khảo sát tính chất biểu hiện của microrna 141 và tính đa hình gene rpms1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại việt nam

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM </b>

<b>BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP </b>

<i><b>Tên đề tài: </b></i>

<b>KHẢO SÁT TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA </b>

<i><b>MicroRNA-141 VÀ TÍNH ĐA HÌNH GENE RPMS1 </b></i>

<b>TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VỊM HỌNG TẠI VIỆT NAM </b>

<b>KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC </b>

<b>GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy ThS. Lao Đức Thuận </b>

<b>SVTH: Nguyễn Hồng Danh MSSV: 1553010019 </b>

<b>Khóa: 2015-2019 </b>

<i><b>Bình Dương, tháng 06 năm 2019 </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>KHẢO SÁT TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA </b>

<i><b>MicroRNA-141 VÀ TÍNH ĐA HÌNH GENE RPMS1 </b></i>

<b>TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VỊM HỌNG TẠI VIỆT NAM </b>

<b>KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC </b>

<b>Giảng viên hướng dẫn 1 Giảng viên hướng dẫn 2 SVTH </b>

<i><b>Bình Dương, tháng 06 năm 2019 </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

iii

<b>LỜI CẢM ƠN </b>

Để báo cáo khóa luận này đạt kết quả tốt đẹp, em đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ từ phía nhà trường, thầy cơ, bạn bè. Với tình cảm sâu sắc, chân thành, cho phép em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả mọi người đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong q trình thực hiện khoa luận khơng chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu sau này mà còn là hành trang quý báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin.

Trước hết, em xin gởi tới các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh lời chào trân trọng, lời chúc sức khỏe và lời cảm ơn sâu sắc. Với sự quan tâm, dạy dỗ, chỉ bảo tận tình chu đáo của thầy cơ, đến nay em đã có thể hồn thành khóa luận tốt nghiệp, với đề tài:“Khảo sát tinh chất biểu hiện của

<i>microRNA-141 và tính đa hình gene RPMS1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại </i>

Việt Nam”.

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới giảng viên – PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy và ThS. Lao Đức Thuận đã quan tâm giúp đỡ, hướng dẫn em hoàn thành đề tài trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Thầy và Cô đã tận tâm hướng dẫn em qua từng buổi nói chuyện, thảo luận về vấn đề nghiên cứu. Nếu khơng có những lời hướng dẫn, dạy bảo của Thầy và Cô, thì em nghĩ đề tài của em rất khó có thể hồn thiện được.

Khơng thể khơng nhắc tới sự hướng dẫn, cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị tại Phịng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, đã tạo điều kiện thuận lợi và truyền đạt lại những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tại phịng thí nghiệm. Đặc biệt là những lời quan tâm, động viên, khuyến khích cũng như sự thơng cảm sâu sắc của các anh chị.

Với điều kiện thời gian, điều kiện cơ sở vật chất tại phịng thí nghiệm, cũng như kinh nghiệm còn hạn chế, báo cáo khơng thể tránh được những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cơ trong tổ bộ mơn, để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức của mình, phục vụ tốt hơn trong quá trình nghiên cứu sắp tới, cũng như công việc sau này.

Em xin chân thành cảm ơn!

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

1.1.Khái niệm về ung thư ... 5

1.2.Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam ... 5

4.1.Định nghĩa về tính đa hình gene ... 12

4.2.Tính đa hình gene của EBV ... 13

4.3.<i>Vai trị gene RPMS1 trong ung thư vịm họng ... 13</i>

4.4.<i>Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về tính đa hình gene RPMS1 ... 15</i>

5. MicroRNA ... 17

5.1.Sơ nét về miRNA ... 17

5.2.Cơ chế phân tử hoạt động của miRNA tác động đến mRNA ... 18

5.3.Cấu trúc của miRNA-141 (has-mir-141) ... 19

5.4.Sự biểu hiện của miRNA-141 trong nhiều loại ung thư khác nhau ... 20

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

v

5.5.Các tính chất của miRNA - một dấu chứng sinh học trong tiên lượng và chẩn đoán

sớm ung thư ... 21

6. Mối liên hệ giữa EBV và microRNA ... 22

<i><b>PHẦN II - NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐA HÌNH GENE RPMS1 TRÊN BỆNH </b></i><b>NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM</b>1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ... 25

1.1.Các phần mềm và trang web được sử dụng ... 25

1.2.Mẫu thí nghiệm ... 25

1.3.Dụng cụ - thiết bị - hóa chất... 26

1.4.Q trình nghiên cứu thực nghiệm ... 27

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 28

2.1.<i>Tiêu chuẩn chọn lọc, loại bỏ công bố khoa học phục vụ cho khảo sát in silico ... 28</i>

2.2.<i>Khảo sát in silico. ... 29</i>

2.3.Phương pháp đánh giá mồi ... 29

2.4.Tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/ Chloroform ... 29

2.5.Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu DNA ... 31

2.6.Khuếch đại trình tự mong muốn và giải trình tự các mẫu đại diện ... 31

2.7.Hiệu chỉnh trình tự ... 32

2.8.Phân tích tần số phát hiện gene RPMS1 và biến thể trên gene RPMS1 ... 34

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ... 35

3.1.<i>Kết quả khảo sát in silico tính đa hình gene RPMS1 ... 35</i>

3.2.<i>Khảo sát ảnh hưởng của các biến thể trên gene RPMS1 ... 38</i>

3.3.Kết quả khảo sát mồi ... 40

3.4.Kết quả thực nghiệm ... 47

4. KẾT LUẬN ... 57

4.1.<i>Kết quả khảo sát in silico ... 57</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

1.1.Các phần mềm và trang web được sử dụng ... 59

1.2.Mẫu thí nghiệm ... 60

1.3.Dụng cụ - thiết bị - hóa chất... 60

1.4.Quá trình nghiên cứu thực nghiệm ... 61

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 62

2.1.Khai thác cơ sở dữ liệu ... 62

2.2.Quy trình thực nghiệm ... 63

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ... 68

3.1.Kết quả khai thác dữ liệu khảo sát tính chất biểu hiện của miRNA- ... 68

3.2.Khảo sát ảnh hưởng của miRNA-141 bằng phần mềm / công cụ tin sinh học ... 71

3.3.Kết quả khảo sát mồi ... 74

3.4.Kết quả khuếch đại trình tự bằng phương pháp Realtime PCR ... 78

3.5.Kết quả phân tích thống kê ... 79

3.6.<i>Kết hợp tính chất biểu hiện của miR-141 và gene RPMS1... 82</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

vii

<b>DANH MỤC HÌNH ẢNH</b>

Hình 1.1. Tỷ lệ tử vong do các loại ung thư năm 2018. ... 5

Hình 1.2. Vị trí giải phẫu của ung thư vịm họng ... 6

Hình 1.3. Các quốc gia có tỷ lệ mắc UTVH cao nhất ... 7

Hình 1.4. Tỷ lệ số ca mắc và tỷ lệ tử vong do ung thư tại Việt Nam ... 8

Hình 1.5. Cấu trúc hệ gene của EBV... 10

<i>Hình 1.6. Cấu trúc gene và exon của họ gene BARTs ... 11 </i>

<i>Hình 1.7. Vị trí các khung đọc mở (ORF) của gene RPMS1 ... 11 </i>

Hình 1.8. Một đột biến điểm xảy ra dẫn đến thay thế một cặp nucleotide G-C bằng T hoặc ngược lại tạo ra một SNP. ... 12

<i>A-Hình 1.9. Ảnh hưởng của RPMS1 trên con đường tín hiệu Notch. ... 14 </i>

Hình 1.10. Con đường tín hiệu Notch ở tế bào. ... 15

Hình 1.11. Sơ đồ biểu diễn cấu trúc kẹp tóc của pri-miRNA. ... 17

Hình 1.12. Sự bắt cặp giữa miRNA và mạch mRNA đích. ... 19

Hình 1.13. Vị trí trình tự miRNA-141 trên nhiễm sắc thế số 12 ở người. ... 19

Hình 1.14. Sơ đồ biểu diễn cấu trúc kẹp tóc của pre-miR-141. ... 19

Hình 1.15. Trình tự của năm phân tử của họ phân tử miRNA-200. ... 20

<i>Hình 2.1. Tóm tắt quy trình nghiên cứu tính chất đa hình gene RPMS1 ... 27 </i>

Hình 2.2. Chu trình nhiệt chung của các phản ứng PCR. ... 31

Hình 2.3. Trình tự nucleotide trước khi hiệu chỉnh ... 32

Hình 2.4. Trình tự nucleotide sau khi hiệu chỉnh ... 32

Hình 2.5. Kết quả BLAST của trình tự trước khi hiệu chỉnh ... 33

Hình 2.6. Kết quả BLAST của trình tự sau khi đã hiệu chỉnh ... 33

Hình 2.7. Sắp gióng cột giữa trình tự EBV hoang dại và mồi mạch xuôi và ngược ... 34

Hình 2.8. Xác định vị trí biến thể trên trình tự EBV hoang dại ... 34

<i>Hình 2.9. Tần số phát hiện các biến thể trên gene RPMS1 ... 37 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

viii

<i>Hình 2.13. Kết quả sắp gióng cột giữa cặp mồi Beta-actin-F,R và trình tự gene Human </i>

<i>Beta-actin bằng phần mềm Annhyb ... 45 </i>

Hình 2.14. Kết quả BLAST của cặp mồi Beta-actin-F,R. ... 46

Hình 2.15. Hình điện di sản phẩm PCR Beta-actin trên các mẫu đại diện ... 47

Hình 2.16. Kết quả tối ưu nhiệt độ cặp mồi SNP-RPMS1-F,R ... 48

<i>Hình 2.17. Kết quả khuếch đại trình tự RPMS1 bằng cặp mồi SNP-RPMS1-F,R ... 48 </i>

