khảo sát hoạt tính kháng một số vi khuẩn sinh của vi khuẩn nội sinh carbapenemase và cao chiết từ cây dược liệu dừa cạn catharanthus roseus l g don và lá trầu không piper betle l

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.52 MB, 94 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

<small>--- Ốpâtì ^Ké*---</small>

<i><b>Tên đề tài:</b></i>

<b>KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT SỐ VI KHUẨN SINH CARBAPENEMASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY DƯỢC LIỆU DỪA CẠN </b><i><b>(Catharanthus</b></i>

<i><b>roseus (L.) G. Don) VÃ LÁ TRẦU KHÔNG (Piper betỉe L.)</b></i>

<b>CHUYÊN NGÀNH: VI SINH -SINH HỌC PHÂN TỦ</b>

<b> ThS.NguyễnVăn </b>

<b>MinhGVDHD: </b>

<b>ThS.</b>

<b> Dương</b>

<b> Nhật </b>

<b>SVTH: HồQúi Đăng</b>

<b>MSSV:1253012080Niên khố:2012 - </b>

TP.

Hồ

ChíMinh,

tháng

5 năm 2016

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<i><b>roseus </b></i><b>(L.) G. Don) VÀ LÁ TRẦU KHÔNG (Piper betle L.) </b>

<b>CHUYÊN NGÀNH: VI SINH –SINH HỌC PHÂN TỬ </b>

<b>GVHD: ThS. Nguyễn Văn Minh GVDHD: ThS. Dương Nhật Linh SVTH: Hồ Qúi Đăng </b>

<b>MSSV: 1253012080 Niên khoá: 2012 - 2016 </b>

TP. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2016

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

Bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban Giám hiệu, quý Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở - thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức trong thời gian thực tập tại trường làm cơ sở để em

<b>thực hiện đề tài nghiên cứu. Thầy Nguyễn Văn Minh, cô Dương Nhật Linh, đã tận tình </b>

hướng dẫn, truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành đề tài trong suốt thời gian thực hiện. Cảm ơn chị Trần Thị Á Ni đã luôn giúp đỡ, động viên em những lúc khó khăn nhất. Cảm ơn các bạn, các em sinh viên Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Các bạn lớp DH12SH02, các bạn lớp DH12VS01 đã quan tâm và chia sẻ cùng tôi quãng đời sinh viên nhiều kỉ niệm đẹp và đáng nhớ. Cuối cùng, con xin

<b>cảm ơn Ba Mẹ, cảm ơn gia đình, người thân và các anh chị luôn chăm lo, ủng hộ, tin </b>

tưởng, khích lệ con những lúc khó khăn và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để con được yên tâm học hành, nghiên cứu. Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến các Thầy Cô khoa CNSH, chúc các Thầy Cô gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống và trên con đường giảng dạy.

Xin chân thành cảm ơn !

<i> Bình Dương, ngày … tháng … năm 2016 </i>

<i>Hồ Qúi Đăng Tháng 5 năm 2016 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

1.1.1 Khái quát về cây Trầu Không (Piper betle L.) ... 5

1.1.2 Công dụng trong y học và hoạt tính sinh học của Trầu Khơng (Piper betle L.) ... 7

1.1.3 Khái quát về cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) ... 8

1.1.4 Công dụng trong y học và hoạt tính sinh học của cây Dừa Cạn <i>(Catharanthus roseus (L.) G. Don) ... 10 </i>

1.2 SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH ... 10

1.2.1 Vi sinh vật nội sinh ... 10

1.2.2 Vi khuẩn nội sinh... 10

1.3 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU ... 11

1.3.1 Vi khuẩn Acinetobacter spp. ... 11

1.3.2 Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) ... 12

1.3.3Vi khuẩn Klebsiella spp. ... 13

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

1.4 KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU ... 15

1.4.1 Các loại cao dược liệu ... 16

1.4.2 Kỹ thuật chiết Soxhlet ... 16

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI ... 18

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ... 18

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước ... 19

PHẦN 2: ... 20

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20

2.1 VẬT LIỆU ... 21

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ... 21

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu ... 21

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và môi trường ... 21

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 22

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

2.2.7 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn gây

bệnh ... 29

2.2.8 Định danh vi khuẩn nội sinh bằng test sinh hóa ... 31

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 37

3.1 Kết quả tái kiểm tra vi khuẩn nội sinh từ bộ chủng vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn và lá Trầu Không đã phân lập trước đó. ... 38

3.1.1 Kết quả tái phân lập vi khuẩn nội sinh lá Trầu Không. ... 38

3.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn. ... 39

3.2 Kết quả thử nghiệm đối kháng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc sinh carbapenemase với các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu ... 43

3.3 Kết quả thử nghiệm đối kháng các chủng vi khuẩn sinh carbapenemase của dịch lọc các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu ... 46

3.4 Kết quả định danh chủng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn cao nhất của vi khuẩn nội sinh cây dược liệu ... 50

3.5 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ lá Trầu Không và rễ dừa Cạn. ... 52

3.5.1 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá Trầu Không ... 52

3.5.2 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết rễ cây Dừa Cạn. ... 54

3.6 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn gây bệnh . 55 3.7 THẢO LUẬN ... 56

