với nhau, loại B có số lượng tế bào ít hơn và tế bào có liên kết lỏng lẻo, loại C có rất ít tế bào và chúng liên kết với nhau một cách lỏng lẻo. Sự thay đổi về số

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

lượng các tế bào liên kết với nhau trong khối ICM ảnh hưởng đến hình dạng của ICM.

 Đánh giá TE

Tương tự như khối ICM, lớp tế bào TE có thể được phân biệt rõ ràng khi phôi đã nở rộng (độ 3 hoặc cao hơn). Vai trò của các tế bào TE chưa rõ ràng trong giai đoạn đầu phát triển của phơi nang nhưng trong giai đoạn hình thành khoang phơi nang TE đóng vai trị tạo ra chất lỏng chứa đầy khoang phôi nang. Mặt khác, vai trò TE thể hiện rõ ở giai đoạn làm tổ của phơi giúp phơi bám dính và ăn sâu vào lớp nội mạc tử cung. Ở giai đoạn sau của phôi thai, các tế TE phát triển thành màng ối và nhau thai. Tế bào TE cũng được phân thành 3 loại: Loại A chứa nhiều tế bào gắn kết với nhau hình thành biểu mơ, loại B chứa số lượng tế bào ít hơn tạo thành lớp biểu mô mỏng, loại C, số lượng các tế bào rất ít, các tế bào có kích thước lớn và liên kết lỏng lẻo.

1.2. SINH LÝ NOÃN 1.2.1. Sự sinh nỗn

Q trình sinh nỗn được bắt đầu từ giai đoạn bào thai và kết thúc khi phụ nữ bước vào thời kỳ mãn kinh. Sự sinh noãn phát triển qua 4 giai đoạn: (1) tế bào mầm sinh dục nguyên thuỷ hình thành và di chuyển tới cơ quan sinh dục; (2) gia tăng số lượng tế bào mầm sinh dục bằng cơ chế nguyên phân; (3) giảm phân để giảm vật chất di truyền; (4) trưởng thành noãn về cấu trúc chức năng.

 Tế bào mầm sinh dục nguyên thuỷ hình thành và di chuyển tới cơ

quan sinh dục

Các tế bào mầm sinh dục đầu tiên có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội, được gọi là các tế bào mầm sinh dục nguyên thuỷ. Những tế bào này xuất hiện đầu tiên ở thành túi noãn hoàng vào khoảng cuối tuần thứ 3 sau khi thụ tinh. Vào khoảng tuần thứ 5, đôi tuyến sinh dục bắt đầu xuất hiện ở trung thận, hình thành nên gờ sinh dục và là nơi duy nhất các tế bào mầm sinh dục nguyên thuỷ có thể sống sót. Từ tuần thứ 4 đến tuần thứ 6, tế bào mầm sinh dục nguyên thuỷ bắt đầu di chuyển của từ thành túi nỗn hồng đến gờ sinh dục. Cuối tuần thứ 6, quá trình nguyên phân đã làm tăng số lượng tế bào mầm sinh dục nguyên thuỷ từ vài trăm tế bào lên đến khoảng 10.000 tế bào.

 Gia tăng số lượng tế bào mầm sinh dục bằng cơ chế nguyên phân

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Các tế bào mầm sinh dục nguyên thuỷ được tiếp tục nguyên phân trong giai đoạn từ tuần thứ 6 đến tuần 16 - 20. Tại cơ quan sinh dục, các tế bào mầm nguyên thuỷ đang nguyên phân được gọi là nguyên bào noãn. Nguyên bào noãn chứa bộ nhiễm sắc thể 2n với 23 cặp nhiễm sắc thể gồm 46 nhiễm sắc thể. Nhờ vào cơ chế nguyên phân, các nguyên bào noãn tăng dần về số lượng, đạt khoảng 600.000 tế bào vào tuần thứ 8 và 7 triệu tế bào vào tuần thứ 20 [14].

 Sự trưởng thành của nhân

Sự phát triển của trứng đòi hỏi một loạt các sự kiện của nhân và tế bào chất diễn ra cùng với các giai đoạn giảm phân để có thể thụ tinh, sao chép DNA và hình thành hợp tử lưỡng bội. Quá trình giảm phân được tái diễn dựa trên báo hiệu bằng sự phá vỡ túi mầm (Germinal vesicle breakdown - GVBD). Sau đó, tế bào trứng tiến triển thông qua kỳ giữa I, trong đó các nhiễm sắc thể tương đồng được ghép đơi sắp xếp ở giữa mặt phẳng xích đạo phân bào. Sau đó, các nhiễm sắc thể kép tách ra, một nửa vật liệu di truyền được đẩy vào thể cực thứ nhất, dẫn đến sự hình thành tế bào trứng trưởng thành, có bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n kép). Hình thái của thoi phân bào bình thường trong tế bào trứng metaphase II (MII) được đánh giá bằng kính hiển vi ánh sáng phân cực. Khi sự hình thành thoi phân bào diễn ra bình thường thì có nhiều khả năng dẫn đến phôi nguyên bội. Một phân tích tổng hợp của 10 nghiên cứu đã xác định rằng khi thoi phân bào được hình thành và có chức năng bình thường thì tỉ lệ thụ tinh (P<0,0001), tỉ lệ phôi phân chia (P<0,0001) và tỉ lệ phơi phân phân chia có hình thái tốt (P = 0,003) cao hơn đáng kể. Ở người, q trình lắp ráp trục chính thường diễn ra ~10 giờ sau GVBD và cần khoảng 14 đến 20 giờ giữa GVBD và q trình giải phóng thể cực. Tổng thời gian trưởng thành của nhân bao gồm cả thời gian GVBD được ước tính là khoảng 20 đến 22 giờ. Tế bào trứng sau đó sẽ bị giữ lại ở kỳ giữa II cho đến khi thụ tinh.

 Sự trưởng thành của tế bào chất

Sự trưởng thành của tế bào chất chuẩn bị cho sự trưởng thành của nhân với các hình thái nhiễm sắc chất cụ thể cho thấy khả năng tế bào trứng tiếp tục quá trình phân bào. Sự trưởng thành của nhân chủ yếu bao gồm sự phân chia nhiễm sắc thể, trong khi sự trưởng thành của tế bào chất liên quan đến sự phân phối lại cơ quan, những thay đổi về động lực học của bộ khung xương tế bào, bộ máy Golgi, hoạt động giải phóng canxi, dự trữ mRNA, protein và các yếu tố phiên mã.

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Những thay đổi về bộ khung tế bào trong các vi ống, sợi Actin và chất nhiễm sắc tạo ra sự bất đối xứng của tế bào và cho phép nhô ra khỏi cơ thể cực

với sự mất tế bào chất ở mức tối thiểu.

 Duy trì sự nghỉ của quá trình giảm phân

Tế bào trứng của con người bị bắt giữ ở kỳ đầu giảm phân I cho đến khi LH tăng vọt giữa chu kỳ báo hiệu một loạt thay đổi nội bào, bao gồm những thay đổi về nồng độ cAMP/cGMP của tế bào hạt và tế bào hạt dẫn đến trong

việc nối lại quá trình giảm phân và phát triển tế bào trứng ở kỳ giữa II.

1.2.2. Đánh giá hình thái nỗn

Sau khi thu nhận, noãn thường ở nhiều trạng thái chất lượng, giai đoạn trưởng thành và khả năng sống khác nhau.