<i>Hình 2.18. Kết quả BLAST kết quả giải trình tự gene RPMS1 ... 49 </i>

<i>Hình 2.19. Vị trí biến thể xuất hiện trên gene RPMS1 tại vị trí 155391 ... 50 </i>

<i>Hình 2.20. Vị trí biến thể xuất hiện trên gene RPMS1 tại vị trí 155384 ... 50 </i>

<i>Hình 2.21. Vị trí biến thể xuất hiện trên gene RPMS1 tại vị trí 155389 ... 51 </i>

<i>Hình 2.22. Cây phả hệ phân tử gene RPMS1 ... 55 </i>

<i>Hình 2.23. Kết quả khuếch đại trình tự gene RPMS1 trên mẫu lành ... 55 </i>

<i>Hình 2.24. Kết quả khuếch đại trình tự gene Beta-actin trên mẫu lành tính đại diện ... 56 </i>

Hình 3.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu sự biểu hiện của miR-141. ... 61

Hình 3.2. Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR ... 65

Hình 3.3. Chu trình nhiệt chung của các phản ứng Realtime PCR. ... 66

Hình 3.4. Sơ đồ mơ tả quy trình chọn lọc cơng trình nghiên cứu vào bộ dữ liệu phân tích tổng hợp ... 68

Hình 3.5. Các gene và con đường tín hiệu liên quan đến miRNA-141. ... 71

Hình 3.6. Con đường tín hiệu liên quan đến ung thư vịm họng. ... 74

Hình 3.7. Kết quả Annhyb của cặp mồi RNA-U6. ... 76

Hình 3.8. Kết quả BLAST của cặp mồi RNA-U6. ... 77

Hình 3.9. Sự biểu hiện miRNA-141 được phát hiện / không bị phát hiện trên các mẫu đại diện. ... 78

Hình 3.10. Sự biểu hiện của U6 được phát hiện trên các mẫu đại diện. ... 79

Hình 3.11. Giá trị trung bình chu kì ngưỡng của miRNA-141 (A) và mức biểu hiện của miRNA-141 (B) trong mẫu lành và bệnh. ... 81

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

ix

<b>DANH MỤC BẢNG BIỂU </b>

Bảng 1.1. Sự biểu hiện của miRNA-141 trong nhiều loại ung thư khác nhau. ... 21

Bảng 2.1. Tần số phát hiện các biến thể của các gene ... 28

<i>Bảng 2.2. Vị trí đột biến các biến thể trên gene RPMS1 trong UTVH ... 35</i>

<i>Bảng 2.3. Tần số xuất hiện các biến thể trên gene RPMS1 trong UTVH ... 36</i>

<i>Bảng 2.4. Kết quả trung bình có trọng số các biến thể của RPMS1 ... 36</i>

Bảng 2.5. Tỉ lệ nghiên cứu sử dụng phương pháp Nested-PCR ... 38

Bảng 2.6. Tỉ lệ loại mẫu sử dụng trong các nghiên cứu ... 38

Bảng 2.7. Các thông số vật lý của các cặp mồi SNP-RPMS1 ... 41

Bảng 2.8. Trình tự các cặp mồi gene Beta-actin ... 44

Bảng 2.9. Các thông số vật lý của các cặp mồi Beta-actin-F,R ... 44

<i>Bảng 2.10. Vị trí các biến thể trên gene RPMS1 ... 51</i>

<i>Bảng 2.11. Cơ sở dữ liệu cục bộ gene RPMS1 ... 53</i>

<i>Bảng 2.12. Tần số xuất hiện của các gene RPMS1 trên mẫu bệnh và lành ... 56</i>

Bảng 3.1. Mẫu bảng ghi nhận trích xuất dữ liệu từ các công bố trên thế giới. ... 62

Bảng 3.2. Thành phần phản ứng phản ứng RT-PCR ... 64

Bảng 3.3. Thông tin nhiệt độ bắt cặp và thời gian kéo dài của các cặp mồi. ... 66

Bảng 3.4. Đặc điểm của bộ dữ liệu 3 nghiên cứu ca chứng về tính chất biểu hiện cao miRNA-141 ... 69

Bảng 3.5. Giá trị OR và RR tính chất biểu hiện cao của miRNA-141 mơ hình phân tích tổng ảnh hưởng ngẫu nhiên dựa trên các nghiên cứu đã công bố ... 70

Bảng 3.6. Các gene và con đường tín hiệu có liên quan đến miRNA-141. ... 72

Bảng 3.7. Các thông số vật lý của các cặp mồi. ... 75

<i>Bảng 3.8. Kết quả phân tích giá trị tần số biểu hiện của miRNA-141. ... 79</i>

<i>Bảng 3.9. Bảng tần số xuất hiện của miRNA-141 và RPMS1 trên mẫu bệnh ... 82</i>

<i>Bảng 3.10. Bảng kết hợp giữa tần số xuất hiện miRNA-141 và RPMS1 ... 83</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

x

<b>DANH MỤC VIẾT TẮT </b>

BAD BCL2-associated agonist of cell death

CIR Corepressor interacting with RBPJ

EBER Epstein–Barr virus-encoded small RNAs EBNA Epstein–Barr virus nuclear antigen

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

xi

PIP2 Phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate PIP3 Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate

qRT-PCR Quantitative reverse transcription PCR RACK1 Receptor for activated C kinase 1 RAN-GTP RAs-related Nuclear – GTP pathway

RT-PCR Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction SKIP Skeletal muscle and kidney enriched inositol phosphatase

SPLUNC1 Short palate, lung and nasal epithelium clone 1 STAT Signal transducers and activators of transcription

UBAP1 Ubiquitin-associated protein 1

Wnt Wingless-type MMTV integration site family

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

1

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ </b>

Dựa trên thống kê của Globocan (2018), ung thư vòm họng là một dạng ung thư phổ biến ở Việt Nam với tỷ lệ tử vong khá cao lên đến 3,9% dân số vào năm 2012. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ung thư vòm họng, bao gồm: sự xâm nhiễm EBV, yếu tố môi trường, các hiện tượng epigenetics (methyl hóa, miRNA, sự biến đổi protein histon),... Trong đó, miRNA đang được các nhà khoa học nghiên cứu chuyên sâu gần đây, là một họ các phân tử RNA không mã hóa (non-coding RNAs), chiều dài khoảng 21 nucleotide, được bảo tồn cao và được tìm thấy rộng rãi ở động vật, thực vật, động vật nguyên sinh và virus. miRNA điều hòa biểu hiện gene bằng cách gắn vào vùng 3'-UTR của các mRNA mục tiêu của chúng, kết quả là gây ra sự ức chế và giảm biểu hiện của mRNA, được chứng minh là liên quan đến một loạt các quá trình sinh học như tế bào phân chia, phát triển, biệt hóa, apoptosis, di căn, phản ứng stress,.... Trong những thập kỷ qua, nhiều cơng trình đã chứng minh rằng các miRNA liên quan đến các vai trò Oncogene và Tumor suppressor. Sự biểu hiện bất thường (tăng biểu hiện hoặc giảm biểu hiện) của miRNA góp phần vào q trình hình thành khối u ở người. Với các tính chất biểu hiện đặc trưng, đặc biệt cho nhiều loại bệnh ung thư, cùng với hai tính chất nổi bật khác, đó là tính lưu thơng trong nhiều loại dịch thể và tính bền, microRNA đã nhanh chóng được chú ý đến như là một dấu chứng sinh học rất tiềm năng, ứng dụng trong tiên lượng và chẩn đoán sớm ung thư.

Sự xâm nhiễm của Epstein-Barr virus là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến UTVH. Trong đó, các cơng trình nghiên cứu trên thế giới về tính đa hình của các gene EBV đã được quan tâm nhằm xây dựng và phát triển một dấu chứng sinh học tiềm năng trong chẩn đoán sớm UTVH, đồng thời các biến thể cung cấp cơ sở cho các nghiên cứu về chức năng hoạt động và cơ chế phát sinh ung thư vòm họng. Ngồi ra, tính đa hình cịn cho phép xác định sự phân bố địa lý của các chủng EBV đặc trưng cho từng vùng, khu vực khác nhau. Mặt khác, các cơng trình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam chỉ tập

<i>trung nghiên cứu về tính đa hình của một số họ gene đặc trưng của EBV như: EBNAs, </i>

<i>LMPs, EBERs; rất ít cơng trình nghiên cứu về họ gene BARTs, nên giới hạn tầm nhìn </i>

về sự đa dạng toàn bộ bộ gene của EBV. Do đó, nghiên cứu về tính đa hình một số gene của EBV hiện đang là một hướng mới mang lại nhiều hứa hẹn trong lĩnh vực này. Hơn nữa, tại Việt Nam, việc nghiên cứu này còn khá mới mẻ, do đó, việc tìm hiểu về

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

2

<i>tính đa hình một số gene của EBV, cụ thể trong nghiên cứu này là họ gene RPMS1 </i>

trên bệnh UTVH sẽ giúp hiểu rõ hơn về nguyên nhân hình thành UTVH liên quan đến EBV. Cùng với đó, trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về tính chất biểu hiện của miRNA trên nhiều loại ung thư khác nhau. Tuy nhiên, tại Việt Nam vẫn chưa có bất kì nghiên cứu nào về miRNA, cũng như tìm hiểu về tính chất biểu hiện của miRNA (cụ thể ở đây là miRNA-141).

<b>Vì vậy, nhóm nghiên cứu quyết định thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính chất </b>

<i><b>biểu hiện của miR-141 và tính đa hình gene RPMS1 trên bệnh nhân ung thư vòm </b></i>

<b>họng tại Việt Nam”. </b>

<b>Mục tiêu tổng quát: Khảo sát một số tính chất phân tử trên bệnh nhân ung thư vòm </b>

<i>họng tại Việt Nam, cụ thể là tính chất đa hình gene RPMS1 và tính chất biểu hiện của </i>

miRNA-141. Đề tài này hướng tới việc xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử ban đầu về sự

<i>biểu hiện của phân tử miRNA-141 và các biến thể trên gene RPMS1 của EBV trên </i>

bệnh ung thư vòm họng Việt Nam. Kết quả nghiên cứu này sẽ bổ sung vào cơ sở dữ liệu phân tử về bệnh UTVH ở Việt Nam, từ đó, hướng tới việc sử dụng các dữ liệu phân tử này làm dấu chứng sinh học tiềm năng có thể ứng dụng trong sàng lọc, chẩn đoán sớm bệnh UTVH trên cộng đồng người Việt Nam.