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>DANH MỤC VIẾT TẮT </b>

CDC Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh Mĩ

CFU Colony Forming Unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc

CLSI Viện tiêu chuẩn lâm sang và thí nghiệm

Cs. Cộng sự

<i>E. coli Escherichia coli </i>

ESBL Men beta-lactamase phổ rộng

Gram (-) Gram âm

Gram (+) Gram dương NA Nutrient Agar

NB Nutrient Broth

MHB Mueller-Hinton Broth

MHA Mueller-Hinton Agar

TSA Trypticase Soy Agar

WHO Tổ chức y tế thế giới

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>DANH MỤC BẢNG</b>

Bảng 1.1: Ưu và nhược điểm của phương pháp chiết Soxhlet ... 18 Bảng 2.1: Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh của chất thử (MIC) ... 30 Bảng 3.1: Bảng kết quả khảo sát đại thể và vi thể vi khuẩn nội sinh từ lá Trầu Không ... 38 Bảng 3.2: Bảng kết quả kết quả khảo sát đại thể và vi thể vi khuẩn nội sinh từ cây Dừa Cạn ... 41 Bảng 3.3: Bảng kết quả đối kháng vi khuẩn sinh carbapenemase của vi khuẩn nội sinh ... 44 Bảng 3.4: Bảng kết quả đối kháng vi khuẩn sinh carbapenemase của dịch lọc vi khuẩn nội sinh ... 47 Bảng 3.5: Kết quả định danh sinh hóa chủng nội sinh ... 51 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh của cao chiết lá Trầu Không ... 52 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh của cao chiết rễ cây Dừa Cạn ... 54 Bảng 3.8: kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết lá Trầu Không kháng các chủng vi sinh vật gây bệnh (μg/ mL) ... 55

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>DANH MỤC HÌNH ẢNH </b>

<i>Hình 1.1: Cây Trầu Khơng (Piper betle L.) ... 5 </i>

<i>Hình 1.3: Cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) ... 8 </i>

Hình 2.1: Bố trí thử nghiệm khuẩn kháng khuẩn ... 26

Hình 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn trên môi trường TSA ... 39

Hình 3.2: Kết quả làm thuần vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn ... 40

Hình 3.3: Kết quả quan sát đại thể và vi thể của vi khuẩn TBD1 nội sinh cây Dừa Cạn ... 40

<i>Hình 3.4: TK8 kháng E. coli : 49e ... 45 </i>

Hình 3.5: Kết quả vòng kháng vi khuẩn gây bệnh của dịch lọc vi khuẩn nội sinh đối với vi khuẩn thử nghiệm ... 49

Hình 3.6: Kết quả nhuộm gram của chủng RBD11, RBD14 ... 50

Hình 3.7: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ lá Trầu Không ... 53

Hình 3.8: Kết quả khả năng kháng khuẩn của cao chiết cây Dừa Cạn ... 54

Hình 3.9: kết quả MIC của mẫu cao chiết từ lá trầu không với vi khuẩn gây bệnh 86p ... 55

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ </b>

Sơ đồ 2.1: Quy trình thí nghiệm ... 22 Sơ đồ 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tái phân lập vi khuẩn nội sinh từ lá Trầu Không và phân lập vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn ... 23 Sơ đồ 2.3: Quy trình chuẩn bị và chiết xuất cao dược liệu ... 27 Biểu đồ 3.1: So sánh khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh cây dược liệu ... 48 Biểu đồ 3.2: Kết quả kháng khuẩn của cao chiết từ lá Trầu Không ... 53

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ </b>

Hiện nay việc sử dụng các bài thuốc từ thực vật để chữa bệnh ngày càng phổ biến. Các loài thực vật này có trong tự nhiên, dễ kiếm lại ít có những tác dụng phụ cho con người, do đó đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế giới (Võ Thị Mai Hương, 2009). Bên cạnh đó, một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, vi khuẩn nội sinh cây dược liệu có khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn chất kháng khuẩn, kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây bệnh (Ryan và cs, 2008). Với những công dụng to lớn của các cây dược liệu, để tận dụng và phát triển nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước, nhằm đem đến nhiều lựa chọn hơn cho vấn đề sức khỏe của con người và động vật.

Thời gian gần đây, thế giới đang rất lo ngại trước sự gia tăngkhông ngừng của hiện tượng đề kháng kháng sinh của nhiều lồi vi khuẩn. Có rất nhiều ngun nhân dẫn đến hiện tượng này; như sử dụng thuốc kháng sinh một cách bừa bãi, không đúng cách, không sử dụng đúng liều lượng và thời gian trị liệu. Các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn đề kháng kháng sinh ngày càng nhiều, trong môi trường bệnh viện và cộng đồng (Conly J., 2002).

Vì vậy, hướng đi mới trong điều chế thuốc kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật nội sinh thực vật có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn ngày càng được quan tâm.

Ở Việt Nam, Trầu Không được dùng chữa hàn thấp nhức mỏi, đau bụng đầy hơi, vết thương nhiễm trùng có mủ sưng đau, hen suyễn khi thời tiết thay đổi, đờm nhiều khó thở, cảm mạo, bỏng, mụn nhọt, hắc lào, mề đay, ghẻ ngứa, sâu kiến đốt, viêm quanh răng, viêm tai, viêm họng. Dùng ngoài, đắp lá tươi giã nát hoặc ngâm lá với nước để rửa (Đỗ Tất Lợi, 2004). Trầu Không có các tác động dược lý khác nhau như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, kháng viêm,…(Singh và cs., 2009). Một số bệnh viện nước ta dùng cao nước Trầu Khơng thí nghiệm điều trị bệnh viêm cận răng (paradentose)

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

có hiệu quả (Đỗ Tất Lợi, 2004). Trong Trầu Khơng có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn. Như trong nghiên cứu của Nalina T. và Rahim Z. H. A. đã thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô của lá trầu Malaysia lên

<i>vi khuẩn gây sâu răng trong khoang miệng người là Streptococcus mutans (Nalina T. và </i>

cs., 2006; Nalina T. và cs., 2007).

Theo Đông y, Dừa Cạn có tác dụng làm săn, chống viêm, hạ áp, được sử dụng để điều trị một số bệnh: viêm đại tràng, khí hư bạch đới, tăng huyết áp, viêm nhiễm phần phụ, kinh bế, zona, phong ngứa, đái tháo đường, vàng da...Ngoài ra, người ta thường dùng Dừa Cạn là thuốc kìm tế bào và được chỉ dẫn trong điều trị bệnh Hodgkin. Trong dân gian, người ta dùng lá giã nát đắp lên những vết bỏng làm mát da thịt, giảm đau, chống bội nhiễm (Thanh Ngọc, 2014).

