dòng hóa biểu hiện và tinh chế protein alpha momorcharin trong e coli tiềm năng kháng nấm nguy hại trong nông nghiệp

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.05 MB, 72 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

-DỊNGHĨA, BIỂUHIỆNVÀTINHCHẾ PROTEIN

ALPHA-MOMORCHARIN TRONG E.COUTIỀMNĂNGKHÁNGNẤM

nguyhại

TRONG NƠNG NGHIỆP

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

DỊNGHĨA, BIỂUHIỆN VÀ TINHCHẾPROTEINALPHA-MOMORCHARIN TRONG E.COLĨTIỀM

NĂNGKHÁNGNẤM

nguy

HẠI

TRONG NÔNG NGHIỆP

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Giảng viên hướng dẫn:...

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

được bước chân vào trường đại học Mở TP.HCM, được học hỏi rất nhiều kiến thức quý báu cũng như trau dồi kinh nghiệm và nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình từ q Thầy Cơ khoa Cơng nghệ Sinh học. Những bài học quý báu của thầy cô sẽ là hành trang giúp em vững bước trên con đường phía trước và hồn thiện bản thân mình hơn.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và đặc biệt nhất đến thầy Đặng Thanh Dũng

– người luôn đồng hành, theo sát và tạo mọi điều kiện để em hồn thành tốt đề tài. Khơng chỉ là người định hướng, thầy còn là người truyền đạt cho em những kinh nghiệm nghiên cứu và những bài học cuộc sống quý giá. Cảm ơn thầy vì đã ln ở bên cổ vũ, khích lệ để em tiếp tục cố gắng; cảm ơn thầy vì ln kiên trì nhẫn nại trả lời vơ vàn những câu hỏi, những thắc mắc của em. Và sau tất cả, cảm ơn thầy đã là tấm gương, đã trở thành động lực tích cực giúp em trở thành một người có ích.

Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Thư – người cô, người chị đã theo sát nghiên cứu của em cũng như mở ra cho em những cách nhìn mới về khoa học, chị đã chỉ dạy hướng dẫn em tận tình và ln ln hỗ trợ giúp em hoàn thành tốt đề tài. Cảm ơn bạn Ngọc và tất cả những người bạn đã luôn đồng cam cộng khổ chia sẻ kiến thức,

giúp đỡ nhau vượt qua khó khăn trong suốt q trình học tập.

Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, đến Ba Má đã ln bên cạnh động viên, quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để con hồn thành việc học. Cảm ơn anh hai ln giúp đỡ và bao bọc em trong những lúc khó khăn xa nơi xứ người.

Với tất cả tấm lòng và tình cảm yêu thương nhất, xin chúc cho mọi người luôn luôn vui vẻ, tràn đầy sức khỏe và nụ cười luôn nở trên môi cũng như sẽ gặt hái được nhiều thành cơng trên con đường phía trước!

Bình Dương, ngày 22 tháng 07 năm 2020

NGUYỄN THỊ THU THẢO

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

1.1.3. Cơ chế hoạt động của protein α-MMC ... 7

1.1.4. Vai trò sinh học và tiềm năng của protein α-MMC. ... 9

1.2. Hệ thống dịng hóa và biểu hiện. ... 13

1.2.1. Chủng dịng hóa E. coli DH5α. ... 13

1.2.2. Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3). ... 14

1.2.3. Vector biểu hiện ... 14

1.3. Tổng quan về đặc điểm gậy hại của các loại nấm gây hại cho cây trồng. ... 15

1.3.1. Nấm Pyricularia oryzae (Magnaporthe grisea) ... 15

1.3.2. Nấm Aspergillus nomius. ... 17

1.3.3. Nấm Aspergillus terreus ... 17

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 19

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu. ... 19

2.4.1 Dịng hóa tạo vector pTD7 trong E. coli DH5α ... 25

2.4.1.1 Phản ứng PCR thu nhận gen mục tiêu α –MMC ... 25

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

2.4.1.2 Phản ứng cắt mở vòng plasmid pET28a và xử lý gene mục tiêu ... 27

2.4.1.3 Phản ứng nối gene mục tiêu vào plasmid pET - 28a ... 28

2.4.1.4 Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào chủ E. coli DH5α khả nạp ... 29

2.4.1.5 Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5α mang vector pTD7 ... 30

2.4.2. Tạo chủng E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pTD7 biểu hiện protein α- MMC... 33

2.4.2.1 Biến nạp tạo chủng E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pTD7...33

2.4.2.2 Kiểm tra biểu hiện của protein α-MMC trong chủng E. coli BL21(DE3) 33 2.4.3. Tinh chế protein α-MMC. ... 36

2.4.4. Khảo sát hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC. ... 38

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 39

3.1 Dịng hóa tạo vector pTD7-MMC ... 40

3.1.1 Phản ứng PCR thu nhận gen α-MMC. ... 40

3.1.2. Tạo vector tái tổ hợp pTD7 ... 40

3.1.3. Sàng lọc các dòng tế bào E. coli DH5α mang vector pTD7 ... 42

3.2 Tạo chủng E. coli BL21(DE3) mang vector pTD7-MMC và kiểm tra sự biểu hiện protein α-MMC. ... 44

3.3 Tinh chế protein α-MMC. ... 45

3.4 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC ... 47

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ... 47

4.1 Kết luận ... 50

4.2 Kiến nghị. ... 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 51

PHỤ LỤC ... 53

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. 1. Cấu trúc khơng gian của α –MMC ... 4

Hình 1. 2. Sơ đồ phân loại protein bất hoạt ribosome thực vật (RIPs)... 5

Hình 1. 3. Hình ảnh quả mướp đắng ... 5

Hình 1. 4. Chuỗi trình tự của α-MMC ... 6

Hình 1. 5. Biểu đồ vị trí cấu trúc thứ cấp của phân tử α -MMC... 7

Hình 1. 6. Mơ hình cơ chế phịng vệ của α-MMC chống lại mầm bệnh ... 8

Hình 1. 7. Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết N-glycosidase giữa Adenine và khung đường trong phân tử RNA ribosome ... 9

Hình 1. 8. Mơ hình kháng bệnh gây hại cho cây trồng của RIP ... 10

Hình 1.9. Mức độ sao chép và biểu hiện của virus trong lá cây thuốc lá. ... 10

Hình 1.10. Hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC ức chế sự tăng trưởng sợi nấm gây bệnh. ... 11