Dựa trên mục tiêu tổng quát, chúng tôi xác định các mục tiêu cụ thể sau:

(1) Ứng dụng các công cụ Tin – Sinh học (Bioinformatics tools) để phân tích, thống kê minh chứng cho việc miR-141 có vai trị quan trọng trong việc hình thành khối u vịm họng; Dự đốn gene đích tương tác trực tiếp với miR-141. Cùng với đó, ghi nhận tần số phát hiện của miRNA-141 và tần số xuất hiện của các biến thể trên

<i>gene RPMS1 trong UTVH. Từ đó, làm cơ sở cho các nghiên cứu thực nghiệm trên </i>

chính cộng đồng người Việt Nam.

(2) Thiết lập quy trình bắt đầu từ tách chiết miRNA và DNA đến việc phát hiện phân tích tính chất biểu hiện của miR-141 bằng kỹ thuật Real-Time PCR; phát hiện các biến thể bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự.

(3) Bước đầu khảo sát tính chất biểu hiện của miR-141 và tính đa hình gene

<i>RPMS1 trên chính mẫu bệnh phẩm ung thư vòm họng trên bệnh nhân người Việt Nam, </i>

so với người chẩn đốn khơng bị ung thư vịm họng.

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>PHẦN I </b>

<b>TỔNG QUAN </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

5

<b>1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ </b>

<b>1.1. Khái niệm về ung thư </b>

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách mất kiểm soát (uncontrolled division). Các tế bào ung thư có khả năng di chuyển, xâm lấn đến các cơ quan khác, phát triển khối u mới thơng qua hệ bạch huyết và mạch máu, tiến trình này gọi là di căn [1].

Về phân loại ung thư được chia làm năm nhóm chính sau: [1] Ung thư biểu mô (Carcinoma): ung thư bắt nguồn trong da hay các mơ lót phủ trong các cơ quan của cơ thể, chẳng hạn như ung thư da, ung thư cổ tử cung, ung thư vòm họng, ung thư gan,…. [2] Bệnh bạch cầu (Leukemia): ung thư bắt nguồn từ trong mô máu như tủy xương, sản xuất lượng lớn các tế bào máu bất thường; [3] Ung thư mô liên kết (Sarcoma): đây là loại ung thư hiếm gặp, bắt nguồn từ xương, sụn, mạch máu hay các mô liên kết khác; [4] Ung thư hệ thần kinh: ung thư bắt nguồn từ trong các mô hệ thần kinh, não và tủy sống. [5] U lympho bào, tủy (Lymphoma): ung thư bắt nguồn từ các tế bào thuộc hệ miễn dịch của cơ thể [1].

<b>1.2. Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam </b>

Theo thống kê của Globocan năm 2018, số ca ung thư mắc mới trên thế giới đạt khoảng 18 triệu ca, số ca tử vong lên đến 9,6 triệu [2]. Đứng đầu trong các quốc gia có tỉ lệ mắc và tử vong do ung thư là Trung Quốc. Các quốc gia tiếp theo là: Mỹ, Ấn Độ, Nhật Bản và Đức [2].

<i><b>Hình 1.1. Tỷ lệ tử vong do các loại ung thư năm 2018. </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

6

Đến nay, số lượng ca ung thư trên thế giới ngày càng tăng và trở thành một vấn đề cấp thiết toàn cầu. Tại Việt Nam, theo thống kê của Globocan năm 2018, Việt Nam có khoảng 164.671 ca mắc mới và trên 114.871 trường hợp tử vong do ung thư. Theo dự đoán của Globocan 2018, ước tính đến năm 2040 số ca mắc mới và tử vong do ung thư tại Việt Nam lần lượt là 285.347 và 214.269 ca [2].

<b>2. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG </b>

<b>2.1. Sơ lược về ung thư vòm họng </b>

Ung thư vòm họng (UTVH) là khối u ác tính xuất phát từ lớp biểu mơ vịm họng [3]. UTVH chiếm tỷ lệ cao trong các loại ung thư ở vùng đầu, cổ và họng. Về vị trí của ung thư ở vùng vịm mũi họng, là nơi tiếp giáp mũi, họng và chỗ đổ của ống vịi nhĩ (ống thơng giữa tai và mũi họng), nên khi ung thư xâm lấn sẽ có triệu chứng liên quan đến các cơ quan này. Một số triệu chứng ở tai bao gồm: nghe kém, ù tai, đặc biệt chỉ xảy ra một bên; triệu chứng ở mũi bao gồm chảy máu mũi, nghẹt; triệu chứng ở họng được ghi nhận là khạc ra máu [3].

<b>Hình 1.2. Vị trí giải phẫu của ung thư vòm họng </b>

Phần lớn các trường hợp phát hiện UTVH hầu hết ở giai đoạn muộn. Tại Indonesia (quốc gia có số ca mắc UTVH đứng thứ 2 trên thế giới), hơn 80% bệnh nhân phát hiện bệnh đang ở giai đoạn muộn [4]. Tại Singapore, phần lớn bệnh nhân lớn tuổi thường được chẩn đoán mắc UTVH ở giai đoạn 2 hoặc giai đoạn 3, có nguy cơ tái phát cao hơn và tỷ lệ sống sót thấp hơn [5]. Trong các thập kỷ vừa qua, việc điều trị UTVH đã được cải thiện đáng kể với sự ra đời đồng thời của các phương pháp hóa trị và xạ trị. Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh nhân di căn vẫn còn khoảng 25-34% và tỷ lệ sống sót của những bệnh nhân này vẫn còn thấp [6, 7]. Một điều quan trọng là UTVH có khả năng

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

7

chữa lành hồn tồn trong giai đoạn đầu. Do đó, việc tìm kiếm một dấu chứng sinh học để chẩn đoán sớm UTVH trong giai đoạn đầu là rất cần thiết.

UTVH là một căn bệnh ác tính và tỷ lệ mắc bệnh của UTVH phụ thuộc vào sự phân bố địa lý và chủng tộc [4]. Một số nhóm dân tộc có nguy cơ cao mắc UTVH, ví dụ: Bidayuh trên đảo Borneo, Nagas ở miền Bắc Ấn Độ và Inuits ở Bắc Cực [4]. Đàn ơng có khả năng mắc UTVH cao gấp hai đến ba lần so với phụ nữ. Độ tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là từ 50 đến 60 tuổi. Người cao tuổi có nguy cơ tái phát cao hơn và cũng có tỷ lệ sống thấp hơn. Mặt khác, tỷ lệ tử vong cao nhất do UTVH đã được ghi nhận ở những người trên 85 tuổi [4].

Cùng với đó, UTVH có sự phân bố địa lý không đồng đều trên thế giới, chủ yếu tập trung tại khu vực Châu Á và Châu Phi [4]. Theo thống kê của Globocan 2018, 84,7% trường hợp mắc ung thư vòm họng xảy ra ở châu Á và 5,4% ở châu Phi [2]. UTVH rất phổ biến tại Châu Á (đặc biệt là Trung Quốc và Đông Nam Á) [8] [8] [8] [9] [8] (8). Theo Globocan năm 2018, số ca UTVH trên thế giới là 129.079 ca, số lượng ca tử vong lên đến 72.987 ca. Quốc gia có số ca UTVH cao nhất là Trung Quốc (60.558 ca), Indonesia (17.992 ca), Việt Nam (6.212 ca) và India (5.086 ca) [1].

<i><b>Hình 1.3. Các quốc gia có tỷ lệ mắc UTVH cao nhất [2] </b></i>

Ở Việt Nam, ung thư vòm họng là loại ung thư đứng đầu trong các loại ung thư vùng đầu cổ. Ngoài ra, UTVH nằm trong 10 loại ung thư phổ biến nhất Việt Nam, với tỉ lệ mắc bệnh tính đến năm 2018 là 5,7% và tỉ lệ tử vong hằng năm là 3,9% [1].

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

Trong những năm gần đây, có rất nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố về mối quan hệ giữa EBV và ung thư vòm họng. Chẳng hạn nghiên cứu của Chou và cộng sự (2008) cho thấy, có khoảng 95% những khối u vịm họng có liên quan tới EBV [10-12]. Sự hiện diện của EBV ở giai đoạn đầu dưới dạng tiềm tan và chỉ biểu hiện bệnh

<i>khi các gene virus (EBNA-1, LMPs, BARTs,…) chuyển sang trạng thái hoạt động </i>

(dạng tan) nhằm giúp chúng nhân lên và gây nhiễm. Lúc này, chúng sẽ gây biến đổi mô, tế bào của cơ thể, phát triển thành khối u ác tính [10].

Yếu tố mơi trường cũng được nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh có vai trị trong việc hình thành ung thư vịm họng. Điển hình, sự khác biệt về khu vực địa lý, thói quen sinh hoạt,… dẫn đến ung thư vòm họng tại các khu vực khác nhau trên thế giới. Chẳng hạn, ung thư vòm họng hiếm ở người da trắng nhưng lại rất phổ biến ở Quảng Đông (Trung Quốc), ngườiEskimo ở Alaska và thổ dân ở Greenland. Ngồi ra, các thói quen như tiêu thụ cá muối, rau củ quả không tươi, hút thuốc lá, tiếp xúc với hóa chất độc hại,… đều làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư vòm họng [10].