1.2.2.1. Đánh giá phức hợp tế bào noãn (OCC)

Phức hợp noãn – tế bào hạt (OCC) thường được thu nhận vào thời điểm 36 giờ sau khi tiêm trưởng thành nỗn và kích thích rụng nỗn. Khối OCC được đánh giá sự trưởng thành thông qua độ giãn nở của lớp tế bào hạt và tế bào vành tia [15].

Hình 1.2. OCC trưởng thành và chưa trưởng thành (Nguồn: HP Fertility). (A) OCC trưởng thành có tế bào hạt và tế bào vành tia giãn rộng. (B) OCC chưa trưởng thành tế bào hạt và tế bào vành tia nén chặt

1.2.2.2. Đánh giá độ trưởng thành của noãn

 Trưởng thành nhân

Trưởng thành nhân của noãn được đánh giá sau khi loại bỏ các tế bào hạt và tế bào vành tia. Nỗn ở giai đoạn túi mầm (GV) có nhân vẫn dạng túi hình cầu chứa 1 hạt nhân to. Giai đoạn kỳ giữa giảm phân I (metaphase I) được xác định túi nhân biến mất và chưa phóng thích thể cực thứ nhất. Nỗn trưởng thành

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

(MII) được xác định bởi sự hiện diện của thể cực thứ nhất trong khoang quanh noãn.

Hình 1.3. Nỗn ở các giai đoạn (Nguồn: HP Fertility). (A) Nỗn GV có túi nhân

(mũi tên). (B): Nỗn MI. (C). Noãn MII với thể cực thứ nhất (mũi tên)

 Trưởng thành tế bào chất

Trưởng thành tế bào chất được xác nhận khi quan sát thấy những thể hạt vỏ (CG) từ bộ Golgi đã di chuyển đến rìa ngồi màng bào tương với vai trị quan trọng trong ngăn ngừa hiện tượng đa thụ tinh [16].

1.2.2.3. Một số hình thái bất thường của noãn

 Đánh giá thể cực thứ nhất

Một số nghiên cứu đã chỉ ra ảnh hưởng của bất thường thể cực thứ nhất đến khả năng thụ tinh và chất lượng phơi [17, 18]. Ngồi ra, nỗn có thể cực khổng lồ khi thụ tinh có khả năng tạo ra phơi lệch bội nhiễm sắc thể cao [12].

Hình 1.4. Phân loại hình thái thể cực thứ nhất (Nguồn: HP Fertility). (A) PB 1:

Bề mặt trơn nhẵn. (B) PB 2: Bề mặt nhăn. (C) PB 3: Thể cực phân mảnh. (D) PB 4: To, bất thường

 Đánh giá khoang quanh noãn (PVS)

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Độ rộng của PVS được cho là có ảnh hưởng đến khả năng sống của noãn sau ICSI [19, 20], tỉ lệ thụ tinh [21] và độ phân mảnh bào tương chất của phơi.

Hình 1.5. Phân loại hình thái khoang quanh nỗn (Nguồn: HP Fertility). (A) PVS1: Bình thường, rộng vừa phải, khơng có hạt. (B) PVS2: Rộng một phần quanh nỗn, khơng có hạt. (C) PVS3: Rộng tồn bộ chu vi quanh noãn. (D) PVS4: Tương tự PVS3 và xuất hiện thêm hạt trong khoang PVS

 Đánh giá chất lượng bào tương chất

Độ mịn bào tương: Sự hiện diện của các quầng hạt thơ là một trong những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thụ tinh và sự phát triển phôi. Tuỳ theo độ dày đặc của quầng hạt bào tương thô từ dạng nhẹ (Gran 1) cho đến nghiêm trọng (Gran 4).

Thể vùi (Incls): Các thể vùi quan sát dưới kính hiển vi là các túi nhỏ dạng lipofuscin, được cho là phức hợp giữa lipid và vật liệu cô đặc, đậm màu từ bào tương [22]. Những thể vùi này khi có kích thước lớn (>5µm) có khả năng ảnh hưởng đến sự thụ tinh cũng như quá trình phát triển của phôi nang [23].

Lưới nội chất trơn (SER): SER là một thành phần bào quan của tế bào, ở dạng đĩa, có chức năng tổng hợp carbohydrate và lipid và đóng vai trị trung gian vận chuyển các sản phẩm từ lưới nội chất đến các cơ quan khác trong tế bào chất. Noãn trưởng thành sẽ có thể thụ tinh bình thường nếu khơng làm vỡ SER trong q trình thao tác [24].

Khơng bào: Khơng bào là một dạng thể vùi hình cầu có màng bao quanh chứa đầy dịch cặn bã cần loại bỏ ra khỏi tế bào nỗn. Các khơng bào lớn >14µm thường gây ra bất lợi đối với tỉ lệ thụ tinh và quá trình phát triển của phôi [25]. Không bào xuất hiện sau giai đoạn 2PN có thể gây trở ngại đối với các mặt phẳng phân bào, dẫn đến giảm tỉ lệ tạo phơi nang.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Hình 1.6. Các bất thường chất lượng bào tương chất (Nguồn: HP Fertility). (A) Gran 4. (B) Incls 2. (C) SER 4. (D) VAC 4

 Đánh giá chất lượng màng trong suốt (ZP)

Màng ZP bất thường hay gặp ở dạng màng hình bầu dục, màng kép, ZP quá dày hoặc quá mỏng. Độ dày ZP 13-15µm được coi là bình thường, nếu kích thước nhỏ hơn ZP được xem là mỏng, các trường hợp còn lại được xem là ZP dày [26, 27].

1.2.2.4. Cơ chế hình thành lệch bội ở nỗn

Các con đường phân chia giảm nhiễm khác nhau được cho là góp phần vào ngun nhân gây ra tình trạng lệch bội ở tế bào trứng. Sự không phân ly xảy ra khi các nhiễm sắc thể tương đồng hoặc các nhiễm sắc tử chị em không thể phân tách tương ứng trong kỳ giữa I hoặc kỳ giữa II, dẫn đến tăng hoặc giảm nhiễm sắc thể [28]. Ngoài ra, một số nghiên cứu đã báo cáo rằng lệch bội trong kỳ giữa I là kết quả của sự phân tách sớm nhiễm sắc tử chị em của một nhiễm sắc thể tương đồng và sự phân chia ngẫu nhiên của các nhiễm sắc thể đơn [29-31]. Các phân tích về các thể cực của noãn bào cho thấy các lỗi phân chia giảm nhiễm do sự phân tách nhiễm sắc tử chị em sớm xảy ra thường xuyên hơn so với các lỗi do sự không phân ly nhiễm sắc thể gây ra [32, 33]. Gần đây, kiểu phân ly nhiễm sắc thể thứ ba góp phần gây ra lệch bội, được gọi là phân ly ngược đã được báo cáo [34]. Trong trường hợp này, các nhiễm sắc tử chị em của cả hai nhiễm sắc thể tương đồng tách ra ở kỳ giữa I dẫn đến một nỗn lưỡng bội có một nhiễm sắc tử chị em từ mỗi nhiễm sắc thể tương đồng thay vì cả hai nhiễm sắc thể từ một nhiễm sắc thể tương đồng. Các nhiễm sắc tử chị em này vẫn khơng liên kết và có thể khơng xếp thẳng hàng với trục chính trong kỳ giữa II hoặc trải qua sự phân chia ngẫu nhiên ở kỳ sau II [35]. Sự phân tách nhiễm sắc tử chị em sớm và phân ly ngược không phải lúc nào cũng dẫn đến lệch bội và một số tế bào trứng vẫn có số lượng nhiễm sắc thể chính xác ở cuối kỳ giữa II. Thật vậy, gần đây đã có báo cáo rằng 78% trứng có phân ly ngược ở kỳ giữa

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

II phân tách chính xác [36]. Các tác giả tương tự đã chứng minh rằng sự không phân ly trong kỳ giữa I giảm theo tuổi phụ nữ, sự phân tách nhiễm sắc tử chị em sớm tăng tuyến tính theo tuổi, trong khi phân ly ngược tăng chủ yếu theo tuổi mẹ cao [36]. Do đó, tần số tương đối của ba kiểu phân chia này trong quá trình giảm phân hình thành giao tử cái dẫn đến biểu hiện lệch bội ở tế bào trứng người và phôi tiền làm tổ.