Hình 1.11. Khả năng ức chế tăng trưởng nấm Fusarium solani ... 12

Hình 1.12. Sơ đồ plasmid pET-28a(+). ... 15

Hình 1.13 Bào tử đính (connidia) và cuống mang bào tử (conidiophore) của nấm Pirycularia oryzae gây bệnh đạo ôn và biểu hiện bệnh đạo ơn trên lúa ... 16

Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pET-28a (+) sử dụng trong đề tài ... 20

Hình 2.2. Thang chuẩn... 21

Hình 2.3. Quy trình dịng hóa tạo vector pTD7 ... 25

Hình 2. 4. Nguyên tắc khuyết đại của phản ứng PCR ... 26

Hình 2.5. Sơ đồ chương trình chạy PCR thu gen mục tiêu ... 27

Hình 2. 6. Nguyên tắc PCR khuẩn lạc ... 31

Hình 2.7. Vị trí bắt cặp của mồi cho phản ứng PCR khuẩn lạc sàng lọc vector pTD7 ... 31

Hình 2.8. Sơ đồ chương trình chạy PCR khuẩn lạc ... 32

Hình 2.9. Quy trình kiểm tra biểu hiện của protein α-MMC ... 34

Hình 2.10. Hình cấu trúc tương tác giữa đuôi ái lực polyhistidine với hai ion kim loại Ni2+ được cố định bằng NTA(Ni2+-NTA) ... 37

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

Hình 2.11. Quy trình tinh chế protein α-MMC ... 37

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR thu gen α-MMC. ... 40

Hình 3.2. Kết quả biến nạp sản phẩm nối của pET28a và gen α-MMC. ... 41

Hình 3.3. Kết quả sàng lọc chủng E. coli DH5α mang vector pTD7 bằng phản ứng PCR khuẩn lạc... 42

Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự lý thuyết (aMMC) với trình tự dịng hóa ... 43

Hình 3. 5. Sơ đồ vector pTD7 có mang gen α-MMC ... 43

Hình 3.6. Kết quả biến nạp vector pTD7 vào chủng E. coli BL21(DE3). ... 44

Hình 3.7.Kết quả kiểm tra biểu hiện của protein α-MMC ... 45

Hình 3.8. Kết quả điện di SDS-PAGE kiểm tra việc tinh chế protein α-MMC. ... 46

Hình 3.9. Sự ức chế tăng trưởng đối với nấm Aspergillus terreus (A) và Aspergillus nomius (B) trên môi trường PDA của protein α-MMC ở các nồng độ 0 (đối chứng), 5µM, 15µM được ủ trong 280C, 24 giờ. ... 48

Hình 3.10. Hoạt tính kháng nấm Pyricularia oryzae của α-MMC ở các nồng độ khác nhau: ĐC (nước), 0 µM, 5 µM, 20 µM, 100 µM và 200 µM được ủ trong 24h, nhiệt độ 28ºC. ... 49

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự các mồi dùng trong thực tập ... 19Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR thu gen α –MMC ... 27Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt plasmid khung sườn và gen mục tiêu với

enzyme cắt giới hạn ... 28

Bảng 2.4. Các thành phần phản ứng nối ... 28Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR cho 1 khuẩn lạc... 32

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

FDA Food and Drug Administration

GMO Genetically Modified Organism

MCS Mutiple Cloning Site

NTA Nitrilotriacetic acid

OD600 Optical Density ( Wavelength: 600nm)

PBS Phosphate-buffered saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PDA Potato Dextrose Agar

RIPs Ribosome Inactivating Proteins

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TAE Tris-Acetate-EDTA

TMV Tobacco mosaic virus

TuMV Turnip mosaic potyvirus

VMV Chilli veinal mottle virus

α-MMC Alpha-momorcharin

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là nước có truyền thống phát triển nơng nghiệp từ lâu đời nay vì thế việc trồng và xuất khẩu nông sản ngày càng đạt kết quả cao. Tuy nhiên vấn đề khó khăn mà nền nơng nghiệp ở Việt Nam cũng như trên toàn thế giới đang gặp phải đó là dịch bệnh phát sinh trong đó nấm, virus và vi khuẩn là các tác nhân gây bệnh chính. Đây là nguyên nhân dẫn đến các thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp trong nước cũng như trên thế giới (Doehlemann và cs, 2017).

Để làm giảm thiệt hại và tăng năng suất cho cây trồng chọi với dịch bệnh do nấm gây ra, hiện nay người nông dân đã và đang sử dụng các biện pháp phòng và trị bệnh như chọn giống sạch bệnh hay kháng bệnh, luân canh, xen canh, cải tạo đất để tiêu diệt các tác nhân gây bệnh, vệ sinh đồng ruộng sau mỗi vụ thu hoạch tuy nhiên hiệu quả đạt được từ các phương pháp này chưa cao. Vì thế họ đã sử dụng liên tục các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học trong canh tác nơng nghiệp. Điều này gây mất cân bằng sinh thái trầm trọng, ảnh hưởng tới hệ sinh vật và vi sinh vật trong đất, dẫn tới hiện tượng kháng thuốc, gây ô nhiễm mơi trường đất, ơ nhiễm nguồn nước thậm chí lượng thuốc hóa học bị tích lũy trong nơng sản dễ dẫn tới nhiễm độc cho con người. Lượng thuốc hóa học tích lũy trong mỡ cơ thể theo thời gian sẽ làm thay đổi kiểu hình hay chức năng miễn dịch và làm tăng khả năng mắc các bệnh tiềm ẩn nguy hiểm như viêm da dị ứng, các bệnh liên quan đến hô hấp, thần kinh, ung thư,… dẫn đến tử vong (WHO,1990). Ngoài ra việc sử dụng kỹ thuật biến đổi gen (GMO) có thể giúp cho cây trồng hạn chế mầm bệnh và tăng năng suất nông sản. Tuy nhiên, vấn đề về thực phẩm biến đổi gen vẫn còn tranh luận và việc ứng dụng kỹ thuật này vào cây trồng còn hạn chế.