Việc nghiên cứu các nhóm vi khuẩn nội sinh trong cây dược liệu có khả năng kháng lại với một số vi khuẩn kháng thuốc sinh carbapenemase là rất cần thiết nhằm tìm ra những loại hợp chất sinh học mới trong tương lai, hỗ trợ thiết thực cho việc điều trị nhiễm trùng.

Vì vậy, nhằm phát huy và phát triển nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước, kết hợp

<b>giữa y học cổ truyền và y học hiện đại tôi tiến hành đề tài: “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT SỐ VI KHUẨN SINH CARBAPENEMASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY DƯỢC LIỆU DỪA CẠN (</b><i><b>Catharanthus roseus </b></i>

<b>(L.) G. Don) VÀ LÁ TRẦU KHÔNG (Piper betle L.)”</b>

<b>Mục tiêu: </b>Khảo sát khả năng đối kháng với một số vi khuẩn kháng thuốc sinh Carbapenemase vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ cây dược liệu Dừa Cạn (<i>Catharanthus roseus (L.) G. Don) và lá Trầu Không (Piper betle L.)” </i>

<b>Nội dung nghiên cứu:</b>

- Tái kiểm tra vi khuẩn nội sinh từ cây Dừa Cạn và lá Trầu Không.

- Xác định khả năng đối kháng và hoạt tính kháng khuẩn một số vi khuẩn kháng thuốc sinh carbapenemase của vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn và lá Trầu Khơng.

<i>- Định danh vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao. </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

- Chiết xuất cao dược liệu từ cây Dừa Cạn (<i>Catharanthus roseus (L.) G. Don) và lá Trầu Không (Piper betle L.)” .</i>

- Xác định nồng độ thấp nhất (MIC) của chiết xuất cao dược liệu từ cây Dừa Cạn và lá Trầu Không ức chế sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc sinh carbapenemase trong môi trường nuôi cấy.

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<b>PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<b>1.1 TỔNG QUAN THỰC VẬT</b>

<i>1.1.1 Khái quát về cây Trầu Không (Piper betle L.) </i>

1.1.1.1 Phân loại thực vật Giới (regnum): Plantae

Ngành (division): Magnoliophyta

<i>Lớp (class) : Magnoliopsida </i>

Bộ (ordo) : Piperales Họ (familia) : Piperaceae Chi (genus) : Piper

<i>Loài (species): P. betle (Pradhan L. D., 2013). </i>

<i><b>Hình 1.1: Cây Trầu Khơng (Piper betle L.) </b></i>

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây Trầu Không hay Trầu, Thược Tương, Hruề Êhang (Bn Mê Thuột) có tên

<i>khoa học là Piper betle L. (Piper siriboa L.), thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae). Là một loại </i>

cây mọc leo, thân nhẵn, lá mọc so le, cuống có bẹ, dài 1,5 – 3,5 cm; phiến lá hình trái xoan, dài 10 – 13 cm; rộng 4,5 – 9 cm; phía cuống hình tim (đối với những lá phía gốc),

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

đầu lá nhọn, khi soi lên thấy nhiều điểm chứa tinh dầu rất nhỏ, gân lá thường 5; hoa khác

<i>gốc mọc thành bơng, quả mọng khơng có vịi sót lại. </i>

<i><b>Hình 1.2: Đặc điểm cây Trầu Không (Piper betle L.) </b></i>

1.1.1.3 Nguồn gốc

Trầu Khơng có nguồn gốc ở miền trung và đông Malaysia, được trồng từ 2500 năm trước, sau đó lan sang Madagasca và Đơng Phi. Ở Trung Quốc, Trầu không được ghi chép từ đời nhà Tần năm 618 – 907 sau công nguyên. Đầu thế kỷ XV, cây bắt đầu được đưa sang Châu Âu. Ngày nay Trầu Không được trồng phổ biến ở khắp các nước nhiệt đới vùng Nam Á và Đông Nam Á như Ấn Độ, Srilanka, Malaysia, Thái Lan, Indonesia, Philipine, Việt Nam, Trung Quốc,… (Đỗ Huy Bích và cs., 2003).

Năm 1999, Theo Kumar, Trầu Khơng trong tự nhiên có ở trung và đơng Malaysia, đã được đưa vào trồng hơn trong suốt 2500 trước ở Châu Á. Ngồi ra cịn được tìm thấy ở Madagasca và phía đơng Châu Phi nhiều năm sau đó và cũng đã được đưa đến phía tây Ấn Độ. Với dược tính được biết thì lồi cây này được sử dụng rộng rãi tại Ấn Độ, Indonesia và nhiều quốc gia như Malaysia, Việt Nam, Lào, Camphuchia, Thái Lan, Myanmar, Singapore (Kumar N., 1999).

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

<i>1.1.2 Cơng dụng trong y học và hoạt tính sinh học của Trầu Không (Piper betle L.) </i>

Trầu Không có vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm, vào các kinh, phế tỳ, vị, có tác dụng trừ phong thấp, chứng lạnh, hạ khí, tiêu đờm, tiêu viêm, sát trùng. Y học dân gian nhiều nước có kinh nghiệm dùng nước sắc lá trầu để rửa vết thương và những chỗ lở loét ngoài da, mẫn ngứa, viêm mạch hạch huyết. Ở Indonesia, dân gian dùng trầu làm thuốc kháng sinh, kháng khuẩn, diệt nấm.