1.3. BẢO QUẢN LẠNH NOÃN 1.3.1. Định nghĩa

Trữ lạnh nỗn là q trình thay đổi từ nhiệt độ sinh lý 37oC xuống -196oC trong nitơ lỏng, làm ngưng trệ tất cả các hoạt động sinh học của tế bào sống, duy trì khả năng tồn tại của noãn cho việc sử dụng trong tương lai.

1.3.2. Các phương pháp trữ lạnh và rã đơng nỗn

Trữ lạnh nỗn được phát triển từ phương pháp hạ nhiệt độ chậm cho đến gần đây nhất là phương pháp thủy tinh hóa, chúng đều có những tác động đến hoạt động chức năng sau này của noãn và ảnh hưởng đến khả năng phát triển sau rã đông [37]. Hai phương pháp đều bao gồm các bước chính sau: sử dụng chất bảo vệ đông lạnh, làm lạnh, cất trữ, rã đông. Sự khác biệt chủ yếu là ở sử dụng chất bảo vệ đông lạnh (CPA) và quá trình làm lạnh.

1.3.2.1. Hạ nhiệt độ chậm

Trường hợp sinh sống đầu tiên từ noãn trữ lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm được báo cáo vào năm 1986 [38]. Trong phương pháp này, trước khi giảm nhiệt độ tế bào xuống dưới 0oC, nỗn sẽ được cho tiếp xúc với mơi trường có chứa CPA nồng độ 1,0-1,5 mol/L để làm mất nước nội bào. Người ta chỉ sử dụng một chất bảo vệ đông lạnh như propanediol (PROH), dimethylsulfoxide (DMSO) hay ethylene glycol. Do tính thấm qua màng của nước cao hơn CPA nên nước ra khỏi tế bào nhanh hơn CPA đi vào tế bào khiến ban đầu thể tích tế bào giảm sau đó sẽ phục hồi dần dần lại. Giai đoạn mất nước thứ hai diễn ra khi cho noãn tiếp xúc với mơi trường có CPA ban đầu kết hợp với một số CPA khơng có khả năng thấm qua màng tế bào, thường là sucrose hay các oligosaccharide khác. Sau đó nỗn được làm lạnh xuống dưới 0oC.

Ở nhiệt độ -30oC đến -40oC, khi nước nội bào đã gần như được loại bỏ và hầu hết nước ngoại bào đã chuyển thành tinh thể đá, noãn và dụng cụ chứa

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

được nhúng trực tiếp vào ni tơ lỏng và lưu giữ ở nhiệt độ -196oC. Quá trình rã đông nên được tiến hành ở tốc độ cao để hạn chế sự lớn lên của các tinh thể đá nội bào đến kích thước có thể làm tổn thương tế bào nỗn. Q trình rã đơng nỗn diễn ra với nguyên lý hoàn toàn ngược lại trữ lạnh, trong đó, q trình bù nước phải diễn ra theo từng bước một với nồng độ CPA giảm dần. Trong thời gian qua, nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm cải thiện hiệu quả của trữ lạnh noãn. Năm 2001, Fabbri và cộng sự cho thấy nếu tăng nồng độ sucrose lên 0,3 M và tăng thời gian tiếp xúc của nỗn với mơi trường trữ lạnh lên 15 phút thì tỉ lệ sống sau rã đông cải thiện đáng kể (82% so với 60%, p<0,05) [39].

1.3.2.2. Thuỷ tinh hoá

Trường hợp có thai và sinh sống đầu tiên từ nỗn trữ lạnh bằng thủy tinh hóa được báo cáo vào năm 1999 [40]. Thủy tinh hóa dựa vào khả năng làm lạnh cực nhanh thông qua sự tiếp xúc trực tiếp của mơi trường thủy tinh hóa (chứa CPA nồng độ cao) với ni tơ lỏng. Tuy nhiên, để đạt được trạng thái này, tốc độ làm lạnh phải rất nhanh và nồng độ CPA tăng đáng kể so với phương pháp hạ nhiệt độ chậm. Các CPA sử dụng trong phương pháp thủy tinh hóa cũng tương tự phương pháp hạ nhiệt độ chậm. Tuy nhiên, do nồng độ CPA cao nên người ta ưu tiên chọn CPA có độc tính thấp và thấm qua màng tế bào tốt. Ethylene glycol trở thành thành phần chuẩn trong phác đồ trữ lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa, đồng thời phối hợp với một hay hai CPA không thấm qua màng tế bào khác để làm giảm độc tính của từng loại CPA nếu sử dụng riêng lẻ. CPA không thấm màng thường được chọn là sucrose [41].

Một cách khác để hạn chế tổn thương do độc tính của CPA là cho nỗn tiếp xúc với mơi trường có nồng độ CPA tăng dần. Mơi trường thứ nhất thường có nồng độ CPA 20-50% so với mơi trường thứ hai. Nỗn tiếp xúc với mơi trường thứ nhất khoảng 5-15 phút và với môi trường thứ hai từ vài chục giây đến một phút trước khi mơi trường và nỗn được nhúng trực tiếp vào ni tơ lỏng. Tuy thời gian tiếp xúc với môi trường ngắn, nhưng do nồng độ thẩm thấu của môi trường cao đủ để kéo nước ra khỏi tế bào, tránh hình thành tinh thể đá nội bào. Mặt khác, thời gian tiếp xúc ngắn giúp hạn chế CPA vào tế bào, làm giảm độc tính và các khó khăn trong việc lấy CPA ra khỏi tế bào trong q trình rã đơng [42].

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Hiệu quả của một chu kỳ trữ lạnh – rã đơng nỗn có thể được đánh giá qua tỉ lệ nỗn sống sau rã đơng, tỉ lệ tạo phôi, tỉ lệ mang thai và trong điều kiện lý tưởng là tỉ lệ trẻ sinh sống. Năm 2006, Oktay và cộng sự đã tiến hành một phân tích gộp để so sánh hiệu quả của hạ nhiệt độ chậm so với thủy tinh hóa trong trữ lạnh noãn người, các số liệu ban đầu cho thấy thủy tinh hóa có khả năng cải thiện cơ hội thành công [43]. Trong một nghiên cứu ngẫu nhiên có nhóm chứng, Cao và cộng sự cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ nỗn sống sau rã đơng giữa hai nhóm nỗn trữ lạnh bằng hạ nhiệt độ chậm và thủy tinh hóa (61% so với 91,8%, p<0,01) [44]. Tỉ lệ thụ tinh ở hai nhóm là tương đương nhưng tỉ lệ phôi phân chia ở nhóm hạ nhiệt độ chậm là 54,4%, thấp hơn so với 78% ở nhóm thủy tinh hóa. Kết quả cũng cho thấy tỉ lệ phơi có chất lượng tốt và tỉ lệ hình thành phơi nang cao hơn đáng kể ở nhóm sử dụng phương pháp thủy tinh hóa khi trữ lạnh. Một báo cáo của Cobo và cộng sự năm 2010 cho thấy trên 50% các trung tâm IVF tại Mỹ có triển khai thường quy trữ lạnh nỗn, trong đó khoảng 2/3 chu kỳ là thủy tinh hóa [45]. Với lợi thế về hiệu quả cao hơn cũng như chi phí ban đầu thấp, thủy tinh hóa đang ngày càng được khuyến khích áp dụng trong trữ lạnh, nhất là trữ lạnh noãn.