Hiện nay, nhận thức của con người về an toàn thực phẩm ngày càng nâng cao trên toàn thế giới. Việc cải cách nông nghiệp và sản xuất lương thực theo hướng phát triển nền nông nghiệp bền vững; sản xuất sản phẩm sạch, an toàn; đẩy mạnh phát triển nông nghiệp hữu cơ để giảm thiểu các tác hại và nâng cao sức khỏe chất lượng thực phẩm cho con người là hết sức cần thiết. Tuy nhiên việc sử dụng phân bón hóa

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

học là không được phép trong canh tác hữu cơ nên cần phải có một giải pháp thay thế hiệu quả giúp tiêu diệt bệnh hại, nâng cao năng suất cho cây trồng. Vì vậy, nhu cầu sản xuất chế phẩm có nguồn gốc sinh học để đáp ứng phát triển nền nông nghiệp hữu cơ là rất cần thiết. Theo Varma và cộng sự (1999), việc sử dụng các chất chiết xuất từ thực vật được xem là lựa chọn tốt nhất vì hạn chế tác động tới mơi trường sinh thái và ít gây nguy hiểm tới người tiêu dùng. Trong đó, Alpha-momorcharin (α-MMC) được tách chiết từ hạt cây mướp đắng đã được thử nghiệm cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học như ức chế sự phát triển của ung thư vú (Cao và cs, 2015), ức chế sự sao chép của HIV-1 (Zheng, Ben, & Jin, 1999). Đặc biệt, theo cơng trình nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2013), cho thấy hoạt tính kháng virus của chất này khá rộng:

kháng được với Chilli veinal mottle virus (Chi VMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV), kháng nhiều loại nấm gây bệnh cho cây trồng bao gồm: nấm Fusarium spp., nấm Aspergillus spp., nấm Sclerotinia sclerotiorum, nấm Bipolaris maydis, nấm Magnaporthe grisea. Qua đó cho thấy triển vọng to lớn

khi sử dụng α-MMC như là một giải pháp thay thế để đề phịng và kiểm sốt bệnh do nấm gây ra.

Tuy nhiên, quá trình chiết xuất protein α-MMC từ hạt trái mướp đắng cịn gặp nhiều khó khăn trong việc thu nhận protein có độ tinh sạch cao cũng như khó khăn trong việc triển khai ứng dụng α-MMC với quy mô lớn trong nông nghiệp. Nhằm giải quyết vấn đề trên, việc sử dụng hệ thống vi khuẩn cho sản xuất α-MMC đang được quan tâm. Hiện nay, Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu về protein α-MMC do

đó chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “ DỊNG HỐ, BIỂU HIỆN VÀ TINH

CHẾ PROTEIN ALPHA-MOMORCHARIN TRONG E. COLI TIỀM NĂNG

KHÁNG NẤM NGUY HẠI TRONG NÔNG NGHIỆP”.

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

❖ Mục tiêu

- Tạo dòng, biểu hiện, thu nhận và tinh chế protein α-MMC với độ tinh sạch cao

trong hệ thống vi khuẩn E. coli nhằm kháng nấm bệnh trong cây trồng đồng

thời tạo nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn phục vụ cho việc phát triển nền nông nghiệp bền vững.

❖ Nội dung nghiên cứu:

- Thiết kế và tạo dòng vector tái tổ hợp pTD7 mang gene α-MMC. - Tạo chủng E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pTD7.

- Biểu hiện, nuôi cấy và cảm ứng với chất cảm ứng sau đó kiểm tra biểu hiện. - Tinh chế protein α-MMC.

- Thử nghiệm khảo sát hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

CHƯƠNG I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

1.1. Protein α-MMC

Theo Stirpe (1982)protein α-MMC thuộc nhóm RIPs (ribosome inactivating proteins) là những độc tố thực vật có các đặc tính sinh - dược học rất đa dạng trong đó nổi bật là hoạt tính rRNA N-glicosidase. Do đó, α-MMC có khả năng bất hoạt các ribosome trong tế bào nhân thực bằng cách ức chế sự kéo dài của chuỗi polypeptide dẫn đến ức chế tổng hợp protein trong giai đoạn dịch mã của tế bào.

Hình 1. 1. Cấu trúc khơng gian của α –MMC [Protein Data Bank file 1aha]

RIPs được phát hiện ở hơn 50 loài thuộc 14 họ thực vật, bao gồm cả cây một và hai lá mầm của thực vật hạt kín. RIPs khơng chỉ được tìm thấy ở họ Bầu bí

(Cucurbitaceae) với rất nhiều chi gồm các cây thuốc quý như Trichosanthes, Luffa, mà còn thấy ở rất nhiều các họ thực vật khác như Cẩm chướng (Caryophylaceae), Thầu dầu (Euphorbiaceae), Hoà thảo (Poaceae), Họ đậu (Fabaceae), họ Hoa phấn (Nygtaginaceae)... RIPs được tìm thấy ở hầu hết các bộ phận của cây như hạt, rễ, lá,

củ, quả, vỏ cây... đặc biệt tồn tại nhiều ở hạt và quả, ít hơn ở lá và thân. Sự phân bố RIPs trên các mô khác nhau tùy thuộc vào từng loài thực vật (Brar, 2017).

Hiện nay, RIPs được phân chia chủ yếu thành hai loại là RIPs loại một và RIPs

loại hai. RIPs loại một (Hình 1.2A) bao gồm một chuỗi polypeptide đơn với hoạt tính N-glycosidase. RIPs loại hai chứa hai chuỗi polypeptide (chuỗi A và chuỗi B, hình

1.2B) được liên kết với nhau thông qua cầu nối disulfide, chuỗi A hoạt động như RIPs

loại một với trọng lượng khoảng 30 kDa cịn chuỗi B là một phân tử có hoạt tính cần

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

cho sự bám vào thụ thể đầu N galactosyl trên bề mặt tế bào đích và tạo điều kiện cho chuỗi A xâm nhập vào tế bào chất của tế bào. Do đó, RIP loại hai có khả năng gây

độc cao. Ngồi ra cịn có RIPs loại bốn (Hình 1.2C) gồm hai chuỗi A với hoạt tính

N-glycosidases hoạt động trên rRNA nhân thực và hai chuỗi B với chức năng chưa được biết đến. Khi miền bổ sung có chức năng chưa biết được loại bỏ, protein hoạt động tương tự như RIP loại một (Zhu và cs, 2018).