Các yếu tố di truyền có vai trị rất quan trọng trong việc hình thành và phát triển ung thư [18]. Yếu tố di truyền bao gồm: hiện tượng epigenetics (sự methyl hóa, biến đổi protein histone và miRNA), đột biến, tính đa hình (SNPs,…) [18]. Những nghiên cứu về yếu tố đa hình một số gene của EBV cũng cho thấy các biến thể ở một số gene

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

9

của EBV liên quan đến khả năng phát sinh khối u vòm họng và đẩy nhanh tiến trình hình thành ung thư. Cùng với đó, miRNA điều hòa biểu hiện gene bằng cách gắn vào vùng 3'-UTR của các mRNA đích (target mRNA) của chúng, kết quả là ức chế hoặc giảm chức năng của mRNA đích, được chứng minh là có liên quan đến một loạt các quá trình sinh học như tế bào phân chia, tăng sinh, biệt hóa, apoptosis, di căn, phản ứng stress,… [13-16]. Trong những thập kỷ qua, các bằng chứng ngày càng nhiều, cho thấy các miRNA liên quan đến các quá trình oncogene và tumor suppressor. Sự biểu hiện bất thường (theo cơ chế điều hoà dương tính hoặc âm tính) của miRNA góp phần tạo ra các khối u ở người [16-21]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy miRNA-141 tăng cường điều hòa ở các mẫu ung thư vòm họng khi so sánh với mẫu lành [16, 22, 23]. Sự ức chế của miRNA-141 lên trên các gene đích có thể ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào, quá trình apoptosis và sự di căn của tế bào ung thư [22].

<b>3. EPSTEIN-BARR VIRUS </b>

<b>3.1. Cấu trúc và đặc điểm </b>

Epstein-Barr Virus (EBV) là một loại virus phổ biến ở người, được phát hiện

<i>đầu tiên năm 1964 bởi Epstein và Barr, thuộc nhóm Herpesvirus type 4, thuộc họ </i>

<i>Herpesviridae [24]. Cấu trúc hệ gene của EBV là chuỗi DNA xoắn kép, mạch hở, có </i>

kích thước 173kb, có hai dạng: dạng vòng (episome) tồn tại trong tế bào khi virus chuẩn bị bước sang giai đoạn tan và dạng mạch thẳng tồn tại trong tế bào sau khi xâm nhiễm [25]. EBV tồn tại dạng khối cầu bao gồm vỏ capsid, vỏ ngoài và bộ gene virus.

<i>Bộ gene của EBV bao gồm sáu gene mã hóa cho protein kháng nguyên nhân EBNAs (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A,3B,3C và EBNA-LP) liên quan đến quá trình xâm nhiễm và nhân lên của EBV ở giai đoạn đầu; ba gene mã hóa cho protein màng LMP-1, LMP-</i>

<i>2A, LMP-2B liên quan đến chu trình tăng trưởng của EBV trong tế bào B; hai gene </i>

<i>không mã hóa RNA EBER (EBER-1, EBER-2) ngăn chặn q trình apoptosis và sản sinh IL-10 (interleukin 10) [24, 26] và ba protein thuộc họ BARTs (RPMS1, A73, </i>

<i>BARF0) liên quan đến đường truyền tín hiệu Notch, điều hịa lượng Ca</i>²⁺ trong tế bào [27-29].

Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể người EBV có 3 hướng tiến triển. Thứ nhất là EBV xâm nhập vào tế bào biểu mô và nhân lên, thứ hai là EBV gây sơ nhiễm và xâm

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

10

nhập vào tế bào lympho B thực hiện sự nhân lên, thứ ba là EBV tàng nhiễm và tiến triển thành ung thư khi có điều kiện. Ngồi ra q trình nhiễm EBV cũng có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch, chủ yếu là loại hình miễn dịch trung gian tế bào có vai trị của Lympho T [30]. EBV gây sơ nhiễm và có thể tồn tại lâu dài trong cơ thể mà khơng gây bệnh. Bên cạnh đó, EBV cũng là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn (một loại bệnh tăng sinh lympho hạn chế ở người, tăng sinh lympho B hay Burkitt lymphoma, bệnh Hodgkin, ung thư dạ dày… Đặc trưng của các khối u này là các tế bào khối u chứa một lượng lớn các bản sao hệ gene của EBV và xuất hiện

<i>sự biểu hiện các gene protein màng tàng nhiễm (LMP) cho một lượng lớn các protein </i>

mà nó có thể đóng vai trị chuyển hóa khối u lành thành ác tính [31].

<i><b>Hình 1.5. Cấu trúc hệ gene của EBV [25] </b></i>

Một số gene có vai trị quan trọng trong việc hỗ trợ sự tồn tại EBV trong cơ thể

<i>người, chẳng hạn như: LMP-1, EBNA-1. Gene EBNA-1 thể hiện chức năng duy trì dạng episome của EBV hay EBNA-1 thể hiện chức năng trong phiên mã thông qua </i>

việc bám lên vùng oriP – vùng khởi đầu phiên mã của DNA hệ gene EBV [32]. Đối

<i>với gene LMP-1, theo Aristides và cộng sự (2001) có các chức năng nổi bật bao gồm: ngăn cản quá trình apoptosis thông qua việc điều chỉnh các protein Bcl-2, MCL-1, </i>

<i>BFL-1, A20 và cIAPs; ảnh hưởng đến quá trình tạo mạch và di căn khối u trong UTVH </i>

<i>liên quan đến EBV [33]. Ngồi ra, họ gene BARTs cũng đóng góp vào q trình sinh ung liên quan tới EBV; RPMS1 có khả năng làm gián đoạn tín hiệu của Notch ở tế bào, góp phần gây ra sự hình thành UTVH [34, 35]; A73 có thể thay đổi tín hiệu làm trung gian cho sự đóng góp của EBV vào sự phát triển tế bào khối u [29]; BARF0 giúp </i>

ngăn chặn q trình tái kích hoạt của EBV [36].

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

11

<i><b>3.2. Vị trí và cấu trúc các gene RPMS1 </b></i>

<i> BamHI-A rightward transcripts (BARTs), cũng được gọi là Complementary </i>

<i>Strand Transcripts (CST), được xác định là trình tự đọc mở về phía bên phải của vùng </i>

BamHI-A, định vị từ nucleotide 138.352 đến nucleotide 160.531 trên bản đồ hệ gene EBV hoang dại (wild-type) [29, 37, 38]. Họ gene <i>BARTs bao gồm một số gene như: </i>

<i>BARF0, RK-BARF0, A73, RPMS1, RPMS1-A. Các thành viên trong họ gene BARTs </i>

lần đầu tiên được xác định trong các mơ UTVH [38-41], sau đó được phát hiện trong tất cả các khối u ác tính liên quan đến EBV, bao gồm bệnh Hodgkin và ung thư dạ

<i>dày[35]. BARTs cũng được phát hiện ở mức thấp trong tất cả các dòng tế bào B bị </i>

nhiễm EBV trong nuôi cấy [35] và trong các tế bào B máu ngoại vi từ những người tình nguyện khỏe mạnh dương tính với EBV.

<i><b>Hình 1.7. Vị trí các khung đọc mở (ORF) của gene RPMS1 </b></i>

<i><small>Chú thích: Sơ đồ cho thấy vị trí trên bộ gene và cấu trúc của các gene RPMS1. Gene RPMS1 được mơ </small></i>

<small>tả bằng các exon (hình hộp) và intron (đường thẳng). Khung đọc mở (ORF) cũng được biểu thị dưới dạng hộp xám đậm. Số lượng acid amin trong khung đọc mở được thể hiện trên hình.</small>

<i>RPMS1 thuộc họ gene BARTs. RPMS1 bắt đầu từ vị trí 138.325 và kết thúc tại </i>

vị trí 160.531 trên bộ gene EBV hoang dại (mã số truy cập V01555). Vùng gene

<i>RPMS1 kéo dài từ exon I đến gần hết exon VII bao phủ gần như toàn vùng gene BARTs, đây là vùng gene dài nhất trong họ gene BARTs. Tuy nhiên, khung đọc mở của </i>

<i><b>Hình 1.6. Cấu trúc gene và exon của họ gene BARTs </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

12

<i>RPMS1 chỉ kéo dài từ cuối exon IV đến đầu exon V; mã hóa cho protein có độ dài </i>

trình tự 103 amino acid.

<b>4. TÍNH ĐA HÌNH GENE </b>

<b>4.1. Định nghĩa về tính đa hình gene </b>

Tính đa hình là sự xuất hiện hai hay nhiều biến thể hoặc các hình thức khác nhau được gọi là kiểu hình thay thế trong một quần thể lồi. Có 3 dạng: đa hình cân bằng (balanced polymorphism), đa hình di truyền (genetic polymorphism), đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism- SNP).<small> </small>

SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) là sự thay đổi của một nucleotide ở một vị trí xác định trên trình tự bộ gene. Trong một quần thể, số cá thể mang biến thể này lớn hơn 1% tổng số cá thể.

<b>Hình 1.8. Một đột biến điểm xảy ra dẫn đến thay thế một cặp nucleotide G-C bằng </b>

<i>A-T hoặc ngược lại tạo ra một SNP. </i>

SNPs xảy ra ở vùng khơng mã hóa thường xun hơn so với vùng mã hóa do ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên, tỷ lệ tái tổ hợp và đột biến di truyền. Khi SNP nằm trong vùng mã hóa có thể khơng nhất thiết làm thay đổi trình tự các amino acid do tính thối hóa của mã di truyền [42]. Các SNP trong vùng mã hóa có hai loại: đa hình đồng nghĩa (khơng ảnh hưởng đến chuỗi protein) và đa hình thay thế (thay đổi trình tự amino acid của protein. SNPs không nằm trong vùng mã hóa protein vẫn ảnh hưởng đến sự liên kết gene, sự gắn kết yếu tố sao chép và sự thối hóa RNA.

