luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm: nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro

MỤC LỤC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ POLYAMINE
LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH CÂY SÂM
NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET
GRUSHV.) NUÔI CẤY IN VITRO
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. DƯƠNG TẤN NHỰT
2. PGS. TS. BÙI VĂN LỆ
Học viên thực hiện: VŨ THỊ THỦY
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình và đồ thị
Mở đầu 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SƠ LƯỢC VỀ PHÔI VÔ TÍNH 3
1.1.1. Quá trình phát sinh phôi ở thực vật 3
1.1.2. Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng 4
1.1.3. Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính 8

1.1.4. Trạng thái của các tế bào phát sinh phôi vô tính 9
1.1.5. Sự phát sinh phôi vô tính 11
1.1.6. Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính 13
1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH 13
1.2.1. Chất điều hòa sinh trưởng 13
1.2.2. Nguồn Nitơ 15
1.2.3. Ánh sáng 16
1.2.4. Đường 16
1.2.5. Độ pH 17
1.3. VAI TRÒ CỦA POLYAMINE 17
1.3.1. Giới thiệu 17
1.3.2. Con đường trao đổi chất của Polyamine 18
1.3.2.1. Sinh tổng hợp Polyamine 18
1.3.2.2. Sự vận chuyển Polyamine 21


1.3.2.3. Sự tiếp hợp Polyamine 22
1.3.2.4. Polyamine trong tương tác với các con đường sinh tổng
hợp khác 22
1.3.2.5. Các chất ức chế sinh tổng hợp Polyamine 22
1.3.3. Polyamine đóng vai trò là chất điều hòa sinh trưởng 23
1.4. SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA
ET GRUSHV.) 25
1.4.1. Phân loại và đặc điểm hình thái 25
1.4.1.1. Phân loại 25
1.4.1.2. Đặc điểm hình thái 25
1.4.2. Phân bố 26
1.4.3. Thành phần hóa học 26
1.4.3.1. Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) 26
1.4.3.2. Phần trên mặt đất (thân và lá) 28

1.4.3.3. Các thành phần khác 28
1.4.4. Các tác dụng của sâm Ngọc Linh 28
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU 30
2.1.1. Nguồn mẫu 30
2.1.2. Môi trường nuôi cấy 30
2.1.3. Điều kiện thí nghiệm 30
2.1.4. Địa điểm thực hiện đề tài 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP 31
2.2.1. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh
quang 31
2.2.2. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi điện tử
quét 31
2.2.3. Thu thập mẫu và phân tích Polyamine nội sinh 32
2.2.4. Bố trí thí nghiệm 32
2.2.4.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo xốp
từ các nguồn mẫu cấy khác nhau của cây sâm Ngọc Linh 32
2.2.4.2. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường
khoáng khác nhau lên sự hình thành mô sẹo xốp sâm
Ngọc Linh 33
2.2.4.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D
kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành
phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 33
2.2.4.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện
nuôi cấy và điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi
vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 34
2.2.4.5. Thí nghiệm 5. Khảo sát ảnh hưởng của một số tiền chất
sinh tổng hợp Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính
từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 35
2.2.4.6. Thí nghiệm 6. Khảo sát ảnh hưởng của một số

Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 35
2.2.5. Xử lý số liệu 35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU LÊN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO
CÓ KHẢ NĂNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH 36
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MÔI TRƯỜNG KHOÁNG LÊN KHẢ
NĂNG HÌNH THÀNH MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 38
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ 2,4-D KẾT HỢP VỚI 0,5 mg/l NAA
VÀ 0,2 mg/l KIN LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ
SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 41
3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ ĐIỀU KIỆN
CHIẾU SÁNG LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO
XỐP SÂM NGỌC LINH 44


3.4.1. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (đặc, lỏng tĩnh, lỏng lắc)
lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 44
3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô
tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 46
3.5. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ TIỀN CHẤT SINH TỔNG HỢP
POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO
XỐP SÂM NGỌC LINH 49
3.5.1. Ảnh hưởng của Arginine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo
xốp sâm Ngọc Linh 49
3.5.2. Ảnh hưởng của Ornithine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo
xốp sâm Ngọc Linh 50
3.6. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THUỘC NHÓM
POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO
XỐP SÂM NGỌC LINH 52

3.6.1. Ảnh hưởng của Putrescine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô
sẹo xốp sâm Ngọc Linh 52
3.6.2. Ảnh hưởng của Spermidine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô
sẹo xốp sâm Ngọc Linh 55
3.6.3 Ảnh hưởng của Spermine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo
xốp sâm Ngọc Linh 57
3.7. PHÂN TÍCH POLYAMINE NỘI SINH 60
3.8. GIẢI PHẪU CÁC DẠNG HÌNH THÁI PHÔI KHÁC NHAU CỦA SÂM
NGỌC LINH 63
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN 65
KIẾN NGHỊ 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
½MS : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng giảm ½, vi lượng giữ
nguyên
½SH : Môi trường SH với thành phần khoáng đa lượng giảm ½, vi lượng giữ
nguyên
2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
ABA : Absisic acid
ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid
ACD : Arginine decarboxylase
Arg : Arginine
ATP : Adenosine-5’-triphosphate
BAP : 6-benzylaminopurine
CH : Casein
EC : Các cụm phát triển phôi (Embryogenic cluster)
G- : Ginsenoside
GA

3
: Gibberellic acid
G-Rb
1
: Ginsenoside-Rb
1

G-Rg
1
: Ginsenoside-Rg
1

IAA : Indole-3-acetic acid
IBA : Indole-3-butyric acid
Kin : Kinetin
LDC : Udecarboxylase
MR
2
: Majonoside-R
2



