cô lập và thử nghiệm khả năng ức chế enzyme α glucosidase của các hợp chất flavonoid từ cao chiết ethyl acetate của lá cây cóc đỏ lumnitzera littorea

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.19 MB, 49 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁC NHẬN

Tơi tên là: Nguyễn Thị Thủy

Ngày sinh: 18/04/1998 Nơi sinh: Ninh Thuận Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã sinh viên: 1653010301

Tơi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thơng tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

Nguyễn Thị Thủy

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Giảng viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Lệ Thủy

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thủy Lớp DH16YD01 Ngày sinh: 18/04/1998 Nơi sinh: Ninh Thuận

Tên đề tài: CÔ LẬP VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME

α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID TỪ CAO CHIẾT ETHYL

ACETATE CỦA LÁ CÂY CÓC ĐỎ (LUMNITZERA LITTOREA)

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên: Nguyễn Thị Thủy được

bảo vệ khóa luận trước Hội đồng: ...

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Qua sự hướng dẫn và truyền đạt tận tình của quý thầy cô em đã hồn thành xong khóa luận tốt nghiệp của mình. Em xin dành lời cảm ơn sâu sắc và chân thành của mình đến cơ ThS. Nguyễn Thị Lệ Thủy – là giảng viên khoa Công nghệ sinh học, chuyên ngành Công nghệ thực phẩm và cũng là giảng viên hướng dẫn em thực hiện đề tài thực tập. Cô đã luôn dành thời gian để đồng hành cùng em, giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình để em hồn thành tốt đề tài của mình. Khơng những chỉ dạy những kiến thức chun ngành mà Cơ cịn chia sẻ cho em những kinh nghiệm làm việc, dạy cách làm việc như thế nào cho đạt hiệu quả cao. Em xin chúc Cô luôn khỏe mạnh, hạnh phúc và đạt được nhiều thành công trong cuộc sống.

Và nhân dịp này em muốn gửi lời cảm ơn đến bạn bè. Những người đã luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên mỗi khi em gặp khó khăn.

Cuối cùng em xin gửi lời tri ân sâu sắc đến ba mẹ. Người đã sinh thành, nuôi nấng và dạy dỗ em nên người, đã lo lắng cho em để em có cơ hội học hỏi và tiếp xúc với cuộc sống.

Em xin chân thành cảm ơn!

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

1.1.5. Các nghiên cứu về thành phần hóa học ... 5

1.1.6. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học ... 9

1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME α – GLUCOSIDASE... 10

1.2.1. Cấu trúc enzyme α-glucosidase ... 10

1.2.2. Cơ chế hoạt động của enzyme α – glucosidase ... 10

1.2.3. Tác nhân ức chế enzyme α – glucosidase ... 11

1.2.4. Chất ức chế enzyme ... 11

2.1. VẬT LIỆU ... 13

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ... 13

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ... 13

2.1.3. Hóa chất và thiết bị ... 13

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 14

2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu ... 14

2.2.2. Phương pháp ngâm dầm ... 14

2.2.3. Phương pháp chiết pha rắn ... 14

2.2.4. Phương pháp cô lập các hợp chất ... 14

2.2.5. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ... 15

2.2.6. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme α- glucosidase ... 15

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ... 17

2.3.1. Quy trình điều chế cao tổng từ lá cóc đỏ ... 17

2.3.2. Quy trình cơ lập hợp chất tự nhiên từ cao tổng ... 18

2.3.3. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase ... 20

3.1. KẾT QUẢ CƠ LẬP HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY CĨC ĐỎ ... 21

3.1.1. Biện luận cấu trúc của hợp chất TT01 ... 21

3.1.2. Biện luận cấu trúc của hợp chất TT02 ... 23

3.1.3. Biện luận cấu trúc của hợp chất TT03 ... 25

3.2. KẾT QUẢ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE ... 27

3.2.1. Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ cao chiết ... 27

3.2.2. Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ các hợp chất flavonoid cô lập được ... 28