1.3.3. Các nghiên cứu về tác động của q trình trữ rã đối với nỗn

 Tiếp xúc với tác động của CPA và sốc thẩm thấu

Trong hai thập kỷ qua, một số quy trình thủy tinh hóa tế bào trứng, các dụng cụ lưu trữ, các phương pháp hạ nhiệt độ, bảo quản và rã đông đã được đề cập và bàn luận [41]. Các quy trình này khác nhau về nồng độ và độ pha loãng các loại chất bảo quản lạnh (EG, DMSO, propylene glycol-PrOH, sucrose và trehalose) [46].

Cho đến nay, một trong những quy trình được sử dụng nhiều nhất để thủy tinh hóa tế bào trứng ở người là sự kết hợp của 15% DMSO (2,1 M), 15% EG (2,7 M) và 0,5 M sucrose (hoặc trehalose) trong thể tích tối thiểu (1 μl) [47], và những thay đổi về độ thẩm thấu cực đại gặp phải trong quá trình tiếp xúc và loại bỏ CPA được sử dụng trong q trình thủy tinh hóa và rã đơng có thể được dự đốn trước. Trong quy trình bảo quản lạnh này, sự thay đổi áp suất thẩm thấu có thể thay đổi từ 280 mOsM (độ thẩm thấu của môi trường nuôi cấy) sang 2700 mOsM (độ thẩm thấu của dung dịch cân bằng) trong pha cân bằng. Độ thẩm thấu tăng lên đáng kể lên đến 5600 mOsM của dung dịch thủy tinh hóa

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

trước khi tế bào trứng được đưa dụng cụ chứa và nhúng vào nitơ lỏng. Trong quá trình làm ấm, những thay đổi thẩm thấu đột ngột được đảo ngược, với sự pha loãng nhanh chóng từ 5600 mOsM đến 1280 mOsM trong dung dịch rã đơng và sau đó là hai bước khử CPA thay thế bằng phân tử nước với áp suất thẩm thấu lần lượt là 780 mOsM và 280 mOsM. Trong suốt quá trình làm lạnh – rã đơng, màng tế bào của tế bào trứng phải có đủ độ bền để chịu được sự thẩm thấu hai chiều của dung dịch qua màng tế bào một cách đột ngột. Việc thủy tinh hóa tế bào trứng có thể thực hiện được phần lớn là do tế bào trứng có thể chịu được sự dịch chuyển chất lỏng mạnh và nhanh mà không bị xẹp xuống.

Cũng quan trọng như các loại CPA, các điều kiện tiếp xúc với CPA có thể ảnh hưởng đến chức năng và khả năng sống sót của tế bào, với các yếu tố như nồng độ, nhiệt độ tiếp xúc và thời gian tiếp xúc là các biến số quan trọng. Tuy nhiên, không phải tất cả CPA đều hoạt động tốt như nhau đối noãn bào. Điều này có thể xuất phát từ sự cân bằng giữa tính thấm của CPA kết hợp với kích thước và tính thấm đặc biệt của màng tế bào trứng cũng như độc tính của CPA. Sử dụng duy nhất một chất bảo quản lạnh thẩm thấu với nồng độ cao có thể gây chết tế bào [48]. Để loại bỏ những tác động tiêu cực từ CPA, một số phương pháp đã được triển khai và tích hợp vào các quy trình thủy tinh hóa tế bào trứng. Nhiều chất bảo quản lạnh đã được sử dụng kết hợp ở nồng độ thấp hơn để cải thiện độc tính của từng chất bảo quản lạnh đồng thời đạt được dung dịch có độ nhớt cao. Hiện nay, phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng ở người được sử dụng nhiều nhất là sử dụng kết hợp EG và DMSO để đạt được nồng độ thấp nhất cần thiết từ mỗi CPA riêng lẻ [49-51].

 Thay đổi siêu cấu trúc

Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho phép phát hiện những thay đổi về siêu cấu trúc sau q trình thủy tinh hóa – rã đông trong tế bào trứng ở giai đoạn kỳ giữa II. Những thay đổi về siêu cấu trúc chủ yếu liên quan đến việc tăng không bào, mạng lưới nội chất trơn của ty thể (M-SER) kết hợp với phức hợp ty thể-túi (MV) và các hạt vỏ (CG) [52]. Không bào xuất hiện trong tế bào trứng sau thủy tinh hóa cũng có thể được tạo ra từ ty thể bị biến đổi, sưng tấy hoặc từ sự hợp nhất của các CG thoái hóa, liên quan đến sự mất đi đáng kể hàm lượng hạt đậm đặc electron. Không bào ngoại vi cũng có thể bắt nguồn từ sự xâm lấn của nỗn bào và/hoặc cụm túi nội bào hình thành trong vỏ tế bào trứng, bởi nó chỉ xuất hiện ở tế bào trứng khi tiếp xúc với chất bảo quản lạnh

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

[53]. Không bào cũng hiện diện trong các tế bào trứng quá trưởng thành hoặc trứng thối hóa, trong khi ở các tế bào trứng trưởng thành tươi có rất ít hoặc hầu như khơng có khơng bào. Do đó, sự xuất hiện của không bào trong tế bào trứng thủy tinh hóa có thể được coi là một dạng tổn thương cấu trúc như một phản ứng không đặc hiệu của tế bào trứng đối với tổn thương lạnh và/hoặc áp suất thẩm thấu.

Các liên kết tổng hợp được xác định rõ ràng giữa ty thể và màng tế bào chất được tìm thấy một cách đặc trưng trong tế bào trứng trưởng thành ở người, và được đặt gọi là tập hợp M-SER và phức hợp MV. Các tập hợp M-SER này có thể điều chỉnh nồng độ canxi và sản xuất ATP của ty thể, do đó có khả năng góp phần điều chỉnh các đường dẫn truyền tín hiệu phụ thuộc canxi khi thụ tinh [54-56]. Do đó, những rối loạn về hình thái và chức năng của các tập hợp M-SER và phức hợp MV có thể dẫn đến giảm khả năng thụ tinh của tế bào trứng. Vì cả tập hợp M-SER và phức hợp MV đều có thể biến đổi lẫn nhau nên đây là một quá trình tái cấu trúc màng động rất nhạy cảm với những thay đổi của môi trường [57]. Tế bào trứng người sau khi thủy tinh hóa thường xuất hiện các tập hợp M-SER điển hình, tương tự về kích thước, hình dạng và vị trí với các kết quả quan sát được trong đối chứng mới.

Các CG là các bào quan có màng bao quanh, có nguồn gốc từ Golgi, được hình thành trong giai đoạn đầu của quá trình phát triển tế bào trứng và chứa glycosaminoglycan, protease, axit phosphatase và peroxidase. Khi thụ tinh, một lượng lớn CG được tế bào trứng hoạt hóa vào khoang quanh tế bào (PVS), dẫn đến sự cứng lại của màng trong suốt (ZP) giúp ức chế sự xâm nhập của nhiều tinh trùng vào tế bào trứng cùng một lúc. Sự chuyển tiếp canxi khi thụ tinh có liên quan đến việc kích hoạt phản ứng tổng hợp CG với tế bào trứng, dẫn đến giải phóng CG vào PVS. Sự giải phóng CG sớm đã được phát hiện trong q trình thủy tinh hóa-rã đơng và điều này chỉ ra rằng việc kích hoạt tế bào trứng sớm có thể xảy ra sau q trình bảo quản lạnh [54].