MS : Môi trường Murashige và Skoog, 1962
MS½ : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½
NAA : Acid -naphtaleneacetic
ODC : Ornithine decarboxylase
Orn : Ornithine
PA : Polyamine
PEM : Cụm tiền phôi (Pre-embryo mass)

pkl : Gene pickle (Một dạng đột biến gene ở cây Arabidopsis)
Put : Putrescine
SAM : S-adenosylmethionine
SERK : Somatic embryogenesis receptor-like kinase
SH : Môi trường Schenk and Hildebrandt, 1972
SH½ : Môi trường SH với thành phần khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½
Spd : Spermidine
Spm : Spermine
TDZ : Thidiazuron







DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu khác nhau
của sâm Ngọc Linh 36
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng hình thành mô
sẹo xốp từ lá sâm Ngọc Linh 39
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,5; 2
mg/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin lên sự hình
thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 42
Bảng 3.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự hình thành phôi vô
tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 45
Bảng 3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô
tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 47
Bảng 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh 49
Bảng 3.5.2. Ảnh hưởng của Orn lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo
xốp sâm Ngọc Linh 51
Bảng 3.6.1. Ảnh hưởng của Put lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 53
Bảng 3.6.2. Ảnh hưởng của Spd lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 56
Bảng 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo
xốp sâm Ngọc Linh 57







DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Các dạng phát sinh phôi ở thực vật 3
Hình 1.2. Mô hình giả thuyết các sự kiện xảy ra trong quá trình phát sinh
phôi vô tính 7
Hình 1.3. Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển của phôi 9
Hình 1.4. Trao đổi chất PA và tương tác với các con đường trao đổi chất
khác 19
Hình 1.5. Cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 25
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu lên khả năng hình thành mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 37
Hình 3.2. Ảnh hưởng của các môi trường khoáng lên khả năng hình thành
mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 41
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên sự hình thành phôi vô tính từ

mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 44
Hình 3.4.1. Mô sẹo và phôi trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc, lỏng tĩnh và
đặc. 46
Hình 3.4.2. Mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày và tối hoàn toàn 48
Hình 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 50
Hình 3.5.2. Ảnh hưởng của Orn lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 52
Hình 3.6.1. Ảnh hưởng của Put lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 54
Hình 3.6.2. Ảnh hưởng của Spd lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp
sâm Ngọc Linh 56
Hình 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo
xốp sâm Ngọc Linh 58
Hình 3.6.4. Một số cây con tái sinh từ mô sẹo xốp trên môi trường ĐC, Spd,
Put và Spm. 58
Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi hàm lượng PA ở các giai đoạn phát triển cụm mô
phôi ở sâm Ngọc Linh trên môi trường ĐC và môi trường bổ
sung Spd 61
Hình 3.7. Sự thay đổi hình thái và cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi
vô tính sâm Ngọc Linh 64


MỞ ĐẦU
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là cây dược liệu đặc hữu
quý hiếm của Việt Nam và thế giới, được biết đến bởi hàm lượng cao các hợp chất
Saponin triterpenoic tiêu biểu như MR2, G-Rb1 và G-Rg1 [Trần Công Luận, 2003].
Không chỉ có dược tính đặc trưng của chi nhân sâm mà loài cây này còn có tác dụng
điển hình như chống stress, chống trầm cảm, tác dụng chống oxi hóa in vitro và in
vivo… Hiện nay, do nhu cầu cao của thị trường kết hợp với việc khai thác ồ ạt, thiếu

khoa học, trồng, nhân giống hạn chế và bảo tồn lỏng lẻo, đã và đang đẩy sâm Ngọc
Linh đến bờ vực của sự tuyệt chủng. Do đó, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã
được áp dụng cho loài cây này [Nguyễn Ngọc Dung, 1995; Dương Tấn Nhựt et al.,
2010]. Đây là phương pháp hiệu quả trong việc nhân nhanh số lượng cây sâm Ngọc
Linh trong thời gian ngắn mà vẫn đảm bảo chất lượng cây giống. Trong đó, nhân
giống vô tính thông qua con đường phát sinh phôi vô tính đã mang lại nhiều ứng
dụng thực tiễn, có tính thương mại cao bởi tạo ra lượng lớn cây con sâm Ngọc Linh
trong thời gian ngắn, cây con đồng đều về di truyền và có tỉ lệ sống sót cao ngoài
vườn ươm.
Tương tự phôi hữu tính, phôi vô tính gồm có mầm chóp rễ và chồi đỉnh nên có
thể nảy mầm thành một cây hoàn chỉnh. Tuy nhiên, sự hình thành phôi vô tính là
một quá trình phức tạp, chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nguồn mẫu, nhiệt độ,
ánh sáng, độ pH … Trong đó, các chất điều hòa sinh trưởng như 2,4-D, NAA,
Kinetin, Proline…. đóng vai trò rất quan trọng. Gần đây, các Polyamine gồm
Putrescine, Spermidine và Spermine cùng các tiền chất của chúng (Arginine và
Ornithine) được chú ý như là một lớp chất điều hòa sinh trưởng mới có các dụng
trong nhiều chu trình của cây như sự chín quả, già lá, sinh trưởng và phát triển hoa;
đặc biệt, có sự liên quan mật thiết với quá trình phát sinh phôi vô tính. Ở nồng độ
cao, Polyamine có tác dụng giúp cho tế bào lớn lên và phân chia. Trong giai đoạn
cảm ứng tạo phôi, Polyamine thúc đẩy các tế bào vùng mô phân sinh phân chia
nhanh chóng và biệt hóa tạo phôi. Nồng độ Polyamine giảm có thể gia tăng các tế
bào mô sẹo nhưng sẽ làm giảm sự hình thành phôi. Polyamine nâng cao hiệu suất
phát sinh phôi ở nhiều loại cây đã được nghiên cứu như cây cà rốt, Pinus
gerardiana Wall, Momordica charatia L., cây ổi [Hadrami và D’Auzac, 1992;
Ravindra et al., 2007; Ananya et al., 2009; Nasim, 2013].
Mặc dù, việc sử dụng Polyamine kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng
khác mang lại hiệu quả trong biệt hóa tế bào hình thành phôi [Rajam, 1997] cũng
như các giai đoạn hình thành cây hoàn chỉnh ở thực vật đã được chứng minh
[Kevers et al., 2000] song cơ chế tác động vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng.
Trong nỗ lực bảo tồn và nhân giống cây sâm Ngọc Linh, chúng tôi đã tiến hành