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

13

SNPs xảy ra thường xuyên trong bộ gene người. Trung bình xảy ra một lần trong mỗi 300 nucleotide, có nghĩa là có khoảng 10 triệu SNPs trong hệ gene của con người. Thơng thường, những biến thể này được tìm thấy trong DNA giữa các gene. Nó được xem như là dấu chứng sinh học giúp xác định các vị trí gene liên quan đến bệnh. Khi SNPs xảy ra trong gene hoặc trong khu vực gần một gene quy định nó có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự xuất hiện của bệnh bằng cách ảnh hưởng đến chức năng của gene.

Vai trò của các SNPs trong nghiên cứu y học là để so sánh các vùng của hệ gene giữa các nhóm (nhóm người bệnh và nhóm người lành). Xác định các thay đổi của một nucleotide vơ cùng có ý nghĩa trong nghiên cứu cơ sở di truyền của bệnh. Các thay đổi này có thể trở thành các điểm xác định cho thí nghiệm về bản đồ gene và nghiên cứu về toàn bộ hệ gene.

<b>4.2. Tính đa hình gene của EBV </b>

Nghiên cứu tính đa hình các gene của EBV là một trong các hướng nghiên cứu mới trong định hướng xây dựng và phát triển một dấu chứng sinh học tiềm năng nhằm phát triển một phương pháp hiện đại trong chẩn đoán các ung thư liên quan đến EBV. Nghiên cứu tính đa hình có thể xác định mối tương quan của EBV với cơ chế hình thành ung thư. Dựa vào tần số xuất hiện của các biến thể có thể xác định được các chủng EBV đặc trưng cho từng loại ung thư, từng vùng địa lý khác nhau.

Ngoài ra, các nghiên cứu về tính đa hình của EBV chủ yếu tập trung vào các họ

<i>gene EBNAs, LMPs và EBERs, rất ít cơng trình nghiên cứu về họ gene BARTs, nên </i>

giới hạn tầm nhìn về sự đa dạng tồn bộ bộ gene của EBV. Do đó, nghiên cứu về tính

<i>đa hình gene RPMS1 hiện đang là một hướng mới mang lại nhiều hứa hẹn trong lĩnh </i>

vực này.

<i><b>4.3. Vai trò gene RPMS1 trong ung thư vòm họng </b></i>

<i>RPMS1 thuộc họ gene BARTs của Epstein-Barr virus, biểu hiện bất thường </i>

trong hầu hết các mô ung thư vòm họng được nghiên cứu ở mức độ RNA và có thể góp phần vào sự phát triển của UTVH [28, 43]. Tuy nhiên, không phát hiện được protein RPMS1 nội sinh trong các công bố nghiên cứu các tế bào ung thư vịm họng

<i>ni cấy hoặc mơ sinh thiết ung thư vòm họng [27], và do đó, RPMS1 có thể được </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

14

dịch mã thành protein ở mức rất thấp, hoặc protein RPMS1 bị thối hóa rất nhanh (chu kì bán rã ngắn) [44].

<i>Với khả năng sinh ung thư (oncogenic), RPMS1 đã được chứng minh tương tác </i>

với vùng domain nội bào trên protein Notch và điều hịa âm tính con đường tín hiệu

<i>Notch nhằm thúc đẩy sự biệt hóa và phát triển của tế bào. RPMS1 có khả năng tương </i>

tác với protein CBF1, RPMS1 sẽ gắn vào vùng lõi của CBF1 [34, 35]. CBF1 (CSL, RBP-Jk), một yếu tố trung gian của con đường tín hiệu Notch và là một protein mục tiêu cho protein EBNA-2 của EBV. EBNA-2 là một protein có chức năng tương đồng với Notch ở trạng thái hoạt hóa trong các tế bào bị nhiễm EBV. CBF1 liên kết với vùng trình tự GTGGGAA trên vùng promoter [45] và hình thành một phức hợp lõi bao gồm SMRT / NCR, SAP30, CIR, SKIP, HDAC1 / 2 và MINT/ SHARP [46]. EBNA-2 và dạng hoạt hóa của Notch (NotchIC) có khả năng chuyển đổi CBF1 từ chất ức chế phiên mã sang trạng thái kích hoạt phiên mã bằng cách loại bỏ các liên kết của SMRT với CBF1 và SKIP. Việc liên kết SMRT với SKIP và liên kết SMRT với CBF1 bị loại bỏ làm tăng khả năng gắn của CBF1 với protein EBNA2 hoặc NotchIC. CBF1 liên kết với các yếu tố phiên mã cơ bản [47], EBNA2 [48] và NotchIC [49] hồn thành q trình chuyển đổi của CBF1 từ trạng thái ức chế phiên mã sang kích hoạt. RPMS1 cạnh tranh với EBNA2 và NotchIC, bằng cách RPMS1 sẽ gắn vào vùng lõi của CIR (CIR thuộc phức hợp SMRT-HDAC). Liên kết này ngăn cản sự thay thế của phức hợp SMRT-HDAC bằng EBNA2 và NotchIC. Điều này nhằm khẳng định vai trò của RPMS1 trong các tế bào bị nhiễm virus trong q trình điều hịa âm tính con đường tín hiệu Notch.

<i><b>Hình 1.9. Ảnh hưởng của RPMS1 trên con đường tín hiệu Notch [31]. </b></i>

<small>Chú thích: (A) Trạng thái ức chế phiên mã, CBF1 liên kết với phức hợp SMRT-HDAC góp phần vào sự ức chế phiên mã bằng cách loại bỏ yếu tố phiên mã khác (21, 26). (B) Trạng thái kích hoạt xảy </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

15

<small>ra khi EBNA2 hoặc NotchIC thay thế phức hợp SMRT-HDAC và liên kết với CBF1 và SKIP [50]. (C) “Ổn định ức chế”, một trạng thái được tạo ra thông qua tương tác RPMS1 với vùng lõi của CIR. Liên kết này ngăn cản sự thay thế của phức hợp SMRT-HDAC bằng EBNA2 và NotchIC. </small>

Con đường Notch điều khiển sự phát triển và quyết định “số phận” của tế bào thơng qua việc kiểm sốt các cơ chế như tăng sinh, bắt giữ chu kỳ tế bào, sự biệt hóa tế bào và q trình apoptosis [51]. Do chức năng đa dạng của Notch, sự gián đoạn hoạt động kiểm sốt, hoặc thơng qua kích hoạt cấu trúc hay thông qua sự hạn chế các cấu trúc của Notch bởi mRNA RPMS1, có thể dẫn đến rối loạn sự biến nạp, oncogene và góp phần gây ra sự hình thành UTVH [51].

<b>Hình 1.10. Con đường tín hiệu Notch ở tế bào. </b>

<b>4.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về tính đa hình gene </b>

<i><b>RPMS1 </b></i>

<i>4.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước </i>

<i>Hiện nay, tại Việt Nam việc nghiên cứu về tính đa hình của gene RPMS1 là một </i>

hướng đi mới trong việc phân tích tính chất đa hình trên bộ gene EBV. Tới nay, vẫn

<i>chưa có cơng trình nào cơng bố về tính đa hình trên gene RPMS1 tại Việt Nam. Mặt </i>

khác, các nghiên cứu ở Việt Nam tập trung về tính đa hình của một số gene đặc trưng

<i>của EBV (như: EBNAs,…). Vì vậy, hướng nghiên cứu tính đa hình trên họ gene </i>

<i>RPMS1 mở ra tầm nhìn về sự đa dạng của toàn bộ gene EBV. </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

16

<i>4.4.2. Tình hình nghiên cứu ngồi nước </i>

<i>Các cơng trình nghiên cứu về tính đa hình của họ gene BARTs chủ yếu tập trung </i>

ở Trung Quốc – quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư vịm họng khá cao. Ngồi Trung Quốc, vẫn chưa có bất kì quốc gia nào nghiên cứu về tính đa hình trên họ gene này, kể cả Việt Nam. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu tập trung phân tích tính đa hình

<i>hai gene và RPMS1 (thuộc họ gene BARTs). Do đó, đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam phân tích tính đa hình họ gene BARTs, cũng như là nghiên cứu đầu tiên ngoài </i>

khu vực Trung Quốc nghiên cứu tính đa hình trên họ gene này.

<i>4.4.3. Nghiên cứu về gene RPMS1 </i>

<i>RPMS1 là một gene trong họ gene BARTs của Epstein-Barr virus (EBV), sự </i>

<i>biểu hiện RPMS1 đã được xác nhận trong tất cả các khối u liên quan đến EBV [28, </i>

43]. Tuy nhiên, một vài cơng trình đã nghiên cứu về tính đa hình đơn nucleotide

<i>(SNPs) của RPMS1 đã chứng minh rằng vị trí SNP G155391A là đặc trưng cho </i>

UTVH, liên quan đến sự hình thành UTVH [44, 52, 53].

Trong nghiên cứu của Feng và cộng sự (2015), tác giả đã phát hiện rằng biến thể G155391A chuyển từ guanine (G) sang adenine (A) đã dẫn đến sự thay đổi acid amine từ Aspatic acid (D) sang Asparagine (N), liên quan đến phiên mã và biểu hiện RPMS1, SNP G155391A có chức năng điều chỉnh sự ổn định protein của RPMS1. Qua đó, RPMS1 ảnh hưởng đến hoạt động kiểm sốt các cơ chế như tăng sinh, bắt giữ chu kỳ tế bào, sự biệt hóa và quá trình apoptosis ở tế bào bằng con đường tín hiệu Notch [44].

Theo nghiên cứu của Cui và cộng sự (2017), nhóm tác giả tiếp tục phát hiện

<i>được vị trí SNP trên gene RPMS1 tại locus 155391 (G → A) được xác định có sự </i>

tương quan đáng kể với nguy cơ UTVH cao trên 50 mẫu UTVH và 54 mẫu lành [52]. Năm 2018, Wu và cộng sự đã ghi nhận 3 biến thể có ý nghĩa (G155325T,

<i>G155326A và C155389T) trên gene RPMS1. Dựa trên các đột biến này, RPMS1 được </i>

chia thành các dạng biến thể: RPMS1-A, RPMS1-B, RPMS1-C, RPMS1- D [53].