 Tác động tới trục tế bào trứng

Trục giảm phân cực kỳ nhạy cảm với nhiệt độ thấp. Trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng, trục nỗn bào khơng chỉ tiếp xúc với nhiệt độ thấp mà cịn có thể bị hư hỏng do sự hình thành các tinh thể băng. Trong mơ hình thí nghiệm trên chuột, người ta đã chỉ ra rằng q trình thủy tinh hóa có thể làm xáo trộn chức năng điểm kiểm tra sự lắp ráp trục chính trong tế bào trứng của

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

chuột thơng qua việc kích hoạt lysome cathepsin B [58]. Một số nghiên cứu chuyên sâu đã chỉ ra rằng cả trục tế bào trứng của chuột và người đều rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp bởi sự khử polyme nhanh chóng khi tiếp xúc với nhiệt độ dưới mức sinh lý [59-61].

 Nỗn tự hoạt hố

Nguy cơ tiềm ẩn với việc bảo quản lạnh tế bào trứng là gây ra hiện tượng kích hoạt tế bào trứng. Sự thụ tinh bắt đầu từ điểm tinh trùng xâm nhập và lan

phần lớn là do sự giải phóng các ion canxi từ nguồn dự trữ bên trong tế bào,

bào CG. Sau đó, các CG sẽ biến đổi cấu trúc của ZP và màng bào tương để tinh trùng không thể liên kết hoặc duy trì liên kết với tế bào trứng. Tuy nhiên, nếu

yếu tố mơi trường, nó có thể gây ra tự hoạt hóa khiến tế bào trứng không thể thụ tinh. Tương tự như vậy, các chất bảo quản lạnh thường được sử dụng trong q trình thủy tinh hóa, DMSO và EG, có thể gây ra sự gia tăng lớn về nồng độ canxi nội bào trong tế bào trứng trưởng thành của chuột [62].

 Tính tồn vẹn của deoxyribonucleic acid (DNA)

Mặc dù hầu hết các phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng thành cơng đều yêu cầu sử dụng nồng độ CPA cao, nhưng một số hợp chất CPA này có thể tự gây ra tác dụng độc hại, chẳng hạn như tổn thương DNA. Ba CPA thường được sử dụng trong phương pháp thủy tinh hóa là EG, DMSO và PrOH đã được đánh giá về tác dụng gây độc gen trong tế bào soma và tế bào trứng. Người ta đã chứng minh rằng nồng độ PrOH cao (7,5 và 15%) gây ra tổn thương DNA đáng kể ở tế bào trứng chuột bất kể thời gian tiếp xúc với CPA [63] . Quá trình thủy tinh hóa tế bào trứng bằng PrOH gây ra tổn thương DNA nhiều hơn đáng kể so với các phương pháp thủy tinh hóa EG và/hoặc DMSO [63]. Các cơ chế gây ra độc tính gen của các chất bảo quản lạnh vẫn đang được xác định và do đó chúng ta nên thận trọng khi chọn CPA cho q trình thủy tinh hóa tế bào trứng cho đến khi có thêm nghiên cứu về độc tính CPA và đánh giá dài hạn.

 Sự cứng lại của màng ZP sau q trình đơng rã

Một vấn đề tiềm ẩn hiện nay với đông lạnh tế bào trứng là gây ra một sự kiện kích hoạt, làm cứng màng trong suốt, có thể ảnh hưởng đến quá trình làm

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

tổ. Sự cứng lại của ZP được tạo ra do sự kết hợp của các hạt vỏ với màng tế bào và giải phóng các thành phần của chúng vào các lớp màng trong của màng trong suốt. Sự hợp nhất màng tế bào phụ thuộc vào canxi và thường được kích hoạt bởi sự gia tăng canxi nội bào được bắt đầu bởi sự hợp nhất giữa tinh trùng và trứng. Sau khi xâm nhập vào noãn bào, tinh trùng kích hoạt một loạt dao động canxi. Sự gia tăng canxi làm cho các hạt vỏ não hợp nhất với màng sinh chất và giải phóng các thành phần của chúng vào các lớp màng trong của ZP [64]. Các enzym phân giải protein nhắm vào các protein liên kết với tinh trùng để ngăn không cho tinh trùng tiếp tục thụ tinh với trứng. Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào tế bào chất (ICSI) có thể khắc phục sự cứng lại của màng ZP, nhưng thực tế là trứng đã trải qua phản ứng hạt vỏ cho thấy tế bào trứng đã được kích hoạt nhân tạo trước khi thụ tinh thực sự.

 Tác động của q trình thủy tinh hóa tế bào trứng đến biểu hiện gen

Các mơ hình nghiên cứu trên bị và lợn tập trung vào các yếu tố chết theo chu trình, biểu hiện của gen BAX tiền chết theo chu trình hầu hết được điều chỉnh tăng lên và gen BCL2 chống chết theo chu trình được điều hịa giảm sau q trình thủy tinh hóa tế bào trứng trưởng thành [65-67]. Tuy nhiên, một số nghiên cứu chỉ ra khơng tìm thấy sự khác biệt trong biểu hiện gen liên quan đến chết theo chu trình sau q trình rã đơng bằng phương pháp thủy tinh hóa.

Trong các mơ hình nghiên cứu trên bò, một nghiên cứu gần đây đã báo cáo sự biểu hiện quá mức của gen Eg5 liên quan đến phân chia tế bào và gen p53 liên quan đến tế bào chết theo lập trình [68], trong khi một nghiên cứu khác mô tả sự giảm biểu hiện của CD9 sau q trình thủy tinh hóa, có khả năng dẫn đến khả năng thụ tinh giảm.

1.4. CÁC NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA QUÁ TRÌNH TRỮ RÃ ĐỐI VỚI KẾT QUẢ PHÔI HỌC VÀ LÂM SÀNG

1.4.1. Kết quả phôi học

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu đã được thực hiện đánh giá kết quả phôi học của nỗn rã đơng với phương pháp thuỷ tinh hố. Nghiên cứu của Lê

năng phát triển của noãn trữ lạnh bằng phương pháp thuỷ tinh hoá cho kết quả tỉ lệ nỗn sống sau rã đơng 89,09%, tỉ lệ thụ tinh 71,28%, tỉ lệ phôi tốt ngày 3 là 38,71% [7]. Một nghiên cứu khác của Lê Thuỵ Hồng Khả và cộng sự (2020)

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

báo cáo kết quả đơng lạnh nỗn ở bệnh nhân điều trị thụ tinh trong ống nghiệm với tỉ lệ nỗn sống sau rã đơng đạt 95,59 ± 13,60%, tỉ lệ thụ tinh 78,96 ± 24,88% [8].