“Nghiên cứu vai trò của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây
sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro”. Ảnh
hưởng nguồn mẫu, điều kiện khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, điều kiện nuôi cấy
và điều kiện chiếu sáng được đánh giá trước khi nghiên cứu vai trò của các
Polyamine cũng như tiền chất của chúng lên sự hình thành và tần suất phát sinh
phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh in vitro. Đồng thời, nồng độ Polyamine nội sinh
cũng được tiến thành phân tích để những kết luận trở nên thuyết phục, có giá trị hơn
và mở đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về Polyamine trên loài cây quý này.










Chương 1

TỔNG QUAN
TÀI LIỆU







1.1. SƠ LƯỢC VỀ PHÔI VÔ TÍNH

Phôi vô tính chứa chất dinh dưỡng tương tự phôi hữu tính, có mầm chóp rễ và
chồi đỉnh nên có thể nảy mầm trực tiếp thành cây không qua giai đoạn phát sinh
chồi, rễ. Các mô và tế bào sinh dưỡng nuôi cấy in vitro tạo ra phôi vô tính trực tiếp;
hoặc gián tiếp thông qua một quá trình tạo mô sẹo. Tế bào mô sẹo có thể phân chia
theo cấp số nhân, nhờ vậy chỉ sau một thời gian ngắn nó có thể tạo được một số
lượng phôi đáng kể. Ưu điểm nổi bật của phôi vô tính là có thể bảo quản được lâu
dài và cho nảy mầm vào thời vụ thích hợp. Hiện nay, trên 200 loài cây trồng đã
được nhân giống thành công bằng công nghệ phôi vô tính. Công nghệ tạo phôi vô
tính hiện nay vẫn đang là công nghệ tiên tiến trên thế giới [Nguyễn Văn Uyển,
2006; Dương Tấn Nhựt, 2007].
1.1.1. Quá trình phát sinh phôi ở thực vật

Hình 1.1. Các dạng phát sinh phôi ở thực vật [Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007]
Ở các loài thực vật bậc cao, phôi và nội nhũ là kết quả của sự thụ phấn kép (sự
thụ phấn của tế bào noãn đồng thời với sự thụ phấn của tế bào trung tâm) được bao
bọc trong hạt. Sự phát sinh phôi hợp tử ở thực vật là một quá trình phức tạp ẩn sâu
trong mô mẹ. Ngoài những dữ liệu mô học thu thập được trên nhiều loài thực vật thì
việc phân tích các dạng đột biến ở cây Arabidopsis cũng đã góp phần làm sáng tỏ
một chuỗi các sự kiện xảy ra trong quá trình phát triển phôi ở thực vật. Ngày nay, vi
nhân giống và thụ phấn in vitro, kết hợp với các biện pháp phân tử và gene, đã làm


rõ ràng thêm một số chi tiết và đồng thời cũng có những đóng góp thiết thực vào
vốn hiểu biết của chúng ta về quá trình phát sinh phôi sinh dưỡng ở thực vật. Tuy
nhiên, ở các loài thực vật bậc cao, việc không thể phát sinh phôi hợp tử ở một số
loài được cho là có liên quan đến sự sinh sản vô phối (apomixis-sự sinh sản không
thông qua quá trình thụ tinh) (gồm hơn 400 loài cây thuộc ít nhất 40 họ khác nhau).
Trong quá trình sinh sản vô phối, sự hình thành hạt vô tính bắt đầu từ mô mẹ của
noãn, không trải qua quá trình giảm phân và thụ phấn, dẫn đến sự phát triển của
phôi. Hiện tượng sinh sản vô phối đã bộc lộ hai khía cạnh quan trọng của quá trình