4.1. KẾT LUẬN ... 30

4.1.1. Cấu trúc của các hợp chất cơ lập được ... 30

4.1.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ... 31

4.2. KIẾN NGHỊ... 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 30PHỤ LỤC ... I

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1. 1. Cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea) ... 4

Hình 1. 2. Cây cóc đỏ (Lumnitzera racemosa) ... 4

Hình 1. 3. Cấu trúc khơng gian của enzyme α-glucosidase ... 10

Hình 2. 1. Phản ứng xúc tác enzyme α- glucosidase………...15

Sơ đồ 2. 1. Quy trình điều chế cao tổng từ lá cóc đỏ ... 17

Sơ đồ 2. 2. Quy trình điều chế cao phân đoạn và cơ lập hợp chất tự nhiên ... 18

Sơ đồ 2. 3. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất ... 20

DANH MỤC BẢNG Bảng 3. 1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TT01 và afzelin ... 22

Bảng 3. 2: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TT02 và naringenin ... 24

Bảng 3. 3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TT03 và taxifolin ... 26

Bảng 3. 4: Kết quả khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết ... 27

Bảng 3. 5: Kết quả khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất cô lập ... 28

Bảng 4. 1: Giá trị IC50 của các hợp chất được cô lập từ lá cây cóc đỏ... ... 31

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe con người được đặt lên hàng đầu. Từ thời xa xưa, ông cha ta đã biết tìm kiếm và sử dụng cây cỏ trong tự nhiên làm thức ăn và thuốc để chữa bệnh. Những hiểu biết về cây cỏ có lợi hay độc hại đã được truyền miệng và ghi chép đúc kết thành kinh nghiệm qua nhiều thế hệ nối tiếp nhau. Xu hướng hiện nay là xác định hoạt tính sinh học của từng thành phần trong cây dược liệu, từ đó có thể loại bỏ thành phần có độc tính giữ lại thành phần có hoạt tính mong muốn.

Với điều kiện sống khắc nghiệt, rừng ngập mặn Cần Giờ - TP.HCM có mức độ đa dạng sinh học phong phú do các loài thực vật ở đây phải có những q trình trao đổi chất đặc biệt để thích nghi với mơi trường sống. Do đó, các cây trong rừng ngập mặn có chứa các hợp chất giàu hoạt tính sinh học như hợp chất phorbol ester từ lá và thân của cây Giá

(Excoecaria agallocha L.) có tác dụng kháng HIV; các polysaccharide từ lá của cây Vẹt

trụ ((Bruguiera cylindrica (L.) Blume), cây Giá (Excoecaria agallocha L.), cây Đước đôi

(Rhizophora apiculata Bl.), cây Đước xanh (Rhizophora mucronata Poir.), cây Sam biển (Sesuvium portulacastrum L.) có hoạt tính kháng HIV; các hợp chất benzoxazolin mà dẫn

xuất đường ribose của nó cho thấy có hoạt tính kháng ung thư và kháng virus được cơ lập

từ cây Ơ rơ (Acanthus illicifolius L.); hai hợp chất methylembelin và ethylembelin cô lập từ thân và cành của cây Sú (Aegiceras corniculatum) có hoạt tính ức

5-O-chế một số dịng tế bào ung thư như HL-60, Bel 7402, Hela, U937. Các triterpenoid từ cây

Đước đỏ (Rhizophora mangle) có khả năng kiểm soát bệnh đái tháo đường[8]

. Đặc biệt,

nhiều nhà khoa học đã chứng minh cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa) chứa thành phần

hóa học đa dạng và giàu hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, bảo vệ gan, hạ đường huyết,...[14, 20]. Trong khi đó, cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea) là một lồi cùng chi

với cây cóc trắng lại chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học.

Mặt khác hiện nay, tình trạng bệnh đái tháo đường cũng đang trở thành căn bệnh phổ biến và đang gia tăng nhanh trên giới ở cả những nước phát triển và những nước đang phát triển. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) về bệnh đái tháo đường thì có hơn

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

năm triệu người mắc bệnh tiểu đường tại Việt Nam, cao nhất Đông Nam Á, nhưng 65% bệnh nhân mắc bệnh nhưng khơng được phát hiện. Hiện nay có nhiều cách điều trị bệnh,

trong đó có ức chế enzyme α-glucosidase. Một enzyme có vai trị trong chuyển hóa các

polysaccharide thành đường đơn.