Trầu Khơng có các tác động dược lý khác nhau như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, kháng viêm,…(Singh và cs., 2009). Một số bệnh viện nước ta dùng cao nước Trầu Khơng thí nghiệm điều trị bệnh viêm cận răng (paradentose) có hiệu quả (Đỗ Tất Lợi, 2004). Trong Trầu Khơng có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn. Như trong nghiên cứu của Nalina T. và Rahim Z. H. A. đã thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô của lá trầu Malaysia lên vi khuẩn gây sâu

<i>răng trong khoang miệng người là Streptococcus mutans (Nalina T. và cs., 2006; Nalina T. và cs., 2007). Cao lá và tinh dầu Trầu Khơng có hoạt tính ức chế in vitro các chủng vi khuẩn: tụ cầu vàng, phế cầu, Staphylococcus albus, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, liên cầu tan máu, E. coli, S. typhi, phẩy khuẩn tả, Shigella flexneri, Shigella shigae, Proteus vulgaris, Sarcina lutea và Erwinia carotovona, các chủng nấm: C. albicans, Candida stellatoides, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Curvularia lunata, Fusarium oxysporum và Rhizopus cans. Nước cất lá có tác dụng ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao in vitro trong thử nghiệm pha loãng với nồng độ ức </i>

chế thấp nhất 1 : 5000 (Panuwat Suppakul và cs., 2006).

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

1.1.3 Khái quát về cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

1.1.3.1 Giới thiệu về cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) Tên khoa học: Catharanthus roseus L., Vinca rosea L., Lochnera rosea Reich. Tên thường gọi: Bông Dừa, Dừa Cạn, Hoa Hải Đằng, Trường Xuân, Dương Giác.

1.1.3.2 Vị trí phân loại cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) Giới : Plantae

Ngành : MagnoliophytaLớp : Magnoliopsida Bộ : Gentianales Họ : Apocynaceae Chi <i>: Catharanthus </i>

Loài <i>: Catharanthus roceus L. (Đỗ Tất Lợi, 2004). </i>

<i><b>Hình 1.3: Cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) </b></i>

Tiếng Anh từ Catharanthus nghĩa là “pure flower”: hoa tinh khiết, hoa tinh khơi và roceus có nghĩa là “rose coloured flower”: hoa có màu sắc hồng (Nguyễn Hoàng Lộc, 1999).

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

1.1.3.3 Đặc điểm thực vật

Cây Dừa Cạn là cây thân thảo sống lâu năm, mọc đứng, phân nhiều cành, cây cao 0,4 – 0,8 m. Thân hình trụ có 4 khía dọc, có lơng trắng, thân non màu xanh lục nhạt, chuyển dần sang màu hồng tím theo thời gian phát triển của cây. Bộ rễ rất phát triển, thân gỗ phía gốc và phần trên mềm. Cây mọc thành bụi dày, có cành đứng. Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, đầu hơi nhọn, dài 4-7 cm, rộng 2-3 cm, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, có lơng. Cuống lá ngắn dài 3-5 mm. Gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, 12-14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới, cong hướng lên trên. Rễ thường chỉ có một rễ chính và nhiều rễ phụ. Rễ chính đâm thẳng xuống đất, có thể đạt chiều dài 30-40 cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa, ngắn, phát triển theo chiều ngang. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; cuống hoa dài 4-5 mm. Lá đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp. Hoa có màu tím (Đỗ Tất Lợi, 1991; Đào Hùng Cường, 2011).

1.1.3.4 Nguồn gốc

<i>Chi Dừa Cạn Catharanthus rosesus có nguồn gốc từ đảo Madagasca Châu Phi. </i>

Nhưng nó đã mọc hoang dại và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới như Ấn Ðộ, Indonesia, Philippine, châu Phi, châu Úc, Braxin... Tại châu Âu và châu Mỹ ở những vùng nóng cây được trồng quanh năm, những vùng lạnh cây được trồng theo mùa vì khơng chịu được lạnh. Cây Dừa Cạn là lồi cây chịu được các điều kiện khô hạn và thiếu chất dinh dưỡng, nó khá phổ biến trong các khu vườn cận nhiệt đới (Huxley A., 1992).

Tại Việt Nam, Dừa Cạn là cây hoang dại, có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Dừa Cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên -Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên, …( Đỗ Tất Lợi, 1991). Trước đây, Dừa Cạn chỉ được trồng làm cảnh, nhưng gần đây đã được trồng để thu hoạch lấy cây, lá và rễ để chế thuốc.

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

<i>1.1.4 Công dụng trong y học và hoạt tính sinh học của cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) </i>

<b>1.2 SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH </b>

1.2.1 Vi sinh vật nội sinh

Vi sinh vật nội sinh là những những vi sinh vật (chủ yếu là nấm và vi khuẩn) sống trong mô thực vật khỏe mạnh, không gây ra các tác động tiêu cực đến kí chủ (Sturz và cs., 2000; Wellington và Marcela, 2004). Để tự bảo vệ mình trước những tác động của mơi trường, vi khuẩn nội sinh thực vật tạo thành những ổ vi khuẩn, xâm chiếm và nội sinh trên đốt cây. Những vi khuẩn này thường xâm chiếm vào vùng không gian ở giữa các tế bào, chúng có thể được phân lập từ tất cả các bộ phận của cây, bao gồm cả hạt giống (Posada và cs., 2005). Vi sinh vật nội sinh thực vật được tìm thấy trong hầu hết ở các loài thực vật sống trên Trái đất, giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh, tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh,… ( Strobel và cs., 2003). 1.2.2 Vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học (He và cs., 2009). Người ta cho rằng hoạt động hỗ sinh của thực vật có sự hiện diện của vi sinh vật nội sinh như một chất "kích hoạt sinh học" (biological trigger) để kích hoạt các hệ thống phản ứng một cách nhanh hơn và mạnh mẽ hơn so với thực vật không được hỗ sinh (Bandara và cs., 2006; Strobel và Daisy, 2003). Vi khuẩn nội sinh sản xuất hàng loạt các chất chuyển hóa thứ cấp tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta có thể ứng dụng trong y học, nơng nghiệp hay công nghiệp. Vi khuẩn

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

nội sinh có thể ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới. Một số nghiên cứu tìm thấy thuốc kháng sinh mới, các hợp chất ức chế miễn dịch và các hợp chất chống ung thư sau khi phân lập, làm thuần và khảo sát hoạt tính đặc tính của một số vi sinh vật nội sinh trong thời gian qua (Schutz, 2001). Nghiên cứu cơ chế sản sinh chất chuyển hóa mới trong sự đa dạng sinh học của vi khuẩn nội sinh có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả các bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel, 1993).