phát sinh phôi ở thực vật: (1) Các điểm nhấn kích hoạt sự thụ phấn có thể được thay
thế bằng những cơ chế nội sinh; (2) Ở một số loài thực vật bậc cao, ngoài tế bào
noãn được thụ phấn thì các loại tế bào khác cũng có thể duy trì và giữ lại khả năng
phát triển phôi. Mặc dù quá trình sinh sản vô phối chỉ hạn chế ở các tế bào phát sinh
đỉnh hoặc noãn, nhưng cũng có một số lượng lớn tế bào sinh dưỡng thực vật có thể
trải qua quá trình phát triển phôi dưới những điều kiện thích hợp. Ví dụ, sự hình
thành phôi (có vai trò như lá mầm sinh dưỡng) cũng có thể xảy ra trên mép lá của
cây sống đời Kalanchoe, cây Malaxis paludosa [Taylor, 1967]. Có nhiều thí nghiệm
phát sinh phôi được bắt đầu từ nuôi cấy in vitro các tế bào sinh dưỡng hoặc tế bào
giao tử (ví dụ: tiểu bào tử). Các dạng thức phát sinh phôi ở thực vật được tóm lược
trên Hình 1.1.
1.1.2. Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng
Theo Moltrasio và cộng sự (2004) thì khả năng phát sinh phôi vô tính được
biểu hiện trước hết là ở mức kiểu gene và điều này có thể được chứng minh dễ dàng
bằng cách chuyển khả năng phát sinh phôi từ kiểu gene có khả năng phát sinh phôi
sang kiểu gene ngăn cản sự phát sinh phôi thông qua quá trình lai giống hữu tính.
Mặc dù các điều kiện kích thích sự phát sinh phôi đã được thiết lập cho nhiều loài,
nhưng vẫn còn một số lượng lớn các loài chưa thể tạo phôi vô tính. Thậm chí ngay
trong cùng một loài, có kiểu gene dễ tạo phôi nhưng cũng có kiểu gene ngăn cản sự
tạo phôi. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sự ngăn cản tạo phôi có thể được giải
quyết bằng cách tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng của cây hoặc bằng cách chọn
lựa mẫu cấy thích hợp. Vì vậy, việc xác định các đặc tính di truyền có thể chỉ được
sử dụng để xác định vị trí và thời điểm biểu hiện khả năng phát sinh phôi. Do đó
khả năng phát sinh phôi chủ yếu được xác định thông qua chương trình phát triển
của thực vật cũng như những dấu hiệu của môi trường.
Phôi vô tính có thể phát triển trên tất cả các cơ quan của cây cà rốt hoặc cỏ linh
lăng mà có mang những kiểu gene nhất định quy định sự phát sinh phôi; từ đó, cho
thấy biên độ biểu hiện rộng của khả năng phát sinh phôi. Tuy nhiên, ở phần lớn các
loài thực vật, khả năng phát sinh phôi bị hạn chế ở những mô nhất định của kiểu
gene nói trên. Những thí nghiệm nuôi cấy mô cho thấy giữa các cơ quan khác nhau

của cây tồn tại một gradient phản ứng phát sinh phôi. Các mô có nguồn gốc từ phôi
thì có khả năng phát sinh phôi cao nhất và khả năng này giảm dần ở cọng dưới lá
mầm, cuống lá, lá và rễ [Neumann, 2000]. Nhưng điều thú vị là vẫn có thể được
phục hồi khả năng phát sinh phôi vô tính bằng con đường tạo mô sẹo trung gian từ
các tế bào sinh dưỡng đã mất đi tiềm năng này.
Rõ ràng, khả năng phát sinh phôi của tế bào thực vật không ngừng giảm trong
suốt quá trình phát triển cá thể và phụ thuộc vào loài. Ở thực vật một lá mầm, bao
gồm hầu hết các loài ngũ cốc quan trọng, khả năng phát sinh phôi hầu như chỉ giới
hạn ở các tế bào có nguồn gốc từ phôi hoặc mô phân sinh bao gồm phôi non, hạt,
gốc lá của Graminae, đỉnh chồi của Orchidaceae, vảy củ và chồi bên của Liliaceae.
Trong nuôi cấy in vitro, khả năng phát sinh phôi của những tế bào mô phân sinh này
có thể được duy trì nếu mẫu cấy được nuôi trên môi trường có bổ sung 2,4-D, tiếp
đó cho tạo mô sẹo. Cấy chuyền những tế bào mô sẹo có khả năng phát sinh phôi này
sang môi trường không có chất kích thích sinh trưởng hoặc môi trường có bổ sung
auxin với nồng độ thấp thì có thể đạt được một tỉ lệ phát sinh phôi vô tính cao.
Ngược với các tế bào mô phân sinh, các tế bào sinh dưỡng của cây một lá mầm
được biệt hóa sớm hơn và nhanh hơn, điều này làm mất khả năng phân chia và phát
sinh hình thái của chúng. Ở mặt này, cần lưu ý là sự điều hòa quá trình phát triển
chuyển tiếp từ giai đoạn còn non đến giai đoạn trưởng thành có thể khác nhau giữa
cây một lá mầm và hai lá mầm. Mặc dù lý do trực tiếp của việc sớm mất đi tính toàn


năng ở thực vật một lá mầm vẫn chưa được biết đến, nhưng người ta đã có thể liên
hệ giữa sự điều hòa nghiêm ngặt của quá trình tổng hợp này với quá trình chuyển
hóa của các chất điều hoà nội sinh, chẳng hạn như auxin.
Nhiều thí nghiệm đã được thực hiện để so sánh kiểu gene điều khiển sự phát
sinh phôi và kiểu gene ngăn cản sự phát sinh phôi nhằm chỉ ra những khác biệt
chính giữa chúng [Fehér et al., 2003]. Ở cỏ linh lăng (Medicago sativa), những kiểu
gene có quan hệ mật thiết được chọn lọc dựa trên khả năng phát sinh phôi của
chúng; các phản ứng của chúng với auxin được so sánh và những đặc điểm khác