Hình 1. 2. Sơ đồ phân loại protein bất hoạt ribosome thực vật (RIPs).

Trong đó, protein α-MMC thuộc RIPs loại một là một chuỗi polypeptide đơn với trọng lượng phân tử khoảng 29 kDa được Yeung và cộng sự (1985) tinh chế thành

công từ hạt trái mướp đắng (Momordica charantia). Phân loại trái mướp đắng theo

Singh và cộng sự (2016) như sau:

Họ Cucurbitaceae ( bầu, bí)

Lồi M.charanti

Tên đồng nghĩa

Momordica chinenus, Momordica elegans, Momordica indica, Momordica operculata, Momordica sinenuns và Silyos fauriei.

Hình 1. 3. Hình ảnh quả mướp đắng (giống Ấn Độ) (A) lát cắt thẳng đứng của quả (B) mặt cắt

ngang của quả (C) nhìn gần hơn về quả (D)

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

1.1.2. Cấu trúc của α-MMC.

Protein α-MMC (CAA40869.1) thuộc nhóm protein bất hoạt ribosome được tìm thấy trong hạt trái mướp đắng (hay trái khổ qua) gồm 286 amino acid. Trong đó, tiểu phần hoạt tính có 246 amino acid (từ vị trí amino acid 24 đến vị trí amino acid 269) với tổng trọng lượng cấu trúc khoảng 29kDa.

Empty: khơng có cấu trúc thứ cấp B: cầu nối beta

S: điểm nối T: chỗ uốn cong E: sợi nếp gấp beta H: chuỗi xoắn alpha

Hình 1. 4. Chuỗi trình tự của α-MMC (Nguồn ngân hàng dữ liệu protein PDB).

Cấu trúc của α-MMC đã được xác định thông qua phương pháp nhiễu xạ tia X ở độ phân giải 2.2 A᷃. Chuỗi polypeptide của α-MMC gấp thành hai miền tương tác tạo thành một khe hở trên bề mặt protein bao gồm 9 α-helices và 10 β-sheets: α1,11-23; α2, 86-91; α3,111-118; α4, 129-139; α5, 144-163; α6, 165-173; α7, 183-191; α8, 192-202; α9, 231-234; β1, 3-5; β2, 27-31; β3, 34-37; β4, 47-53; β5, 59-65; β6, 70-76;

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

β7, 79-82; β8, 101-104; β9, 208-215; β10, 223-227. Trong đó tương tác kỵ nước, cặp ion và liên kết hydro giúp ổn định toàn bộ nếp gấp và cấu trúc thứ cấp của protein

Hình 1. 5. Biểu đồ vị trí cấu trúc thứ cấp của phân tử α -MMC

khi nhìn về phía khe hở vị trí hoạt động ( Ren và cs, 1994).

Vị trí hoạt động của α-MMC nằm ở giữa khe hở và bao gồm các amino axit tham gia vào hoạt động. Trong đó Tyr70, Tyr111, Glu160, Argl63 và Trp192 là bất biến hình thành trung tâm hoạt động và phần còn lại được bảo tồn cao trong protein khơng liên quan trực tiếp đến việc hình thành các trung tâm hoạt động, như Phe-4, Tyr-14, Phe-17, Arg-22, Leu-52 và Arg-122. Những axit amin này liên quan đến sự ổn định hình học của các trung tâm hoạt động (Ren và cs, 1994).

1.1.3. Cơ chế hoạt động của protein α-MMC

Protein α-MMC đã được chứng minh có nhiều hoạt tính quan trọng trong nơng nghiệp như kháng nấm và kháng virus. Mơ hình cơ chế phịng ngự trực tiếp của α-

MMC chống lại mầm bệnh nấm và virus được mơ tả như trong Hình 1.6.

α-MMC có thể ức chế mầm bệnh trực tiếp bằng cách xâm nhập vào vách tế bào thông qua lưới nội chất (1) để vào tế bào chất và dựa vào hoạt tính N-glycosidase (2) có thể nhắm đến mầm bệnh ở vùng nội bào hoặc ngoại bào dẫn đến ức chế sự phát triển tổng hợp protein do đó ngăn chặn sự phát triển của nấm và tiêu diệt tế bào nấm (3). Nhưng ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy nguyên nhân chính gây độc trong các tế bào mầm bệnh là do khả năng gây ra ức chế ngược apoptosis của chúng

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

(4). Protein α-MMC hoạt động ức chế tổng hợp protein nhờ vào hoạt tính xúc tác glycosidase để giải phóng một phân tử adenin đặc trưng (A4324 đánh dấu dựa trên 28S rRNA của gan chuột) do đó phân cắt cầu nối N-glycosidic giữa adenine đặc hiệu và ribose (6). Quá trình khử purine do thủy phân liên kết N-glycosidic diễn ra trên vùng bảo tồn cao Sarcin/Ricin Loop của rRNA làm gián đoạn sự tương tác của yếu tố kéo dài II (EF-2) khiến ribosome không thể bám vào và cuối cùng ức chế tổng hợp protein ở bước dịch mã gây chết tế bào.

Hình 1. 6. Mơ hình cơ chế phịng vệ của α-MMC chống lại mầm bệnh (Brar, 2017).

Cụ thể trong cấu trúc tiểu phần hoạt tính, ba amino acid: Ile71, Glu160 và Arg163 đóng vai trị quan trọng trong khả năng xúc tác thủy phân của α-MMC. Trong khi Glu160 tích điện âm đóng vai trị ổn định ion oxycarbonium, những liên kết hydrogen ở vị trí N1 và N3 của Adenine với Ile71 và Arg163 tạo điều kiện thuận lợi cho việc α-MMC bẻ gãy liên kết cộng hóa trị giữa N9 của Adenine và C1 của khung

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

đường (Hình 1.7). Sự bẻ gãy liên kết giữa Adenine và khung đường bởi α-MMC dẫn

đến bất hoạt RNA ribosome và ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào làm giết chết tế bào.

Hình 1. 7. Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết N-glycosidase giữa Adenine và khung

đường trong phân tử RNA ribosome (Ren và cs, 1994). 1.1.4. Vai trò sinh học và tiềm năng của protein α-MMC.