<b>1.3 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU </b>

<i>1.3.1 Vi khuẩn Acinetobacter spp. </i>

– Phân loại theo khóa phân loại quốc tế

<i> Acinetobacter spp. được phân loại như sau (Dworkin M., 2006): </i>

Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Moraxellaceae Chi: <i>Acinetobacter </i>

– Hình thái

<i>Acinetobacter </i>spp. là những vi khuẩn Gram (-), đa hình, rất dễ nhầm giống

<i>Neisseria. Trên phết nhuộm Gram trực tiếp từ các bệnh phẩm, Acinetobacter spp. là </i>

những song cầu nhỏ.

<i>Vi khuẩn Acinetobacter spp. có thể gây nhiễm khuẩn bệnh viện với những bệnh </i>

nặng như viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi và nhiễm khuẩn huyết có khuynh hướng ngày càng gia tăng (Nguyễn Thanh Bảo, 2011).

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

– Tình hình đề kháng kháng sinh :

<i>Ở Mĩ, dữ liệu nhiễm khuẩn bệnh viện xác định 65-75% bởi Acinetobacter đa </i>

kháng thuốc và không nhạy với carbapenem tăng từ 9% trong năm 1995 lên 57% trong năm 2008 (WHO, 2011).

Ở Việt Nam, trong những nghiên cứu gần đây cho thấy, tại một số bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh, các vi khuẩn Gram (-) là căn nguyên thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện cũng đã kháng lại cephalosporin thế hệ 3 và gia tăng từ 25% trong năm 2000-2001 lên đến 42% trong năm 2009 (GARP - VN, 2010).

<i>1.3.2 Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) </i>

– Phân loại theo khóa phân loại quốc tế

<i>Escherichia coli được phân loại như sau (Dworkin M., 2006): </i>

Trực khuẩn Gram (-), dài hay ngắn tùy thuộc môi trường nuôi cấy. Một số di

<i>động, một số lại bất động. Một số có nang. Vi khuẩn khơng sinh bào tử. E. coli có kích </i>

thước trung bình 2 – 3 µm x 0,5 µm.

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

– Khả năng gây bệnh

<i>Viêm màng não: E. coli chiếm khoảng 40 % trường hợp gây viêm màng não ở trẻ </i>

sơ sinh, 75 % trong số đó có kháng nguyên K1 (Nguyễn Thanh Bảo, 2011). – Tình hình đề kháng kháng sinh

Theo một báo cáo tổng kết về tình hình đề kháng kháng sinh ghi nhận từ 15 bệnh

<i>viện của GARP – VN cho thấy tỷ lệ E. coli kháng với cephalosporin thế hệ 3 khá cao và </i>

có tỷ lệ kháng cao với cotrimoxazole dao động từ 60 %– 80 % tại hầu hết các bệnh viện.

<i>Tuy nhiên, tỷ lệ E. coli kháng với carbapenems thấp hơn 2 % (GARP – VN, 2010). </i>

<i>1.3.3 Vi khuẩn Klebsiella spp. </i>

<i>Klebsiella spp. là vi khuẩn thường trú ở đường ruột, chúng có mặt khắp nơi trong </i>

tự nhiên như ở đất, nước, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao, các sản phẩm thực vật. Ở người, có thể tìm thấy chúng ở da, cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hay vết thương (Podschun và cs, 1998; Dworkin M., 2006).

– Phân loại theo khóa phân loại quốc tế

<i>Klebsiella </i>được phân loại như sau (Buchanan R. E. và Gibbons N. E., 1994; Dworkin M., 2006):

Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: <i>Klebsiella </i>

<i>Trong chi Klebsiella, K. pneumoniae là thành viên quan trọng nhất về bệnh học và </i>

là một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng trong những năm gần đây (Podschun và cs, 1998).

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

– Hình thái

<i>Klebsiella spp. là trực khuẩn Gram (-), khơng di động, có vỏ polysacharide đặc trưng giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệ của tế bào chủ (Podschun và cs, 1998). </i>

<i>Klebsiella spp. có kích thc 0,3-1,5 àm ì 0,6-6,0 µm, hình que, thường đứng </i>

thành từng đôi, không sinh bào tử (Buchanan R. E. và Gibbons N. E., 1994). – Khả năng gây bệnh

<i>Klebsiella spp. có thể gây tổn thương ở hầu hết các cơ quan của cơ thể như: viêm </i>

xoang, viêm họng, viêm màng não, viêm phúc mạc, đáng chú ý là trẻ con có thể bị viêm

<i>ruột do loài vi khuẩn này. Tuy nhiên, nhiễm khuẩn bệnh viện do Klebsiella tăng cao chủ </i>

yếu do việc sử dụng kháng sinh không hợp lý nên làm gia tăng những chủng kháng thuốc (Podschun và cs, 1998; Dworkin M., 2006).

– Tình hình đề kháng kháng sinh

<i>Tính đề kháng kháng sinh của các loài Klebsiella rất cao. Tất cả đã đề kháng với ampicillin do sự có mặt của gen mã hóa sản xuất β - lactamase đặc hiệu cho penicillin. </i>

Carbapenem (imipenem, ertapenem, meropenem, doripenem) được coi là kháng sinh có

<i>tác dụng nhất trong việc điều trị các ca nhiễm ESBL. Tuy nhiên, “siêu vi khuẩn” K. pneumoniae có khả năng kháng carbapenem với một số cơ chế khác nhau đang bùng phát </i>

và trở thành mối nguy cho sức khỏe cộng đồng (Podschun và cs, 1998).

<i>1.3.4 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa </i>

<i>Pseudomonas aeruginosa thường được thấy hiện diện trong đường tiêu hóa với số </i>

lượng ít và một số nơi ẩm ướt trên cơ thể của người như da, niêm mạc, vùng dưới cánh tay. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, thường xuất hiện trong môi trường ẩm thấp ở bệnh viện và là một tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện và nhiễm trùng cơ hội (Dworkin M. và cs, 2006; Jawetz E. và cs, 1989).