nhau được ghi nhận; trong đó, những gene đáp ứng với auxin được kích thích hoặc
bị ức chế ở nồng độ auxin rất thấp để chống lại những kiểu gene ngăn cản sự phát
sinh phôi [Börge et al., 1990]. Ngoài ra, auxin còn có tác dụng ức chế sự ra rễ của
những mẫu cắt chồi sinh trưởng in vitro ở nồng độ thấp hơn nhiều [Börge et al.,
1990]. Mô sẹo của các kiểu gene không phát sinh phôi vẫn tiếp tục sinh trưởng
trong môi trường bổ sung 2,4-D có nồng độ tương đương với nồng độ ức chế sự
phân bào của những kiểu gene điều khiển sự phát sinh phôi. Các quan sát trên chỉ ra
những khác biệt đáng kể về tính nhạy cảm với auxin của hai kiểu gene này. Vai trò
quan trọng của các hormone biến dưỡng nội sinh (bị ảnh hưởng bởi tính di truyền,
các dấu hiệu sinh lý và môi trường) trong giai đoạn kích thích phát sinh phôi sinh
dưỡng đã được thừa nhận.
Những tế bào có khả năng phát sinh phôi có đặc điểm là nhân nằm ở vị trí
trung tâm, có những ống siêu nhỏ nổi bật ở gần nhân và những sợi nhỏ actin [Šamaj
et al., 2003]. Verdeil và cộng sự (2001), đã mô tả các tế bào phát sinh phôi ở cây
dừa có các đặc điểm rất rõ ràng: lõm sâu vào vỏ nhân, các thể lưới dictyosomes và
bộ máy golgi nhân lên có quan hệ trực tiếp với sự dày lên các vách tế bào. Ngoài ra,
chúng còn có một cấu trúc thành tế bào đặc biệt. Các dạng tế bào này vừa có nguồn
gốc từ các mô phân sinh (hoặc mô phát sinh phôi) vừa có thể được tạo ra từ những
tế bào có khoảng không bào lớn trong một số điều kiện thích hợp; chẳng hạn như
sau khi xử lý với 2,4-D. Tuy nhiên, một số loại hormone (ABA, cytokinin) hoặc
stress khác cũng có thể kích thích sự hình thành những kiểu tế bào có khả năng phát
sinh phôi.

Hình 1.2. Mô hình giả thuyết các sự kiện xảy ra trong quá trình phát sinh phôi vô tính
[Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007]
Hệ thống nuôi cấy tế bào trần của cỏ linh lăng cho phép tiến hành những
nghiên cứu chi tiết ở mức độ tế bào đơn và cả ở mức độ quần thể tế bào. Kết quả
cho thấy sự phát triển của những tế bào này phụ thuộc vào nồng độ 2,4-D: môi
trường có bổ sung 1 µM 2,4-D cho phép hình thành những tế bào có khoảng không
bào lớn (không có khả năng phát sinh phôi), trong khi môi trường có bổ sung 2,4-D

với nồng độ cao gấp 10 lần cho phép hình thành những tế bào nhỏ và dày đặc tế bào
chất (có khả năng phát sinh phôi) [Pasternak et al., 2002]. Ngoài ra, hệ thống này
còn được sử dụng để tiến hành so sánh giữa các kiểu gene có hoặc không có khả
năng phát sinh phôi [Bögre et al., 1990]. Kết quả so sánh giữa những tế bào có khả


năng phát sinh phôi và những tế bào không có khả năng phát sinh phôi cho thấy cả
2 kiểu gene trên không những thể hiện những khác biệt về đặc điểm hình thái mà
còn thể hiện những biến đổi trong quá trình sinh lý.
Gene đặc trưng nhất liên quan đến tiềm năng phát sinh phôi là gene mã hóa
cho enzyme SERK1, được Schmidt và cộng sự (1997) phát hiện lần đầu tiên ở cây
cà rốt. Tác giả này dụng promoter SERK để nối vào đoạn gene mã hóa cho enzyme
luciferase và tiến hành theo dõi tế bào bằng video, kết quả cho thấy tế bào đơn mà
có sự biểu hiện của SERK thì thực sự có thể phát triển thành phôi sinh dưỡng.
Ngoài ra, sự biểu hiện lệch vị trí gene AtSERK có thể làm cho sự hình thành phôi
sinh dưỡng diễn ra một cách dễ dàng hơn [Hecht et al., 2001]. Do đó, sự biểu hiện
của gene SERK được sử dụng như là một nhân tố đánh dấu khả năng sinh phôi. Ở
thực vật, AtSERK được biểu hiện lần đầu tiên trong quá trình phát sinh đại bào tử và
sau đó là trong các đại bào tử có chức năng, trong tất cả các tế bào của túi phôi cho
đến khi thụ phấn và trong túi phôi cho tới giai đoạn hình tim. Sau giai đoạn hình tim
này, sự biểu hiện của gene không còn được tìm thấy ở bất kì bộ phận nào của hạt
đang phát triển. Tuy nhiên, gene này có sự biểu hiện thấp ở những mô mạch trưởng
thành. Sự biểu hiện gene AtSERK1 cũng được quan sát ở đỉnh chồi, mô phân sinh
và lá mầm của hạt cây Arabidopsis nuôi cấy trong môi trường có bổ sung auxin
trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy mô sẹo phát sinh phôi [Hecht et al.,
2001]. Có ý kiến cho rằng protein SERK đơn thuần chỉ là một marker phát sinh
hình thái tổng quát chứ không hẳn là một marker phát sinh phôi.
1.1.3. Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính
Có nhiều hệ thống nuôi cấy mô sử dụng 2,4-D như là một chất cảm ứng có
hiệu quả trong quá trình phát sinh phôi vô tính. Hiện nay, thừa nhận quan điểm rằng