Hiện nay RIPs đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực và được nghiên cứu phổ biến vì độc tính của chúng với khả năng hoạt động sinh học ức chế tổng hợp protein dựa vào hoạt tính N-glycosidase , do đó RIPs là một nhân tố tiềm năng với ứng dụng hứa hẹn nhất của RIPs trong y học thực nghiệm là phòng chống trị liệu ung thư bằng cách sử dụng protein này như một loại độc tố miễn dịch, liên hợp hoặc các tinh thể tái tổ hợp trong đó chúng được liên kết với các khối u hoặc các kháng thể trung gian gắn kết với các tế bào ác tính (Citores và cs, 2016).

Đặc biệt, ứng dụng trong nông nghiệp của RIPs là kháng nấm và kháng lại virus gây hại cho cây trồng.Các nghiên cứu mới gần đây đã chứng minh α-MMC có thể giúp tăng sức đề kháng của thực vật để chống lại các tác nhân gây hại như virus,

vi khuẩn, nấm trong in vitro và in vivo. Trong cây trồng chuyển gen như cây lúa, sự

biểu hiện protein α-MMC có thể ngăn chặn bệnh đạo ơn (Huang và cs, 2014). Do đó có thể ứng dụng protein tiềm năng này vào các cơ chế phòng ngự của cây trồng bằng công nghệ chuyển gen giúp thực vật tăng sức đề kháng nấm, kháng vi khuẩn, kháng

virus và kháng cơn trùng. ( Hình 1.8.)

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Hình 1. 8. Mơ hình kháng bệnh gây hại cho cây trồng của RIP (Zhu và cs, 2018).

Nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2013) đã cho thấy khả năng kháng virus hiệu

quả bao gồm virus gây bệnh khảm trên cây như Chilli veinal mottle virus (Chi VMV),

Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV) và Turnip mosaic

potyvirus (TuMV). Kết quả được thể hiện như trong Hình 1.9.

Hình 1.9. Mức độ sao chép và biểu hiện của virus trong lá cây thuốc lá (Zhu và cs,

2013). (A) Kết quả realtime-PCR phân tích mức độ sao chép của virus. (B) Triệu chứng của lá cây khi được ủ với RNA virus. Đối chứng: phun 0.02M đệm PBS; Xử

lý: lá cây được tiền xử lý với 0.5 mg/mL α-MMC.

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

Kết quả cho thấy nồng độ của α-MMC tỉ lệ với mức độ kháng virus gây hại cho

thực vật. Trong đó, cây bị nhiễm virus Chi VMV cho thấy các triệu chứng như vết

đốm xanh đậm, xuất hiện dải dọc theo gân lá, đốm vòng hoại tử và biến dạng lá. Cây

bị nhiễm virus chi CMV bề mặt lá nhăn nheo, khảm. Nhiễm virus chi TMV cây xuất

hiện triệu chứng khảm xanh đậm cùng với sự biến dạng và phồng lá cây trong khi ở lá cây được xử lí với 0,5 mg/mL α-MMC khơng xuất hiện các triệu chứng trên.

Hơn nữa, tính chất kháng nấm đầy tiềm năng của α-MMC chống lại nấm gây bệnh

tấn cơng vào lúa mì, bắp, lúa… đã được báo cáo bao gồm các loại nấm Sclerotinia

sclerotiorum, Fusarium graminearum, Bipolaris maydis, Aspergillus niger,

Aspergillus oryzae, kết quả được thể hiện như Hình 1.10.

Hình 1.10. Hoạt tính kháng nấm của protein α-MMC ức chế sự tăng trưởng sợi nấm

gây bệnh ( Zhu và cs , 2013). Đối chứng: đệm PBS; Xử lý: α-MMC 500µg/ml

Kết quả cho thấy protein α-MMC chống lại tất cả các mầm bệnh thực vật thử nghiệm với sự ức chế nảy mầm và thể hiện hoạt tính kháng nấm rộng rãi. Cụ thể ở

các loại nấm bị ức chế 67% (Bipolaris maydis), 65% (Aspergillus niger), 53% (Aspergillus oryzae), 51% (Fusarium graminearum) và 50% (Sclerotinia

selerotiorum) khi có sự hiện diện của α-MMC (500 µg/ml) so với các mẫu đối chứng.

α-MMC có khả năng kháng trên 50% đối với các chủng nấm, trong đó khả năng

kháng Bipolaris maydis cao nhất lên đến 67%. Hiện nay, cơ chế kháng của α-MMC

được cho là giống những protein khác, chúng phá vỡ màng của nấm và xâm nhiễm vào bên trong dẫn đến giết chết tế bào nấm (Zhu và cs, 2018).

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2016) đã xác định hoạt tính kháng nấm của

chiết xuất hạt trái mướp đắng đối với nấm Fusarium solani L - một loại nấm có nhiều

sợi nhỏ là nguyên nhân gây ra hiện tượng thối rễ và chết cây trồng. Bệnh thường gây hại nặng ở những vùng thường xuyên ngập nước, đất bị ngập úng thì rễ cây sẽ bị thiếu

oxy, làm rễ suy yếu. Nấm Fusarium solani có sẵn trong đất sẽ dễ dàng tấn cơng vào

chóp rễ, dẫn đến thối rễ trong cánh đồng và trong nhà kính. Ngồi ra, ở những vùng đất có tuyến trùng thì khi chúng chích hút tạo vết thương, thuận lợi cho nấm xâm nhập gây hại trầm trọng hơn.

Hình 1.11. Khả năng ức chế tăng trưởng nấm Fusarium solani (Wang và cs, 2016).

(A) a-1 đến a-3, F. solani được nuôi cấy trong 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ (B) b-1 đến b-3, F. solani được xử lý với protein α-MMC trong 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ

Kết quả cho thấy khả năng kháng của α-MMC tùy thuộc vào nồng độ và thời gian

thử nghiệm. Trong đó, ở đĩa đối chứng (A) a-1 đến a-3 sợi nấm F. solani phát triển

bình thường và khỏe mạnh khi được nuôi cấy trong 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ trong khi ở đĩa được xử lí với protein α-MMC (B) b-1 đến b-3 gần như khơng có sự tăng trưởng của sợi nấm. Đường kính sợi nấm phát triển trên đĩa đối chứng đạt tới 3,8 ± 0,2 cm

sau 36 giờ ni cấy (Hình 1.11A: a-3), nhưng khơng có thay đổi về sự tăng trưởng xảy ra trên đĩa xử lý với protein α-MMC (Hình 1.11B: b-3). Ngồi việc ức chế tăng

trưởng, hình thái của nấm F. solani cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi việc gây ra

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

sự biến dạng của các tế bào với sự nảy chồi không đều, mất tính tồn vẹn của thành tế bào, cũng như sự phá vỡ màng tế bào nấm. Ngoài ra, DNA bộ gen nấm cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Do đó α-MMC được chứng minh là một nhân tố hiệu quả trong việc kiểm soát con đường gây bệnh của nấm và là một sản phẩm tự nhiên có thể sử dụng để thay thể cho thuốc hóa học diệt nấm.