– Phân loại theo khóa phân loại quốc tế

<i>P. aeruginosa được phân loại như sau (</i>Buchanan R. E. và Gibbons N. E., 1994): Giới: Bacteria

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Chi: <i>Pseudomonas </i>

<i>Loài: Pseudomonas aeruginosa </i>

– Hình thái

<i> P. aeruginosa là trực khuẩn Gram (-) thẳng hoặc hơi cong, không cú bo t, cú </i>

kớch thc 0,6 ì 2 àm, có khả năng di động nhờ đơn mao ở một đầu (Dworkin M. và cs, 2006; Jawetz E. và cs, 1989).

– Khả năng gây bệnh

<i>Nguồn lây vi khuẩn P.aeruginosa cho người là môi trường ẩm thấp ở bệnh viện. </i>

Người mang mầm bệnh tiềm ẩn là nguồn lây quan trọng từ người này sang người khác (Luvsansharav U. O., 2011; MacKenzie F.M., 1997).

– Tình hình đề kháng kháng sinh

<i> Tỉ lệ P. aeruginosa gây nhiễm khuẩn bệnh viện đã tăng dần trong những năm </i>

gần đây trên thế giới và cả Việt Nam. Theo một công bố mới nhất của CDC ước tính rằng ở Hoa Kì, hơn hai triệu người bị bệnh mỗi năm với bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng

<i>sinh thì có ít nhất 23.000 người chết và có khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh liên quan đến P. aeruginosa. Trong các ca nhiễm bệnh liên quan đến P. aeruginosa có hơn 6000 (13%) là </i>

đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong do nhiễm trùng (CDC, 2014).

<b>1.4 KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU </b>

Theo dược điển Việt Nam IV năm 2009, cao dược liệu là chế phẩm được chế bằng cách cô đặc hoặc sấy đến thể chất qui định các dịch chiết thu được từ cao dược liệu thực vật hay động vật với dung mơi thích hợp. Các dược liệu khi chiết xuất được sử lý sơ bộ (sấy khơ và nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp).

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

1.4.1 Các loại cao dược liệu

Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó có cồn và nước đóng vai trị dung mơi chính. Nếu khơng có chỉ dẫn khác, qui ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1g dược liệu dùng để điều chế.

Cao đặc: là khối đặc quánh. Hàm lượng dung mơi cịn lại trong cao không quá 20%.

Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao khơ khơng được có độ ẩm lớn hơn 5%.

Có nhiều phương pháp để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây thuốc. Các kỹ thuật đề xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết rắn – lỏng. Trong thực nghiệm, việc chiết rắn – lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn – lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm dầm (maceration), chiết với máy Soxhlet,… chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước cịn được gọi là nước sắc. Ngồi ra cịn có chiết với phương pháp lơi cuống bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluidmethod),… (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Từ Minh Koóng, 2007). 1.4.2 Kỹ thuật chiết Soxhlet

Bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong túi vải trắng hay giấy lọc dày rồi cho vào trụ chiết (đặc vài viên bi thủy tinh dưới đáy để tránh làm nghẹt ống thông nhau), không được để lượng bột cây cao hơn mức thông nhau của trụ chiết.

Rót dung mơi vào bình cầu cho thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu (khơng được để lượng thể tích trong bình cầu nhiều hơn hai phần ba thể tích hình cầu).

Kiểm tra hệ thống kín. Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi. Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sơi nhẹ đều. Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây. Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài, rút lấy một giọt dung môi và thử lên mặt kiếng, nếu thấy khơng có vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt. Sau khi hoàn tất lấy dung môi ra khỏi bình cầu, đuổi dung mơi thu được cao chiết.

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

Đối với dung môi chiết 100 ml, chiết liên tục 10 g bột dược liệu ở 60 - 80℃ trong 3 h, dịch chiết đem sấy khô 40℃, ly tâm 5000 vịng/ 10 phút, lọc với giấy lọc, cơ quay cho bay hơi dung môi.

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

<b>Bảng 1.1: Ưu và nhược điểm của phương pháp chiết Soxhlet </b>

- Tiết kiệm dung môi, không tốn công lọc và châm thêm dung môi.

- Dung môi chiết nóng dễ hịa tan. - Chiết kiệt hợp chất do dung môi

ln đổi mới.

- Kích thước trụ làm giới hạn khối lượng chiết.

- Chất chiết trong bình bị đun nóng lâu dễ phân hủy.

- Thiết bị phức tạp khó sản xuất qui mơ lớn.

<b>1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI </b>

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trầu Khơng có các tác động dược lý khác nhau như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, kháng viêm,…(Singh và cs., 2009). Nó cũng hoạt động như một chất kích thích, làm tươi mát hơi thở, thuốc tống hơi, thuốc bổ tim, thuốc giảm đau trong đau khớp, chất sát khuẩn, kích thích tiêu hóa và tuyến tụy sản xuất lipase (Prabhu và cs., 1995), sử dụng như một tác nhân kháng nấm đặc biệt để điều trị nhiễm trùng tại chỗ, cũng như

<i>dùng trong nước súc miệng chống lại nhiễm trùng Candida miệng (Intzar Ali và cs., </i>

2010). Trong nghiên cứu của Nalina T. và Rahim Z. H. A. đã thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô của lá trầu Malaysia lên vi khuẩn gây sâu răng trong khoang miệng người

<i>là Streptococcus mutans (Nalina T. và cs., 2006; Nalina T. và cs., 2007) kết quả là dịch </i>

chiết thô ức chế hoạt động của enzym glucosyltransferase (GTF), đó là enzym cần thiết

<i>để tổng hợp glucan của các vi khuẩn Streptococcus mutans. Trong khi các loài thực vật </i>

đã được nghiên cứu như là nguồn chất có hoạt tính sinh học thì các vi sinh vật nội sinh cư trú trong các mô giữa tế bào cây sống chưa được nghiên cứu rộng rãi (Strobel G., 2004). Chúng đại diện cho một nguồn hóa chất mới phong phú có khả năng khai thác trong một loạt các lĩnh vực y tế, nông nghiệp và công nghiệp (Strobel G., 2003).