việc xác định trạng thái của tế bào xảy ra trong môi trường có 2,4-D, nhưng trong
cùng thời điểm đó thì sự phát triển lại bị ức chế. Việc 2,4-D chỉ là một điểm nút
chuyển đổi trạng thái của tế bào thì đã được nhấn mạnh bằng các thí nghiệm sử
dụng một hệ thống đặc biệt (nuôi cấy huyền phù các vi mô sẹo) nuôi cấy các tế bào
Medicago trong môi trường có bổ sung một loại auxin tổng hợp khác là NAA
[Dudits et al., 1991]. Nếu cấy chuyền những tế bào này sang môi trường không có
chất điều hòa sinh trưởng thì chúng sẽ tạo rễ với tần số cao. Nếu những tế bào này
được xử lý 2,4-D ở nồng độ cao (100 M) trong một khoảng thời gian ngắn
(khoảng vài phút) rồi cấy chuyền sang môi trường không có chất điều hòa tăng
trưởng thì chúng sẽ phát triển thành phôi vô tính. Tuy nhiên, phải 2-3 tuần sau khi
xử lý thì mới có thể quan sát được những khối phôi đầu tiên trên bề mặt của mô sẹo.
Dựa trên cơ sở những thí nghiệm này, hiệu quả phát sinh phôi cao đạt được khi nuôi
cấy các mảnh cấy lá mầm cây cà rốt trên môi trường bổ sung 450 M 2,4-D trong
thời gian 2 giờ [Kitamiya et al., 2000].
Thực ra, những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng 2,4-D rất cần thiết để khởi sự
chương trình phát sinh phôi. Việc cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường không có
2,4-D có vai trò quan trọng trong việc thiết lập tính phân cực của tế bào, đây được
xem là một trong những sự kiện đầu tiên của quá trình phát triển phôi [Fehér et al.,
2003].
1.1.4. Trạng thái của các tế bào phát sinh phôi vô tính

Hình 1.3. Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển của phôi.
[Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007]


Sự khởi đầu quá trình phát triển phát sinh phôi ở các tế bào đã biệt hóa đòi hỏi
một quá trình tái chương trình hóa tế bào hoàn chỉnh. Quá trình này đi kèm với
những thay đổi hoàn toàn về mặt hình thái và sinh lý; trong đó, việc tái chương trình
hóa kiểu biểu hiện tổng thể của các gene là hết sức quan trọng. Trong những năm
gần đây, việc kiểm soát nghiêm ngặt sự cải biến các nhiễm sắc thể phản ứng lại các

tín hiệu môi trường và tín hiệu phát triển nhằm xác định chính xác vị trí và thời
điểm biểu hiện của các gene này đã được chấp nhận rộng rãi [Li et al., 2002]. Mức
độ tổ chức cao của nhiễm sắc thể sẽ tạo ra tính ổn định về kiểu biểu hiện của những
gene xác định vùng nào của bộ gene là im lặng hay hoạt động trong tế bào hoặc
trong giai đoạn phát triển đang khảo sát. Các bằng chứng thực nghiệm đã chứng tỏ
được tầm quan trọng của cấu trúc nhiễm sắc thể trong việc điều hòa sự chuyển vị
sinh phôi. Ví dụ, việc bất hoạt một số gene trong bộ nhiễm sắc thể có vai trò quan
trọng trong việc quyết định sự sinh trưởng của phôi và nội nhũ của Arabidopsis.
Người ta đã xác định được những gene đột biến mã hóa cho những protein tương tự
như những protein có chức năng bất hoạt nhiễm sắc thể (nhóm Polycomb trong suốt
quá trình phát triển của ruồi giấm) ở Arabidopsis. Kết quả của những đột biến này
là sự hình thành hạt hoặc nội nhũ mà không lệ thuộc vào quá trình thụ phấn. Dạng
đột biến medea gây ra sự thiếu hụt protein trong cùng một con đường điều hòa. Các
kết quả nghiên cứu cho thấy chương trình phát sinh phôi bị ức chế bởi các gene im
lặng trong nhiễm sắc thể và sau đó được kích hoạt nhằm đáp ứng với sự thụ phấn.
Một dạng đột biến nữa ở Arabidopsis, pickle (pkl), có kiểu hình được xác định
dựa trên sự biểu hiện của các marker phôi chuyên biệt trong giai đoạn hậu phát sinh
phôi và quá trình tái sinh tự phát của các phôi vô tính ở rễ. Sản phẩm của gene pkl
được mô tả như là một nhân tố tái tổ chức nhiễm sắc thể mà có thể ức chế sự biểu
hiện của những gene liên quan đến sự phát sinh phôi cũng như điều hòa sự chuyển
vị phát triển từ trạng thái phát sinh phôi sang trạng thái sinh dưỡng. Ngoài việc tổ
chức nhiễm sắc thể, sự điều hòa trực tiếp của các gene liên quan đến các nhân tố
phiên mã đặc hiệu. Cho tới nay, nhiều nhân tố phiên mã (leafy cotyledon 1 và 2,
wuschell, baby woom) đã được xác định là có liên quan đến sự phát sinh phôi hợp tử
và gây ra sự lệch vị trí trong quá trình hình thành phôi nếu chúng được biểu hiện
trong mô sinh dưỡng. Mối liên hệ giữa sự tái tổ chức nhiễm sắc thể và những nhân
tố phiên mã này đã được chứng minh bằng cách làm giảm tác dụng ức chế biểu hiện
của lec1 trong đột biến pickle, và điều này đã dẫn tới sự phát triển phôi ở rễ. Pickle
được nhận định là nhân tố ức chế tế bào phát sinh phôi trong tất cả các mô sinh
dưỡng, nhưng người ta cũng đã chứng minh được rằng có thể chọn lọc được những