Xuất phát từ cơ sở khoa học như trên, đề tài : “Cô lập và thử nghiệm khả năng ức

chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất flavonoid từ cao chiết ethyl acetate của lá cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea)” được đề xuất.

• Mục tiêu nghiên cứu:

- Cô lập một số hợp chất flavonoid của cao chiết ethylacetate từ lá cây cóc đỏ

(Lumnitzera littorea).

- Thử nghiệm khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao tổng, cao phân đoạn và các hợp chất flavonoid cô lập được từ lá cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea).

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI LUMNITZERA

1.1.1. Phân loại

Chi Lumnitzera là một chi sống trong rừng ngập mặn. Theo tác giả Phạm Hoàng

Hộ[2], ở Việt Nam chi Lumnitzera gồm hai lồi là cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và cóc trắng (Lumnitzera racemosa).

- Họ: Bàng (Combretaceae)

- Chi: Lumnitzera

- Lồi: cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và cóc trắng (Lumnitzera racemosa)

1.1.2. Mơ tả thực vật

Hai cây cóc đỏ (Luminitzera littorea) và cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa) có

đặc điểm giống nhau, chỉ khác ở màu cánh hoa.

Cây thân gỗ, cao 10–20 m, vỏ màu nâu thẫm, có vết nứt, mặt trong vỏ màu nâu đỏ, phần giác màu vàng, lõi màu nâu thẫm, cành nhánh hình khúc khuỷu, vuông, khi non màu đỏ nhạt, có nhiều mặt do những vết sẹo của lá rụng để lại.[8]

Lá mọc cách, tập trung ở đầu cành, phiến lá hình trứng ngược, mặt trên lá bóng, dài 2–8 cm, rộng 1–2,5 cm, đỉnh trịn có khía tai bèo, gốc hình nêm, ít gân, cuống đài 0,5–1 cm, lá tích nhiều muối.[13]

Rễ có khả năng đâm sâu vào lớp mùn dày. Rễ khí thường khơng phát triển thành hệ rễ trên mặt đất như các cây khác. Tuy nhiên trong mơi trường ẩm thấp, rễ khí có thể phát triển thành hệ rễ vòng trên mặt đất dạng mẫu rễ nhỏ.

Cụm hoa hình chum ở đầu cành, dài 1,5–3 cm. Hoa có cuống ngắn, đài 1,5–2 mm. Đài hình ống tạo thành đĩa chứa mật. Tràng 5 thùy, hình bầu dục thn, dài 5–6 mm, đứng, màu đỏ, rụng. Một cặp bao hoa dạng vảy đính vào ống đài. Nhị 5–10 cm, dài gấp đôi cánh hoa, nhụy hơi nhô ra khi hoa nở, vòi nhụy và đài bền. Bầu lơ 5 lá nỗn hợp, nỗn nhỏ 3–5 cm, đính nỗn treo. Hoa thụ phấn nhờ chim đặc biệt là chim hút mật và những loài ăn mật. Ong mật và ong vò vẽ cũng tham gia vào sự thụ phấn của hoa.[13]

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Quả hạch, 1 hạt, hình trứng dài 3–4 cm, với nhiều sự cương mô của vỏ quả nằm rải rác, vỏ quả trong cứng. Quả non màu nâu đỏ, quả chín rụng, mùa ra hoa vào tháng 6 đến tháng 8, mùa quả chín vào tháng 8 đến tháng 10.