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

<i>năm 1993 bởi Ambros và cộng sự có tên là miRNA lin-4 trên loài Caenorhabditis </i>

<i>elegans, hơn 20.000 phân tử miRNA được phát hiện trên 193 lồi khác nhau và trong </i>

đó gần 1.000 miRNA được phát hiện ở người. Tồn bộ thơng tin về miRNA được lưu trữ trên cơ sở dữ liệu miRBase (

<b>Hình 1.11. Sơ đồ biểu diễn cấu trúc kẹp tóc của pri-miRNA. </b>

Q trình sinh tổng hợp miRNA bao gồm các sự kiện xảy ra trong nhân và sau đó xảy ra trong tế bào chất [19, 56]. Ở giai đoạn trong nhân, các gene mã hóa cho miRNA hay các vùng intron mã hóa (coding intron) được phiên mã bởi RNA polymerase II tạo thành phân tử miRNA sơ cấp (primary miRNA, pri-miRNA). Về cấu trúc, phân tử pri-miRNA chứa một đến hai cấu trúc kẹp tóc [57]. Các phân tử pri-miRNA có đầu 5’ được gắn mũ chụp và đầu 3’ có cấu trúc dạng poly(A) [58]. Sau đó các phân tử pri-miRNA được biến đổi thành phân tử pre-miRNA (precursor miRNA) với cấu trúc thứ cấp có chiều dài khoảng 70 nucleotide với đầu 5’ phosphate và 3’ nhô ra 2 nucleotide [19, 56]. Quá trình biến đổi này cần thiết phải có sự hỗ trợ của phân tử Drosha [56, 59]. Drosha chỉ thể hiện hoạt tính phân cắt khi hình thành phức hợp với

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

18

một phân tử protein dsRBD có tên là Pasha (trong Drosophila) hay DGCR8 (trong động vật có vú), để phân cắt pri-miRNA thành pre-miRNA [15, 56, 59]. Phân tử pre-miRNA được tạo thành, đầu 3’ có 2 nucleotide nhô ra, sẽ được phân tử exportin-5 nhận diện và vận chuyển ra khỏi nhân, vào trong tế bào chất. Ở giai đoạn xảy ra trong tế bào chất, pre-miRNA biến đổi tiếp theo thông qua con đường RAN-GTP (RAs-related Nuclear – GTP pathway) [54, 60]. Khi đi vào trong tế bào chất, pre-miRNA tiếp tục bị cắt bởi phân tử Dicer tạo thành miRNA dạng mạch đơi có chiều dài khoảng 18 - 25bp [15]. Tiếp theo, phân tử miRNA mạch đôi được tháo xoắn, một trong hai mạch sẽ bị phân hủy nhanh chóng, mạch cịn lại chính là miRNA trưởng thành [15, 61].

<b>5.2. Cơ chế phân tử hoạt động của miRNA tác động đến mRNA </b>

Cơ chế phân tử của miRNA thể hiện ở hai trạng thái: Oncogene và Tumor suppressor. Sự giảm biểu hiện hay mất đi các phân tử miRNA đóng vai trị là Tumor suppressor hoặc sự tăng biểu hiện của các phân tử miRNA đóng vai trị Oncogene dẫn đến tăng cường sự phân chia tế bào, xâm lấn hay sự tạo thành mạch máu, kết quả là dẫn đến sự tăng sinh của khối u thông qua sự biểu hiện các oncoprotein. Chẳng hạn, trên các bệnh nhân bạch cầu mãn tính dịng lympho B, phần lớn có sự mất đi hay giảm biểu hiện của hai miRNA là miR-15a và miR-16-1. Sự giảm này dẫn đến sự tăng biểu

<i>hiện của gene Bcl2 (gene ức chế quá trình apoptosis của tế bào và biểu hiện cao ở các </i>

tế bào khối u) [62, 63] Một nghiên cứu khác cho thấy miRNA-21 liên quan đến u nguyên bào đệm như một oncogene, biểu hiện vượt mức cao gấp 5-100 lần so với mơ bình thường và ức chế quá trình apoptosis [64].

Các phân tử miRNA tham gia vào q trình điều hịa âm sự biểu hiện gene bằng gắn vào đầu 3’ không dịch mã (3’UTR) của mRNA, làm cho mRNA bị phân hủy hoặc sự dịch mã xảy ra trên phân tử mRNA này bị khóa [13-15].

Giai đoạn đoạn đầu tiên, miRNA trưởng thành gắn kết với protein Ago (là nhân tố khởi đầu dịch mã 2C2 – eIF2C2 ở eukaryote) và phức hợp RISC để tạo thành phức hợp miRNA-RISC (RNA-induced silencing complex) [19]. Phức hợp miRNA-RISC gắn lên vùng 3’UTR của mRNA thông qua sự bắt cặp bổ sung của các base giữa mRNA với trình tự trên mạch dẫn (guide strand) của phân tử miRNA theo nguyên tắc bổ sung [65]. Sự nhận diện này phụ thuộc rất nhiều vào sự bắt cặp bổ sung của base

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

19

giữa vùng “seed” (vùng trung tâm) trên phân tử miRNA với mRNA [15, 19]. Vùng “trung tâm” là vùng trình tự nằm ở đầu 5’ phân tử miRNA có kích thước 2-7 nucleotide [15, 19, 65]

Sự bắt cặp giữa các cặp base giữa vùng “trung tâm” với vùng trình tự trên mRNA có thể trùng khớp hồn tồn hoặc khơng trùng khớp hồn tồn và quyết định tính ổn định tương tác giữa miRNA với mRNA [19, 66]. Một phân tử miRNA có khả năng điều hịa nhiều trình tự mRNA đích [19].

<b>5.3. Cấu trúc của miRNA-141 (has-mir-141) </b>

miRNA-141 (accession MI0000457/ NC_000012) có chiều dài là 22 nucleotide, có vị trí tại 12p13.31 (bắt đầu từ vị trí 6964097bp và kết thúc tại vị trí 6964191bp).

<small>Chú thích: Vùng “seed” được gạch chân và hai phân họ được biểu thị bằng thanh màu xanh/ đỏ. </small>

---NNNNNNNNNN NNNNNNA---AAAAA

NNNNNNNNNN

<small> </small>

NNNNNNNN

<small>A U >15 nucleotide </small>

<small>Vùng seed Vùng bắt cặp 3’ </small>

<b>Hình 1.12. Sự bắt cặp giữa miRNA và mạch mRNA đích. </b>

<b>Hình 1.13. Vị trí trình tự miRNA-141 trên nhiễm sắc thế số 12 ở người.</b>

<b>Hình 1.14. Sơ đồ biểu diễn cấu trúc kẹp tóc của pre-miR-141. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

20

miRNA-141 thuộc họ phân tử miRNA-200 [67, 68]. Họ phân tử này gồm 5 miRNA khác nhau, được phân thành hai phân họ theo sự tương đồng trình tự trong vùng “seed” (trình tự miRNA xác định độ đặc hiệu đích tương ứng với nucleotide 2-7) [68, 69]. Phân họ đầu tiên bao gồm miRNA-141 và miRNA-200a, phân họ thứ hai là miRNA-200b, miRNA-200c và miRNA-429 [68, 69]. Các miRNA nằm trong hai cụm trên các locus gene khác nhau: miR-200b, miR-200a và miRNA-429 nằm trên nhiễm sắc thể số 1 trong bộ gene người (NST số 4 ở chuột) và miRNA-141 và miRNA-200c trên nhiễm sắc thể người số 12 (nhiễm sắc thể số 6 ở chuột) [68, 69].

Theo những nghiên cứu gần đây, miRNA-141 được phát hiện biểu hiện vượt mức trong ung thư vòm họng, điều này tiếp diễn làm gia tăng sự tăng trưởng của tế bào, di cư và xâm lấn, cũng như làm mất sự điều hòa chu kỳ tế bào và ức chế quá trình apoptosis [16, 22, 67]. Sự điều hòa này được biểu hiện thông qua việc miRNA-141

<i>gắn lên các gene đích của nó như: phosphatase and tensin homolog (PTEN), </i>

<i>ubiquitin-associated protein 1 (UBAP1), và bromodomain containing 3 (BRD3) trong ung thư </i>

<i>vịm họng [22, 70]. Trong đó, BRD3 và UBAP1 đều tham gia vào quá trình phát sinh khối của ung thư vòm họng và PTEN là gene ức chế khối u [22, 70]. BRD3 tham gia điều hòa bằng con đường Rb/E2F [22]. PTEN điều hịa âm tính phosphatidylinositol-</i>

<i>3,4,5-trisphosphate trong tế bào và có chức năng ức chế khối u bằng cách điều hịa âm </i>

tính con đường tín hiệu AKT [71].

Ngoài ra, sự biểu hiện của miRNA-141 cũng được điều hòa bởi các oncogene,

<i>như: c-Myc và SPLUNC1 (short palate, lung and nasal epithelium clone 1), làm nổi </i>

bật mạng lưới điều hòa liên quan chặt chẽ đến miRNA-141 trong UTVH [22].

<b>5.4. Sự biểu hiện của miRNA-141 trong nhiều loại ung thư khác nhau </b>

Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh biểu hiện của miRNA là một đặc điểm đặc trưng của sự hình thành khối u. Sự biểu hiện q mức của miRNA có vai

<b>Hình 1.15. Trình tự của năm phân tử của họ phân tử miRNA-200. </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

21

trò như Tumor suppressor, điều hòa làm giảm các protein có hoạt tính sinh ung thư. Ngồi ra, miRNA hoạt động như Oncogene, ức chế các hoạt động của các gene ức chế khối u dẫn tới quá trình tăng sinh, hình thành mạch máu và sự xâm lấn [72, 73]. Trong đó, có nhiều nghiên cứu chứng minh miRNA-141 có liên quan đến các loại ung thư ở người, bao gồm ung thư vòm họng [16, 22, 23], ung thư gan [74-76], ung thư đại tràng [77, 78], ung thư tuyến tiền liệt [79, 80], ung thư bàng quang [81, 82], ung thư buồng trứng [83-85], ung thư vú [86-88],... Nói chung, miRNA-141 có vai trị kép trong sự hình thành khối u của người, có chức năng như là các Oncogene và Tumor suppressor ở các khối u ác tính ở người (Bảng 1.1).