chức năng không ức chế sự phát sinh phôi trong những đột biến pickle.
Dựa vào những bằng chứng trên, chúng ta có thể đưa ra giả thiết rằng trong
suốt quá trình cảm ứng phát sinh phôi vô tính, sự tái tổ chức của nhiễm sắc thể đã
làm giảm chương trình phát sinh phôi, mặt khác bị ức chế bởi các cơ chế bất hoạt
nhiễm sắc thể trong các tế bào sinh dưỡng thực vật. Những protein có chứa vùng
nhiễm sắc thể có cấu trúc tương tự Polycomb đã được tìm thấy trong quá trình phát
sinh phôi hợp tử và phôi vô tính của cà rốt. Ngoài ra, sự biểu hiện của lec1 trong
suốt quá trình phát sinh phôi vô tính đã được chứng minh ở cà rốt và cỏ linh lăng
[Yazawa et al., 2004]. Cụ thể, với cà rốt, gene c-lec1 xuất hiện trong các mẫu cấy
phôi và gene này biểu hiện rõ chỉ 1 ngày sau khi cấy chuyền sang môi trường không
có 2,4-D ; trong khi đó, ở cỏ linh lăng, khi gây shock mẫu cấy bằng 2,4-D trong 1
giờ sau nhiều tuần nuôi cấy trong môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng,
sự biểu hiện của ms-lec1 chỉ gia tăng vào giai đoạn biệt hóa phôi (3 tuần sau khi
cảm ứng) [Fehér et al., 2003]. Nghiên cứu này đã củng cố cho giả thuyết rằng ở hệ
thống nuôi cấy phát sinh phôi cây cà rốt thì quá trình phát sinh phôi diễn ra trước
khi mẫu cấy được cấy chuyền sang môi trường không có 2,4-D.
1.1.5. Sự phát sinh phôi vô tính
Sự phát sinh phôi vô tính được định nghĩa là một quá trình mà trong đó cấu
trúc lưỡng cực giống phôi hữu tính phát triển từ một tế bào sinh dưỡng và không có
liên kết mao mạch với tế bào gốc ban đầu. Sự phát sinh phôi vô tính xảy ra thông
qua một số giai đoạn tương tự như phôi hữu tính. Phôi vô tính có thể biệt hóa trực
tiếp từ mẫu cấy không cần đi qua giai đoạn mô sẹo hoặc gián tiếp thông qua giai


đoạn tạo mô sẹo trung gian. Mẫu cấy trong phát sinh phôi trực tiếp thường là các vi
bào tử, noãn bào, phôi hữu tính hoặc phôi vô tính và cây con.
Khác biệt giữa phát sinh phôi trực tiếp và gián tiếp vẫn chưa được hiểu rõ.
Theo những giả thuyết trước đây, phát sinh trực tiếp xảy ra từ các tế bào có nguồn
gốc từ phôi. Ngược lại, phát sinh gián tiếp lại xảy ra ở các tế bào chưa biệt hóa và
đầu tiên sẽ tạo thành các mô sẹo không biệt hóa. Tuy nhiên, trong thực tế mô sẹo

được tạo thành có thể là những mô sẹo có khả năng phát sinh phôi (embryogenic
callus) hoặc không có khả năng phát sinh phôi (non-embryogenic callus). Thông
thường dễ phân biệt giữa embryogenic callus và non-embryogenic callus dựa vào
hình thái và màu sắc của chúng. Embryogenic callus bao gồm các cụm tiền phôi
(PEM). Hiện tại, người ta chưa biết liệu các PEM này có phải là phôi hay không, có
phải do chúng đi chệch con đường phát triển phôi và chỉ tăng sinh khi đáp ứng lại
sự hiện diện của các chất điều hòa sinh trưởng?
Phát sinh phôi vô tính là một quá trình gồm nhiều bước khởi đầu bằng PEM,
theo sau đó là sự hình thành phôi vô tính, phôi trưởng thành, phôi ở giai đoạn miên
trạng và cuối cùng là giai đoạn tái sinh cây. Tóm lại, các giai đoạn phát triển phôi
vô tính đều phải trải qua các giai đoạn như minh họa ở Hình 1.3. Để theo đúng con
đường này, một số các biện pháp lý hóa quan trọng phải được xử lý đúng thời điểm.
Mặc dù có những tiến bộ đáng kể trong việc tìm kiếm, khám phá các hướng xử lý
mới nhưng một số cách tiếp cận trong việc cải thiện khả năng trưởng thành của phôi
nhằm tăng hiệu quả phát triển phôi lại gây ra những ảnh hưởng xấu đến chất lượng
phôi, từ đó làm giảm khả năng nảy mầm và tăng trưởng ex vitro của thực vật từ phôi
vô tính. Do vậy, tăng trưởng ex vitro của thực vật chịu ảnh hưởng của toàn bộ quá
trình nuôi cấy và biện pháp xử lý trong giai đoạn in vitro.
Tóm lại, có thể tóm tắt sự tái sinh thực vật thông qua con đường phát sinh
phôi vô tính bao gồm năm giai đoạn:
 Nuôi cấy tạo phôi bằng cách chọn lựa mẫu cấy sơ cấp cấy vào môi trường bổ
sung chất điều hòa sinh trưởng, chủ yếu là auxin (đôi khi là cytokinin).
 Tăng sinh của quá trình nuôi cấy phôi trên môi trường rắn hoặc lỏng có bổ
sung các chất điều hòa sinh trưởng tương tự như trên.
 Giai đoạn trước khi trưởng thành của phôi trong môi trường không có chất
điều hòa sinh trưởng, để ngăn sự tăng sinh và kích thích sự tạo phôi và phát
triển sớm.
 Giai đoạn phôi trưởng thành bằng cách nuôi cấy phôi trong môi trường bổ
sung ABA và/hoặc giảm áp lực thẩm thấu.
 Sự phát triển của cây trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng.