1.1.3. Phân bố

Cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa) là loài

cây ngập mặn, phân bố ở Châu Á và Châu Úc thuộc vùng nhiệt đới [13]. Ở Việt Nam, hai loài cây này phân bố ở các rừng ngập mặn cửa đông, ven biển nơi chỉ ngập triều cao hoặc ít ngập mặn như Cần Giờ, Cà Mau, Phú Quốc,... Trước năm 2001, Cóc đỏ đã bị nhiều người dân khai thác rất nhiều. Vì thân cây cóc đỏ khi già thường bị rỗng hoặc mối ăn, nên trước khi chặt cây, người ta thường đục lỗ trên thân cây để kiểm tra. Nhiều cây cóc đỏ già nhưng không bị chặt, nhưng cũng bị chết do các vết đục quá sâu. Sau khi Vườn Quốc Gia Phú Quốc được thành lập 2011, công tác bảo vệ rừng đã thực hiện khá tốt, phần nào ngăn chặn được việc khai thác cây cóc đỏ tại Phú Quốc. Hiện nay, tại Phú Quốc đang tiến hành một số dự án ươm và trồng cây cóc đỏ để nhân giống phát triển loài cây này. Điều kiện thiên nhiên của Phú Quốc là mơi trường rất phù hợp với cây cóc đỏ.

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

địa phương dùng làm công cụ lao động như cán cuốc [3]

,... Ngoài ra, nếu loài cây này được đem vào hầm than sẽ cho nhiệt cao và chưa ít NaCl hơn nên khơng làm hư máy móc. Chiết xuất từ lá dùng để chữa nấm vòm họng ở trẻ con. Lá còn được sử dụng như một phương thuốc để chữa bệnh tiêu chảy ở xứ nóng, bệnh viêm ruột, loét miệng.

1.1.5. Các nghiên cứu về thành phần hóa học

1.1.5.1. Cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa)

Năm 1980, Majumdar và Patra[15]

từ lá và vỏ cây của Lumnitzera racemosa đã

phân lập được một số hợp chất như triacontanol (1), taraxerol (2), -amyrin (3), betulin (4), -sitosterol (5) và friedelin (6)

Năm 1993, Lin T. C. và cộng sự[13]

đã phân lập được 11 hợp chất tannin từ lá cây

Lumnitzera racemosa gồm có castalagin (7); corilagin (8); chebulagic acid (9); acid

chebulinic (10); acid neochebulinic (11); 2,3-di-O-galloyl-D-glucopyranose (12);

1,2,3,6-tetra-O-galloyl-D-glucopyranose (13); 2,3,4,6-O-galloyl-D-glucopyranose (14);

1,2,3,4,6-penta-O-galloyl--D-glucopyranose (15); 2,3-(S)-HHDP-D-glucose (16) và punicalagin (17).

Cũng trong năm này, tác giả Connolly và cộng sự, từ lá và thân cây đã cô lập được

10 hợp chất bao gồm 2-methyl-tridecylbenzene (18),

1,3-dihydroxy-5-undecylbenzene (19), ergosta-7,22-dien-3β-ol (20), emodin (21), kaempferol (22),

quercetin (23), quercitrin (24), isoquercitrin (25), (-)-epigallocatechin (26), và acid gallic (27).

Năm 2015, Nguyễn Phương Thảo và cộng sự[24]

đã cô lập được 36 hợp chất từ lá của cây cóc trắng thu hái tại vườn quốc gia Xuân Thủy, Nam Định, Việt Nam bao gồm: 1,5,6-trihydroxy-3-methoxyxanthone (28), 5,6-dihydroxy-2,4-dimethoxyxanthone (29),

perforaphenonoside A (30), acetylannulatophenonoside (31),

(6S,9R)-6-hydroxy-3-oxo-α-ionol 9-O-β-D-glucopyranoside (32), (6S,9R)-9-hydroxy-4,7-megastigmadien-3-one

9-O-(β-D-apiofuranosyl-(1′′→6′)-β-D-glucopyranoside) (33), (6S,9R)-vomifoliol

9-O-β-apiofuranosyl-(1′′→6′)-O-β-D-glucopyranoside (34), (+)-pinoresinol (35), polystachyol

(36), (+)-lyoniresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside (37) , (–)-lyoniresinol 3α-O-β-D

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

-glucopyranoside (38), 1,6-di-O-p-coumaroyl-β-D-glycopyranoside (39), alangilignoside C

-galactopyranosyl-sn-glycerol (50), methyl gallate (51), ipuranol (52), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (53),

ginsenoside Re (54), ginsenoside Rg1 (55), 20(29)lupen-3-ol (56), hederagenin arabinopyranoside (57), acid tormentic (58), kaji-ichigoside F1 (59), phenylmethane α-L-

3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (60) và sigmatsterol (61).