<b>Bảng 1.1. Sự biểu hiện của miRNA-141 trong nhiều loại ung thư khác nhau. </b>

<b>5.5. Các tính chất của miRNA - một dấu chứng sinh học trong tiên lượng và chẩn đoán sớm ung thư </b>

Việc tìm ra các dấu chứng sinh học tiềm năng, có tính chất ổn định, đánh giá dễ dàng trên các mẫu bệnh phẩm, dành cho tiên lượng và chẩn đoán ung thư đã trở thành một việc cần thiết để tăng tỷ lệ sống sót của bệnh nhân. Từ khi khám phá ra các miRNA đầu tiên vào năm 2007, kể từ đó, sự rối loạn biểu hiện của miRNA được phát

<small>Loại ung thư </small> ^{Sự biểu hiện miR-141/}

<small>[16, 22, 23] Ung thư đại </small>

<small>MAP2K4; ZEB1/SIP1 </small>

<small>miR-141-[77, 78] Ung thư tuyến </small>

<small>miR-141-3p/KLF9 </small> ^{[79, 80]}<small>Ung thư bàng </small>

<small>Ung thư buồng </small>

<small>Ung thư gan </small> ^{Giảm / tumor}<small>suppressor </small>

<small>Giảm / tumor suppressor </small>

<small>ANP32E, PR, </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

22

hiện trong nhiều khối u của người, do đó việc phân tích các đặc tính của miRNA có thể cho phép dự đốn tốt hơn sự phát triển của ung thư.

Các tính chất quan trọng để miRNA trở thành một lựa chọn tối ưu cho khuynh hướng sử dụng như là một biomarker trong tiên lượng và chuẩn đốn sớm bệnh là: [1] Tính đặc trưng và chuyên biệt của từng loại phân tử miRNA cho từng loại ung thư khác nhau; [2] Tính lưu thơng (circulating) trong nhiều loại mẫu dịch thể như huyết thanh, huyết tương, nước tiểu, nước bọt và các thành phần dịch khác trong cơ thể [13, 91-93]; [3] Tính bền, các phân tích về mặt hóa học và sinh học cho thấy miRNA có khả năng kháng lại hoạt động của RNase, điều kiện pH, nhiệt độ cực đoan, lưu giữ tại nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian dài hay giai đoạn đông lạnh lưu trữ mẫu,… [13, 93].

Trong những năm gần đây, tính chất lưu thông của miRNA được phát hiện trong một số loại dịch cơ thể như huyết tương, huyết thanh, nước bọt,... và đã được sử dụng làm dấu chứng sinh học tiềm năng trong nhiều bệnh ở người, bao gồm ung thư [94, 95]. Việc sử dụng miRNA thuận lợi hơn do sự ổn định của miRNA trong dịch cơ thể cũng như nguồn gốc của miRNA [94, 95]. Tính chất lưu thơng của miRNA, được phát hiện trực tiếp ở các tế bào ung thư, đã được báo cáo rằng chúng có thể truyền qua các tế bào hoặc các mô và các cơ quan thông qua sự lưu thông máu, liên kết với các phức ribonucleoprotein hoặc các túi ngoại bào, như các túi vi tiểu, các exosome hoặc các tế bào apoptotic, sự bảo vệ khỏi nuclease hiện diện dồi dào trong dịch cơ thể, do đó giúp chúng ổn định và chống lại sự thối hóa [96, 97]. Những đặc tính này làm cho miRNA có tiềm năng và có giá trị như các dấu chứng sinh học mới để chẩn đoán và tiên lượng bệnh ung thư.

<b>6. Mối liên hệ giữa EBV và microRNA </b>

Các microRNA hoặc các gene từ EBV có thể ức chế dịch mã tạo protein từ các mRNA của virus, cũng như của tế bào chủ. Shinozaki và cộng sự. chứng minh rằng EBV mã hóa gene EBNA1 và LMP2A đã ức chế biểu hiện của pre-mir-200, một chất ức chế chuyển tiếp trung mơ biểu mơ (EMT) [60]. Ngồi ra, Marquitz et al. đã phân tích tính chất của miRNA trên dòng tế bào AGS-EBV, một dòng tế bào ung thư biểu mô dạ dày bị nhiễm EBV và cho thấy rằng sự xâm nhiễm của EBV làm giảm mức độ biểu hiện của miR-200, miR-143-3p và miR-146b [61]. Biểu hiện thấp của miRNA được chứng

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

23

mình có liên quan đến tiên lượng bệnh ung thư [62]. Dicer là một yếu tố thiết yếu trong việc tạo ra miRNA, chẳng hạn như miR-200, và biểu hiện thấp của Dicer giúp tăng cường sự di căn của khối u thông qua việc tạo ra EMT [63]. EBV có thể mã hóa ra miR-BART6, miR-BART6 gắn trực tiếp và gene mục tiêu Dicer và giảm biểu hiện của protein Dicer [54]. Các nghiên cứu này cho thấy rằng sự xâm nhiễm EBV làm thay đổi cấu trúc miRNA của tế bào và những thay đổi trong cấu trúc này có thể tăng cường hoạt động di căn của các tế bào khối u bị nhiễm EBV.

Đặc biệt, một số thành viên của họ gene miRNA-200 giảm biểu hiện sau khi nhiễm EBV và biểu hiện của chúng bị giảm trong một số bệnh ung thư ở người bao gồm ung thư dạ dày liên quan đến EBV và UTVH [67]. Họ gene này đã được chứng minh là rất quan trọng để duy trì kiểu hình biểu mơ bằng cách nhắm mục tiêu ZEB1 và ZEB2, hai chất ức chế E-cadherin và chất kích hoạt EMT, kích hoạt sự di động của tế bào và thúc đẩy di căn [63 điều66]. Thật vậy, Shinozaki et al. đã chứng minh rằng mức độ biểu hiện miR-200a và miR-200b đã giảm trong ung thư biểu mô dạ dày liên quan đến EBV cũng như trong các dịng tế bào ung thư biểu mơ dạ dày bị nhiễm EBV [67]. Hơn nữa, họ đã chứng minh rằng giảm biểu hiện này chủ yếu được gây ra bởi sự ức chế phiên mã của miRNA, qua trung gian một phần bởi các gen tiềm tan của EBV như: BARF0, EBNA1 và LMP2A thông qua các cơ chế chưa được làm rõ. Sự giảm biểu hiện này dẫn đến giảm biểu hiện E-cadherin do sự hiện diện của ZEB1 và ZEB2 cao hơn, dẫn đến mất sự kết dính giữa tế bào và thay đổi mạnh mẽ hình thái biểu mô, thúc đẩy di căn và xâm lấn tế bào. Vì cả ZEB1 và ZEB2 đã được chứng minh là đóng vai trị quan trọng trong việc điều hòa sự chuyển đổi trạng thái tiềm tan/ tan của EBV thông qua ức chế yếu tố phiên mã trên vùng promoter gen BZLF1 [68, 69], hai nhóm gần đây đã nghiên cứu về vai trò của họ phân tử miR -200 trong quá trình tái kích hoạt trạng thái tan của EBV [70, 71]. Ellis-Connel et al. nhận thấy rằng biểu hiện của miR-200b và miR-429 cả trong các tế bào biểu mô và tế bào B bị nhiễm EBV có thể thúc đẩy trạng thái tan của EBV bằng cách nhắm mục tiêu ZEB1 và ZEB2 và chặn hoạt động ức chế của trên vùng promoter Zp của gene BZLF1. Do đó, sự giảm biểu hiện của họ miRNA này hoặc biểu hiện quá mức của ZEB1 hoặc ZEB2 đã dẫn đến việc giảm kích hoạt lại trạng thái tan của EBV. Tương tự như vậy, Lin et al. đi đến kết luận tương tự. Họ đã chỉ ra rằng biểu hiện miR-429 trong các nguyên bào sợi bị nhiễm EBV và các tế bào B

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

24

đã làm thay đổi trạng thái cân bằng giữa trạng thái tiềm tan/ trạng thái thông qua sự ức chế ZEB1 và ZEB2.

Cùng với đó, các gene của EBV cũng tham gia điều hòa sự biểu hiện của các phân tử miRNA. Cụ thể, trong nghiên cứu của Zhu et al., (2014), nhóm nghiên cứu đã chứng minh vai trò của gene LMP1 thúc đẩy sự biểu hiện của phân tử miRNA-155. Bên cạnh đó, gene LMP1 của EBV cũng đã được chứng minh liên quan đến sự tăng biểu hiện của một số miRNA như: miR-21, miR-155, miR-146 trên bệnh nhân Burkitt's lymphoma.

<i>Tuy nhiên, mối liên hệ giữa tính chất biểu hiện của miR-141 và gene RPMS1 vẫn chưa </i>

được bất kì nghiên cứu nào trên thế giới là rõ. Do đó, đây là nghiên cứu tiền đề đầu

<i>tiên xác định đồng thời tính đa hình trên gene RPMS1 và tính chất biểu hiện của </i>

miRNA (cụ thể là miRNA-141).

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

<b>PHẦN II </b>

<b>NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐA HÌNH GENE </b>

<i><b>RPMS1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM </b></i>

<b>HỌNG TẠI VIỆT NAM </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

25

<b>1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU </b>

<b>1.1. Các phần mềm và trang web được sử dụng </b>

<b>Cơ sở dữ liệu sinh học NCBI (National Center for Biotechnology Information) </b>

( phần mềm dùng cho việc khai thác thông tin. Dịch

<b>vụ Pubmed (med/): khai thác tất cả các cơng trình nghiên cứu khoa học đã cơng bố về Y – Sinh trong MEDLINE. Dịch vụ Genbank: tìm </b>

kiếm các thơng tin như trình tự nucleotide và protein, taxonomy, genome, mapping, cấu trúc protein, thông tin vùng domain và bài báo đã công bố trên Pubmed.