Hầu hết các nghiên cứu về hiệu quả của quá trình thủy tinh hóa tế bào trứng đã được thực hiện bằng cách sử dụng trứng của người hiến tặng với chất lượng trứng được mong đợi là gần tối ưu. Rất ít nghiên cứu sử dụng tế bào trứng tự thân để so sánh các chu kỳ được thực hiện với trứng tươi và thủy tinh hóa. Kết quả là, chúng ta biết rất ít về kết quả thủy tinh hóa khi sử dụng tế bào trứng tự thân ở bệnh nhân vô sinh. Tuy nhiên, một nghiên cứu từ Ý dường như cũng có kết quả tương tự với tế bào trứng được thủy tinh hóa. Trong giai đoạn 2004–2009, các phòng khám IVF ở Ý bị hạn chế số lượng trứng được thụ tinh. Luật cũng cấm bảo quản lạnh phôi nhưng không cấm việc bảo quản lạnh tế bào trứng [69]. Chỉ ba tế bào trứng có thể được thụ tinh trong các chu kỳ IVF mới, nên các tế bào trứng dư phải được bảo quản lạnh để sử dụng sau hoặc loại bỏ. Hạn chế pháp lý này đã tạo ra cơ hội tự nhiên để so sánh kết quả của tế bào trứng tươi và đông lạnh phát sinh từ một lần lấy tế bào trứng và được thụ tinh với cùng một nguồn tinh trùng. Năm 2010, Ubaldi và cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu thuần tập theo chiều dọc trong tương lai bằng cách sử dụng tỉ lệ thai diễn tiến cộng dồn thu được bằng cách thụ tinh noãn tươi và nỗn thủy tinh hóa từ cùng một đồn hệ làm thước đo cho kết quả chính. Các tác giả kết luận rằng

thủy tinh hóa khơng có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng phát triển in vitro, phát

biểu dựa trên kết quả về tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ nỗn phát triển thành phơi chất lượng tốt giữa nỗn tươi và nỗn rã đơng khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê [51].

Điều quan trọng khi nghiên cứu ảnh hưởng của q trình thủy tinh hóa nỗn bào là phải loại trừ các yếu tố gây nhiễu có thể ảnh hưởng đến hiệu quả lâm sàng của quá trình, ngoại trừ kỹ thuật thủy tinh hóa. Bên cạnh đó, một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi và kết quả lâm sàng, bao gồm chất lượng của giao tử (do tuổi mẹ, kích thích buồng trứng, chất lượng và

cứu điều tra tác động của q trình thủy tinh hóa ở những bệnh nhân vô sinh với độ tuổi mẹ từ trung bình đến cao (30–39 tuổi) [70]. Những người tham gia đã đồng ý thủy tinh hóa một nửa số tế bào trứng của họ và sử dụng nửa còn lại (tế bào trứng anh chị em) làm nhóm đối chứng tươi. Các tế bào trứng được thủy

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

tinh hóa và rã đơng trong vịng <30 phút, đảm bảo điều kiện thụ tinh và ni cấy tương đương so với nhóm tươi trong cùng chu kỳ và khoảng thời gian. Tất cả điều kiện về chất lượng trứng, tinh trùng, thời điểm thu hồi trứng, tinh trùng được thực hiện trong cùng một ngày, các thao tác với phôi và giao tử được kiểm soát theo tiêu chuẩn để đảm bảo sự đồng bộ khi so sánh hai nhóm. Do tỉ lệ thối hố sau rã đơng gần 20%, các tác giả đã báo cáo các kết quả lâm sàng là hàm số của số lượng tế bào trứng ban đầu trước khi đông lạnh chứ không phải là hàm số của số lượng tế bào trứng sống sót sau rã đơng. Cách tiếp cận này ngăn chặn sự thiên vị đối với noãn thủy tinh hóa bằng cách đưa các nỗn thối hố sau rã đông vào mẫu số. Mặc dù cách tính tốn này đã tạo ra xu hướng tỉ lệ thụ tinh cao hơn ở nhóm tươi, tỉ lệ thụ tinh và phát triển phơi vẫn có thể so sánh về mặt thống kê giữa nhóm tươi và thủy tinh hóa. Kết quả cho thấy sự thụ tinh và phát triển phôi sớm (được xác định bằng tỉ lệ phôi chất lượng tốt ở ngày thứ 3 và tỉ lệ hình thành phơi nang) khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê ở trứng thủy tinh hố so với nhóm đối chứng. Những kết quả này gợi ý mạnh mẽ rằng tác động tiêu cực tiềm tàng của q trình thủy tinh hóa lên tế bào trứng có thể được giảm thiểu.

1.4.2. Kết quả sản khoa và chu sinh

Mặc dù, thủy tinh hóa là một cải tiến đáng kể so với đông lạnh chậm về hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng tự thân [51, 70], vẫn chưa biết liệu q trình thủy tinh hóa có gây ra tổn thương lâu dài hay không, biểu hiện ở sức khoẻ theo dõi nhiều năm sau đó hoặc ở các thế hệ tiếp theo. Thủy tinh hóa đã trở thành “tiêu chuẩn vàng” trong chưa đầy một thập kỷ và khơng có nghiên cứu theo dõi lâu dài nào về sức khỏe trẻ em. Tương tự, kỹ thuật này cịn q mới để có bất kỳ dữ liệu nào về sự phát triển cho đến tuổi trưởng thành. Phân tích kết quả chu sinh cũng như sự phát triển lâu dài của trẻ sinh ra là cần thiết để loại trừ bất kỳ tác động bất lợi nào đối với trẻ sinh sống. Năm 2014, Cobo và cộng sự đã báo cáo một nghiên cứu với một nhóm số lượng lớn trẻ em được sinh ra sau khi sử dụng tế bào trứng thủy tinh hóa (1027 trẻ từ 804 trường hợp mang thai) và tế bào trứng tươi (1224 trẻ từ 996 trường hợp mang thai) [71]. Kết quả khả quan khi khơng có sự gia tăng các kết quả bất lợi về sản khoa và chu sinh ở trẻ được thụ tinh bằng tế bào trứng thủy tinh hoá khi so sánh với tế bào trứng tươi. Việc theo dõi lâu dài những đứa trẻ sinh ra từ tế bào trứng thủy tinh hóa

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

vẫn cần thiết để thiết lập sự an tồn chung của quy trình. Q trình thủy tinh hóa trứng khơng những khơng ảnh hưởng xấu đến sự phát triển và sức khỏe của con cái sau giai đoạn sơ sinh mà còn cho thấy sự phát triển hoàn thiện về tinh thần và thể chất của trẻ được so sánh với dữ liệu của nhóm tham khảo trong nghiên cứu sau quá trình 6 năm theo dõi [72].

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Bệnh nhân thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm tại Bệnh viện Quốc tế Sản Nhi Hải Phòng trong giai đoạn 05/2021 – 08/2023 đáp ứng các tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ.

2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn

 Bệnh nhân có hồ sơ bệnh án lưu trữ đầy đủ thơng tin,

 Bệnh nhân có nỗn rã đơng được tạo phơi tại cùng thời điểm với nỗn tươi ở chu kỳ chọc hút noãn tươi sau cùng,

 Bệnh nhân có kết quả sàng lọc bất thường số lượng nhiễm sắc thể ở phôi giai đoạn tiền làm tổ (PGT-A),

 Cặp vợ chồng có kết quả karyotype bình thường và khơng mắc các bệnh lý tâm thần, tim mạch.

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ

 Bệnh nhân thực hiện thụ tinh bằng phương pháp IVF cổ điển,

 Cặp vợ chồng vô sinh do yếu tố nam giới: tinh trùng được thu nhận từ thủ thuật, tinh dịch đồ kết luận SOAT [73],

 Bệnh nhân xin tinh trùng, noãn, phơi,

 Bệnh nhân có đơng phơi ngày 3,

 Bệnh nhân không đáp ứng các tiêu chuẩn lựa chọn.