1.1.5.2. Cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea)

Năm 2017, Phạm Thị Huyền và cộng sự đã cô lập được 11 hợp chất từ lá và cành của cây Cóc đỏ bao gồm: 1 hợp chất lipid (1,3-dihydroxy-2-methyl-5-tridecylbenzene

(18); 2 hợp chất flavonoid gồm: quercetin (23) và astragalin (62), 2 hợp chất hexitol: acetyl-D-mannitol (63) và D-mannitol (64); β-sitosterol (5) và stigmasterol (61).

1-CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP TỪ CHI LUMNITZERA

Lignan

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Steroid

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Flavonoid

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Các hợp chất khác

1.1.6. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

1.1.6.1. Cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa)

Năm 2013, Trần Mỹ Linh [5]

và cộng sự đã chứng minh hoạt tính ức chế nấm và vi

khuẩn gây bệnh của ba loại thực vật ngập mặn Aegiceras corniculatum, Avicennia

marina và Lumnitzera racemosa tại vườn quốc gia Xuân Thủy với độ dịch chiết từ 10 –

100 mg/ml.

Năm 2010, Lisette D.[16]

và cộng sự đã chứng minh cao thô ethanol và cao butanol từ cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa Willd.) có khả năng diệt khuẩn, trong đó

n-myricetin hoạt động mạnh nhất so với các flavonoid khác (MIC–1,5 µg/ml), có khả năng

kháng Pseudomonas aeruginosa (MIC–6 µg/ml).

Năm 2011, Sundaram R. và Murugesan G.[22]

đã chứng minh cao chiết ethanol của

lá cây Lumnitzera racemosa có khả năng bảo vệ chức năng gan in vitro khi thử nghiệm

trên chuột và có khả năng đánh bắt một số gốc tự do như DPPH•, HRSA•, NO•, FRAP•, LPO•, SOD•.

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

1.1.6.2. Cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea)

Năm 2011, Shahbudin S.[20]

và cộng sự đã chứng minh hoạt tính n-hexane từ lá cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea) có khả năng kháng khuẩn. Khả năng ức chế sự tăng trưởng

của vi khuẩn tại nồng độ 0.04 mg/ml.

1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME α – GLUCOSIDASE 1.2.1. Cấu trúc enzyme α-glucosidase

Enzyme α-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase, glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase- glucoamylase, nitrophenyl α-D-

glucosidase, transglucosidase, α- glucosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase ( nhóm enzyme xúc tác

α-các phản ứng thủy phân) [2].

Cấu trúc khơng gian của enzyme α-glucosidase được trình bày theo hình 1.3

Hình 1. 3: Cấu trúc khơng gian của enzyme α-glucosidase

(Nguồn: en.wikipedia.org)

1.2.2. Cơ chế hoạt động của enzyme α – glucosidase

Carbohydrate chứa trong thức ăn là nguồn cung cấp chất đường cho cơ thể. Sau khi vào cơ thể, những carbohydrat được thủy phân thành những phân tử đường đơn bởi những enzyme trong ruột non và các phân tử đường này được tỏa ra nuôi các tế bào cơ

thể. Tiến trình phân hóa này địi hỏi tụy tạng phải tiết ra α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrate lớn thành oligosaccharide, màng tế bào ruột non lại tiết ra α-

glucosidase để tiếp tục phân hóa các oligosaccharide thành các phân tử đường đơn rồi

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

mới thẩm thấu vào máu. Chức năng chính của enzyme này là xúc tác cho việc cắt đứt liên

kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất để giải phóng ra α-D-glucose. Bằng cách kiềm chế sự

hoạt động của enzyme α-glucosidase, có thể làm giảm sự thủy giải của carbohydrate và

làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu.