<b>Phần mềm trực tuyến BLAST ( trên </b>

trang web NCBI: các đoạn mồi khi đưa vào chương trình này sẽ được so sánh với hàng trăm triệu trình tự được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI.

<b>IDT analyzer ( giúp xác định các thông số </b>

quan trọng của mồi như: chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer, Self-dimer, Hetero-dimer).

<b>Phần mềm Annhyb phiên bản 4.946: là phần mềm dùng để thực hiện các thao </b>

tác xử lí trên các trình tự nucleotide, bao gồm các tính năng như đọc trình tự, chú thích trình tự, tìm kiếm, sắp xếp trình tự oligonucleotide,…

<b>Phần mềm SeaView phiên bản 4.2.12: phần mềm có các tính năng hỗ trợ sắp </b>

gióng cột các trình tự, phân tích tương đồng.

<b>Chromas Lite 2.1.1 là phần mềm miễn phí giúp hiển thị các đường peak, thể </b>

hiện sự bắt màu của các nucleotide trong trình tự DNA.

<b>MEGA (phiên bản 6.0 Kumar, 1993): phần mềm miễn phí dùng để xây dựng </b>

cây phát sinh loài theo các phương pháp Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Neighbor-Joining.

<b>Bioedit: là phần mềm dùng để so sánh nhiều trình tự nucleotide hay amino </b>

acid.

<b>1.2. Mẫu thí nghiệm </b>

Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu được thu nhận từ các bệnh nhân đến khám tại phòng khám Tai – Mũi – Họng, bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh. Bộ

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

26

mẫu gồm 20 mẫu mơ được chẩn đốn chính xác bằng giải phẫu bệnh là ung thư vịm họng thơng qua các phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (HE). Trong trường hợp kết quả nhuộm HE cho kết quả nghi ngờ sẽ được đề nghị thực hiện nhuộm hóa mơ miễn dịch để phát hiện kháng nguyên Ki67 trong nhân tế bào. Đồng thời, 20 mẫu ở dạng dịch phết được thu nhận và kiểm tra âm tính với kết quả nhuộm HE. Các mẫu sau khi thu nhận được bảo quản trong dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline), dùng để đối chứng. Bộ mẫu này được bảo quản trong dung dịch PBS, ở nhiệt độ thấp và chuyển về phịng thí nghiệm tiến hành các phương pháp thực nghiệm sau này.

Tất cả các mẫu nghiên cứu (bao gồm các mẫu sinh thiết UTVH và mẫu dịch phết lành tính) đều kế thừa bộ mẫu nghiên cứu được sự đồng ý cho phép từ Hội Đồng Y Đức Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh: 516/BVCR-HDDD, và sự đồng ý của bệnh nhân tham gia nghiên cứu.

<b>1.3. Dụng cụ - thiết bị - hóa chất </b>

<i>1.3.1. Dụng cụ </i>

Các dụng cụ thơng thường trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử. Các dụng cụ chính bao gồm: kẹp lấy mẫu, đèn cồn, eppendorf, micro pipette, đầu tip, ống đong, erlen,…

<i>1.3.2. Thiết bị </i>

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý), máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức), bộ điện di DNA (Biorad), tủ lạnh (LG), tủ đông (Sanyo), tủ ủ nhiệt (Multitemp III), cân kỹ thuật (Satorious, Đức), tủ hút khí độc (Ascent Max), máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS), máy luân nhiệt (My-cycle Thermal, Biorad), máy đọc gel (Gel Doc XR System, Biorad), lị vi sóng (Sharp).

<i>1.3.3. Hóa chất cần cho quy trình tách chiết DNA </i>

Tris-HCl pH 8 1M, EDTA 0,5M; SDS 10%; NaCl 0,5M (đã hấp); H₂O (đã hấp); Proteinase K 1mg/ml; Phenol; Chloroform; Isoamyl acolhol; TE 1X, Ethanol 70%, Ethanol tuyệt đối; Isopropanol; NaOAc 3M.

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

27

<b>1.4. Quá trình nghiên cứu thực nghiệm </b>

<i><b>Hình 2.1. Tóm tắt quy trình nghiên cứu tính chất đa hình gene RPMS1 </b></i>

<small>Giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự </small>

<small>Ghi nhận các biến thể và tần số xuất hiện trên </small>

<small>từng gene </small>

<b><small>Nhận xét và biện luận kết quả </small></b>

<small>Xử lí thống kê tần số phát hiện Ghi nhận các biến thể chủ đạo và tần số xuất hiện biến thể </small>

<small>này trên từng gene Thu thập dữ liệu từ các </small>

<small>nghiên cứu trước </small>

<small>Ghi nhận cặp mồi khuếch đại gene </small>

<small>mục tiêu </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

28

<b>2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>

<b>2.1. Tiêu chuẩn chọn lọc, loại bỏ công bố khoa học phục vụ cho khảo sát </b>

<i><b>in silico </b></i>

<i>Tiến hành tìm kiếm các thông tin về tính đa hình của gene RPMS1 trên bệnh </i>

nhân ung thư vòm họng. Các cơng trình nghiên cứu được thu nhận trên các cơ sở dữ liệu, bao gồm: PUBMED, Web of Science, Embase Database bằng một số từ khóa như: Nasopharyngeal carcinoma, BARTs, RPMS1, SNP, variation, structure, mechanism,…

Các công bố khoa học được chọn vào phân tích tổng hợp theo một số tiêu chuẩn như sau: [1] Nghiên cứu ca-chứng (case-control study)/ hoặc nghiên cứu đoàn hệ

<i>(cohort study) trong khảo sát tính đa hình gene RPMS1 với các đặc điểm lâm sàng: giai đoạn bệnh, độ tuổi,…; [2] Mối quan hệ giữa tính đa hình gene RPMS1 trên bệnh </i>

UTVH; [3] Các nghiên cứu liên quan đến phương pháp phân tích tính đa hình gene RPMS1.

Tiêu chí loại bỏ: các cơng bố khoa học khơng trình bày dưới ngơn ngữ Anh; các cơng bố chỉ có phần tóm tắt (abstract), các bài tổng quan (review), các bài thư gửi tạp chí (letter to editor), … đều không được đưa vào dữ liệu thống kê.

<i>2.1.1. Trích xuất dữ liệu </i>

Dựa vào các cơng trình nghiên cứu đề cập đến tính đa hình, các biến thể của

<i>RPMS1 tiến hành thu nhận thông tin về tác giả, năm xuất bản, đặc điểm mẫu bệnh và </i>

mẫu lành, tần số xuất hiện của từng biến thể trong mẫu bệnh và mẫu lành (Trình bày theo bảng 2.1). Sau đó, tiến hành thống kê trung bình có trọng số tần số xuất hiện các biến thể, loại mẫu và phương pháp phát hiện biến thể.

<b>Bảng 2.1</b>

<b>. </b>

Tần số phát hiện các biến thể của các gene

<small>STT </small> ^Tác

<small>giả Năm </small> ^Quốc<small>gia </small>

<small>Loại mẫu (Mẫu bệnh) </small>

<small>Loại mẫu (Mẫu lành) </small>

<small>Loại biến thể </small>

<small>TLTK Tần số xuất </small>

<small>hiện trên mẫu bệnh </small>

<small>Tần số xuất hiện trên mẫu lành </small>

<small>Chú thích: STT – số thứ tự; TLTK – tài liệu tham khảo </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

29

<i><b>2.2. Khảo sát in silico. </b></i>

<i>Sau khi thu nhận tần xuất của các biến thể trên gene RPMS1 (trình bày như </i>

bảng 2.1). Tiến hành tính tần số trung bình có trọng số nhằm loại bỏ các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thống kê.

Tiến hành thống kê phân loại tần số xuất hiện các biến thể theo phương pháp, loại mẫu. Tính tốn tần số trung bình có trọng số nhằm đưa ra phương pháp và loại mẫu thích hợp nhất.

<b>2.3. Phương pháp đánh giá mồi </b>

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu được kế thừa từ các cơng trình nghiên cứu đã cơng bố. Sau đó, sẽ được khảo sát các thơng số vật lý, vị trí bắt cặp trên trình tự đích, độ đặc hiệu của mồi.

Các thông số vật lý của mồi được khảo sát bằng phần mềm trực tuyến IDT OligoAnalyzer 3.1. Các thông số của mồi phải đạt các tiêu chí sau: chiều dài mồi trong khoảng 17-28 bps, %GC nằm trong khoảng 40-60%, T_m nằm trong khoảng 50-60^oC, năng lượng hình thành các cấu trúc thứ cấp (ΔG) phải lớn hoặc bằng -9Kcal/mol<small>-1</small>

. Phần mềm Annhyb v.4.946 được sử dụng để khảo sát vị trí bắt cặp của mồi trên trình tự đích, độ dài của sản phẩm PCR. Mồi đạt yêu cầu khi trình tự mồi bắt cặp với trình tự đích trên 90% tổng số nucleotide của mồi.

Phần mềm trực tuyến Primer-BLAST trên trang web NCBI. Các đoạn mồi khi đưa vào chương trình này sẽ được so sánh với hàng trăm triệu trình tự được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI.

<b>2.4. Tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/ Chloroform </b>

<b>Bước 1: Ly giải tế bào </b>

Trường hợp tách chiết DNA từ mẫu mô sinh thiết:

Dùng kéo (vô trùng) cắt một phần mô nhỏ (khoảng 1 mm²), cho mẫu mô vào eppendorf sạch cắt nhuyễn mẫu mô (càng nhỏ càng tốt). Thêm 50 µl dung dịch trữ mẫu.

Vortex ống mẫu trong 10 phút. Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong vòng 20 phút.

</div>