2.1.3. Thiết kế nghiên cứu

 Nghiên cứu hồi cứu: Số liệu nghiên cứu được thu thập sau khi bệnh nhân đã kết thúc chu kỳ điều trị. Các thông số về kết quả điều trị thụ tinh trong ống nghiệm bao gồm số lượng trứng tươi, số lượng trứng sống sau rã đông, số lượng phôi ngày 3, số lượng phôi nang, số lượng phôi được sàng lọc di truyền được hồi cứu thông qua Phiếu tổng kết phôi cuối chu kỳ thụ

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

tinh trong hồ sơ bệnh nhân. Kết quả sàng lọc bất thường nhiễm sắc thể được thu thập thơng qua Phiếu kết quả phân tích ADN trong hồ sơ bệnh nhân. Các thông số về đặc điểm người mẹ được hồi cứu thông qua Phiếu khám sức khoẻ sinh sản nữ trong hồ sơ bệnh án.

 Mô tả cắt ngang: Nghiên cứu cắt ngang từ tháng 05/2021 đến tháng 08/2023. Tất cả bệnh nhân thực hiện thụ tinh với noãn tươi và noãn rã tự thân trong khoảng thời gian trên được đưa vào nghiên cứu. Mỗi chu kỳ thụ tinh được thu thập thông tin một lần duy nhất vào thời điểm hồi cứu hồ sơ bệnh án và không theo dõi xuôi theo thời gian.

2.1.4. Cỡ mẫu và chọn mẫu

Tỉ lệ thụ tinh trung bình của nỗn trữ - rã được sử dụng tính cỡ mẫu là một biến định lượng. Do đó, cơng thức của Yamane [74] được sử dụng để ước tính cỡ mẫu cho một giá trị trung bình với độ chính xác tuyệt đối.

p: Tỉ lệ phôi nang lệch bội nhiễm sắc thể d: Sai số tuyệt đối cho phép

Độ chính xác tuyệt đối (p) được sử dụng là tỉ lệ thụ tinh trung bình của nỗn trữ - rã trong nghiên cứu của Joseph O. Doyle và cộng sự (2016) với giá trị là 0,695 [11]. Sử dụng độ tin cậy 95% và sai số tuyệt đối là 5%. Theo tính tốn, cỡ mẫu tối thiểu cho nghiên cứu đánh giá kết quả thụ tinh trong ống nghiệm và kết quả sàng lọc bất thường số lượng nhiễm sắc thể ở phơi giai đoạn tiền làm tổ trên nhóm đối tượng trữ lạnh noãn là 76 noãn rã.

Trong giai đoạn từ tháng 05/2021 đến 08/2023, nghiên cứu của tôi ghi nhận được 83 chu kỳ tạo phôi với nỗn rã đơng và thực hiện sinh thiết phơi có kết quả PGT-A phù hợp với tiêu chuẩn lựa chọn (Xem Hình 2.1). Như vậy, số lượng nỗn rã đơng trong nghiên cứu này đã đảm bảo cỡ mẫu tối thiểu.

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Hình 2.1. Sơ đồ lựa chọn mẫu trong nghiên cứu

2.2. HỐ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.2.1. Hố chất

 Hố chất thao tác với giao tử, phơi [75].

 Hố chất tách nỗn khỏi phức hợp OCC [76].

 Hố chất ni cấy phơi [77]

 Hóa chất sinh thiết phôi và rửa phôi bào.

 Hố chất đơng và rã phơi nỗn có chứa các chất bảo quản lạnh (CPA)

2.2.2. Vật tư, thiết bị

 Hệ thống tủ ni cấy tích hợp camera theo dõi phôi liên tục (timelapse)

 Hệ thống kính hiển vi đảo ngược và bộ vi tiêm đ ICSI và sinh thiết phôi

 Tủ thao tác IVF có bề mặt gia nhiệt Astec – Nhật Bản AITT có gắn kính hiển vi soi nổi SMZ1270 NIKON Nhật Bản sử dụng cho quy trình trữ rã phơi, nỗn và quy trình rửa phơi bào sau sinh thiết phôi.

 Các vật tư trong IVF: ống đáy trịn, ống đáy nhọn, đĩa petri các kích thước, đĩa timelapse, đĩa 4 giếng, đầu cơn có màng lọc, ống effendorf…

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phương pháp trữ lạnh nỗn/phơi

Quy trình trữ lạnh và rã đơng nỗn/phơi được thực hiện theo theo mơ tả của Masashige Kuwayama [78].

Bước 1. Noãn được tách khối tế bào hạt và tế bào vành tia xung quanh bằng hyaluronidase 80 IU/mL.

Bước 2. Quy trình trữ lạnh bắt đầu với nỗn được cân bằng trong môi trường ES chứa 7% EG (ethylene glycol), 7% DMSO (dimethyl sulfxide) trong tối đa 15 phút trước khi được chuyển sang môi trường thuỷ tinh hoá (VS) chứa 14.5% EG, 14.5% DMSO, 0.5 M trehalose trong tối đa 90 giây. Noãn được chuyển lên dụng cụ chứa Cryotec với thể tích mơi trường tối thiểu và nhúng trực tiếp vào hộp xốp chứa ni tơ lỏng và được lưu giữ trong bình lưu trữ mẫu.

2.3.2. Phương pháp rã đơng nỗn/phơi

Bước 1. Quy trình rã đơng được thực hiện với môi trường rã (TS) chứa 1.0 M trehalose được làm ấm đến 37oC ít nhất 1 giờ.

Bước 2. Nhúng thật nhanh cọng phơi/nỗn từ ni tơ lỏng vào TS cho tới khi noãn trên cọng nổi lên bề mặt môi trường. Sau 1 phút, nỗn/phơi được chuyển sang và giữ trong mơi trường trung hồ (DS) chứa 0.5 M trehalose trong 3 phút trước khi được chuyển sang mơi trường tráng (WS1). Nỗn ở trong WS1 trong 5 phút và trong WS2 1 phút. Bước 3. Chuyển noãn vào đĩa ni cấy, đánh giá hình thái dưới kính hiển vi.

2.3.3. Phương pháp vi tiêm tinh và nuôi cấy phôi

Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) được thực hiện với noãn trưởng thành (MII) sống sót sau q trình rã đơng. Nỗn sau khi ICSI được nuôi cấy liên tục trong môi trường đơn bước trong tủ nuôi cấy 37oC sử dụng khí trộn có nồng độ 7% CO2, 5% O2.

2.3.4. Phương pháp đánh giá sự phát triển của phôi

2.3.4.1. Đánh giá hợp tử vào ngày 1 (17±1 giờ sau ICSI)

Noãn thụ tinh bình thường có hình cầu với 2 thể cực và 2 tiền nhân (pronuclei – PN) có màng bao riêng biệt.

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

2.3.4.2. Đánh giá phôi phân chia vào ngày 3 (68±1 giờ sau ICSI)

Bảng 2.1. Đánh giá hình thái và xếp loại chất lượng phơi ngày 3

Xếp loại Số lượng phôi bào

2.3.4.3. Đánh giá phôi nang vào ngày 5 (116±2 giờ sau thụ tinh) hoặc ngày 6 (140±2 giờ sau thụ tinh).

Phôi được đánh giá dựa trên độ nở rộng của khoang phôi, khối tế bào nụ phôi (ICM) và lớp tế bào lá nuôi. Sau khi chấm điểm 3 yếu tố trên, phôi sẽ được xếp thành 3 loại dựa trên hình thái theo đồng thuận Alpha 2011 [12]:

 Loại I: 3/4/5/6 AA, AB, BA

 Loại II: 3/4/5/6 BB, AC, CA

 Loại III: 3/4/5/6 CC, BC, CB

Nếu độ nở rộng khoang phôi ≤ 2 thì chất lượng phơi sẽ bị hạ 1 bậc.