1.2. Hệ thống dịng hóa và biểu hiện.

Tạo dòng là gắn một đoạn DNA/gene mục tiêu vào một vector tạo dòng (cloning vector) sau đó biến nạp vào một tế bào sống để khuếch đại gene mục tiêu.Mục đích của tạo dịng là lưu trữ và thu nhận số lượng lớn và tinh sạch các đoạn DNA mục tiêu hay thu nhận dòng tế bào có khả năng biểu hiện gene mục tiêu.

Việc thu nhận các protein mục tiêu trực tiếp từ trái mướp đắng còn gặp nhiều trở ngại do hiệu suất thấp, khó tinh sạch và khơng an tồn khi thao tác. Do đó việc

lựa chọn một hệ thống dịng hóa và biểu hiện an tồn và phổ biến hiện nay như E.

coli để thu nhận protein là cần thiết.

1.2.1. Chủng dịng hóa E. coli DH5α.

Trong số các hệ thống vật chủ, vi khuẩn có nhiều ưu điểm như khả năng tăng

trưởng nhanh, chi phí sản xuất thấp nên thường được ưu tiên sử dụng. Vi khuẩn E.

coli là đối tượng được quan tâm sử dụng trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất

protein tái tổ hợp nhiều nhất hiện nay. E. coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, khơng tạo nội bào tử, có chiều dài khoảng 2µm và chiều ngang 0,5µm. E. coli có nhiều ưu

điểm nổi bật như (Broadway, 2016):

• Tăng trưởng nhanh, thời gian thế hệ trong điều kiện tiêu chuẩn của E. coli là

20 phút.

• Mơi trường ni cấy đơn giản, ít tốn kém.

• Thơng tin di truyền đã được hiểu biết rõ.

• Cho phép thu nhận plasmid một cách nhanh chóng và dễ dàng, một plasmid

có thể biến nạp vào E. coli trong khoảng 5 phút.

• Được tổ chức FDA chấp thuận để sử dụng trong nghiên cứu ứng dụng cho con người.

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Trong đó, E. coli DH5α là một chủng được dụng rộng rãi trong tạo dòng và nhân

bản plasmid vì các đặc tính riêng biệt như:

• Có lac Z∆M15 cho phép sàng lọc khuẩn lạc xanh/trắng trên các đĩa thạch có

chứa Bluo-Gal hoặc X-Gal.

• Độ ổn định khi chèn gen cao do đột biến rec A1 (giảm khả năng tái hợp không mong muốn của plasmid).

• Kiểu gen endA1 làm bất hoạt endonuclease nội bào đảm bảo hàm lượng endonuclease thấp cho năng suất plasmid cao.

1.2.2. Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3).

Chủng E. coli BL21(DE3) thuộc nhóm E. coli nhóm B, chứa thể tiềm tan của

thực khuẩn thể DE3, được xem như một trong những chủng biểu hiện protein ngoại

lai mạnh. E. coli BL21(DE3) chứa gene mã hóa cho T7 RNA polymerase, được chịu sự kiểm soát dưới lac UV5 promoter và được cảm ứng bởi lactose hoặc IPTG. Ngoài ra, sự thiếu hụt đột biến Ion protease (protease nội bào) và ompT (protease màng

ngoài tế bào) giúp hạn chế sự phân cắt của protease đối với protein ngoại lai làm

chúng không bị phân hủy và ổn định hơn sau khi tổng hợp. Gene lacI trong trình tự

giúp tổng hợp protein LacR, kiểm sốt q trình tổng hợp protein tái tổ hợp thơng

qua lac operator chặt chẽ hơn. Ngồi ra tế bào thiếu sự hoạt động của hệ thống enzyme cắt giới hạn hsdSB(rB-mB-) đảm bảo cho sự tồn tại của protein tái tổ hợp.

1.2.3. Vector biểu hiện

Vector biểu hiện là phân tử DNA được ứng dụng như một phương tiện mang vật liệu di truyền ngoại lai vào một tế bào chủ để có thể sao chép hoặc biểu hiện. Vector có thể là phage, plasmid, cosmid, chromosome nhân tạo và trong số đó plasmid là vector được sử dụng nhiều nhất. Vector biểu hiện sẽ được dịng hóa mang gene mục tiêu để biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào chủ.

Hệ thống pET là hệ thống vector phổ biến trong tạo dòng và biểu hiện protein

tái tổ hợp ở E. coli. pET28a chứa T7 promoter là một promoter mạnh, sau vài tiếng

đã cảm ứng 50% tế bào tổng hợp protein mục tiêu. T7 promoter chỉ nhận diện một loại RNA polymerase duy nhất là T7 RNA polymerase, vì vậy RNA polymerase khác

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

của E. coli không thể bám vào vùng T7 promoter và cảm ứng biểu hiện protein mục

tiêu. Đây là một cơ chế hoàn hảo tránh sự rò rỉ biểu hiện protein.