1.2.3. Tác nhân ức chế enzyme α – glucosidase

Việc tìm kiếm các hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase có ý nghĩa rất lớn trong

các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm…Đã có rất nhiều hợp chất được tìm thấy trong

tự nhiên hoặc tổng hợp có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase. Tuy nhiên, những tác nhân ức chế enzyme α-glucosidase hiện nay thường gây nhiều phản ứng phụ.Vì vậy, việc tìm kiếm các chất có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase vẫn đang được sự quan tâm

của các nhà khoa học trên thế giới.

1.2.4. Chất ức chế enzyme

Chất ức chế enzyme là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác. Hoạt động của một enzyme có thể giết chết một mầm bệnh hoặc điều chỉnh lại sự không cân bằng trong chuyển hóa. Có nhiều loại thuốc ức chế enzyme, chúng cũng được sử dụng như là chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu. Không phải tất cả các phân tử liên kết với enzyme đều là chất ức chế enzyme, những chất hoạt hóa liên kết với các enzyme và làm tăng hoạt tính enzyme mà chúng liên kết [1]

Sự liên kết của một chất ức chế có thể ngăn chặn một chất nền đi vào tâm hoạt động của enzyme và gây trở ngại cho các phản ứng xúc tác của enzyme đó. Chất ức chế có thể liên kết với enzyme thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Chất ức chế không thuận nghịch thường phản ứng với enzyme và thay đổi nó về mặt hóa học. Những chất ức chế đó làm thay đổi dư lượng các acid amin quan trọng cần thiết cho hoạt động của enzyme. Ngược lại, chất ức chế thuận nghịch liên kết khơng đồng hóa trị và theo những kiểu khác nhau tùy thuộc vào liên kết chất ức chế-enzyme, phức enzyme-chất nền, hoặc cả hai.

Chất ức chế thuận nghịch liên kết với enzyme bằng các tương tác khơng đồng hóa trị chẳng kết như liên kết hydrogen, tương tác kị nước và liên kết ion. Nhiều liên kết yếu giữa các chất ức chế và tâm hoạt tính mạnh mẽ và đặc biệt.

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Ngược lại đối với các chất nền và chất ức chế không thuận nghịch, các chất ức chế thuận nghịch thường không trải qua phản ứng hóa học khi liên kết với enzyme và có thể dễ dàng loại bỏ bằng cách pha loãng hoặc thẩm tách.

Có 4 kiểu của ức chế enzyme thuận nghịch, chúng được phân chia dựa theo tác động của sự thay đổi nồng độ chất nền của enzyme trên chất ức chế:

❖ Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)

Chất nền và chất ức chế không liên kết với enzyme cùng một lúc. Điều này có thể là do chất ức chế có ái lực với tâm hoạt động của một loại enzyme nên xảy ra sự cạnh tranh giữa chất nền và chất ức chế cạnh tranh vào tâm hoạt động của enzyme. Đây là loại ức chế có thể được khắc phục bằng nồng độ đủ cao của chất nền bởi vì những chất ức chế cạnh tranh thường có cấu trúc tương tự như cấu trúc của chất nền.

❖ Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition)

Chất ức chế chỉ kết hợp với phức enzyme-chất nền mà không kết hợp với enzyme tự do. Đây là một dạng ức chế mà các liên kết của chất ức chế với enzyme làm giảm hoạt tính của nó nhưng khơng ảnh hưởng đến liên kết của enzyme-chất nền. Kết quả là mức độ của sự ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế.

❖ Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition)

Chất ức chế hợp với enzyme ở vị trí khác với vị trí kết hợp của chất nền tạo thành phức enzyme-chất nền-chất ức chế không bị chuyển hóa tiếp. Như vậy, enzyme có thể đồng thời kết hợp cả chất ức chế và chất nền. Chất nền và chất ức chế không cạnh tranh với nhau để kết hợp enzyme và cũng không thể loại trừ tác dụng kìm hãm bằng cách tăng nồng độ chất nền.