2.3.5. Phương pháp sinh thiết phôi

Sinh thiết được tiến hành trên lớp tế bào lá nuôi (TE) vào ngày 5 hoặc ngày 6 sau khi thụ tinh. Quy trình sinh thiết phơi được tiến hành với các bước cơ bản bao gồm: (1) sử dụng kính hiển vi đảo ngược có gắn kèm bộ vi thao tác và hệ thống laser để ngắt 2-3 tế bào TE ra khỏi phôi, (2) các tế bào TE sau khi sinh thiết được rửa qua 3 giọt môi trường đệm trước khi được đặt vào ống PCR, (3) các ống PCR chứa phôi bào được ghi mã sinh thiết phôi, (4) vận chuyển các mẫu phơi bào tới phịng xét nghiệm di truyền để thực hiện PGT-A [79].

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

2.3.6. Chuyển phôi trữ đông

Bệnh nhân sẽ được bác sĩ tư vấn và đưa ra quyết định lựa chọn phôi chuyển. Tiến hành rã phôi và chuyển vào tử cung của bệnh nhân. Theo dõi kết quả thụ thai bằng xét nghiệm máu định lượng β-hCG. Theo dõi thai kỳ bằng siêu âm.

Kết cục lâm sàng được ghi nhận bởi các biến số sau [80] :

 Có thai: kết quả xét nghiệm β-hCG dương tính (>25IU)

 Thai sinh hố: khơng có túi thai trên hình ảnh siêu âm sau khi có.

 Thai lâm sàng: xuất hiện túi thai trên hình ảnh siêu âm.

 Thai diễn tiến: thai phát triển đến tuần tuổi thứ 12.

 Trẻ sinh sống: trẻ sinh ra có dấu hiệu của sự sống.

2.3.7. Phân tích số liệu nghiên cứu

2.3.7.1. Phương pháp thu thập số liệu

 Chất lượng phơi, nỗn được đánh giá bằng hình ảnh phơi từ tủ nuôi cấy Timelapse hoặc quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi đảo ngược.

 Kết quả sàng lọc bất thường số lượng nhiễm sắc thế (PGT-A) và kết quả thai trên hồ sơ bệnh án tại Bệnh viện Quốc tế Sản Nhi Hải Phòng.

 Các biến số nghiên cứu chính gồm: (1) Số lượng nỗn trữ đơng, (2) Số lượng nỗn sống sau rã đơng, (3) Số lượng nỗn thụ tinh, (4) Số lượng phôi hữu dụng, (5) Kết quả PGT-A, (6) các yếu tố người mẹ (tuổi, thời gian vô sinh, AMH, BMI.

2.3.7.2. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được mã hóa, thu thập và xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0. Kiểm định t-test được sử dụng để so sánh các giá trị trung bình. Sử dụng kiểm định χ2 so sánh sự khác biệt giữa các tỉ lệ ở hai nhóm noãn tươi và noãn rã bao gồm tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ tạo phôi ngày 3, tỉ lệ tạo phôi nang, tỉ lệ phôi nguyên bội, tỉ lệ phôi lệch bội, tỉ lệ phôi khảm, tỉ lệ có thai, tỉ lệ thai sinh hố, tỉ lệ thai lâm sàng, tỉ lệ thai diễn tiến, tỉ lệ trẻ sinh sống. Vùng dưới đường cong ROC (AUC) được sử dụng để xác định giá trị của yếu tố tiên lượng và chỉ số Youden ước tính chẩn đốn để xác định ngưỡng chẩn đốn có hay khơng có phơi nang ngun bội. Tỉ suất chênh Odds ratio (OR) đánh giá mức tương quan. Các test

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

thống kê được kiểm định với sự khác biệt P < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Các tỉ lệ được tính theo cơng thức sau:

Tỉ lệ thụ tinh bình thường = Số lượng hợp tử 2 PN Số lượng nỗn được thụ tinh

Tỉ lệ có thai =

Số lượng ca

có kết quả xét nghiệm β − hCG dương (> 25IU) Số chu kỳ chuyển phôi

Tỉ lệ thai sinh hóa = Số lượng ca 𝐤𝐡ơ𝐧𝐠 có túi thai trên siêu âm Số chu kỳ chuyển phôi

Tỉ lệ thai lâm sàng = Số lượng ca có túi thai trên siêu âm Số chu kỳ chuyển phôi

Tỉ lệ thai diễn tiến = Số lượng ca thai có tuổi thai ≥ 12 tuần Số chu kỳ chuyển phôi

Tỉ lệ trẻ sinh sống =

Số lượng ca

có ít nhất 1 trẻ sinh ra có dấu hiệu sự sống Số chu kỳ chuyển phôi

2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

 Nghiên cứu được sự cho phép của lãnh đạo Khoa Hỗ trợ Sinh sản, Bệnh viện Quốc tế Sản Nhi Hải Phòng và tuân theo các quy định về đạo đức trong nghiên cứu y sinh.

 Các văn bản pháp lý, quy trình lâm sàng, cận lâm sàng được thực hiện theo đúng quy định của phát luật Việt Nam về thụ tinh trong ống nghiệm, sàng lọc phôi.

 Bệnh nhân đồng ý, tự nguyện ký đơn đề nghị thực hiện thụ tinh ống nghiệm, phiếu đề nghị phân tích di truyền phôi tiền làm tổ và được thông báo về mục đích nghiên cứu. Thơng tin cá nhân của đối tượng nghiên cứu được bảo mật tuyệt đối.

 Quá trình đánh giá thụ tinh và chất lượng phôi đảm bảo không ảnh hưởng tới chất lượng phôi.

 Kỹ thuật sinh thiết phôi, tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn và PGT-A khơng ảnh hưởng đến sức khỏe của trẻ sơ sinh.

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Từ tháng 05/2021 đến tháng 08/2023, trung tâm Hỗ trợ sinh sản – Bệnh viện Quốc tế Sản Nhi Hải Phịng đã thực hiện 94 chu kỳ rã đơng noãn với 88 chu kỳ sử dụng trứng tự thân. Áp dụng tiêu chuẩn loại trừ, 79 bệnh nhân với tổng cộng 83 chu kỳ thụ tinh có sử dụng noãn trữ rã thoả tiêu chuẩn nhận được đưa vào nghiên cứu.

Bảng 3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu

Các thông số đánh giá Giá trị trung bình Khoảng tin cậy 95%

Thời gian vô sinh (năm) 2,9 ± 2,4 2,4 - 3,5

Chỉ số khối cơ thể (BMI) 21,8 ± 2,1 21,3 - 22,3

Số chu kỳ chọc hút trứng

Số lượng trứng MII được tạo phôi mỗi chu kỳ thụ tinh (trứng)

5,2 ± 3,8 4,3 - 6,0

Đặc điểm nền của đối tượng trong nghiên cứu khơng thuộc nhóm tiên lượng tốt với tuổi trung bình của dân số nghiên cứu là 37,7 ± 4,2 tuổi; thời gian vô sinh kéo dài trung bình 2,9 ± 2,4 năm; dự trữ buồng trứng thấp với giá trị AMH trung bình 1,53 ± 1,37. Số chu kỳ chọc hút trứng trung bình 2,9 ± 1,5 thấp tương ứng với số lượng trứng trung bình được tạo phơi mỗi chu kỳ ở mức 5,2 ± 3,8.

Độ tuổi dân số trong nghiên cứu của tôi tương đồng với một số nghiên cứu của Goldman và cs., 2015 [81] và Doyle và cs., 2016 [11] thực hiện đánh giá kết quả trữ lạnh nỗn với độ tuổi trung bình đều trên 35 tuổi.

</div>

di

rAC

,!

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về