Hình 1. 12. Sơ đồ plasmid pET-28a(+).

f1ori: vị trí khởi đầu sao chép; lacI: gene mã hoá protein lacI; KanR (Kanamycin Resistance): vùng trình tự kháng kháng sinh Kanamycine; His-tag: vùng trình tự

quy định đi 6×His; Thrombin site: vùng trình tự cắt bằng Thrombin site

Ngồi ra pET28a cịn chứa vùng gen lacI nằm sau T7 promoter, mã hóa cho lac

repressor. Khi chưa có chất cảm ứng IPTG, lac repressor sẽ bám vào operator ngăn cản tạo ra T7 RNA polymerase, lúc này gene mục tiêu vẫn chưa được biểu hiện. IPTG có chức năng cảm ứng như lactose nhưng khơng bị phân cắt trong tế bào vì vậy có thể cảm ứng protein liên tục trong thời gian tế bào tăng trưởng. Việc kết hợp gene

lacI và chất cảm ứng tổng hợp IPTG sẽ dễ kiểm soát sự biểu hiện protein. Vector

pET28a còn chứa gene kháng kháng sinh Kanamycin để sàng lọc tế bào E. coli

BL21(DE3) mang gene mục tiêu. Vùng gene mã hóa đi 6×His và vùng trình tự Thrombin site cũng là yếu tố quan trọng giúp tinh chế tốt protein mục tiêu.

1.3. Tổng quan về đặc điểm của các loại nấm gây hại cho cây trồng.

1.3.1. Nấm Pyricularia oryzae (Magnaporthe grisea)

- Tác nhân phát sinh bệnh đạo ôn: Nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở giai đoạn vơ

tính là Pyricularia oryzae (syn. Pyricularia oryzae, Pyricularia grisea, Pleospora

oryzae). Giai đoạn hữu sinh của nấm đã được đặt tên là Magnaporthe grisea.

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Hình 1. 13 Bào tử đính (connidia) và cuống mang bào tử (conidiophore) của

nấm Pirycularia oryzae gây bệnh đạo ôn và biểu hiện bệnh đạo ôn trên lúa nguồn: Chi cục bảo về thực vật TPHCM.

- Mô tả: Phân loại thuộc ngành Ascomycota (nấm túi) là một chủng nấm gây bệnh

đạo ôn thường làm ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng lúa. Bệnh có thể gây thiệt hại đến hơn 80% năng suất lúa, khi nhiễm nặng có nguy cơ mất trắng gây thiệt hại to lớn trong nông nghiệp trồng lúa (Boddy, L., 2016). Cơ quan sinh trưởng của nấm là sợi nấm khơng màu, phân nhánh , có vách ngăn, sống kí sinh bên trong mơ thực vật, có bào tử và bào tử nấm phát triển sinh sản phát tán bào tử đi xa để truyền lan bệnh. Cành bào tử phân sinh là cơ quan sinh ra bào tử vơ tính tạo thành một lớp

mốc mịn màu xám trên bề mặt vết bệnh ở lá, ở cổ bông và đốt thân.

- Triệu chứng bệnh: Nấm bệnh có thể tấn cơng trên lá, thân, cổ bơng, cổ gié hoặc hạt

lúa. Trong cây lúa, các vùng hoại tử nhỏ xuất hiện ban đầu, trở nên lớn rộng ra thành một vòng tròn bao quanh trên bề mặt vết bệnh ở lá, đốt thân, cổ bông. Khi bào tử được hình thành đều có một lớp giống như mốc xám gây ra các bệnh như đốt thân bị mềm nhũn gãy gập, bơng có nhiều hạt lép lửng, bông lúa nhỏ, dễ gãy cổ bông, rụng gié, làm giảm năng suất (Nguyễn Văn Viên và cs, 2013).

- Đặc điểm phát sinh và phát triển: Nấm đạo ơn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 25

– 28oC và độ ẩm khơng khí là 93% trở lên. Điều kiện ánh sáng âm u có tác dụng thúc đẩy quá trình tạo bào tử của nấm (Vũ Triệu Mân, 2007). Độ ẩm khơng khí và độ ẩm

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

đất ảnh hưởng đến sự lây lan và phát triển của nấm bệnh. Ngoài ra mật độ gieo trồng, giống lúa, phân bón cũng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng phát sinh nấm bệnh.

1.3.2. Nấm Aspergillus nomius.

- Nguồn: Aspergillus nomius thường có trong các mặt hàng nông sản như cây ngũ

cốc, đậu phộng, bơng, ngơ, lúa mì, mía và hạt cây.

- Phát sinh bệnh: A. nomius sinh sản hữu tính gây bệnh cho con người thơng qua

nhiễm độc tố Aflatoxin qua các mặt hàng nông sản.

- Độc tố: A. nomius sản sinh ra độc tố aflatoxins B và G là các chất chuyển hóa thứ

cấp tiềm năng gây ung thư cho con người và gây quái thai, làm cho sản phẩm không thể sử dụng dẫn đến tổn thất kinh tế nặng nề. Sự nhiễm nấm vào nông sản sẽ sản sinh ra một lượng aflatoxins không chỉ gây nguy hiểm nghiêm trọng cho sức khỏe của con người và động vật, gây nhiễm độc gan là độc tính cấp tính hoặc ung thư gan là độc tính mãn tính mà cịn là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế lớn trên toàn thế giới đặc biệt trên cây ngũ cốc, đậu phộng, bông, ngô lúa mì, mía và hạt cây (Yabe và cs , 2018).

- Mơ tả: Aspergillus nomius là một lồi nấm thuộc chi Aspergillus phần Flavi , được mô tả lần đầu tiên vào năm 1987 có kiểu hình giống với Aspergillus flavus. Những

lồi nấm này có màu từ ơ liu đến xanh rêu nhạt, sợi nấm có hình cầu, bề mặt nhám và đường kính khoảng 4,6μm. Chúng tạo ra aflatoxin B1, B2, G1 và G2 nhưng không tạo ra axit cyclopiazonic (CPA - là một độc tố chuyển hóa thứ cấp được sản xuất ra

bởi một số chi nấm) (Ito và cs, 1998).

1.3.3. Nấm Aspergillus terreus

- Nguồn: Aspergillus terreus là một loại nấm hoại sinh cư trú trong đất, phân hữu cơ,

bụi..

- Phát sinh bệnh: A. terreus là mầm bệnh cơ hội gây ra bệnh nhiễm trùng ở phổi hoặc

lây lan khắp cơ thể của người và động vật. Khi bào tử nấm xâm nhập vào cơ thể, mầm bệnh đi dọc theo đường hô hấp gây ra bệnh nhiễm trùng đường hơ hấp điển hình, các nhiễm trùng khác cũng có thể xảy ra như bệnh nấm móng và bệnh tai mũi

họng. Trong nông nghiệp, A. terreus phá hủy chu kỳ sinh sản hữu tính ở cây

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

Arabidopsis thaliana và được báo cáo gây bệnh ở cây lúa mì và lúa mạch đen (Dewan

và Sivasithamparam, 1988); là mầm bệnh gây ra cháy lá ở cây khoai tây (Louis và cs, 2013), hoạt động tổn thất lớn sau thu hoạch mất nhiều hoa màu (Kozakiewicz và cs,

1989).