Một vài công trình có thể kể đến như: năm 2014, Maria Bintang và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn nội sinh BS1 từ lá Trầu Khơng có khả năng chống lại một

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

<i>số vi khuẩn gây bệnh như: E. coli, Bacillus cereus và S. aureus, kết quả sự ức chế lớn nhất đối với S. aureus và phân tích trình tự 16S rRNA cho thấy chủng vi khuẩn BS1 tương đồng 98 % với Pseudomonas sp. (Maria Bintang và cs., 2014). </i>

Rajendran Srinivasan và cs. (2012) đã tiến hành chiết xuất cao chiết từ gỗ cây Tô Mộc bằng hệ thống Soxhlet và thử nghiệm cho kết quả đường kính vịng kháng khuẩn đối

<i>với S.aureus là 28,00 ± 2,30 mm, S.typhi là 20,00 ± 1,30 mm, E.coli là 9,00 ± 0,7 </i>

mm,…

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, có nhiều nghiên cứu về Trầu Khơng như: Nghiên cứu về tinh dầu

<i>và cao chiết từ lá Trầu Không Việt Nam (Piper betle L. – họ Piperaceae) có tác động kháng Candida spp. (Nguyễn Đinh Nga và Nguyễn Văn Thanh, 2010), nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu, Nguyễn Thành Văn (2011) cho thấy dịch chiết lá Trầu Khơng (Piper betle) cịn có khả năng kháng khuẩn như Edwardsiella tarda, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa (Huỳnh Kim Diệu, Nguyễn Thành Văn, 2011). Trầu Khơng có tác dụng kháng Entamoeba histolytica phân lập từ bệnh phẩm. Tinh dầu diệt động vật nguyên sinh Paramaecium caudatum với độ pha loãng đến 1 : 10000, diệt nấm mạnh đối với 24 chủng T. rubrum, 3 chủng T. mentagrophytes, 3 chủng Trichophyton tosurans, 1 chủng Trichophyton verrucosum, 4 chủng M. canis, 2 chủng M. gypseum và 2 chủng Epidermophyton floccosum (Đỗ Huy Bích và cs., 2003). </i>

Hiện nay có sản phẩm từ lá Trầu Không được sản xuất như chế phẩm sinh học Bokashi – trầu, do tiến sĩ Nguyễn Quang Linh cùng các cộng sự Khoa Thủy sản – Đại học Nông Lâm Huế nghiên cứu và vừa được đưa vào sản xuất. Chế phẩm có khả năng

<i>phịng trị một số bệnh cho động vật thủy sản, ức chế và tiêu diệt 2 loài vi khuẩn Vibrio parahaemoliticus và Aeromonas hydrophyla, đây là hai loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến </i>

trên thủy sản nước ngọt và nước lợ, chế phẩm an toàn sinh học và thân thiện với môi trường (Nguyễn Quang Linh và cs., 2010). Tuy nhiên vẫn chưa có cơng trình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh cây Trầu Không được công bố trong nước.

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

<b>PHẦN 2: </b>

<b>VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

<b>2.1 VẬT LIỆU </b>

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ ngày 19 tháng 10 năm 2015 đến ngày 16 tháng 05 năm 2016 tại Phịng thí nghiệm Vi Sinh 01 – Cơ sở 3, Trường Đại Học Mở – Tp. Hồ Chí Minh.

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

10 chủng vi khuẩn nội sinh lá Trầu Khơng do phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Mở Tp. Hồ Chí Minh cung cấp. 9 mẫu cây Dừa Cạn được thu nhận ở tỉnh Bình Dương. 3 mẫu lá cây Trầu Không và 3 mẫu rễ cây Dừa Cạn (thực hiện cao chiết dược liệu) được thu nhận ở tỉnh Bình Dương

Chủng vi khuẩnkháng thuốc sinh carbapenemase được cung cấp bởi Khoa Xét Nghiệm, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và mơi trường

Thuốc nhuộm: tím kết tinh (Crystal Violet), Lugol, Safranin O

Môi trường: NA (Nutrient Agar), NB (Nutrient Broth), TSA (Trypticase Soya Agar), MHA (Muller Hinton Agar).

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

Lá Trầu Không và rễ cây Dừa Cạn khỏe mạnh

Thuốc thử: Catalase (H2O2 5%), Tricloroacetic acid (TCA), Gress A, Gress B, Methyl Red, Phenol Red, ∝ - naphtop,…

Dung môi để chiết cao: Chloroform (CHCl3).

Dung mơi hịa tan cao chiết: Dimethyl sulfoxid (DMSO).

<b>2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Bố trí thí nghiệm </b>

Dựa theo mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm như sau:

<b>Sơ đồ 2.1: Quy trình thí nghiệm </b>

Quan sát đại thể, vi thể Phơi khô và xay thành bột dược

liệu

Làm thuần Chiết xuất với dung môi

Chloroform

Cô thành cao dược liệu

Thử nghệm hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase

Tìm nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết với vi khuẩn

Tái kiểm tra vi khuẩn nội sinh lá Trầu Không và cây Dừa Cạn trên môi trường TSA

Định danh chủng vi khuẩn có hoạt tính mạnh

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

<b>2.2.2 Tái phân lập vi khuẩn nội sinh từ bộ chủng vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn (</b><i><b>Catharanthus roseus (L.) G. Don) và lá Trầu Không (Piper betle L.) </b></i><b>đã phân lập </b>

<i><b>trước đó. </b></i>

❖ Tái phân lập Bố trí thí nghiệm:

<b>Sơ đồ 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tái phân lập vi khuẩn nội sinh từ lá Trầu Không và phân lập vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn </b>

Chủng vi khuẩn nội sinh lá Trầu Không

Tái kiểm tra vi khuẩn nội sinh trên môi trường TSA

Làm thuần

Quan sát đại thể, vi thể

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

Tái kiểm tra: Bước đầu nhận dạng các loại vi khuẩn khác nhau dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước của khuẩn lạc. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn, đánh giá khả năng sinh trưởng và mô tả đặc điểm của từng chủng vi khuẩn nội sinh mọc lên từ các mẫu phân lập trên môi trường TSA. Tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường NA cho đến khi thu được khuẩn lạc có độ đồng đều về hình dạng, màu sắc.

Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vơ trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính. Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần.

Bước 2: Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U. Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1 – 2 phút, rửa nước, thấm khô.

Bước 3: Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

Bước 4: Tẩy màu bằng cồn 96°, khoảng 15 – 30 giây (cho đến khi vừa thấy giọt cuối trên lam mất màu), rửa nước, thấm khô.

Bước 5: Nhuộm bằng dung dịch safranin O trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Bước 6: Quan sát bằng vật kính dầu 100X Kết quả: vi khuẩn G (+) bắt màu tím crystal violet, vi khuẩn G (-) bắt màu hồng safranin.

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

Chú ý: trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bôi. Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa nước và thấm khô tiêu bản. Trả lời tiêu bản nhuộm gram: hình dáng vi khuẩn, cách sắp xếp các vi khuẩn, ách bắt màu của vi khuẩn.

<b>2.2.3 Thử nghiệm khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase </b>

<b> </b> Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn sinh carbapenemase với các chủng vi khuẩn nội sinh cây dược liệu bằng phương pháp giếng khuếch tán (Ingroff và cs., 1995; Kumar A. và cs., 2009).

<b>Chuẩn bị môi trường thử nghiệm : </b>

– Môi trường NB thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121℃ trong 20 phút. – NA được đổ vào đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 ml. – MHA được đổ vào đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 ml • Chuẩn bị dịch vi khuẩn nội sinh thử nghiệm:

– Chuẩn bị vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ 24 giờ ở 37℃.

– Chọn 1 khuẩn lạc đơn, cấy tăng sinh vi khuẩn nội sinh vào 30 ml môi trường NB, ủ ở 37℃ trong 5 ngày.

– Tiến hành ly tâm môi trường ni cấy ở 8000 vịng/ phút trong 8 phút ở 4℃ và thu dịch nổi vi khuẩn.

• Chuẩn bị dịch vi khuẩn sinh carbapenemase

– Sử dụng vi khuẩn sau khi nuôi cấy 18-24 giờ, pha dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lí 0,85%, tiến hành pha loãng đưa về nồng đồ 10<small>6</small> CFU/ ml. – Tiến hành thí nghiệm

– Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, trải đều trên mặt thạch MHA.

– Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch MHA bằng dụng cụ tiệt trùng. – Dịch vi khuẩn nội sinh thử nghiệm được nhỏ vào trong lỗ khoảng 70 μl.

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

– Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch. – Sau đó ủ 24 giờ rồi xem kết quả vịng kháng.

• Đọc kết quả: vi khuẩn thử nghiệm có khả năng kháng vi khuẩn sinh enzyme Carbapenemase khi xung quanh lỗ có vịng kháng khuẩn (tính bằng đường kính vịng – mm).

<b>Hình 2.1: Bố trí thử nghiệm khuẩn kháng khuẩn </b>

<b>2.2.4 Thử nghiệm đối kháng các chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase của dịch lọc các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu bằng phương pháp giếng khuếch tán. </b>

• Chuẩn bị mơi trường thử nghiệm :

– Chuẩn bị vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ 24 giờ ở 37℃.

– Chọn 1 khuẩn lạc đơn, cấy tăng sinh vi khuẩn nội sinh vào 30 ml môi trường NB, ủ ở 37℃ trong 5 ngày.

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

– Tiến hành ly tâm mơi trường ni cấy ở 8000 vịng/ phút trong 8 phút ở 4℃ và thu dịch nổi vi khuẩn.

– Lọc dịch vi khuẩn qua màng lọc 0,2 μm thu dịch lọc. • Chuẩn bị dịch vi khuẩn sinh carbapenemase

– Sử dụng vi khuẩn sau khi nuôi cấy 18-24 giờ, pha dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lí 0,85%, tiến hành pha lỗng đưa về nồng đồ 10<small>6</small> CFU/ ml. – Tiến hành thí nghiệm

– Dùng que bơng vơ trùng nhúng vào dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, trải đều trên mặt thạch MHA.

– Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch MHA bằng dụng cụ tiệt trùng. – Dịch lọc vi khuẩn nội sinh thử nghiệm được nhỏ vào trong lỗ khoảng 70 μl. – Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch.

– Sau đó ủ 24 giờ rồi xem kết quả vịng kháng.

• Đọc kết quả: dịch lọc vi khuẩn thử nghiệm có khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc sinh enzyme Carbapenemase khi xung quanh lỗ có vịng kháng khuẩn (tính bằng đường kính vịng – mm).

<b>2.2.5 </b><i><b>Phương pháp chiết xuất cao dược liệu từ lá Trầu Không (Piper betle L.) và rễ </b></i>

<b>Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don). </b>

Dung mơi trích ly: Chloroform (CHCl3) vì dung mơi có khả năng chiết nhiều hợp chất và giá thành hợp lý.

Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:8; nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phịng, thời gian trích ly là 3 giờ (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

giấy lọc. Dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách đem thu hồi dung môi. Đem cân số cao này bằng cân phân tích. Cao dược liệu được hịa tan vào DMSO để khảo sát tác động kháng vi sinh vật. Quy trình chiết xuất được trình bày qua sơ đồ sau:

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

Phơi bóng râm, sấy 60℃

Rây qua rây (đường kính lỗ 0,5 mm)

Chiết Soxhlet

Thu hồi dung mơi

<b>Sơ đồ 2.3: Quy trình chuẩn bị và chiết xuất cao dược liệu</b>

Lá Trầu Không (rễ Dừa Cạn)

chloroform 10 g dược liệu

Xay

3 lần chiết xuất

Cao dược liệu

</div>