❖ Ức chế hỗn hợp (mixed inhibition)

Chất ức chế không những liên kết với enzyme tự do mà còn liên kết với cả phức hợp enzyme-chất nền tạo thành phức hợp enzyme-chất ức chế -chất nền nên không tạo được sản phẩm. Hiện tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế. Tốc độ ức chế cực đại đo được khi không có chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất ức chế.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Lá của cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) được thu hái tại rừng ngập mặn Cần Giờ,

Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam vào tháng 6 năm 2019. Được định danh bởi TS. Phạm Văn Ngọt, khoa Sinh trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu (LL-012) được lưu tại khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm Sinh Hóa, Khoa Cơng Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 6/2019 đến tháng 12/2019.

2.1.3. Hóa chất và thiết bị

❖ Hóa chất:

- Các loại dung môi ethanol, n-hexane, ethyl acetate, methanol, chloroform:

Chemsol (Việt Nam).

- Silicagel 200 – 400 (Merck)

- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck).

Enzyme α- glucosidase (EC 3.2.1.20) saccharomyces cerevisiae (750 UN), cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside ( Aldrich Sigma). Acarbose và DMSO (Merck).

❖ Thiết bị:

- Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III tần số 500 MHz của viện Cơng nghệ Hóa Học- viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu

Mẫu nghiên cứu được thu hái tại rừng ngập mặn Cần Giờ TP.HCM. Mẫu được giám định tên khoa học bởi TS. Phạm Văn Ngọt (trường Đại học Sư Phạm TP.HCM). Mẫu được rửa sạch, phơi khô, xay mịn và ngâm dầm với ethanol.

2.2.2. Phương pháp ngâm dầm ( Maceration)[4]

Ngâm bột cây trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép khơng rỉ, bình có nắp đậy (tránh sử dụng bình bằng nhựa). Rót dung mơi tinh khiết vào bình cho đến khi sấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung mơi sẽ có được cao chiết. Tiếp theo, rót dung mơi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.

2.2.3. Phương pháp chiết pha rắn (SPE) [4]

Kỹ thuật chiết pha rắn được áp dụng để xác định mức độ phân cực của một hợp chất chưa biết, làm đậm đặc một hợp chất đang ở trong một dung dịch rất lỗng và lượng thế tích lớn. Có thể dùng để phân chia cao thơ ban đầu (có chứa tất cả các loại hợp chất từ không phân cực đến phân cực) thành các phân đoạn có tính phân cực khác nhau: Cao thô nạp trên dầu cột, giải ly với dung mơi có độ phân cực tăng theo kiểu bậc thang, sau khi đuổi dung môi, thu được những loại cao chiết có độ phân cực khác nhau. Và dùng để cô lập một mẫu hợp chất thiên nhiên cần khảo sát ra khỏi cao thô ban đầu.

2.2.4. Phương pháp cô lập các hợp chất

Từ cao chiết tổng ban đầu tiến hành phân bố lại trong các dung môi hexan, ethylacetat và ethanol. Dùng sắc ký cột để chia cao ethyl acetate thành nhiều phân đoạn, từ các phân đoạn được đem đi phân lập chất tinh khiết. Chất tinh khiết sẽ được phân lập dựa trên các kỹ thuật sắc ký cột pha thường, pha đảo, Sephadex LH-20, HPLC điều chế kết hợp với sắc ký bản mỏng.

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

❖ Sắc ký bản mỏng (TLC)[4]

Sắc ký bản mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254(Merck 1.05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.

❖ Sắc ký cột (CC) [4]

Sắc ký cột được tiến hành trên cột thủy tinh, với chất nhồi cột là silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040–0,063 mm (240–430 merck), silica gel pha đảo, sephadex LH–20 để phân lập chất.

2.2.5. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

❖ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa Học-Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.6. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme α- glucosidase

❖ Nguyên tắc[6]

Nghiên cứu khả năng ức chế α-glucosidase được xác định theo phương pháp của Apostolidis và cộng sự (2007). Để khảo sát khả năng ức chế hoạt tính enzyme α-glucosidase trên cao chiết, sử dụng p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG) làm cơ

chất. Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid sẽ bị enzyme α-glucosidase thủy phân chuyển hóa thành α-D-glucose và p-nitrophenol (pNP).

Phản ứng enzyme α- glucosidase được trình bày theo hình 2.1.

Hình 2. 1:Phản ứng xúc tác enzyme α- glucosidase

</div>