- Độc tố: A. terreus sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp như erritrem A, citreoviridin, citrinin, gliotoxin, patulin, axit terreic, terretonin. Trong đó, axit aspterric và 6-hydroxymellein ức chế sản xuất phấn hoa, ảnh hưởng đến sự đa dạng di truyền ở các loài thực vật.

- Mơ tả: A. terreus có màu nâu trong mơi trường ni cấy, chúng sinh ra các bào tử

đính. Các tế bào bào tử đính trên các túi sinh ra dạng nấm đính hình cột dày đặc.

Cuống bào tử đính của A. terreus trơn và trong suốt. Hạt đính của A. terreus có kích

thước nhỏ, đường kính khoảng 2 µm, có hình cầu, thành trơn và có thể thay đổi từ

màu vàng nhạt đến trong suốt. Nấm A. terreus dễ dàng được phân biệt với các loài Aspergillus khác bởi màu sắc của khuẩn lạc là màu nâu quế và sản xuất aleurioconidia. A. terreus là một lồi chịu nhiệt vì nó tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ

trong khoảng 35-40°C (95-104°F) và tăng trưởng tối đa trong 45-48°C (113-118°F) (Anderson và cs, 1980).

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

CHƯƠNG 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu.

- Thời gian: Từ tháng 8 năm 2019 đến tháng 7 năm 2020.

- Địa điểm: phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh trường Đại học Mở Tp.HCM, cơ sở 3 – Bình Dương; Trung tâm Cơng Nghệ Sinh Học Tp. HCM; phịng thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh (CBB).

2.2. Vật liệu sinh học.

- Gen α-MMC được tối ưu hóa một số codon cho việc biểu hiện trong E. coli

bằng phần mềm Optimal codon (Firstbase, Singapore) trước khi được tổng hợp tại công ty Macrogen (Hàn Quốc).

- Mồi:các mồi đặc hiệu sau khi thiết kế bằng phần mềm Clone Manager được tổng hợp bởi công ty Macrogen (Hàn Quốc). Trình tự các mồi sử dụng trong quá trình

PCR thu gene mục tiêu

ON-D15 GGTGCTCGAGTCAGTAGCTCGAAAAGCCATGTG

ON-D15 GGTGCTCGAGTCAGTAGCTCGAAAAGCCATGTG PCR khuẩn lạc ON30 GGTGATGTCGGCGATATAGG

- Chủng vi sinh vật:

⮚ Chủng E. coli DH5α [F-, Ø80lacZ∆M15, recA1, endA1, hsdR17 (rk-, mk+),

phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1] (Invitrogen) là chủng chủ dùng trong bước dịng hóa và để nhân bản plasmid.

⮚ Chủng E. coli BL21 (DE3) F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3)

(Invitrogen): được sử dụng làm chủng chủ để biểu hiện protein mục tiêu dưới sự cảm ứng của IPTG.

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

- Plasmid : plasmid pET28a là một vector biểu hiện có gen kháng Kanamycin làm gen chọn lọc và vùng MCS nằm ngay sau promoter T7 (đây là một promoter biểu

hiện mạnh ở E. coli và được kiểm soát bằng chất cảm ứng IPTG). Sơ đồ plasmid

pET28a sau khi được tối ưu hóa bằng phần mềm Clone Manager Hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pET-28a (+) sử dụng trong đề tài

- Plasmid và chủng vi sinh được cung cấp bởi Trung tâm Khoa học và CNSH, Đại học Khoa học tự nhiên, TP.Hồ Chí Minh (CBB).

- Chủng nấm:

⮚ Nấm Aspergillus nomius và nấm Aspergillus terreus được cung cấp bởi Trung

tâm Công Nghệ Sinh Học Tp. HCM phường Trung Mỹ Tây, Q.12, TP. HCM.

⮚ Nấm Pyricularia oryzae đã phân lập được cung cấp bởi phịng thí nghiệm

Cơng nghệ Vi sinh trường Đại học Mở Tp.HCM, cơ sở 3 – Bình Dương

- Thang chuẩn: thang chuẩn dùng trong đề tài được thể hiện trong Hình 2.2

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Hình 2.2. Thang chuẩn

(A): Thang DNA 2 (DNA Ladder 200bp HT200D400V, HT Biotech) (B): Thang protein HT-P1(HT Biotech) (C): Thang Protein PageRuler Unstained Protein

Ladder (Thermo Fisher Scientific)

2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường.

- Máy ly tâm (Eppendorf Đức).

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

- Máy ly tâm falcon (Hermle). - Máy PCR (Eppendorf). - Máy Vortex (Biocote, Mỹ). - Micro pipette (Eppendorf).

- Nồi hấp Autoclave (SS325-TOMY). - QIAquick PCR Purification Kit. - Tủ ấm, tủ sấy (Pol-Eko, Ba Lan). - Tủ lạnh -20oC (Lucland Fukusima). - Tủ lạnh 4oC (Lucland Fukusima). - Tủ lạnh sâu -80oC (Telstar). - Tủ cấy vô trùng.

- Các dụng cụ khác: eppendorf, tip, que cấy, đèn cồn, đĩa petri, erlen, ống nghiệm, falcon…

- Deep Vent®Buffer (Thermo Scientific).

- Deep Vent®DNA Polymerase (Thermo Scientific).

❖ Hóa chất điện di DNA

- Agarose 2% (Invitrogen). - SafeView 10,000X (ABM).

- Dung dịch nạp mẫu điện di DNA 6X (30% Glycerol; 0,25% bromophenol blue).

- Dung dịch điện di TAE 1X (40 mM Tris base; 20 mM acetic acid; 1 mM EDTA pH 8,0).

❖ Hóa chất dùng trong phản ứng cắt giới hạn và nối - Red Buffer dùng cho XhoI 10 U/µl (Fermentas).

- Orange Buffer dùng cho NdeI 10 U/µl (Fermentas).

</div>