1.1.6. Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính
Quá trình hình thành phôi vô tính đã mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn quan
trọng và có tính chất thương mại rất lớn, đặc biệt là trong vi nhân giống in vitro.
Trên lý thuyết, từ một mẫu mô được nuôi cấy có thể sản xuất ra vô số tế bào phôi.
Tốc độ nhân giống từ phôi cao hơn nhiều so với nhân giống từ mô phân sinh. Ngoài
ra, số lượng lớn của phôi chính là một nguồn nguyên liệu đáng kể phục vụ cho
những ứng dụng thực tiễn quan trọng khác như sản xuất hạt nhân tạo, cải thiện chất
lượng cây trồng (là nguyên liệu cho chọn lọc tế bào, biến nạp gene, lai soma, tạo
thành những cây đa bội), bảo quản chất mầm, loại trừ virus, sản xuất các chất biến
dưỡng in vitro và sự thành lập khuẩn căn in vitro.
1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH
1.2.1. Chất điều hòa sinh trưởng
Nhằm khôi phục khả năng phát sinh phôi vô tính từ các tế bào đã suy giảm
hoặc mất đi khả năng này, các chất điều hòa sinh trưởng phải được sử dụng trong
hầu hết các hệ thống nuôi cấy phôi vô tính. Trong đó, 2,4-D là loại auxin tổng hợp
được sử dụng phổ biến nhất. Những auxin khác như IBA và picloram cũng được sử
dụng; thậm chí cả các auxin yếu như NAA và IAA cũng được dùng trong một vài
hệ thống nuôi cấy. Auxin được dùng cho cảm ứng hình thành tế bào phát triển phôi,
có lẽ do hoạt hóa phân hóa gene khởi đầu và cũng thúc đẩy tăng quần thể tế bào qua
phân bào liên tiếp; đồng thời ngăn cản sinh trưởng và biệt hóa tế bào thành các


phôi. Trong trường hợp mẫu cấy có chứa các tế bào phát triển phôi thì môi trường
nuôi cấy có thể không cần đến auxin.
Ngoài auxin, các cytokinin cũng được dùng cho cảm ứng phát sinh ở các loài
thực vật hai lá mầm. Loại cytokinin được sử dụng nhiều trong môi trường nuôi cấy
là BAP, nhưng các cytokinin khác như Kin, zeatin và TDZ cũng cho kết quả tốt tùy
thuộc vào loại thực vật. Trong nuôi cấy phôi, nồng độ của các chất điều hòa sinh
trưởng là rất quan trọng đối với phản ứng sinh trưởng tối ưu của mẫu cấy. Khi nồng
độ quá thấp sẽ không kích thích sinh trưởng, ngược lại hàm lượng quá cao có thể

gây độc cho mẫu…
Ví dụ điển hình là về sự phát triển của phôi vô tính cà rốt trong nuôi cấy trải
qua một quá trình gồm hai giai đoạn, mỗi giai đoạn cần có môi trường riêng. Các
mô sẹo được nuôi cấy khởi đầu và nhân sinh khối trên môi trường giàu auxin và
thường được sử dụng 2,4-D ở nồng độ 0,5-1 mg/l. Trên môi trường này, sự phân
hóa mô sẹo xảy ra tại các nhóm tế bào phân sinh được gọi là “các cụm phát triển
phôi” (EC). Nếu các EC được chuyển sang môi trường có nồng độ auxin rất thấp
(0,01-0,1 mg/l) hoặc không có auxin, chúng sẽ phát triển thành phôi trưởng thành.
Sự có mặt của auxin trong môi trường tăng sinh là cần thiết cho mẫu có thể phát
triển thành phôi khi chuyển sang môi trường phù hợp. Các môi trường tăng sinh có
thể coi là môi trường cảm ứng đối với sự hình thành phôi vô tính. Những mẫu duy
trì liên tục trong môi trường không có auxin sẽ không hình thành phôi.
Ở cây cà phê Coffea arabica, các phôi vô tính chỉ phát triển khi mô sẹo hình
thành trên môi trường chứa 2,4-D được chuyển sang môi trường không có loại
hormone này. Đối với một số loài thực vật, những auxin khác lại sử dụng hiệu quả
hơn 2,4-D, như trong trường hợp của cây bí ngô, NAA và IBA được dùng cho phát
sinh phôi. Trong nuôi cấy phôi tâm cây Vitus, sự hình thành phôi xảy ra khi có mặt
của NAA và BAP [Mullin và Schlegel, 1976]. Các mô sẹo của phôi tâm cây Citrus
sinensis thuộc họ Cam chanh yêu cầu có IAA và Kin cho sinh trưởng và biệt hóa
phôi. Sự cấy chuyền lặp lại của mô sẹo đã làm giảm dần khả năng phát sinh phôi và
sau khoảng hai năm các dòng mô có biểu hiện tự dưỡng hormone. Ở những dòng